Procédures légères

Dix chevaux reçoivent chacun jusqu'à dix administrations de médicaments et subissent jusqu'à dix-huit prélèvements sanguins en dix-sept jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Les produits passent par la bouche, parfois par une sonde gastrique, parfois par perfusion lente de plus de trente minutes, parfois par piqûre. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'administrer ces substances pour vérifier que le laboratoire retrouve bien la molécule et ses métabolites, au service du contrôle antidopage des courses hippiques. Les chevaux sont maintenus en vie et réutilisés d'un essai à l'autre, chacun quittant l'établissement pour être adopté au plus tard à quinze ans.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de vérifier la détection des substances prohibées selon l’article 6 du code des courses et dont l’origine ne peut être rattachée à l’alimentation normale du cheval. Les substances prohibées comme définies dans le code des courses sont susceptibles d’agir à tout moment sur au moins un ou plusieurs systèmes corporels des mammifères ci-après : système nerveux, système cardiovasculaire, système respiratoire, système digestif, système reproducteur, système musculo-squelettique, système hémo lymphatique et la circulation sanguine, système immunitaire à l’exception des substances présentes dans les vaccins agréés pour la lutte contre les agents anti-infectieux et le système endocrinien. Une très grande majorité de ces substances figure sur la liste de la Fédération Equestre Internationale disponible sur le site de la FEI.

Bénéfices attendus

Il est indispensable d’appliquer ou d’administrer un médicament à un cheval afin de vérifier que le laboratoire détecte la molécule administrée et/ou ses métabolites dans les conditions satisfaisantes afin de répondre aux exigences du contrôle antidopage des chevaux comme défini dans l’article 6 du code des courses. Dans ce contexte, les échantillons obtenus après administration de substances thérapeutiques sont nécessaires pour : - le développement de nouvelles méthodes - des validations de méthodes (validation de la détection et de l’identification de métabolites) - la préparation de contrôles inter laboratoires dans le cadre d’échanges européens Les échantillons obtenus après administration de substances thérapeutiques sont aussi utiles pour valider des dossiers de confirmation (rapport de cas positifs) en l’absence de métabolites disponibles sur le marché.

Procédures

Les chevaux sont soumis à des administrations par voie orale ou parentérale et aussi des prélèvements notemment sanguins. Type d’intervention : administration Il s’agit le plus souvent d’une administration unique. Dans le cas d’administrations répétées, le nombre max est de 10. Nombre max d'administrations par animal : 10. Durée de chaque administration : courte de 1 à quelques minutes par administration, exceptionnellement plus long jusqu’ à plus de 30 minutes dans le cas d’une perfusion lente.. Type d’intervention : prélèvements sanguins. Nombre max par animal : 18 sur une période de 17 jours (1 jour avec 2 prélèvements). Durée de chaque prélèvemnt : très courte.

Impact sur les animaux

Au cours de ces expérimentations, les administrations par voie parentérale ainsi que les prélèvements notamment les prélèvements sanguins peuvent entrainer des nuisances. Ces nuisances sont principalement une douleur au point de piqure lors de certaines administrations par voie parentérale et lors des prélèvements sanguins. Ces manipulations peuvent générer un stress pour l’animal. Le personnel a suivi des stages de médical training. Cette formation permet d’optimiser tous les gestes pour réduire la douleur au point de piqure lors des prélèvements, le stress de l’animal lors des prélèvements sanguins et tout risque d’infection liée aux injections et aux prélèvements. Les administrations par voie parentérale sont réalisées par un vétérinaire qui a lui aussi suivi des stages de médical training. Concernant les administrations par voie orale, la gêne à l’administration est principalement due à l’utilisation d’une sonde gastrique. La sonde ne s’emploie que dans quelques rares cas où la quantité de produit à administrer est importante. Dans les autres cas, l’administration se fait par exemple en mettant le principe actif dans une gélule, la gélule étant insérée dans une carotte ou une pomme, aliments appétants pour le cheval. Si la sonde doit être utilisée, c’est toujours un expérimentateur chevronné qui réalise l’administration. De ce fait, le geste est très rapide diminuant la gêne occasionnée. Par ailleurs, les chevaux sont quotidiennement surveillés, la fréquence d’observation peut être augmentée si le protocole en cours l’impose. Tout éventuel signe d’inconfort ou d’abattement est noté et corrigé et pris en compte afin d’optimiser les tests ultérieurs.

Devenir

Animaux maintenus en vie et réutilisés. Au plus tard à l’âge de 15 ans, chaque cheval est sorti de l’établissement utilisateur pour être adopté. Cela concerne les 10 chevaux d’expérimentation.

Remplacement

Les différents protocoles ne peuvent être réalisés que chez l’animal vivant et sur l’espèce cheval. Dans le cas de cette saisine, il est toutefois possible de réaliser dans certains cas des études in vitro ou in silico préliminaires afin de mettre en évidence certains métabolites de phase I ou de phase II. Dans le cas où les tests in vitro sont possibles, ils sont réalisés mais les résultats obtenus doivent toujours être complétés et/ou vérifiés par une étude in vivo dans l’espèce cible.

Réduction

Le nombre d’animaux impliqués est réduit au maximum. Ces essais sont généralement conduits sur un, deux (dans la cadre d’expérimentation pilote) voir six chevaux dans le cadre d’étude PK/PD en accord avec les recommendations de l’EHSLC (European Horserace Scientific Liaison Committee).

Raffinement

Les chevaux sont quotidiennement surveillés et observés autant que nécessaire pendant la journée en fonction du protocole. Tout éventuel signe d’inconfort est noté afin d’optimiser les tests ultérieurs. Ces chevaux sont tous logés dans le même barn d’un établissement récent et confortable aménagé pour des chevaux de compétition dans le souci de leur bien-être. Les propositions éducatives pendant les sorties au paddock (ou éventuellement aux boxes) sont principalement les suivantes : ballon adapté, bouteille en plastique ou brosse pour grattage. Ces méthodes d’enrichissement suivent les recommandations des stages Medical training équidés suivis par l’équipe. Des points limites concernant les signes généraux, les signes locaux inflammatoires et les constantes biologiques ont été mis en place. La procédure est arrêtée au plus tard dès le deuxième point d’altération et/ ou de modifications des signes généraux.

Choix des espèces

Répondre aux exigences du contrôle anti-dopage des chevaux. Le cheval est l’unique espèce concernée. Les chevaux utilisés sont des chevaux adultes, de 3 ans à 15 ans environ, dont l’âge est similaire à celui des chevaux de compétition (courses et sport).

Tuées vingt-quatre heures après une administration unique, pour que leurs embryons soient prélevés au stade où se forment les articulations des doigts. 228 souris femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 12 dans une phase pilote destinée à choisir entre l'injection et le gavage. Aucun embryon ne survit aux analyses, et le porteur ne retient qu'un seul embryon par portée, uniquement s'il présente les caractéristiques attendues. Il présente le choix de femelles de un à trois mois, plus fertiles et moins sujettes aux complications, comme garantissant une reproduction efficace et conforme au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Même si l’on connaît de mieux en mieux comment se forment les membres au début du développement, la manière dont les articulations apparaissent reste encore difficile à comprendre. L’objectif de ce projet est donc d’étudier en détail comment les articulations se forment, en observant les cellules et les molécules qui participent à ce processus. Pour cela, nous utiliserons un modèle bien établi en recherche biomédicale : la souris. Mieux connaître ces mécanismes est essentiel pour imaginer, dans le futur, des thérapies capables de réparer ou de régénérer des articulations abîmées par des maladies. Dans ce projet, nous comparerons le développement des articulations chez des embryons de souris normaux et chez d’autres présentant des anomalies. Plus précisément, notre objectif est d'examiner plusieurs aspects clés à différents moments du développement : comment les cellules qui constituent les articulations se déplacent, se divisent, communiquent entre elles et s’organisent pour former des structures fonctionnelles comme le cartilage ou la capsule articulaire. En parallèle, nous chercherons à comprendre quels gènes et quelles molécules contrôlent ces comportements cellulaires. Pour cela, nous combinerons les informations déjà publiées dans la littérature scientifique avec nos propres observations expérimentales. En réunissant toutes ces données, notre ambition est d’obtenir une vision complète des différentes étapes qui permettent à une articulation de se former correctement.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension de la façon dont les articulations se mettent en place pendant les premières étapes de la vie. En observant de très près leur formation, il sera possible de mieux comprendre pourquoi, parfois, elles ne se développent pas correctement ou s’abîment avec le temps. Ces nouvelles connaissances pourront servir de base pour imaginer, à l’avenir, de nouvelles méthodes pour prévenir, diagnostiquer ou traiter certaines maladies des articulations, qu’elles apparaissent à la naissance ou plus tard. Elles pourraient également aider à trouver des approches innovantes pour réparer ou régénérer les articulations abîmées à la suite d’une blessure ou d’une maladie. Le projet contribuera aussi à enrichir les connaissances générales en biologie et à renforcer les collaborations entre chercheurs spécialisés dans différents domaines. Il offrira des opportunités de formation pour les étudiants de master, les doctorants et les jeunes chercheurs, qui apprendront à utiliser des méthodes de pointe pour étudier le développement et la santé des tissus. En résumé, les résultats attendus auront un impact positif à la fois sur la recherche fondamentale et, à plus long terme, sur les applications médicales, au bénéfice de la santé articulaire de tous.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, une seule procédure sera réalisée. Un composé sera administré à des femelles en gestation afin de permettre la mise en évidence de certaines cellules présentes au niveau des articulations des embryons. L’administration de ce composé pourra être réalisée soit par injection, soit par voie orale. Chaque manipulation sera de très courte durée, ne prendra que quelques minutes. Chaque femelle gestante ne recevra qu’une seule administration. Vingt-quatre heures après cette administration, les femelles seront mises à mort afin de permettre le prélèvement des embryons.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce protocole consistent à administrer un produit aux souris gestantes soit à l’aide d’une piqûre au niveau de l’abdomen, soit par l’introduction contrôlée d’un petit tube dans la bouche afin qu’ils avalent le produit. Ces interventions sont de courte durée et peuvent occasionner un léger inconfort ou un stress temporaire liés à la contention et à la manipulation au moment de l’administration. Aucune nuisance supplémentaire n’est attendue après l’administration du produit. Aux doses utilisées, le composé ne présente pas de toxicité aiguë ni d’effets délétères différés pour les femelles gestantes. Aucun effet indésirable a posteriori n’est anticipé, notamment en termes de douleur prolongée, d’altération de l’état général, de comportement anormal ou de risque d’avortement, durant la période précédant la mise à mort. Vingt-quatre heures après l’administration, les femelles gestantes sont mises à mort afin de procéder au prélèvement des embryons.

Devenir

Cette étude porte exclusivement sur les embryons. Tous les embryons seront prélevés pour les analyses prévues, ce qui ne permet pas leur survie. La mise à mort des femelles gestantes est nécessaire au moment du prélèvement embryonnaire.

Remplacement

À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’étudier de manière fiable la formation des articulations sans recourir à des animaux. Des modèles développés in vitro à partir de cellules (cultures 2 dimensions ou organoïdes) permettent de reproduire certaines étapes précoces du développement du membre. Toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire les phases plus avancées du développement embryonnaire, au cours desquelles s’opère la formation des articulations. Ces étapes reposent sur des interactions spatio-temporelles complexes entre plusieurs tissus (cartilage, tissu conjonctif, muscle, innervation, vascularisation), ainsi que sur des contraintes mécaniques spécifiques. En particulier, les processus de segmentation articulaire, de cavitation et de maturation des articulations nécessitent un contexte tridimensionnel intégré et dynamique qui ne peut actuellement être reproduit de manière fidèle par des modèles cellulaires isolés, comme cela est décrit dans la littérature. Ces limites ne permettent donc pas d’obtenir les informations nécessaires pour répondre aux objectifs de cette étude. Ce projet ayant pour objectif de comprendre comment les articulations se forment naturellement au cours du développement embryonnaire in vivo, l’utilisation d’animaux demeure indispensable pour mener cette recherche de façon rigoureuse.

Réduction

Le nombre de souris gestantes a été défini de façon à n’utiliser que le strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs du projet. Cette estimation tient compte des limites pratiques (temps d’observation au microscope, disponibilité des équipements) ainsi que des variations naturelles entre embryons. Le prélèvement des embryons destinés à l’imagerie sera organisé selon un plan permettant de réduire les biais : un seul embryon sera sélectionné par portée, uniquement lorsqu’il présente les caractéristiques attendues, et à différents moments du développement afin de couvrir les étapes clés d’intérêt. Avant de commencer l’étude principale, une courte phase de test sera réalisée afin de choisir la meilleure façon d’administrer le produit aux femelles gestantes, en s’assurant qu’elle soit efficace et bien tolérée. Cette étape évitera de répéter des expériences inutiles. Douze femelles seront utilisées pour cette phase : six pour tester une administration par injection, et six pour tester une administration par voie orale. Une fois la méthode choisie, le protocole sera appliqué de manière rigoureuse afin d’assurer des résultats comparables entre les différentes souris et de limiter les variations individuelles. Pour l’étude principale, 72 femelles gestantes seront utilisées dans chacune des trois conditions testées (développement normal et deux modèles présentant des anomalies chez les embryons), soit au total 216 femelles. Ce nombre a été sélectionné sur la base de travaux antérieurs réalisés dans notre laboratoire, dans lesquels des stratégies expérimentales similaires ont été utilisées. Le plan expérimental est identique entre les groupes pour permettre des comparaisons directes et limiter le nombre total d’animaux. Enfin, lorsque cela sera possible, des outils d’analyse informatique seront employés afin d’éviter d’avoir recours à de nouveaux prélèvements.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’inconfort des animaux, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place. En ce qui concerne l'administration du produit, l’utilisation de volumes appropriés, de solutions tièdes, d’aiguilles fines et d’une manipulation douce contribue à limiter l’inconfort. Après chaque administration, les animaux seront attentivement observés afin de détecter tout signe de malaise. Comme les animaux seront mis à mort 24 heures après l’administration pour permettre le prélèvement des embryons, il est peu probable qu’ils subissent des effets indésirables affectant leur bien-être. Cette affirmation repose sur le fait que le composé administré est utilisé à des doses ne présentant pas de toxicité aiguë chez la souris gestante, telles que décrites dans la littérature. De plus, la courte durée d’exposition ne permet pas l’apparition d’effets différés ou chroniques. Aucun signe d’altération de l’état général (perte de poids, modification du comportement, douleur persistante) n’est attendu dans l’intervalle séparant l’administration du produit de la mise à mort. Par ailleurs, le raffinement prévoit un enrichissement environnemental renforcé (y compris matériau de nidification abondant, igloo en papier, etc.), visant à soutenir leur confort et à limiter le stress associé à l’administration du produit et à la gestation.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier le développement des organes, car son organisation du corps et ses gènes sont très proches de ceux de l’être humain. Son squelette et ses articulations se forment de façon semblable à celle des autres mammifères, ce qui permet de mieux comprendre les étapes normales de ce processus et les causes possibles de certaines malformations. De plus, la souris est un petit animal facile à élever, qui se reproduit rapidement et pour lequel il existe de nombreux outils scientifiques permettant d’observer et de suivre le développement de manière précise. Les connaissances obtenues chez la souris aident ainsi à mieux comprendre le développement des articulations chez l’homme et à préparer des recherches futures sur certaines maladies ou anomalies articulaires. Des femelles âgées de 1 à 3 mois seront utilisées pour la procédure expérimentale. À cet âge, elles présentent une activité ovarienne régulière, une réceptivité utérine élevée et un faible risque de complications gestationnelles, ce qui permet d’obtenir des portées régulières et viables. Au-delà de cette tranche d’âge, la fertilité tend à diminuer et la variabilité des résultats augmente. Ce choix garantit donc une reproduction efficace, fiable et conforme au bien-être des animaux. En ce qui concerne les embryons, les stades étudiés correspondront aux jours embryonnaires 11.5 à 14.5, soit l’intervalle de formation des articulations des doigts.

Deux coups de chaleur à 32 °C maintenus une heure, espacés de sept jours, pour 240 poulets de chair, et un accéléromètre porté en continu par 300 d'entre eux, vérifié jusqu'à cinq fois par semaine. 360 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun ne devant être tué dans le cadre du projet, les 360 étant rendus à l'élevage. L'objectif est de constituer un jeu de données d'entraînement pour un algorithme capable de repérer, à partir des mouvements, les changements de comportement qui annoncent une maladie dans un élevage entier. Le porteur remplace le contexte infectieux par un stress thermique jugé plus simple, et se borne à écrire que des conditions d'élevage classiques permettront facilement leur "replacement", sans préciser ce que devient ensuite un poulet de chair.

Objectifs

Détecter de façon précoce les perturbations du comportement d’un individu est un levier peu invasif pour prédire la survenue d’un état de mal-être et/ou l’apparition de symptômes d’une maladie. Néanmoins, s’il est possible de décrire le répertoire comportemental d’un individu isolé, il est beaucoup plus complexe de faire ses observations à l’échelle d’un troupeau d’animaux tel qu’un élevage de poulet de chair. Aussi, il devient nécessaire de mettre en place des outils capables de détecter ces changements. L’accélérométrie couplé à de l’intelligence artificielle serait un outil qui permettrait de répondre à ce défi. Néanmoins cela demande la création de jeux de données d’entrainement pour que ce couplage soit réalisable. Dans ce contexte, cela demande d’équiper des animaux et de les suivre en vidéo pour pouvoir associer les mesures tirées de l’accélérométrie à des comportements précis. C’est pourquoi nous souhaitons effectuer notre expérience. Néanmoins plutôt que de choisir le contexte infectieux pour notre étude nous avons choisi de réaliser un stress thermique qui permet l’obtention de réponses comportementales ressemblant à une fièvre. Notre étude se fera sur deux souches de poulets de chair, l’une à croissance rapide et l’une à croissance lente qui reflète la diversité de l’élevage français. Dès que les animaux attendront un poids de 1.3 kg, les animaux seront équipés d’un accéléromètre. Nos animaux seront élevés dans des conditions classiques avec un enrichissement adapté au poulet qui permet de favoriser les comportements de gratage, picorage et perchage. A la fin de leur cycle d’élevage, deux stress thermiques d’une durée maximale de 8 heures, dont une heure en température maximale, seront effectués pour mesurer les modifications des comportements et des mesures d’accélérométries. Ces données vidéo et accelerométriques seront ensuite annotées pour permettre de corréler ces évènements grâce à l’intelligence artificielle.

Bénéfices attendus

1. Description du répertoire comportemental des animaux en état de bien-être ou de stress thermique 2. Développement d’algorithmes permettant de connaitre les comportements des poulets à partir de dispositifs accéléromètres 3. Détection d’un changement de comportements dû à une source de stress

Procédures

240 animaux subiront deux coups de chaleur (montée à 32°C très progressive, maintien de la température pendant une heure puis redescente rapide à la température d’élevage de 19-22°C) espacés chacun de 7 jours. Après l'installation des capteurs, chaque animal portant le dispositif (100 par lot) sera manipulé quelques secondes/ minutes en état vigile au plus 5 fois par semaine afin de vérifier le fonctionnement des dispositifs.

Impact sur les animaux

Les stress thermiques devraient provoquer des réponses comportementales type halètement, classiques lors d’une exposition à une élévation de la température. Un stress léger dû à la contention des animaux pour installer puis vérifier la bonne position des capteurs et à prévoir. Enfin, les dispositifs en continu des dispositif accélérométrique (

Devenir

Les animaux seront élevés dans des conditions classiques d’élevage permettant facilement leur replacement

Remplacement

L’étude des comportements ne peut se faire que sur des organismes entiers.

Réduction

Les effectifs, 3 lots de 120 animaux (deux pour l’étude des comportements des souches à croissance rapide et un pour l’étude des comportements des souches à croissance lente) ont été défini sur la base d’études antérieures ayant mesurées l’apparition des comportements liés à l’hyperthermie. Les plans expérimentaux ont été définis pour optimiser au mieux le nombre d’animaux requis tout en permettant d’assurer l’obention de données robustes pour répondre à nos objectifs scientifiques

Raffinement

Les animaux seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment et à la boisson ad libitum. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : plateformes de perchage, cachettes et zones de fuite, bacs à poussière et blocs à piquer. La densité maximale sera de 10 animaux par m2, équivalente aux densités d’élevage en biologique, pour permettre notamment un espacement des animaux pendant les coups de chaleur. Les observations journalières dureront entre 15 et 20 min par groupe. Si un animal est blessé (e.g. locomotion impossible), malade, ou s’il est en souffrance (prostration permanente, c’est-à-dire animal qui ne se met pas debout à l’approche de l’humain et/ ou reste prostré pendant toute la visite quotidienne), nous suivrons un arbre de décision visant à faciliter la gestion quotidienne des animaux (atteinte ou non du point limite) utilisé en routine par l’unité expérimental et fourni aux technicien-nes en charge du suivi des animaux. Pendant les coups de chaleur, les animaux seront suivis en temps réel grâce aux caméras mises en place et une intervention instantanée de diminution de la température pourra être enclenchée. Les animaux seront habitués à notre présence lors de nos visites journalière afin de faciler l’installation et le maintien des dispositifs d’accélérométrie. Des récompenses alimentaires type grains de raisin pourront être envisagées pour faciliter le contatc avec les animaux et réduire le stress de la contention. La démarche de raffinement de notre expérimentation s’engage également en étudiant des changements de comportements lors d’un stress thermique plutôt que d’une infection nécessitant une procédure sévère/ létale type inoculation infectieuse.

Choix des espèces

Nous travaillons sur le poulet de chair dans des conditions d’élevage classique. Nous avons donc choisi de nous placer directement sur notre espèce modèle et d’étudier les deux sexes comme cela est fait en élevage. Nous utiliserons nos animaux dès qu’ils atteindront un poids de 1.3 kg, poids défini pour porter le dispositif d’accélérométrie sans compromettre le déplacement des animaux (

Échographies cardiaques et électrocardiogrammes sous anesthésie à l'isoflurane, dès le 21e jour de vie et jusqu'à douze mois, avec pesées hebdomadaires puis mensuelles. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées en fin de protocole. Une lignée porteuse d'une mutation du gène STRIP1, identifiée chez quatre familles atteintes de prolapsus valvulaire mitral, est créée pour tenter d'expliquer les troubles du rythme cardiaque associés. Le porteur annonce qu'aucune nuisance ni effet secondaire n'est attendu, tout en indiquant que le phénotype de ces souris n'est pas connu chez le rongeur et devrait ressembler à celui des patients.

Objectifs

Le prolapsus valvulaire mitral (PVM) est l’une des pathologies cardiovasculaires les plus fréquentes, et est associé à un haut taux de morbidité et de mortalité. Plus particulièrement, certaines données récentes suggèrent que le PVM est associé au développement de troubles du rythme cardiaque, augmentant le risque d’évènement cardiovasculaire et de décès des patients. A l’heure actuelle, aucun traitement pharmacologique n’est disponible pour les patients porteurs d’un PVM et la composante trouble du rythme cardiaque dans la pathologie n’est pas prise en compte dans le management des patients. La seule option proposée est la réalisation d’une chirurgie valvulaire mitrale, une approche thérapeutique très invasive, adressant uniquement la problématique liée à la valve cardiaque. Notre projet a pour objectif d'analyser et d’identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue du PVM, mais aussi de la cardiomyopathie associée à cette maladie valvulaire. Notre équipe a identifié lors de l’analyse génétique de plusieurs grandes familles (n=4) présentant un PVM et une susceptibilité à développer des troubles du rythme cardiaque, une mutation spécifique sur le gène STRIP1. L’objectif aujourd’hui est de créer et d’évaluer le bien-être animal d’une nouvelle lignée de souris porteuse de la mutation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, via la génération d’un nouveau modèle animal, une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et la progression du PVM, ainsi que ceux impliqués dans le développement de troubles du rythme cardiaque associés au PVM. Ce projet permettra d’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les patients.

Procédures

Des approches macroscopiques (observation du comportement, suivie de poids, suivie de la prise alimentaire) et prélèvement unique pour le génotypage ainsi qu’une approche d’imagerie (échocardiographie et électrocardiogramme) sont réalisés. Ces approches non invasives seront réalisées, pour certaines, sous anesthésie dès le jour 21 après la naissance jusqu’à 12 mois.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet secondaire ne sont attendus lors de la réalisation de cette étude. Le stress ressenti par les animaux sera limité ou maitrisé. Les pesées seront rapides et la préhension réduite par l’utilisation d’un tunnel (1 fois par semaine pendant 12 semaines puis 1 fois par mois jusqu'à 12 mois ). L’acquisition des images échocardiographiques et l’électrocardiogramme sont réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane (induction 4% ; maintien 2%) en ventilation spontanée. Pour l’échocardiographie, la zone thoracique est rasée. Les souris sont placées sur la plateforme dédiée et chauffante (rétro-contrôlée par sonde rectale afin de maintenir la température des animaux à 37°C). Un onguent ophtalmique est systématiquement appliqué. L’examen consiste à l’acquisition de l’ensemble des images nécessaires à l’évaluation de la morphologie et de la fonction des valves cardiaques et du myocarde (durée maximum de la procédure 20 minutes). Pour l’électrocardiogramme, les souris sont placées sur la plateforme dédiée et chauffante (rétro-contrôlée par sonde rectale afin de maintenir la température des animaux à 37°C). Un onguent ophtalmique est systématiquement appliqué. L’examen consiste à l’acquisition d’un électrocardiogramme (durée maximum de la procédure 10 minutes). Pour leur réveil, les animaux seront hébergés en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue.

Devenir

Sacrifice en fin de protocole

Remplacement

La modélisation in vitro ou in silico de la pathologie valvulaire cardiaque est limitée. En effet, les valves subissent à chaque cycle cardiaque des stress mécaniques multiples (tension, pression, flux) et répétitifs, qu’il est impossible de modéliser. De plus, le retentissement sur le myocarde de la pathologie, ne peut lui non plus être modélisé in vitro ou in silico. Une approche de physiologie et pathophysiologie intégrée est donc nécessaire pour répondre aux questions auxquelles nous faisons face.

Réduction

Les croisements sont élaborés pour obtenir un nombre suffisant d’animaux permettant d’obtenir des résultats robustes et fiables pour l’évaluation du bien-être animal. Leur nombre est adapté aux besoins de l’évaluation du bien-être chez les deux sexes (au moins 14 animaux par génotype selon les recommandations européennes).

Raffinement

Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue. Les procédures d’imagerie proposées sont non invasives et permettent de suivre un même animal longitudinalement. Elles sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

De nombreux processus et systèmes biologiques inter-régulés et intégrés sont décrits dans le PVM, tout comme dans le développement des troubles du rythme cardiaque. Il est donc impossible de substituer ou modéliser par des approches in vitro ou in silico l’ensemble de ces processus. Le recours au modèle animal est donc primordial. L’utilisation d’un modèle animal permet quant à lui d’étudier de façon intégrée l’ensemble des mécanismes impliqués, augmentant ainsi la pertinence des découvertes afin de les appliquer chez l’Homme. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de laboratoire qui nous permettront d’étudier les mécanismes impliqués dans la pathologie. Le phénotype attendu des souris devrait être similaire au phénotype observé chez les patients, mais n’est pas connu chez le rongeur. Le bien être animal sera évalué de la naissance jusqu’à 52 semaines. Le génotypage sera réalisé au moment du sevrage à 21 jours.

Toutes les souris de ce projet naissent immunodéficientes, privées d'une partie de leur système immunitaire, donc exposées aux infections toute leur vie. 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, le projet consistant à les faire naître et à les élever plutôt qu'à leur infliger des expériences. Les reproductrices et les petits qui n'ont pas le génotype recherché sont tués à la fin de la période d'accouplement, leurs organes partant vers d'autres projets, tandis que les petits porteurs du bon génotype sont gardés en vie pour des expériences ultérieures. Le porteur ne dit pas quelle part des 2 880 animaux passe dans cette seconde catégorie, ni ce que ces projets ultérieurs leur feront subir.

Objectifs

L’inflammation est une hyperréactivité de notre système de défense, le système immunitaire. Elle peut être aiguë c’est-à-dire sur une courte période (type piqûre de moustique) ou chronique c’est-à-dire s’établir sur plusieurs années voire toute la vie. Ce type d’inflammation regroupe un grand nombre de pathologies de la peau et de l’intestin telles que le psoriasis, les colites, la maladie Crohn ou cœliaque. Le nombre de personnes atteintes de ces inflammations chroniques ne cesse de croître. Par ailleurs, les inflammations chroniques sont connues pour faire le lit du cancer. Pour l’heure il n’existe aucun traitement curatif. La mise en place d’un traitement impose de comprendre ces pathologies et donc les modifications de notre système immunitaire qui y sont associées afin d’identifier des cibles thérapeutiques. La souris récapitulant fidèlement les pathologies inflammatoires cutanées et intestinales de l’Homme y compris le développement de cancers associés, notre objectif est d’étudier le système immunitaire et particulièrement les globules blancs appelés lymphocytes T qui semblent responsables de la pathologie. Pour cela, notre laboratoire prévoit de générer et d’élever des souris génétiquement modifiées avec une déficience en lymphocytes T et en molécule qui contrôlerait l’hyperréactivité des lymphocytes dans les inflammations chroniques.

Bénéfices attendus

Face au manque de traitement curatif et à la recrudescence des sujets atteints d’inflammations chroniques, il y a une vraie urgence à comprendre les altérations du système immunitaire responsables de la pathologie pour les contrecarrer et proposer enfin un traitement curatif.

Procédures

L’ensemble des souris produites dans ce projet sont immunodéficientes. Cette immunodéficience est causée par l’absence d’une partie du système immunitaire rendant les souris plus susceptibles aux infections par des pathogènes. Nos souris sont hébergées dans des conditions sanitaires strictes et contrôlées par des examen sanitaires réguliers et sont manipulées sous hotte garantissant le statut sanitaire. Tout ceci permet d’éviter l’apparition d’infection chez ces souris tout au long de leur vie.

Impact sur les animaux

Bien que ce soit peu probable dans nos conditions d’hébergement et de statut sanitaire stricts, l’apparition d’infections par pathogènes opportunistes du fait d’un système immunitaire défaillant peut générer un stress, un mal-être et une souffrance.

Devenir

Les souris reproductrices ainsi que les petits non porteurs du génotype recherché seront mis à mort à la fin de la période d’accouplement. Les petits porteurs du génotype recherché seront gardés en vie dans le cadre d’une utilisation continue dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Si nos résultats in vitro et in silico sont en accord avec notre hypothèse sur les molécules à cibler pour contrecarrer l’inflammation chronique, celles-ci faisant partie d’un processus physiologique complexe il nous est impossible de formuler des conclusions sans une étude dans un organisme entier qui présente les mêmes caractéristiques pathologiques que l’Homme.

Réduction

Le nombre d’accouplements décrits dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir les souris nécessaires à nos expérimentations. Par ailleurs, les organes des animaux qui n’auront pas les bons génotypes seront étudiés pour d’autres projets. Le cas échéant, les accouplements pourront être modulés à la baisse pour limiter le nombre de souris générées si un projet ne nécessite pas ou peu de souris pour une lignée donnée pendant une période définie.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi quotidien avec l’établissement de points limites précoces et la manipulation des animaux limitant le stress au minimum possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur, stress ou souffrance des souris. L'environnement sera enrichi avec du coton pour tous les animaux et des maisons rouges seront ajoutées dans les cages d'accouplement. Les souris immunodéficientes étant hébergées dans un environnement sanitaire contrôlé, très peu sont susceptibles de développer une infection.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. La souris (mus musculus) correspond à ces critères dans le cadre ce projet car c’est non seulement un mammifère dont le système immunitaire est similaire à celui de l’Homme mais aussi parce qu’elle développe des pathologies inflammatoires chroniques cutanées et intestinales en tout point similaires aux pathologies humaines. Nous disposons de l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans et maitrisés par le laboratoire. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet n’existent que chez la souris. La mise en accouplement se fera à partir de 8 semaines lorsque les souris atteignent leur maturité sexuelle. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines et jusqu’à 6 mois pour les projets actuels et futurs de l’équipe.

Gardés en hébergement standard ou transférés vers d'autres projets, 600 primates vont être prélevés à répétition dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger: 400 macaques à longue queue, 150 ouistitis et tamarins, 30 macaques rhésus et 20 singes vervets. Chaque individu peut être prélevé une à six fois par an, sang, liquide céphalo-rachidien, moelle osseuse, urine, lait, sperme, humeurs oculaires, biopsies de peau ou de muscle, lavage broncho-alvéolaire. Pour recueillir le lait, les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures, et pour le sperme, le mâle est isolé de son groupe la veille. Le porteur présente ces prélèvements comme un moyen de remplacer l'utilisation d'animaux "entiers" et affirme qu'ils suivent "parfaitement" la règle des 3R.

Objectifs

L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projet diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Chaque intervention dure entre 15 min à 1 heure le temps de l'anesthésie et du prélèvement. 30 min à 1 heure supplémentaires sont ensuite nécessaires après le retour de l’animal dans son animalerie jusqu'à son réveil complet. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvements biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Un même animal peut être prélevé de manière répétée, en respectant des volumes et des temps de récupération spécifiques afin de préserver la bonne santé de l'animal. En se basant sur les dernières années, un individu peut être prélevé en moyenne entre 1 à 6 fois par an, tout échantillon confondu.

Impact sur les animaux

La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.

Devenir

Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.

Remplacement

Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.

Raffinement

La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.

Choix des espèces

De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.