Procédures légères

Pour 75 à 95 % d'entre eux, ce sont des animaux dits de réforme, déjà présents dans l'établissement et n'ayant pas le génotype attendu par les projets qui les ont fait naître. 1 810 souris et 95 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à la fin de chaque session. Chaque animal vigile subit trois gestes au maximum, une administration, un prélèvement sanguin et un nouvel essai si le premier a échoué, dont un gavage classé douloureux de façon modérée. Le porteur admet que la maîtrise des gestes par des expérimentateurs néophytes est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur, et indique que les planches anatomiques, le puzzle 3D et la peluche utilisés en démonstration ne remplacent pas l'animal vigile.

Objectifs

Les personnels de la recherche amenés à concevoir ou à réaliser des procédures expérimentales impliquant des animaux utilisés à des fins scientifiques ont l’obligation réglementaire d’acquérir une formation spécifique en experimentation animale. Cette formation initiale à l’expérimentation animale vise à délivrer les connaissances réglementaires requises concernant l’expérimentation animale (niveau applicateur). Au cours de cette formation pratique réalisée sur souris et/ou rats, les participants se familiariseront aux gestes techniques réalisés sur animaux vigiles tels que la manipulation et la contention, le sexage, le prélèvement sanguin et l’administration de molécules par différentes voies. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les gestes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et limiter le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, une bonne maîtrise des gestes techniques participe au respect de la règle des 3R. (reduction, raffinement et remplacement)

Bénéfices attendus

Chaque participant recevra ainsi une formation pratique prenant en compte le respect du bien-être animal et la règle des 3R. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes techniques permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles tout en réduisant au maximum le stress et la souffrance des animaux et leur nombre.

Procédures

3 injections = 15s par injection douleur légère; 1 administration orale par gavage = 1 min douleur modérée; 1 prélèvement = 15s douleur légère. Un même animal vigile aura une combinaison maximale de 3 gestes (une administration et un prélèvement et un nouvel essai si l'un des gestes était non concluant)

Impact sur les animaux

La préhension et la contention des animaux peut induire un stress chez les animaux. Les administrations réalisées sur animaux vigiles peuvent induire un stress et une douleur de courte durée. Le prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. S’agissant d’expérimentateurs néophytes, la maitrise des gestes techniques est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur qu’effectués par des expérimentateurs compétents et expérimentés.

Devenir

A chaque session de formation, l’intégralité des animaux seront mis à mort car il s'agit d'animaux issu d'élevage, n'ayant pas initialement le bon génotype d'intérêt.

Remplacement

Nous avons mis au point diverses méthodes au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage des gestes de contention ou de techniques d’administration ou de prélèvements en situation réelle, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et nécessitent l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

De notre expérience, 75 à 95% des animaux nécessaires à cette formation sont couverts par des animaux de réforme de l'établissement utilisateur accueillant cette formation (réutilisation des animaux n'ayant subi aucune autre procédure > classe légère). Seuls 5 à 25% maximum des animaux nécessaires à cette formation nécessiteront une provenance d’un fournisseur. Trois sessions par an de cette formation réglementaire seront réalisées.

Raffinement

Pour la séance de travaux pratiques, les animaux seront amenés dans leur cage d’hébergement dans la salle de travaux pratiques quelques heures avant le début de la séance pour habituation. Le stress des animaux sera réduit au maximum en commençant cette session pratique par une approche douce d’habituation aux animaux par des techniques de préhension douce permettant aux participants de maîtriser leur propre appréhension. Les participants seront en situation réelle sensibilisés à la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal. Les gestes techniques d’administration et de prélèvement ne seront réalisés par le participant que lorsqu’il maitrisera parfaitement la contention, celle-ci étant validée par l’encadrant. Le nombre de gestes techniques réalisé sur chaque animal est limité et chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration et d’un prélèvement sanguin. L’encadrant veille tout au long de la séance de formation pratique au respect du bien-être animal et sensibilise en continu les participants au raffinement des techniques.

Choix des espèces

La formation étant spécialisée sur les rongeurs et les lagomorphes, des rongeurs (souris ou rats) mâles et femelles âgés de 8 semaines et plus seront utilisées dans ce projet.

Tester un complexe sucrant breveté, issu de fruits fermentés et de fibres, pour une filière qui cherche un substitut au saccharose : 6 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur appareil digestif, leur foie, leurs reins, leur pancréas, leurs dents et leur cerveau. Chaque souris est mise à jeun cinq heures par semaine, vingt-quatre fois, et subit jusqu'à douze prélèvements sanguins. Une partie reçoit un régime hypercalorique jusqu'à l'obésité, une autre est privée de nourriture pour reproduire une anorexie, avec des périodes d'isolement pouvant atteindre vingt-deux heures. Le porteur situe le projet dans une demande croissante de la population et des acteurs de l'agroalimentaire pour des produits plus sains et sensoriellement satisfaisants, et annonce une contribution à la reformulation de produits.

Objectifs

Le sucre, et plus particulièrement le saccharose, occupe une place centrale dans notre alimentation en raison de ses propriétés organoleptiques (goût sucré, texture…) et fonctionnelles (conservation, structure...). Toutefois, sa consommation excessive est associée à de nombreuses pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, l’obésité, les troubles du comportement alimentaire ou encore l’inflammation. Au-delà des impacts physiopathologiques, plusieurs études mettent en évidence un lien entre consommation excessive de sucre et troubles du comportement, en particulier chez les enfants. En effet, la consommation de sucre serait associée à des troubles de l’attention, de l’impulsivité, voire à une augmentation de l’agressivité. Face à ces enjeux de santé publique, la recherche de substituts sucrants plus sains devient essentielle. L’objectif est double : maintenir les caractéristiques sensorielles et fonctionnelles du sucre tout en réduisant son impact sur la santé. Dans ce contexte, un nouveau substitut de sucre, un complexe sucrant breveté issu de fruits fermentés et de fibres, apparait comme prometteur dans cet enjeu. Ce substitut présente une particularité majeure : il possède des propriétés physiques similaires à celles du sucre, ce qui lui permet de s’intégrer aisément dans les préparations culinaires classiques, tout en limitant l’impact sur la santé. Au-delà de ces propriétés, ce substitut de sucre suscite un intérêt croissant pour son potentiel à limiter les pics glycémiques postprandiaux. Il permettrait aussi de palier aux dysrégulations émotionnelles et cognitives induites par le sucre. Par ailleurs, sa faible valeur énergétique pourrait jouer un rôle dans le contrôle du poids corporel et des apports caloriques, éléments clés dans la lutte contre l’obésité. Ce projet, à l’interface entre nutrition, physiologie et comportement, a pour objectif de déterminer si le substitut de sucre représente une alternative crédible au sucre classique du point de vue de la santé à court et long terme. NOUS AVONS CHANGE LA FAÇON DE FAIRE LES PRISES DE SANG POUR UTILISER UNE METHODE PLUS RAPIDE, MOINS STRESSANTE ET MOINS FREQUENTE POUR LES ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances sur les effets d’un substitut sucrant innovant. Les bénéfices attendus sont : scientifiques, sanitaires et sociétaux. 1-Avancées scientifiques : Ce projet permettra d’approfondir la compréhension des effets des substituts du sucre sur la régulation de la glycémie, la sécrétion d’insuline et les marqueurs d’inflammation de bas grade. Il explorera également les effets neurocomportementaux d’une consommation chronique ou aiguë de sucre et de ses substituts, notamment en ce qui concerne la concentration, l’impulsivité et les comportements agressifs. Par ailleurs, les mécanismes de régulation de la satiété feront l’objet d’une attention particulière, en lien avec la fermentation colique et la production d’acides gras à chaîne courte. Enfin, le rôle de ce substitut de sucre sera évalué dans des contextes de surconsommation alimentaire (modèle d’obésité) et de réalimentation après une phase de dénutrition (modèle post-anorexique). 2-Bénéfices sur la santé humaine : Les retombées potentielles pour la santé sont significatives. Le bénéfice principal réside dans la réduction des risques associés à une consommation excessive de sucre, tels que le diabète de type 2, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et certaines dysrégulations neurocognitives. Une attention particulière sera portée à l’amélioration de la régulation des fonctions cognitives et émotionnelles, en lien avec les variations de neurotransmetteurs observées lors de la consommation de sucre chez certains individus sensibles. 3- Impact sur la santé publique : Ce projet répond à une demande croissante de la population et des acteurs de l’agroalimentaire pour des produits alimentaires à la fois plus sains et sensoriellement satisfaisants. Il pourrait ainsi contribuer à la formulation de nouvelles recommandations nutritionnelles et à la reformulation de produits à moindre impact métabolique. En apportant des données robustes sur les effets d’un substitut sucrant à faible index glycémique, ce projet ambitionne de participer à la transition vers une alimentation plus favorable à la santé métabolique et mentale, tout en préservant le plaisir alimentaire.

Procédures

MODIFICATION Procédure 1 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min.- PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN - Le test de l’attention sera réalisé 3 fois par souris et durera 30 à 40 min - Le test de comportement sera réalisé 1 fois par souris et durera 23min divisé en 3 sessions sur 2 jours. - le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par groupe et durera 3h30 (à jeun) - le test de tolérance au glucose sera réalisé 1 fois par souris (sur un second lot) la semaine de la mise à mort et durera 6h (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 2 : -La période de jeun durera entre 15h30 et 19h selon la phase. -La période d’isolement durera entre 18h30 et 22h selon la phase --LE PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR PHASE (1 PAR SEMAINE) SOIT 5 FOIS MAXIMUM DURERA 5 MIN. -Le gavage sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum, et durera 2 min. Procédure 3 : -Le gavage sera réalisé 1 fois par jour pendant 8 jours soit 8 fois et durera 2 min. -L’injection sera réalisé 1 fois par souris et durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR SEMAINE PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 4 FOIS), ET DURERA 5 MIN. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) Procédure 4 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR SEMAINE PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 4 FOIS) ET DURERA 5 MIN. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 5 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN.. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 6 : - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN.. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun)

Impact sur les animaux

Les techniques de contention et l'administration de substances peuvent induire un stress significatif chez la souris. En particulier, l'administration sous-cutanée ou par gavage, ainsi que les prélèvements sanguins, peuvent être traumatisants si effectués par du personnel insuffisamment expérimenté, entraînant des complications telles que des hématomes ou une administration incorrecte, comme dans la trachée au lieu de l'estomac. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger. Les souris devront être isolées, or l’isolement social peut causer du stress et de l’anxiété chez les souris, qui sont des animaux sociaux par nature. Un régime hyper calorique sera administré aux souris afin de mimer une obésité, leur prise de poids va entraîner une réduction de leur mobilité, ce qui pourrait provoquer un inconfort. Une privation de nourriture sera mise en place afin de mimer une anorexie chez les animaux, une perte de poids trop élevée entraînera une sortie des animaux de l’étude. Les périodes de jeûne pourraient provoquer un stress et un inconfort modérés. Les pesées réalisées plusieurs fois par semaine pourraient générer un stress léger.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet de la consommation de ce substitut de sucre. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins, le pancréas, les muscles, le tissu adipeux, les dents et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’alternative aux tests sur les animaux qui permette de comprendre de manière fiable et complète comment ce substitut de sucre agit sur l’ensemble du corps. Les méthodes en laboratoire (sur cellules ou par modélisation informatique) ne suffisent pas à reproduire la complexité des réactions de notre organisme, notamment en ce qui concerne le métabolisme, la satiété, l’inflammation ou encore le comportement alimentaire. C’est pourquoi les études sur l’animal, en particulier la souris, restent nécessaires. Elles permettent d’observer comment ce substitut de sucre influence la sensation de satiété, la régulation du sucre dans le sang, les réponses inflammatoires et ses effets dans des situations comme l’obésité ou l’anorexie. L’utilisation de la souris offre une vision globale et sur la durée, ce qui est essentiel pour mener à bien ce projet de recherche dans un cadre scientifiquement pertinent.

Réduction

Cette étude, qui s’étalera sur cinq ans, vise à mieux comprendre les effets du substitut de sucre en le comparant aux sucres et édulcorants déjà disponibles sur le marché. Elle prendra en compte les différences entre les sexes en étudiant ses effets à la fois chez les mâles et les femelles, car le métabolisme peut varier selon le genre. Pour évaluer les effets d’une consommation prolongée, un grand nombre de souris est nécessaire. Certaines seront analysées à différentes étapes de l’étude afin de détecter, le cas échéant, des effets sur des organes comme le foie, les reins ou les intestins. Toutefois, si aucun impact n’est observé après 24 semaines chez un premier groupe de souris, les autres groupes ne seront pas utilisés. Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables : 20 souris par groupe permettront notamment de tester la réponse du corps au sucre (tolérance au glucose et à l’insuline).

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre ou cinq dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles animaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude biologique avec l'homme. Elles ont des systèmes digestifs, hormonaux et métaboliques assez proches de ceux de l’homme, ce qui permet d'étudier les effets physiopathologiques des aliments, tels que les substituts de sucre. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces. Nous allons utiliser des souris de 8 semaines afin de regarder l’impact de la prise du substitut de sucre au cours de la vie adulte.

Avant leur sevrage, entre quinze et vingt jours de vie, de jeunes Psammomys obesus reçoivent sous anesthésie une injection de virus dans chaque œil, dix minutes par œil, pour désactiver le gène Abca4. Suivent deux fonds d'œil et quatre examens de l'activité électrique de la rétine, une heure chacun sous anesthésie, entre deux et seize semaines d'âge. En parallèle, des femelles adultes reçoivent deux injections d'hormones pour déclencher une superovulation, sont accouplées, puis opérées une heure pour modifier le gène dans l'embryon, avec un risque de résorption fœtale ou de mort in utero. 6 773 de ces rongeurs diurnes vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les animaux dont la rétine ne porte pas la mutation attendue sont tués eux aussi, parce que la technique employée peut créer des mutations non désirées et qu'ils ne peuvent plus être considérés comme des animaux naïfs réutilisables.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte la rétine, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, la macula, qui est riche en cônes. Le gène impliqué dans cette maladie héréditaire est le gène ABCA4, un transporteur étroitement impliqué dans le recyclage du pigment visuel. Plus de 1200 mutations ont été identifiées dans ce gène mais less mécanisme par lesquels elles impactent la gravité de la maladie ne sont pas connus. Les mécanismes pathogènes ont été étudiés dans une souche de souris dont le gène Abca4 a été invalidé (KO). Néanmoins, ces souris KO ne présentent pas les déficits observés chez les patients atteints de la maladie de Stargardt. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne utilisé dans ce projet, présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’Homme. Nous avons développé un premier modèle de la maladie de Stargardt chez ce modèle en réalisant des injections spécifiques de virus invalidant dans l'oeil , le gène Abca4, ce qui aboutit à l’apparition rapide des symptômes de la maladie dans les yeux infectés. L’invalidation complète du gène est cependant un cas extrême qui est très rare parmi les patients : des mutations ponctuelles sont plus fréquentes, et responsables de toute une gradation dans les symptômes. Afin d’affiner notre modèle, ce projet présente 2 versants : 1, utiliser la même approche que précédemment (infection virale) pour investiguer les conséquences de mutations plus fines, ayant un effet moins drastique sur l’expression du gène. 2, développer un modèle transmissible de mutation du gène Abca4 qui permettrait de contourner la variabilité (qualité, site et étendue de l’injection) inhérente à l’injection oculaire..

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’affiner la compréhension du lien structure/fonction dans la protéine ABCA4 et de faire le lien entre mutation et sévérité de l’impact sur la vision, des aspects difficilement accessibles chez l’humain. La production de modèles de la maladie avec mutation germinale, sera à terme un clair gain par sa reproductibilité et la simplicité de son maintien en tant que nouvelle lignée stable, ainsi que sa potentielle utilisation pour évaluer des traitements contre la maladie de Stargardt.

Procédures

Pour la sélection des mutations du gène cible pertinentes: deux lots d'animaux recevront avant sevrage une injection dans chaque oeil (durée 10 minute chacune) qui sera réalisée sous anesthésie générale. Ces animaux, placés sous anesthésie générale et analgésie, seront ensuite soumis à 2 fond d'oeil (durée 2minutes) et 4 examens de l'activité électrique de la rétine (ERG) d'une durée d1 heure chacun, entre l'âge de 2 et 16 semaines avec un délai minimum de 4 semaines entre chaque ERG. Pour la mise en place d'un modèle de la maladie par transmission germinale: les femelles vigiles pourront recevoir deux injections d'hormones (durée de 30 secondes chacune) avec un délai de 3jours entre les deux pour réaliser l'étape de superovulation. Certaines femelles seront ensuite accouplées et les femelles fécondées seront soumises à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptée permettant d'invalider le gene cible dans l'embryon (durée 1h). Après mise bas, les petits issus de ces femelles seront soumis, sous anesthésie gazeuse, à l'injection d'une puce d'identification et à un prélèvement tissulaire pour les caractériser génétiquement (durée 2minutes en tout). Les petits d'intérêt génétique poru le projet seront soumis sous anesthésie générale et analgésie à 3 ERG d'une durée de 1h à partir de l'âge de 4 semaines et avec un délai de 4 semaines entre chaque examen.

Impact sur les animaux

L’injection oculaire chez les jeunes Psammomys obesus n’engendre en général aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Les virus utilisés dans le projet sont couramment utilisés dans les essais de thérapie génique en raison de la faible réponse immunitaire de l’hôte. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté, ou d’une douleur transitoire. L’ERG est une méthode non invasive utilisée également en clinique humaine, ne provoquant pas de souffrance particulière. Une inflammation voire une opacification de l’œil n’est pas à exclure à cause du contact des électrodes d’ERG avec la cornée, mais le risque est minimisé avec l’utilisation de gel ophtalmique. Les anesthésies répétées pendant les suivis longitudinaux peuvent engendrer du stress La chirurgie peut induire une perte de masse moyenne de 10% maximum dans les 24h après la chirurgie et une douleur modérée, une inflammation ou des agrafes arrachées. On ne peut totalement exclure un risque infectieux. Les injections pour la superovulation : saignement si piqure dans un organe, risque d’inflammation. Electroporation : réduction possible du nombre de petits par résorption foetale ou par mort in utéro des embryons . Identification par injection d'une puce et biopsie d'oreille: douleur légère transitoire. Suite à la chirurgie les femelles seront isolées en cage individuelle pour la durée de la gestation ce qui pourrait induire un stress leger transitoire.

Devenir

En fin de procédures, les animaux dont le gène cible a été invalidé dans la rétine seront mis à mort pour analyse histologique et moléculaire de la rétine. Les animaux ne portant pas la mutation attendue dans la rétine seront mis à mort car la technologie de transgénèse utilisée est susceptible de créer des mutations non désirées que nous ne pourront vérifier. Les animaux ne pourront donc plus être considéré comme des animaux naïfs réutilisables dans les projet de l'EU utilisant cette espèce. Les femelles superovulées non fécondées seront mis à mort car elles ne peuvent plus être considérée comem des animaux naifs qui pourraient être réintroduits dans des projets scientifiques de l'EU utilisant cette espèce.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles. Le remplacement est d’autant plus difficile qu’il s’agit ici de mimer une pathologie complexe du système visuel, avec de nombreux degrés de sévérité et d’établir une lignée de rongeur génétiquement modifiée

Réduction

Dans la PE1 chaque animal est son propre contrôle : un œil est injecté avec la construction contrôle et l’autre avec la construction induisant la mutation du gène Abca4. Le suivi longitudinal permet de limiter la multiplication des groupes et de renforcer l’analyse des effets des mutations. Ce projet a également pour objectif la mise au point et la validation d’une nouvelle approche de transgénèse sur une nouvelle espèce : le Psammomys obesus. En intégrant la PE2 , étape de mise au point in vitro des conditions de survie et développement des embryons après superovulation, sur la base de l’expertise acquise au Chronobiotron sur le modèle hamster doré, nous estimons notre besoin à 10 expériences intégrant 15 femelles surperovulées accouplées = 150 femelles. Il est à noter que la superovulation permet d'augmenter le nombre d'ovocytes/femelles et donc le nombre d'embryons potentiels après fécondation ce qui conduit à réduire le nombre de femelles utilisées pour obtenir le même nombre d'embryons sans la superovulation. Pour la PE3, I-Gonad : Les paramètres d’électroporation sur cette espèce sont inconnus. Nous aurons à les mettre au point à partir des données publiées sur les rongeurs (rat, souris, hamster...). Nous estimons à 15 femelles/semaine et répétition 10x du protocole sur la durée du projet soit 150 femelles. Puis une fois les conditions établies, en routine : 15 femelles / 4 semaines (durée de gestation = 24-25j) sur 17 semaines/an sur 5 ans = 1275 femelles. Soit au total : 1275 +150 = 1425femellles. Dès validation des paramètres optimaux pourl’électroporation et dès que nous aurons le nombre d’animaux des deux sexes (10 de chaque sexe) suffisant pour lancer une colonie, les expériences seront interrompues. Les N estimés sur la base de l'expertise de l'EU pour les PE2 et PE3 sont des N maximaux. Dès que le résultat scientifique sera atteint la procédure concernée sera interrompue (point limite scientifique). Aucune analyse statistique ne sera réalisée au cours de cette partie du projet. PE4: les petits présentant la mutation attendue seront comparés (fonction visuelle: ERG) à leurs frères et soeurs de génotype sauvage afin de valider l'approche. Les mêmes animaux seront utilisés pour mettre en route des croisements sur animaux sauvages puis génération d'une F2 pour vérifier la transmission germinale de la mutation. Nous estimons à N=20 mâles et 20 femelles pour cette partie.

Raffinement

Les animaux jusqu’à l’âge de P15-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales ; et dans un environnement enrichi (matériel de nidification : frisure, bâton à ronger). Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et l’enrichissement des cages sera maintenu à l’identique. Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P15-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’oeil. Après l’intervention, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel ophtalmique. Lors de l’ERG les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une anesthésie locale pour l’ERG. De plus, le dessèchement de l’œil est limité par l’application de gel ophtalmique. Les injections pour induire la superovulation seront réalisées en alternant côté droit et gauche de l’abdomen. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale complétée d’une anesthésie locale et d'un traitement pre, per et post-opératoire analgésique adpaté. Après toute procédure invasive un suivi quotidien sera assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être. La fréquence de suivi sera adpatée aux gestes réalisés deux fois par jour le jour de l’intervention, puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement . Suite aux Injections pour superovulation et à la chirurgie : suivi 1x/J pendant 7j avec pesée des animaux tous les deux dès le lendemain de la chirurgie. Selon l’évaluation de l’état de santé des animaux lors de ces suivis, des mesures correctives adaptées seront mises en place pour soulager l'animal (soutien prise hydrique, alimentaire, analgésie)et des critères d'arrêt ont été définis

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne. Par comparaison avec la souris, ce rongeur dirune est de plus grande taille et est enrichie en cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’étude des cônes et de leur implication dans la maladie de Stargardt. De plus, la taille de l’œil de cette espèce augmente pour la probabilité de réaliser une injection intra-oculaire de qualité et reproductible en réduisant le risque de nuisances à l’animal. Selon les étapes du projet, nous utiliserons: soit des animaux à des stades postnataux entre P15 et P20 (15-20 jours après la mise-bas, intervalle validé par nos expériences préliminaires : les cônes se différencient plus tardivement que les bâtonnets, la protéine ABCA4 endogène n’est que peu exprimée à cette période et le virus utilisé pour éditer le gène Abca4 a eu la même efficacité). Il est également important de noter que ce stade précoce correspond à l’âge où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans). Pour les procédures intégrant une manipulation des embryons dans l'oviducte, nous utiliserons des femelles adultes sexuellement mâtures soit à partir de 10 semaines.

Porteuses de deux exemplaires d'une mutation qui provoque un déficit congénital en vitamine B12, une partie des souris de ce projet naît avec des malformations cardiaques, des retards de développement neurologique et une espérance de vie inférieure à six mois. 140 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 20 femelles reproductrices. Les souriceaux subissent à huit jours un tatouage et le prélèvement d'un fragment de queue, puis huit tests comportementaux enchaînés jusqu'à l'âge de trente jours. Le porteur annonce que 60 souris au génotype sans intérêt pour l'étude seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants, toutes les autres étant tuées dans l'établissement.

Objectifs

Une nouvelle maladie liée à la vitamine B12 a été découverte en Europe et aux États-Unis. Elle s’appelle la « pathologie épicobalamine C ». Elle peut causer des problèmes graves chez les nouveau-nés, comme des troubles du cœur, une anémie (manque de globules rouges) et des problèmes neurologiques (liés au cerveau et aux nerfs). Cette maladie est due à un problème causé par un gène voisin de celui impliqué dans l’utilisation de la vitamine B12, c’est donc un effet indirect. Les scientifiques ne savent pas encore exactement pourquoi cela arrive chez l’humain, mais ils pensent que cela pourrait être lié au stress (comme le stress oxydatif). En 2024, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire cette maladie. En 2025, des scientifiques en France ont commencé à élever ces souris pour observer leurs symptômes (comportement, cœur, sang, cerveau, etc.). Les souris porteuses de la maladie sont croisées entre elles pour obtenir des petits avec ou sans la maladie. Certaines souris recevront un traitement pour « réparer » le gène défectueux et voir si leurs symptômes disparaissent. Cette étude, menée en collaboration entre deux établissements utilisateurs situés sur le même campus, aidera à mieux comprendre la maladie et à trouver des solutions pour les humains touchés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont la compréhension du dysfonctionnement provoquée par la mutation et la découverte de cibles thérapeutiques qui permettraient d'améliorer la prise en charge des patients. Les animaux porteurs des 2 exemplaires de la mutation traités avec le médicament devraient retrouver un aspect et un comportement normal, sans altération du métabolisme de la vitamine B12.

Procédures

Une partie des femelles gestantes (5 souris) sera traitée avec un médicament à faible dose administré par ingestion volontaire grâce à un mélange alimentaire avec du lait concentré sucré, très appétissant pour les souris, afin d’induire la recombinaison génique chez les embryons. Cette prise alimentaire du médicament ne durera quelques secondes. Le tatouage et le prélèvement d'un petit bout de queue chez les souris âgées de 8 jours (120 souris) sont réalisés en moins de 2 minutes afin de procéder à l'identification des souris. L’enchainement des 8 tests comportementaux sera réalisé tout au long de la vie des souriceaux dès l’âge de 8 jours et jusqu’à 30 jours, et chaque test ne dure que de 2 à 5 minutes maximum. Ces tests sont basés sur une observation des animaux (66 souris) libres de leur déplacement afin de tester leurs capacités d'apprentissage, de mémorisation, de coordination locomotrice et d'interactions sociales.

Impact sur les animaux

Les souris homozygotes mutants portant l’épimutation étudiée du gène Prdx1 ont un phénotype proche de celles déficientes pour le gène MMACHC, une souche que nous avons déjà étudiée par ailleurs. La conséquence est un déficit congénital en vitamine B12 qui induit des troubles cognitifs, des retards de développement neurologique et des malformations cardiaques, donc une fragilité physique chez les animaux d’intérêt et une espérance de vie à la baisse, inférieure à 6 mois. Par ailleurs, les souris subiront un geste invasif au moment du prélèvement tissulaire d’un fragment distal de queue (

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront utilisés afin de générer un effectif suffisant pour permettre de réaliser l'étude expérimentale qui sera basée sur l'utilisation d'animaux porteurs des deux exemplaires de la mutation. Les souris dites hétérozygotes (un seul exemplaire de la forme mutante et non mutante) issus des différents croisements et présentant un génotype sans intérêt pour l'étude, seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants pour un replacement éventuel. Toutes les autres souris (femelles génitrices, descendants présentant les 2 exemplaires mutants ou non mutants) seront étudiées et mises à mort dans l'établissement utilisateur.

Remplacement

Les études humaines in vitro sur cultures cellulaires ont donné des informations sur les mécanismes moléculaires liant les mutations entre les 2 gènes d'intérêt mais ne permettent d’établir un lien clair entre stress cellulaire et déclenchement ou maintien de ces mutations, ni d’en comprendre les conséquences physiopathologiques. Ainsi, les études nécessitent un modèle in vivo intégrant les dimensions métaboliques, comportementales, inflammatoires et hormonales. A ce jour, aucune approche in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions de manière fonctionnelle et intégrée. Une approche sur animal entier est donc indispensable pour étudier ces mécanismes dans leur globalité

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire aux phases expérimentales suivantes est déterminé à l’aide d'un logiciel spécialisé en tenant compte de différents facteurs afin de déterminer les effectifs nécessaires et suffisants pour obtenir des données statistiques fiables. Les souris mutantes auront un comportement et un métabolisme bien différent des autres, ce qui nous indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe d'étude sera nécessaire. Ainsi, en se basant sur des portées de 6 souris, 5 femelles gestantes traitées avec du tamoxifène devraient suffire pour générer 11 mâles et 11 femelles qui ne devraient plus avoir la mutation grâce au traitement tamoxifène (100% de la portée), tandis que 15 femelles gestantes sans traitement tamoxifène généreront 11 mâles et 11 femelles mutants et 11 mâles et 11 femelles non mutants. Ce protocole expérimental impliquera donc 20 génitrices (5+15) et 120 descendants (30+90).

Raffinement

Les souris sont élevées et manipulées dans un établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifique ayant un statut sanitaire bien contrôlé. Le transport des animaux entre les deux EU se fait à pied car les établissements sont situés sur le même campus, à quelques dizaines de mètres de distance. Les cages sont placées dans des sacs noirs isothermes, et en période de froid (température inférieure à 15°C), deux blocs chauffants sont placés dans le sac afin de maintenir une chaleur suffisante pendant la durée du transport (moins de 5 minutes). Le traitement au tamoxifène sera réalisé grâce à une prise volontaire des souris en diluant ce produit dans du lait concentré. Pendant la gestation les souris seront pesées 2 fois par semaine pour suivre l’augmentation du poids corporel et la bonne santé de l’animal. Chez les descendants, la biopsie d’un fragment de queue sera réalisée selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs, couplée à une anesthésie locale au moment du prélèvement. Les animaux seront ensuite surveillés quelques minutes pour vérifier la reprise d’une activité motrice normale. A l’issue de chaque test comportemental, les souris retournent dans leur cage d’élevage en présence de leurs congénères et sont laissées quelques minutes sous la surveillance de l’expérimentateur afin de contrôler leur bon état de santé (motricité, exploration, interactions). Des points limites ont été fixés en accord avec la structure chargée du bien-être animal afin de garantir la préservation du bien-être animal tout au long du protocole.

Choix des espèces

Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d’une séquence humaine qui n’existe pas chez la souris. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. L’utilisation d’un modèle portant la séquence mutante est indispensable pour reproduire le contexte génétique observé chez l’humain et évaluer ses conséquences physiopathologiques. La lignée utilisée ici a été spécifiquement développée pour reproduire le contexte génétique humain de façon ciblée. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (8 semaines d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les mutations seront recherchées à l'âge de 8 jours, à partir d’un prélèvement de queue , puis sevrés à J21, avec un suivi du comportement à l'âge de 3 jours jusqu'à 30 jours, puis finalement mis à mort à l'issue de ces tests.

Jusqu'à vingt-huit administrations, une par jour pendant vingt-huit jours, et jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie par animal : 3 180 souris, 1 110 rats et 360 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue parce que le sang est prélevé en totalité. Il s'agit de mesurer comment des molécules candidates sont absorbées, distribuées et éliminées, pour fixer la dose et le mode d'administration avant les essais chez l'humain. Le porteur reconnaît que les effets secondaires possibles ne sont ni systématiques ni prévisibles, et cite une mauvaise tolérance locale, des réactions inflammatoires ou des troubles du comportement. Il justifie le choix de ces trois espèces par les recommandations des agences réglementaires, puis par des avantages pratiques qu'il énumère, faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport et de manipulation.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier le devenir de certaines molécules dans l’organisme après leur administration chez le rongeur. Les analyses permettront de mesurer des paramètres clés tels que la vitesse d’élimination, la proportion effectivement absorbée, la durée de présence dans l’organisme et leur répartition dans les différents tissus. Ces données serviront à définir la dose optimale à tester et à ajuster les modalités d’administration pour maximiser l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouvelles molécules se comportent dans l’organisme afin de soutenir le développement de futurs médicaments. Les données recueillies permettront de savoir comment ces substances sont absorbées, distribuées et éliminées, et d’aider à déterminer les doses et modes d’administration les plus adaptés. Ces informations sont essentielles avant de passer à des études d’efficacité ou de tolérance. Réalisées sur des modèles animaux reconnus, ces analyses permettront d’identifier les candidats les plus prometteurs et de réduire les risques d’échec lors d’étapes ultérieures de la recherche, notamment chez l’humain.

Procédures

Une administration unique ou plusieurs administrations (maximum 28 à raison de 1 par jour pendant 28 jours) pourront être réalisées. La durée de chaque administration est inférieure à 1 minute (quelques secondes). Des prélèvements sanguins (de 1 à 5 maximum) seront réalisés sous anesthésie. La durée d'anesthésie pour un prélèvement est d'environ 5 minutes, le prélèvement dure 1 minute.

Impact sur les animaux

S’agissant des nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux, ceux-ci sont liés principalement à la nature des manipulations réalisées. Les administrations répétées, les anesthésies, ainsi que les prélèvements sanguins peuvent engendrer du stress ou une gêne transitoire. Certains effets secondaires potentiels sont également envisageables selon la nature des molécules administrées, bien que leur occurrence ne soit pas systématique ni précisément prévisible. Ces effets peuvent inclure une mauvaise tolérance locale ou systémique, des réactions inflammatoires ou des troubles comportementaux passagers. Toutefois, des mesures rigoureuses d’observation quotidienne, l’application de points limites définis, l’utilisation d’analgésiques compatibles et l’aménagement du milieu d’hébergement visent à réduire autant que possible l’inconfort animal. L’ensemble des procédures est conçu dans un souci constant de raffinement, de réduction du nombre d’animaux utilisés, et d’engagement éthique envers leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination (ADME) d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. De plus, des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe et calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en utilisant des tests statisiques appropriés. L'évaluation pharmacocinétique d'un composé est faite par analyse du sang, du plasma ou des organes à l'aide de techniques analytiques. Ces techniques d'analyse nécessitent des volumes d'échantillons définis souvent faibles. Cependant, pour certains composés, il n'est pas possible de réduire drastiquement les volumes d'échantillons à analyser (molécule avec une faible réponse analytique, doses faibles administrées aux animaux). Les volumes de prélèvement pour l'analyse de ces composés devront être donc plus élevés (prélèvement sanguin total terminal). La réduction du nombre d'animaux pourra donc se faire dans le cas où le volume d'analyse est faible. Dans ce cas, les animaux seront prélevés à différents temps (selon les fréquences et volumes définis dans les procédures) et une analyse en « serial batch » sera appliquée afin d'optimiser les résultats. Cette méthode permet de réduire le nombre d'animaux de 50 à 70 %.

Raffinement

Une évaluation des points finaux sera réalisée quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des zones ayant reçu le traitement topique…) tout en prenant en compte l’enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures pourront être réalisées sous anesthésie générale, avec utilisation de tapis chauffants. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Une analgésie locale pourra être utilisée au site de ponction ou d’injection afin de limiter l'inconfort et/ou le potentiel de souffrance chez les animaux. En cas de signes cliniques avérés de douleur ou d’inconfort persistant, une analgésie systémique (opioïde) pourra être administrée de façon ponctuelle, après évaluation du rapport bénéfice/risque scientifique. Ces mesures relèvent d’une démarche de raffinement visant à réduire au minimum la douleur et la détresse animale, conformément aux principes des 3R et aux exigences réglementaires.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet sont recommandées par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Ces espèces sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre elles et modéré pour l'autre. Chacune reçoit une injection d'un marqueur génétique, soit par une chirurgie intracérébrale d'environ quarante-cinq minutes, soit dans une veine, puis passe un test d'apprentissage moteur sur cylindre en rotation ou un test d'exploration. Le projet ne cherche aucun résultat sur l'apprentissage lui-même, il sert à mettre au point la technique de marquage avant une étude ultérieure. Sur le remplacement, le porteur indique qu'aucune simulation informatique ne permet d'évaluer l'activité du cerveau pendant le comportement et que les structures étudiées sont absentes chez les invertébrés.

Objectifs

Pour comprendre comment le cerveau capture les expériences transitoires et les convertit en changements durables dans les circuits neuronaux, il faut identifier les ensembles spécifiques de neurones responsables du codage de chaque expérience. Cette étude pilote vise à tester une nouvelle méthode d'identification de population neuronales activées lors d'un test d'apprentissage rapide chez la souris, grâce l'injection d'un marqueur de l'activation encodé génétiquement.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote nous permettra de tester et mettre au point une technique de marquage d'activité neuronale efficace dans une tâche d'apprentissage rapide. Ces résultats serviront de base à une étude des mécanismes neuronaux de l'apprentissage rapide, en identifiant les neurones impliqués et manipulant les neurones identifiés, et permettront une réduction du nombre d’animaux nécessaires pour cette étude. De plus, ce travail servira également à tous nos autres projets : en effet, l'identification des ensembles neuronaux activés dans des situations contrôlées est fondamental pour l'étude de la physiologie et pathologies cérébrales

Procédures

Tous les animaux seront soumis à l'injection du marqueur d'activation, sous anesthésie générale. L'injection sera soit intra-cérébrale (chirurgie d'environ 45 minutes), soit intra-veineuse (moins d'une minute). Tous les animaux seront ensuite soumis à un test comportemental non douloureux, soit d'apprentissage moteur (cylindre en rotation, 5 essais de 5 minutes maximum par jour pendant 5 jours), soit d'aprentissage rapide (exploration pendant 10 min par jour pendant 3 jours)

Impact sur les animaux

La chirurgie d'injection intracérébrale sous anesthésie peut engendrer une douleur post-opératoire modérée de courte durée. L'injection intra-veineuse peut causer un saignement léger de courte durée peu douloureux. Les tests de comportements peuvent entrainer un stress léger de courte durée pour l'animal.

Devenir

La mort des animaux est nécessaire pour le prélèvement des cerveaux et l’identification des neurones qui ont été activés pendant la tache comportementale.

Remplacement

Aucune méthode de simulation informatique n'est suffisante pour permettre d'évaluer l'activité du cerveau lors du comportement. Les cultures cellulaires ne permettent pas d'étudier des mécanismes d'apprentissage observés chez l'animal in vivo. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.

Réduction

Cette étude pilote technique vise à diminuer le nombre d'animaux utilisés dans notre projet scientifique en testant et optimisant une nouvelle méthode en amont avant de l'appliquer dans un projet comprenant de multiples groupes et conditions. De plus, ce travail servira également à tous nos autres projets : en effet, l'identification des ensembles neuronaux activés dans des situations contrôlées est fondamental pour l'étude des réseaux neuronaux, que ce soit dans des conditions physiologiques ou pathologiques. Nous utilisons le nombre minimal d'animaux par groupe pour obtenir des résultats exploitables. De plus, la stratégie expérimentale est choisie de manière à minimiser le nombre de groupes, chaque condition supplémentaire étant testée, ou abandonnée, à la lumière des résultats précédents. Le nombre d'animaux indiqué est donc un maximum qui ne sera probablement pas atteint.

Raffinement

Ce projet teste un moyen de raffiner le protocole d'injection pour nos projets futurs en remplaçant une chirurgie cérébrale par une injection intra-veineuse. Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher). Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: période d'acclimatation, anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, suivi post-opératoire quotidien pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation. Le bien-être des animaux est contrôlé tout au long de leur utilisation et des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. L'animal est habitué à la manipulation par l'expérimentateur en amont des expériences pour réduire son stress.

Choix des espèces

Il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différemment chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à la suite du projet. Les animaux sont utilisés à l'âge jeune adulte pour les tests comportementaux. Pour cela, l'injection du système de marquage est effectuée 2 à 4 semaines en amont (à partir de 4 semaines d'âge minimum)

Des rates sont mises en gestation pour fournir des ratons utilisés dès la naissance, puis renvoyées à l'animalerie pour y servir de nouveau : ce sont les 80 seuls animaux du projet à ne pas être tués. 1 580 animaux non-humains sont utilisés en tout, 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Les souris reçoivent un gavage deux fois par semaine pendant seize semaines, une bague posée dans l'oreille au sevrage, des prises de sang à la queue et des mesures de motricité intestinale sous anesthésie pouvant durer trois heures, à l'endoscope ou à la bille. Le porteur numérote quatre tests comportementaux sans en nommer aucun, et affirme qu'aucun effet indésirable des vésicules bactériennes n'est rapporté dans la littérature chez les rongeurs.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde et a pour cause principale le vieillissement. Aucun traitement efficace n’existe pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et entraîne une perte progressive des neurones au niveau du cerveau. Un des signes physiopathologiques majeurs de la MA est l’accumulation dans le cerveau d’un peptide appelé Abeta qui à la longue altère la connectivité des neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives pouvant se manifester de façon très précoce, avant qu’apparaissent les premiers signes cérébraux. De plus, les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Enfin, il a été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du microbiote intestinal ainsi que de la quantité de métabolites produits par ce microbiote. L’inflammation est aussi une composante majeure de la pathologie et a été montrée comme stimulant la production de l’Abeta. Ce projet vise à apporter la preuve de concept qu’une approche thérapeutique utilisant des vésicules extracellulaires (VEs) bactériennes : 1) favorise le développement fonctionnel de l’intestin ; 2) prévient les altérations intestinales et/ou cérébrales chez un modèle murin de vieillissement accéléré évoluant vers une MA, ce qui pourrait ouvrir la voie à des traitements innovants ciblant le système nerveux entérique dans la MA. Les VEs seront produites à partir de bactéries à Gram+ ayant des propriétés anti-inflammatoires connues telles que Propionibacterium freudenreichii, une bactérie propionique laitière utilisée dans l’industrie agroalimentaire, et Faecalibacterium prausnitzii, une bactérie présente naturellement dans le microbiote intestinal. Du fait de leurs rôles ubiquitaires et leur biodisponibilité, les VEs sont perçues comme des acteurs et outils majeurs dans des approches thérapeutiques visant la santé humaine. De plus, des travaux récents montrent des effets bénéfiques de ces VEs dans des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ce qui nous a permis d’émettre l’hypothèse que ces VES pourraient améliorer les fonctions et communications des neurones entériques et de la barrière épithéliale intestinale, baisser ou bloquer la neuro-inflammation intestinale et prévenir de ce fait les altérations des fonctions intestinales observées dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif et digestif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (MA). Le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones et/ou de la paroi intestinale. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale au niveau intestinal pourrait aussi positivement impacter ceux du cerveau. C’est ainsi qu’une étude récente montre qu’une approche de supplémentation en probiotique montre des effets bénéfiques sur l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de MA. Il apparait donc pertinent de penser qu’une approche utilisant des probiotiques non vivants comme les VEs provenant de bactéries ayant des propriétés anti-inflammatoires, aurait des effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l’intestin, mais aussi pourrait contrecarrer les effets délétères de la protéine responsable de la MA. Ainsi, la capacité de VEs d’intérêt à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action dans le développement fonctionnel normal et pathologique de l’intestin reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

1. Elevage des souris transgéniques - pose de la bague d’identification au moment du sevrage bague avec crème analgésique, sur l’oreille de l’animal (20 sec/pose de bague) 2. Étude du développement intestinal - pesée quotidienne (10 sec sur la balance pendant 21/22 jours) - - administration quotidienne de VEs à la pipette (20 sec pendant 21/22 jours)- mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 4h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : - contention + gavage 2 fois/semaine avec les VEs (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure de motricité in vivo (3h max de l’anesthésie au réveil) 3. Étude de vieillissement pathologique évoluant vers des pertes de mémoire caractéristiques de la MA - pesée 2 fois/semaine (10 sec sur la balance, pendant 16 semaines) - contention + gavage 2 fois/semaine (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 2h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : contention + gavage (30 sec) + prélèvement de sang à la queue sur animal vigile (1*30 sec) - test comportemental 1 (5 min à 2 mois et à 6 mois) - test comportemental 2 (10 min à 2 mois et à 6 mois) -- test comportemental 3 (30 min + 10 min + 10 min à 2 mois et à 6 mois) - - test comportemental 4 (10 min + 5 min à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec un endoscope (3h max de l’anesthésie au réveil à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec une bille (30min max de l’anesthésie au réveil à 2, 3, 4, 5 et 6 mois)

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant l’administration de VEs bactériennes chez les murins. La technique du micropipette-guided drug administration devrait permettre de limiter le stress lié à l’administration de vésicules exracellulaires. Le gavage des souris est limité à 2 fois par semaine pour limiter le stress et la douleur liés à au gavage, bien que cet acte soit pratiqué par un personnel entraîné.

Devenir

Mise à mort de tous les ratons et toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour analyser les protéines, l’expression des gènes et les tissus. Les rates gestantes utilisées pour produire les ratons seront réutilisées à l’animalerie.

Remplacement

L’étude des effets bénéfiques de postbiotiques comme les vésicules extracellulaires sur l’intestin dans un contexte physiopathologique nécessite une étude in vivo non seulement des fonctions intestinales, mais aussi des capacités comportementales qui ne peuvent, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier les vésicules extracellulaires d’intérêt parmi plusieurs types de vésicules extracellulaires bactériennes, réduisant de manière significative le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et de réduire le nombre minimum d’animaux par groupe. Pour étudier l’effet des vésicules extracellulaires bactériennes sur le développement intestinal, nous avons réduit au nombre minimum le nombre d’animaux nécessaires pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les rates gestantes seront seules dans leur cage avec de l’enrichissement (frisottis, tubes) leur permettant de déchiqueter, de jouer, se cacher et préparer leur nid. Les ratons seront gardés avec leur mère jusqu’à la fin de l’expérience. Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. L’ensemble des animaux sera également surveillé quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les animaux seront habitués à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

Pour l’étude des effets de vésicules extracellulaires sur le développement fonctionnel de l’intestin en condition physiologique, le raton nouveau-né constitue un bon modèle adapté du fait de la facilité d’administration de composés par la technique d’administration à la pipette à partir de la naissance et la possibilité d’effectuer des études fonctionnelles après le sevrage. Le modèle de souris choisi est un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car c’est un modèle de vieillissement spontané puisqu’il ne présente aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, il se prête bien à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec des vésicules extracellulaires envisagée dans ce projet. Les travaux menés au sein du laboratoire in vitro ont également montré que ce modèle est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la maladie d’Alzheimer. Les souris seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon chronique par gavage jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les rats seront utilisés dès la naissance pour pouvoir évaluer les effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l'intestin et sur la barrière épithéliale intestinale. En effet, la mise en place des mécanismes fonctionnelles de l’intestin telle que la motricité se fait très tôt et une intervention au-delà de cette fenêtre de temps risque de ne pas être efficace.