Procédures légères

Capturées dans un piège lors de leur migration de reproduction, 300 lamproies marines sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans la rivière. Chaque poisson est maintenu jusqu'à 18 heures en bassin de stabulation, anesthésié, mesuré, pesé, puis équipé d'un émetteur radio et acoustique implanté dans la cavité abdominale, avant un réveil d'une dizaine de minutes en nasse amarrée d'où il repart seul. L'espèce figure sur la liste rouge de l'UICN en France et ses indicateurs de population baissent depuis onze ans, avec une absence récurrente de nids. L'effectif retenu, deux échantillons de 30 lamproies par an pendant cinq ans, est justifié par la variabilité des débits et par une mortalité naturelle qui "pourrait réduire légèrement" ce nombre.

Objectifs

La lamproie marine est un poisson migrateur amphihalin, c’est-à-dire qu’il effectue une partie de son cycle biologique dans l’océan (phase de grossissement) et l’autre partie en eau douce (phase de reproduction et développement des larves). Cette espèce est historiquement présente sur de nombreux systèmes fluvio-estuariens. Elle fait partie depuis 1992 des espèces prioritaires d’intérêt communautaire de l’Union Européenne qui doivent être protégées au titre de la biodiversité grâce à la conservation des habitats naturels aquatiques. Elle est inscrite sur la liste rouge des espèces menacées en France par l’UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature). Les principales menaces recensées sur cette espèce sont l’entrave à la libre circulation (difficulté d’accès aux frayères du fait des barrages présents sur les cours d’eau), la dégradation potentielle de l’habitat nécessaire à la reproduction et une prédation en rivière lors de sa migration. De nombreux suivis sont mis en place depuis ces dernières années pour suivre l’état des populations (comptages sur frayères ainsi qu’au niveau de stations de contrôle et suivi de l’efficacité de la reproduction). Or, depuis presque 11 ans, l’ensemble de ces indicateurs est à la baisse, et tendent vers un constat de situation alarmante de la population avec notamment une absence récurrente de reproduction (absence de nids). Des suivis complémentaires doivent donc être mis en place afin d’évaluer le comportement de migration d’un échantillon de la population préalablement équipé d’émetteurs radio et acoustique afin de comprendre la réelle problématique rencontrée lors de cette phase fondamentale du cycle de vie.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de mieux appréhender le comportement des lamproies marines pendant la phase de migration. Il s'agit d'une approche intraspécifique chez la lamproie où la variabilité des trajectoires individuelles sera décrite pour une prise en compte spatiale et temporelle des données de suivi par télémétrie. L’étude cherche à amener des éléments pertinents permettant d’expliquer la chute drastique du stock reproducteur.

Procédures

La procédure débute par le prélèvement des poissons dans la zone de stabulation. Les poissons seront capturés dans un piège puis ils auront une anesthésie d’une durée de 1 à 2 minutes. Une fois sédaté, le poisson fait l’objet de mesures de taille et de poids durant environ 1 minute, avant de procéder à un marquage unique télémétrique et acoustique dans la cavité abdominale, en moins de cinq minutes. La totalité des opérations effectuées pendant la phase de sédation ne dépasse pas 5 minutes. Enfin, le poisson est placé dans une nasse de réveil pour une durée d’environ 10 minutes, assurant une récupération complète avant son retour dans le milieu naturel. Cette nasse de réveil est amarrée dans la rivière et dispose d’ouvertures sur les bords permettant aux lamproies de partir d’elles même lorsqu’elles sont réveillées sans manipulation humaine supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles sont les suivantes : - Stress du maintien des lamproies dans les bassins de stabulation (durée max 18 heures, intensité légère et modérée) - Stress de la contention et anesthésie (durée totale < 4 min intensité légère), - Stress du marquage pour l’insertion des marques (durée < 5 min, intensité légère) - Retard migratoire (temps de piégeage et manipulations estimée entre 10 et 30 min nuisance légère) - Inconfort et douleurs légères post marquage (classe légère durée < 10 min)

Devenir

Tous les poissons seront libres dans leur milieu naturel

Remplacement

Le projet porte sur le comportement migratoire des lamproies, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus de l’espèce et du stade visé (lamproie marine adulte en migration de reproduction) afin d’obtenir des données pertinentes.

Réduction

Dans des systèmes ouverts de grande taille, le choix de deux échantillons contenants chacun n=30 lamproies/an correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités des paramètres environnementaux (débit notamment) et de la variabilité intraspécifique sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif. Par ailleurs, la reconduction de l’étude pendant 5 ans permet de mener les suivis dans différentes conditions environnementales et ainsi objectiver les résultats vis-à-vis des différents partenaires techniques.

Raffinement

L’ensemble des manipulations a été raffiné et conçu pour limiter au maximum le stress et l’épuisement des animaux. Le marquage des animaux est réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis jusqu’à récupération complète après l’anesthésie et relâchés dans le milieu naturel. Aucun poisson faible ou malade ne sera sélectionné pour l’implantation de l’émetteur (mycose, nageoire abîmée…). Par ailleurs, le poids des individus marqués sera toujours supérieur ou égal à 1000 g pour que la marque ne représente pas plus de 1 % du poids de l’individu et ainsi garantir au maximum un comportement normal après implantation de la marque. En cas de difficulté à l’endormir, la lamproie sera positionnée dans l’eau claire pour un réveil total avant d’être relâchée dans le milieu naturel sans être marquée. Une injection d'un analgésique sera effectuée pour réduire la douleur post opératoire au droit de l'incision.

Choix des espèces

L’étude cible la migration de la lamproie marine et cherche à amener des éléments pertinents permettant d’expliquer la chute drastique du stock reproducteur. L’objectif étant d’étudier le comportement des lamproies pendant leur migration de reproduction sur la partie moyenne des fleuves. Les individus utilisés seront donc nécessairement adultes et matures sexuellement.

Pour mesurer les effets d'un cocktail de fongicides sur les cellules immunitaires des méninges, 126 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les pesticides sont ajoutés à l'eau de boisson des parents deux mois avant l'accouplement, puis maintenus pendant la gestation, la lactation et après le sevrage. Le porteur écrit que la quantité administrée correspond à ce que nous buvons chaque jour dans notre eau, que ses collaborateurs n'ont détecté aucun trouble du comportement ni de la croissance, et présente pourtant le modèle murin comme "indispensable". Les souriceaux sont tués à 15 puis 60 jours pour prélever leurs méninges et trier leurs cellules immunitaires.

Objectifs

L’usage intensif des pesticides en agriculture suscite des inquiétudes croissantes en raison de leurs effets néfastes sur la santé humaine. Des études épidémiologiques ont établi des liens entre l’exposition aux pesticides et les maladies neurodégénératives ainsi que des troubles neurodéveloppementaux. La contamination de l’eau, des sols et des aliments par ces substances est également préoccupante. Parmi les pesticides, les anilinopyrimidines (AnPy), couramment utilisés comme fongicides, sont retrouvés dans l’alimentation et pourraient avoir des effets délétères sur la formation du cerveau. Ils constituent une classe de fongicides utilisés en agriculture pour lutter contre un large éventail de champignons pathogènes, Le système nerveux central (SNC) est protégé de la périphérie par différentes barrières anatomiques en particulier le cerveau est protégé par les méninges - Les méninges, et plus particulièrement la dure-mère, sont peuplées de cellules immunitaires résidentes. En raison de leur localisation stratégique à l'interface entre la périphérie et le cerveau, les cellules immunitaires des méninges peuvent communiquer avec les deux compartiments. Notre étude portera sur les effets d’une exposition chronique aux pesticides sur l’interface méningée. Nous réaliserons cette étude chez des souris de type sauvage des deux sexes. Nous analyserons les différentes populations de cellules immunitaires présentes dans les méninges sur des animaux issus d’accouplements où les parents et en particulier les femelles gestantes auront été traitées 2 mois avant l’accouplement, ainsi que durant la gestation et la lactation. Nous poursuivrons également cette exposition après le sevrage. Notre étude permettra de fournir des données cruciales sur les effets des pesticides sur le développement cérébral et contribuera à mieux comprendre les interactions entre environnement et troubles neurodéveloppementaux. Cette étude est basée sur la caractérisation des différentes populations de cellules immunitaires par cytométrie en flux. Cette technique nous permettra d’identifier le statut inflammatoire de chaque population de cellules immunitaires. Pour cette étude nous utiliserons un nombre total de 126 animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet innovant fournira à court terme des données cruciales sur les effets des pesticides sur le système immunitaire dans les méninges et contribuera à mieux comprendre les interactions entre environnement et troubles neurodéveloppementaux. Il vise à plus long terme à alerter les populations exposées et à fournir une base scientifique pour orienter les politiques publiques

Procédures

Il n’y a pas d’intervention sur les animaux puisque le cocktail est ajouté à l’eau de boisson. Afin d’étudier les effets potentiels des pesticides sur le développement du Système Nerveux Central, la descendance sera également exposée aux pesticides.

Impact sur les animaux

A ce jour nos collaborateurs n’ont pas détecté de phénotype comportemental sur la descendance et aucune altération du comportement maternel n'a été observé. Ils n’ont pas non plus observé de différence pour la courbe de poids sur leurs individus descendance et géniteurs. La quantité de pêsticides correspond à ce que nous buvons tous es jours dans notre eau. Il existe cependant un risque de troubles neurodéveloppementaux ou de retard de croissance sur les souriceaux dont nous tenons compte dans l'écriture des points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont mis à mort pour prélever les tissus pour analyse.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal murin est essentielle dans ce projet, car dans l’état actuel des connaissances, il est impossible de recréer in vitro les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement (méninges, cerveau et système immunitaire)

Réduction

Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Une approche statistique solide requiert 12 animaux par groupe de chaque sexe. Des exemples de données publiées ainsi que nos précédents travaux non publiés prévoient un effet sexe en particulier lors des interactions cellules immunitaires et système nerveux. Nous traiterons tous les animaux des portées en les sexant pour obtenir au final 12 femelles et 12 males dans les groupes.

Raffinement

Les souriceaux et les souris seront suivis régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (surveillance renforcée, analgésie, enrichissement, etc.). Avant manipulation des souriceaux, l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera le stress.

Choix des espèces

LÉtant donné l’organisation anatomiquement complexe du SNC, le modèle murin reste indispensable pour effectuer cette étude. Les organoïdes n’arrivent pas à reproduire actuellement toute la complexité des échanges et la souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés car il est montré dans différentes études des effets différents entre les sexes. Nous utiliserons des souris C57BL6J de type sauvage de 8 semaines (accouplements) et nous analyserons les souriceaux à jour post natal 15, stade clé de la maturation de l’unité gliovasculaire (unité maintenant l’équilibre homéostatique entre sang et cerveau) et à jour post natal 60 où la maturation de cette unité est terminée.

Tuées après une chirurgie terminale de quinze minutes destinée à prélever leurs tissus, 207 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse et deux injections intrapéritonéales, contenu à la main. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet d'évaluer les effets d'une molécule sur l'"organisme entier" et qualifie le passage in vivo de prérequis "indispensable". Le bénéfice annoncé se réduit, lui, à fournir des informations sur le potentiel thérapeutique d'une molécule contre des myopathies congénitales qui restent sans traitement.

Objectifs

Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien et qui affectent considérablement leur qualité de vie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de molécules qui pourraient servir de traitement pour les myopathies congénitales et de déterminer les paramètres optimaux d’utilisation des molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de fournir des informations relatives au potentiel thérapeutique d’une molécule qui pourrait servir pour le traitement de myopathies congénitales.

Procédures

Les animaux recevront une injection intraveineuse d’une molécule dont l’administration ne durera pas plus de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes afin de réaliser une chirurgie terminale qui ne durera pas plus de 15 min.

Impact sur les animaux

Chaque animal recevra 1 injection intraveineuse et 2 injections intrapéritonéales réalisées sur animal vigile. L’injection sera à l’origine d’une douleur légère au point de piqûre et la contention manuelle de l’animal génèrera un stress léger/inconfort.

Devenir

Les animaux seront mis à mort après prélèvement des tissus nécessaires pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Dans ce projet qui consiste à évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule, le modèle murin est privilégié car il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation in vivo des effets de potentiels traitements est un prérequis indispensable avant toute application clinique.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur un nombre d’animaux restreint car il s’agit d’expérimentations pilotes qui vont servir à identifier une molécule à fort potentiel thérapeutique et ses paramètres optimaux d’utilisation. De plus, les résultats d’une procédure pourront être réutilisés pour une autre procédure ce qui permet de s’affranchir d’un groupe expérimental et de réduire ainsi le nombre d’animaux. Les travaux antérieurs ont démontré qu’un échantillon de 4-5 animaux par groupe est requise pour garantir la fiabilité des tests statistiques utilisés pour vérifier l’activité de la molécule dans l’organisme et comparer les différents groupes d’animaux entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés et pesés 2 à 3 fois en une semaine. Si une perte de poids >5% au cours de 48h est notée, de la nourriture humidifiée ou gélifiée sera placée au sol dans la cage et les animaux seront alors pesés quotidiennement. Les prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiants et analgésiants. Des points limites adaptés et spécifiques à ce projet ont été définis et seront mis en place.

Choix des espèces

Le modèle rongeur a été sélectionné pour sa pertinence scientifique et le choix de la souris repose sur sa proximité de nombreux mécanismes physiologiques avec ceux observés chez l’être humain ainsi qu’un niveau d’organisation similaire à celui de l’Homme. Le modèle murin permet ainsi d’étudier de manière pertinente les effets biologiques d’une molécule dans un organisme entier, intégrant les interactions entre les différents organes et systèmes. Les animaux seront inclus dans l’étude à l’âge de 8 à 10 semaines et évalués jusqu’à 9 à 11 semaines. Ce stade de développement, considéré comme jeune adulte chez la souris, est adéquat car la croissance de l’animal est stabilisée et ses fonctions physiologiques sont matures et homogènes. Ce choix d’âge permet donc d’analyser l’effet de la molécule dans des conditions physiologiques stables, comparables à celles d’un organisme adulte, tout en limitant la variabilité liée au développement ou au vieillissement. Ce cadre expérimental garantit ainsi la pertinence scientifique des résultats tout en optimisant la reproductibilité des données.

Estimer les teneurs en muscle et en gras, l'un des critères de paiement des carcasses aux éleveurs : 21 cochons de 30, 70 et 115 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont immobilisés au panneau ou, pour les plus lourds, au lasso, puis anesthésiés par injection intramusculaire avant de passer une fois au scanner à rayons X et une fois sous le prototype radar, en moins de vingt minutes. Le porteur identifie la contention comme la nuisance principale, "la plus stressante et douloureuse pour l'animal", et précise que les cochons sont anesthésiés plutôt que tués pour éviter la raideur cadavérique et conserver les rythmes cardiaque et respiratoire. Le projet est enregistré sous la finalité bien-être animal, et les cochons retournent ensuite dans leur case d'élevage.

Objectifs

L'objectif du projet est de développer une méthode rapide et sans contact pour l'estimation de la composition corporelle du porc. La connaissance de la composition corporelle, à savoir les teneurs en muscle et gras, est essentielle à tous les niveaux dans le cadre de l'élevage porcin. La composition en muscle est, avec le poids, un des critères de paiement des carcasses aux éleveurs. Par ailleurs, le suivi de la composition corporelle fait partie des éléments permettant d’adapter l’alimentation des animaux pour assurer les performances de croissance, la qualité de la lactation pour les mères et aussi la santé des animaux. Afin de répondre à ce besoin, de nombreuses méthodes d’estimation de la composition corporelle sur l’animal vivant ont été mises au point et utilisées depuis plusieurs décennies (exemple : échographie, imagerie par rayons X ou IRM …). Cependant aucune n’est à la fois précise, peu coûteuse, rapide et ne nécessitant pas de contention ou d’anesthésie. Il est donc nécessaire d'améliorer les méthodes existantes, voire d’en développer de nouvelles, grâce à des outils méthodologiques modernes. L'objectif de ce projet est de mettre au point et de calibrer, grâce à une mesure de référence, une nouvelle méthode d'estimation in vivo de la composition corporelle chez le porc. Cette méthode se veut rapide et peu coûteuse, et ne nécessite ni anesthésie ni contention et potentiellement aucun contact avec l'animal. Cette nouvelle méthode en cours de développement consiste en l'utilisation d'ondes électro-magnétiques (radar). L'objectif est d'établir les relations entre les mesures réalisées avec le prototype et celle réalisée au scanner à rayon X (CT scan). Le CT scan permet de mesurer sur l’animal vivant mais anesthésié la composition corporelle de façon rapide et non-destructive et est reconnu comme une référence pour ce type de mesure.

Bénéfices attendus

Ce projet est une validation et une calibration de prototype. Les données obtenues lors de ce projet seront utilisées pour établir les équations reliant les mesures par ondes radar à la composition corporelle en utilisant les données de composition corporelle estimée par CT-scan comme référence. Ce prototype sera ensuite affiné pour proposer à moyen terme un appareil de mesure adapté aux mesures en élevage sur animaux vivants non anesthésiés. L'objectif à terme est de proposer un dispositif permettant d'obtenir en élevage expérimental ou commercial des données de composition corporelle sur les porcs par une mesure à distance, sans contention et automatique.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour être scannés par un scanner à Rayons X puis par onde radar. Chaque animal ne passera qu'une fois dans chaque appareil de mesure. Le temps des deux mesures et de la manutention ne dépassera pas 20 minutes.

Impact sur les animaux

Il y a trois nuisances identifiées dans ce protocole. La première est la contention de l'animal pour l’administration de l’anesthésie. Si les animaux des stades 30 kg voire 70 kg peuvent être immobilisés au moyen d'un panneau, au stade de 115 kg la contention peut nécessiter d’utiliser un lasso de contention. C'est vraisemblablement la principale nuisance et la plus stressante et douloureuse pour l'animal. Cependant, c’est la seule méthode possible pour des animaux lourds, à la fois pour la sécurité de l'opérateur mais aussi pour la qualité de l'injection et donc de l'anesthésie ; une anesthésie incomplète peut générer un stress chez l'animal. La deuxième nuisance est l'utilisation d'une aiguille et l'injection des produits anesthésiants. Toute piqûre ainsi que l’injection des produits eux-mêmes pour l'animal sont des actes douloureux. Enfin, durant l'anesthésie, rarement, l'animal peut ressentir de l'inconfort, des spasmes et parfois une difficulté respiratoire.

Devenir

Les mesures étant non invasives, la seule perturbation à l'élevage normal de ces animaux est cette prise de mesures avec anesthésie. D'expérience, cette procédure n'a pas d'incidence sur la vie de l'animal donc il est replacé dans ses conditions normales d'élevage à la fin de la procédure.

Remplacement

Afin de mesurer une composition corporelle, le projet ne peut être mené que sur un animal. En amont de cette expérimentation, le prototype d'appareil de mesure par onde electro-magnétiques (radar) a d'abord été testé sur des modèles non biologiques mimant les propriétés des tissus appelés "fantômes" (gels, liquides, plastiques), puis récemment sur des pièces bouchères (« dos de porcs découpés »). L’étape suivante est donc la mesure sur animal vivant. Les animaux sont anesthésiés au lieu d’être euthanasiés afin d’éviter la raideur cadavérique pour les manipulations des animaux dans les dispositifs (positionnement des pattes par exemple) mais aussi pour conserver les rythmes respiratoires et cardiaques qui peuvent avoir un effet sur les mesures.

Réduction

Le nombre de 21 animaux soit 7 par stade est le minimum que l'on puisse utiliser pour établir une relation relativement fiable entre les deux méthodes de mesures. De plus, nous considérons que la relation entre les deux techniques de mesure peut être indépendante du stade de l'animal. Nous vérifierons l’absence d’effet du stade sur la relation.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un suivi pendant l'expérimentation de techniciens en expérimentation animale formés à l'éthique. Le suivi de l'expérimentation sera assuré par un ingénieur d'études et une vétérinaire formés aux exigences de l'expérimentation et sensibilisés fortement au bien-être animal. L'anesthésie par injection intramusculaire est la méthode la plus simple à réaliser et la moins invasive. Un soin tout particulier sera apporté à la contention. La contention au panneau sera réalisée en limitant le stress et sans douleur pour l'animal. Quant à la contention au lasso pour les animaux les plus lourds, elle sera la plus brève possible. La contention et le transport pendant l'anesthésie seront réalisés avec un matelas à dépression utilisé sur les humains. Cela a pour effet de limiter l'inconfort de l'animal et d'assurer une manutention sans risque pour l'animal et les opérateurs. L’animal est surveillé pendant l’anesthésie. Une attention particulière sera prise au chauffage (chauffage d’appoint si nécessaire) des zones de mesure et de la case de réveil car l’anesthésie ralentit la thermorégulation. Le réveil de l’animal est surveillé et il retournera dans sa case d’origine une fois pleinement conscient et mobile.

Choix des espèces

Le projet consiste à évaluer la méthode de mesure de la composition corporelle par la méthode radar à des fins de recherche mais aussi éventuellement commerciales sur l'espèce porcine. 3 stades de développement ont été choisis : 30, 70 et 115 kg. 7 animaux de chaque stade seront utilisés. Ces trois stades ont été choisis car cela coïncide globalement avec le début, le milieu et la fin de la croissance au cours de laquelle la composition corporelle change fortement. Cela permet d'avoir la variabilité souhaitée pour établir les relations entre la composition corporelle et la mesure radar, mais aussi de vérifier que cette relation n’est pas dépendante du stade, ce qui est notre hypothèse. Si cela était le cas, une étude complémentaire serait nécessaire.

Piquer sous la peau et dans l'abdomen des rongeurs vigiles, pour que des étudiants valident une certification réglementaire : 240 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque étudiant dispose d'un animal de chaque espèce, manipulé lors de trois séances de quatre heures puis lors d'un examen où le geste d'administration est tiré au sort. Les souris passent ensuite à d'autres travaux pratiques avant d'être tuées, leurs corps servant à la dissection en licence, et les rats sont réutilisés en troisième année ou proposés à l'adoption aux étudiants. Le porteur affirme que la manipulation d'animaux factices ne permettrait pas de former à l'observation des signes de bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

La réglementation en matière d'expérimentation animale publiée en 2013 oblige la formation spécifique des personnes voulant appliquer des procédures expérimentales utilisant des animaux. Ce projet concerne la réalisation de séances pratiques dans le cadre de cette Unité de Certification en matière d'Expérimentation Animale : Application de Procédures sur Rongeurs. Cette action de formation a été agréée pour une durée de 5 ans et comprend des séances qui mettent en oeuvre des animaux vivants et qui ont pour objectif de former les étudiants aux aspect pratiques de la manipulation et de l'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que l'observation du comportement pour évaluer le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Cet enseignement permettra aux étudiants volontaires et motivés qui souhaitent poursuivre leurs études dans le domaine de l'expérimentation animale, de mobiliser les concepts fondamentaux et les technologies de la physiologie animale et des sciences du comportement pour traiter une problématique du domaine, ainsi que d'analyser et synthétiser des données en vue de leur exploitation pour développer une argumentation critique et constructive vis-à-vis de cette problématique. Cette action de formation permettra également de sensibiliser les étudiants au respect des principes d’éthique, de déontologie et de responsabilité en matière d’expérimentation avec des animaux vivants.

Procédures

Les animaux qui seront utilisés dans le cadre de cette Unité de Formation Certifiante en matière d'applications de procédures expérimentales sur rongeurs permettront aux étudiants de se former à l'observation de leur comportement et des signes de leur bien-être, aux gestes de manipulation, de préhension et de contention de ces animaux ainsi que les gestes relatifs à l'administration de substances à des animaux vigiles par injection sous la peau ou dans l'abdomen.

Impact sur les animaux

Le stress lié à la manipulation des animaux lors des séances pratiques et/ou de la séance d'évaluation des aptitudes pratiques des étudiants. Douleurs et/ou saignements liés aux piqûres lors de l'apprentissage des gestes d'administration sur animaux vigiles (seules les voies d'administration par injection ou dans l'abdomen seront enseignées).

Devenir

Les rats comme les souris seront utilisés dans des séances pratiques spécifiques (une séance rat et une séance souris) consistant chacune à enseigner aux étudiants les bases de l'observation du comportement des animaux et des signes apparents de bien-être, les gestes de manipulation, de préhension et de contention ainsi que les procédures d'administration de substances à des animaux vigiles par injection sous la peau ou dans l'abdomen. A l'issue de ces séances, les souris seront réaffectées à d'autres travaux pratiques de 1ère année de master consacrées à l'étude du comportement avant d'être mises à mort à l'issue de ces travaux pratiques et leurs cadavres utilisés pour des travaux pratiques de dissection en 2ème année de licence. Les rats seront quant à eux réutilisés dans le cadre de travaux pratiques de 3ème année de licence. Dans le cas où des rats ne seraient pas utilisés pour ces séances pratiques de 3ème année, ceux-ci seront proposés à l’adoption auprès des étudiants. Il ne sera procédé à la mise à mort de ces rats restants qu'en dernier recours dans le cas où leur réutilisation/adoption ne serait pas possible.

Remplacement

La formation en matière d'Expérimentation Animale - Application de Procédures sur Rongeurs vise à certifier les personnes inscrites pour la pratique de procédures non-chirurgicales sur des rongeurs. La formation oblige les étudiants à suivre 3 séances pratiques de 4h chacune dont 2 mettent en jeu des rongeurs vigiles (rat et souris) pour leur permettre d'apprendre à mettre en oeuvre des gestes de manipulation et d'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que se former à l'observation des rongeurs et de leurs signes apparents de bien-être. L'apprentissage de ces pratiques ne peuvent donc être réalisées qu'en mettant en oeuvre des animaux vivants. Le recours à des méthodes alternatives telles que la manipulation d'animaux factices ne peut pas être mis en oeuvre, ne permettant pas de rendre compte à eux seuls du comportement de l'animal et de permettre aux opérateurs de se former à l'observation des signes de bien-être animal.

Réduction

Les animaux (rat et souris) seront obtenus auprès d'un fournisseur agréé pour permettre la réalisation de ces travaux pratiques. Le nombre d'animaux est limité à un animal de chaque espèce par étudiant inscrit à la formation. Ces animaux seront ensuite réutilisés pour la séance d'examen pratique individuel à la suite des séances pratiques de formation, l'étudiant tirant au sort le geste d'administration qu'il aura à réaliser uniquement sur un animal d'une des 2 espèces. Ce nombre d'un animal de chaque espèce par étudiant a été estimé au plus juste sans avoir recours à une approche statistique pour l'estimer, le but de cet enseignement étant de former les étudiants à l'observation, la manipulation et l'administration de substances à des animaux vigiles. Par ailleurs, 4 animaux de chaque espèce ont été prévus en plus de ceux utilisés par les étudiants pour constituer des pools de nombre suffisant pour éviter une réutilisation excessive des animaux, notamment lors de la séance d'examen qui a lieu à la suite des séances de travaux pratiques dans un laps de temps très réduit.

Raffinement

Dès leur réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Pendant toute la durée du projet, les animaux seront traités selon la réglementation par du personnel compétent. Les animaux seront hébergés selon les conditions imposées par la réglementation. Ils seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs (enseignants intervenant dans la formation) ou le zootechnicien de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les points limites habituels seront notés (l'isolement, les yeux fermés, un dos voûté, les poils hérissés, l'immobilité, une perte de poids de plus de 20% du poids corporel total ou de 15% entre deux pesées consécutives à une semaine d'intervalle, des signes de déshydratation, les yeux et l'abdomen creux, etc…).

Choix des espèces

Cette unité de certification Application de Procédures sur Rongeurs vise à certifier les personnes inscrites pour la pratique de procédures non-chirurgicales sur des rongeurs. La formation oblige les étudiants à suivre 3 séances pratiques de 4h chacune dont 2 mettant en jeu des rongeurs vigiles (rat et souris) pour leur permettre d'apprendre à mettre en oeuvre des gestes de manipulation et d'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que se former à l'observation des rongeurs et de leurs signes apparents de bien-être. L'apprentissage de ces pratiques ne peuvent donc être réalisées qu'en mettant en oeuvre des espèces rongeurs (rat et souris) qui sont l'objectif de la formation. Les rats comme les souris seront utilisés à l'âge adulte (3 mois d'âge postnatal) quand tous les systèmes physiologiques sont matures.

Tués à douze mois pour éviter, selon le porteur, l'apparition de signes de vieillissement, 7 200 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir des lignées où douze gènes liés à l'habituation sont remplacés par une protéine fluorescente. Aucune intervention n'est déclarée sur les poissons de plus de cinq jours, la surveillance se limitant à cinq jours sur sept, avec pour points limites la scoliose, une nage anormale ou des femelles remplies d'œufs. Le tri des embryons de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire, réduit selon lui le nombre d'individus élevés, sans que le RNT indique combien sont écartés à ce stade.

Objectifs

Chez les patients atteints de schizophrénie ou d'autisme, le processus d'habituation, un type de mémoire, est impacté. Nous avons reproduit ce mécanisme d'habituation chez le poisson zèbre. Quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, le poisson zèbre réagit en changeant de direction. Lorsqu'il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant l’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes ciblés seront remplacés par de la fluorescence ce qui nous permettra d'étudier les effets des protéines invalidées sur l'habituation en évitant le génotypage par prélèvement de la nageoire.

Bénéfices attendus

Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'homme nous montrent l'importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines, d'étudier leur rôle tout en évitant un génotypage par biopsie de la nageoire caudale.

Procédures

Aucune intervention ne sera réalisée sur les poissons âgès de plus de 5 jours.

Impact sur les animaux

Lors de la génération et l'élevage des individus mutant, aucun effet indésirable n'est attendu considérant nos résultats précédents avec des lignées similaires mais non fluorescentes. Toutefois, la création de ces lignées avec insertion d'une protéine fluorescente à la place du gène n'étant pas un simple knock-out, une surveillance 5 jours sur 7 sera réalisée par du personnel qualifié et l'expérimentateur avec pour points limites l’observation d’anomalies physiques du poisson (couleur de la peau anormale, hyperventilation, déformation morphologique du poisson, scoliose, siphose, blessure, femelles remplies d'oeufs), d’anomalies de son comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité), prostration au fond du bac à l'abri de la lumière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l'apparition de signes de vieillissement et donc d'impacter le bien-être des animaux.

Remplacement

L'étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique obligatoirement l'utilisation de modèles animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre les adaptions du cerveau des vertébrés face à des stimuli extérieurs. De plus, le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités avec celui de l'Homme.

Réduction

Afin de minimiser le nombre de poissons à élever, un tri des embryons âgés de moins de 5 jours et présentant une fluorescence appropriée sera réalisé (non soumis à une DAP). Ceci permettra de réduire drastiquement le nombre d'individus élevés et de garder après 5 jours de développement uniquement les poissons pour le maintien de la lignée et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement. Pour le maintien des lignées, nous faisons une nouvelle génération tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Pour surveiller le bien-être animal, nous observerons les poissons qui seront utilisés ensuite pour créer les générations suivantes.

Raffinement

Les poissons-zèbres générés et conservés devraient tous être sans phénotype dommageable d'après notre expérience précédente. Tous les individus sont regroupés dans des bacs de 3.5l pour être au minimum 8 par bac et au maximum 20 par bac. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.

Choix des espèces

Les gènes de l'Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fertilisation externe, avec des pontes de plus de 100 oeufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d'autres modèles tels que la souris et ainsi obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux, ce qui nous permettra de relier les événements dans les neurones avec le comportement d'apprentissage de l'animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettrons de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement (hors cadre). Ainsi, ces reproducteurs seront gardés jusqu'à 12 mois; avant l'apparition de signes de vieillesse.