Procédures légères

Cinq injections sous-cutanées d'un neuropeptide déclenchant la migraine, un jour sur deux, puis des mesures du seuil de douleur à la patte et à la face, une sensation de brûlure provoquée sur la queue, l'implantation d'électrodes sur la cornée et d'une caméra vissée sur le crâne: 3 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique attendre une hypersensibilité sensorielle et une hypersensibilité à la douleur, ainsi qu'un inconfort lié au surpoids de l'endoscope fixé sur la tête. L'objectif déclaré est d'évaluer l'effet analgésique de la lumière verte dans un modèle de migraine, une piste qu'il présente comme non invasive et peu coûteuse. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leur vieillissement au cours de l'expérience.

Objectifs

Il est estimé qu’une personne sur 7 dans le monde souffre de migraine représentant plus de 1 milliard d’individus. La prévalence de la migraine a augmenté de 732,56 millions à 1,16 milliard de cas entre 1990 et 2021. En France, 12 millions de personnes sont concernées. La migraine affecte environ 15 % de la population. Alors que les femmes ont une incidence et prévalence globale plus élevée que les hommes, les hommes présentent une augmentation 4 à 5 fois plus. La migraine est plus courante chez les individus âgés de 20 à 50 ans qui correspond à la population active. Elle représente la 6ème cause de handicap dans le monde. Alors que la lumière bleue peut aggraver ou déclencher la migraine, la lumière verte présenterait un effet bénéfique (analgésique). Dans un contexte de nécessité de développement de nouvelle approches thérapeutiques sans effet secondaire, la thérapie par la lumière apparait comme une option intéressante, non invasive et peu couteuse. L’exposition à des lumière de longueur d’onde spécifique ont déjà montré des effets bénéfiques dans différentes conditions pathologique tels que les cancers, les maladies de peau, les perturbations du sommeil et de l’humeur. Récemment, la thérapie utilisant de la lumière LASER ou de faible intensité a été utilisée dans le cadre de la douleur incluant des douleurs dorsales, fibromyalgies, neuropathique ou migraineuse. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’analgésie induite par une exposition à la lumière verte dans un modèle de migraine et définir la meilleure stratégie d’exposition pour un efficacité optimale. Le projet se déroulera sur 2 EU (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence la capacité de la lumière à moduler la sensibilité à la douleur. L'objectif étant en particulier de mettre en évidence la capacité analgéqiue de la lumière verte qui pourrait alors être évaluer en clinique et apporter une approches compémentaires du traitment de la douleur.

Procédures

injections sous cutanées de neuropeptides une fois par jour tous les 2 jours avec au total 5 injections par animal; durée de l'injection

Impact sur les animaux

hypersensibilité sensorielle; hypersensbilité à la douleur; la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement; Inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids; Normalement le neuropeptide n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaines souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité; Douleur légère (piqûre) lors des injections; Inconfort lié à la présence des vis pour les VEP et de l'endoscope.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait de leur vieillissement au cours de la procédure.

Remplacement

Le projet prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière) et le cerveau, impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.

Réduction

Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux tout au long des procédures, les souris seront surveillées par les personnes compétentes et manipulées tous les jours par l’expérimentateur pour permettre une habituation optimale. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération suite à une anesthésie, elles auront un environnement enrichi avec accès libre à la nourriture et l’eau. Pour les stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), elles sont limitées en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour le test de sensibilité thermique, pour limiter le ressenti d'une sensation de brulure par les animaux, la température est augmentée le plus progressivement possible pour atteindre le seuil le plus précis et limiter cette sensation sans compromettre le test. Après les enregistrements électrorétinographiques, l'oeil est réhydraté. La nourriture est placée dans la cage pour faciliter l'accès en particulier pour les animaux avec l'endoscope et ceux avec les vis pour les enregistrements. Lors de l'implantation des électrodes, les animaux seront placés sous médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) utilisé pour traiter la douleur et l'inflammation, pendant 3 jours (jours de la chirurgie + 2 jours). Avant chaque test les animaux suivront une phase d'habituation. Pour le transport, les animaux seront préalablement habitués aux conditions de transport à savoir placés dans leur cage dans un carton de transport ventillé qui sera soulevé et légèrement manipuler quotidiennement. Les animaux seront placés dans des cages propres la veille du transport et auront des croquettes humidifiées dans la cages. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur ou la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Le choix de travailler chez l'adulte vient du fait que la migraine est plus fréquente chez l'adulte que chez l'enfant. De plus les symptômes et les mécanismes chez l'enfant peuvent être différents. Aussi dans le cadre de ce projet nous nous limiterons à l'étude chez l'adulte.

Sur les 50 animaux en croissance de chaque espèce, 40 partiront à l'abattoir pour caractériser la qualité de la carcasse et entrer dans la consommation humaine, 10 resteront reproducteurs, et 5 truies iront chez des agriculteurs : 55 cochons, 50 chèvres et 50 moutons vont être utilisés, dont 55 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit quatre prises de sang, au début, avant la phase de décontamination, à mi-parcours et à la fin, avec hématome et stress possibles. Le porteur reconnaît qu'aucun entraînement à la prise de sang n'est possible faute de personnel habilité sur cinq fermes, et qu'un lasso nasal sera donc utilisé sur les porcs. Il justifie 10 animaux par ferme par un seuil statistique de 49 individus pour détecter des corrélations élevées, l'objectif étant de mesurer combien de temps la chlordécone met à quitter l'organisme.

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer et mettre en oeuvre avec les agriculteurs et conseillers agricoles une démarche de conception de systèmes innovants agroécologique visant à l'arrêt d'herbicides, par l'utilisation d'animaux de service, gérant l'enherbement des cultures. Le projet vise à quantifier le niveau de contamination des animaux élevés en zone chroldéconée pour proposer des stratégies visant à maintenir l'élevage dans ces zones et produire des denrées alimentaires d'origine animale saines et indemnes de pesticides.

Bénéfices attendus

Les données receuillies permettront de mieux préciser la variabilité de la durée de demi-vie de la molécule dans l'organisme des animaux et ainsi améliorer la précision de la durée de la phase décontamination.

Procédures

prélèvement sanguin lors des pesées: 4 prélèvements (début, avant phase de décontamination, mi-parcours, en fin de décontamination) un prélèvement dure environ moins d'une minute

Impact sur les animaux

La prise de sang peut engendrer une légère douleur au niveau du site de prélèvement. La prise de sang peut également engendrer un hématome. Les différentes manipulations peuvent également générer du stress, notamment la contention liée à la prise de sang pour les porcs.

Devenir

Sur les 50 animaux en croissance par espèce, 40 seront euthanasiés à l'abattoir pour caractériser la qualité de carcasse et entreront dans le circuit de la consommation humaine et 10 animaux seront conservés pour la reproduction. Les 5 truies seront placés chez les agriculteurs.

Remplacement

L'objectif est de caractériser la variabilité de la durée de décontamination des animaux, après paturage en zone chlordéconée. L'utilisation de l'animal est donc nécessaire pour documenter la variabilité individuelle à l'ingestion de matrices contaminées et à la décontamination.

Réduction

L'effectif des différentes espèces (50 animaux par espèce issus de 5 fermes) permettra de caractériser la variabilité intra et inter-ferme de manière robuste et ainsi aider à mieux estimer la durée de la décontamination. Un calcul du nombre d'animaux nécessaires a été réalisé afin d'estimer au plus juste le nombre d'individus à inclure dans le projet. Des collectes de fèces, non invasives et non stressantes seront réalisés, afin de vérifier la corrélation entre les dosages de chlordécone dans les fèces qui pourraient remplacer à terme les dosages sanguins. Avec total de 5 élevages par espèce permet d'avoir intra-élevage, l'effectif minimum pour détecter des corrélations élevées est de 49. Ainsi un total de 50 porcs, 50 moutons et 50 caprins (soit 10 par ferme) constituent l'effectif minimal. Par ailleurs, à l'échelle d'une exploitation, le nombre de 10 animaux permet d'estimer une moyenne et un écart-type plus robuste que le nombre minimal de 3 animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement sont raffinées par des installations prenant en compte l'enrichissement du milieu des animaux. Le personnel assistant les agriculteurs est formé à l'expérimentation animale, aux notions de santé des animaux et aux notions de points limites pour favoriser leur bien-être. L'état de santé et les indicateurs de mal-être seront surveillés chaque jour lors de la distribution des aliments. Les indicateurs de mal-être concerneront l'apparence, les urines et les fèces, l'alimentation et le comportement. Les prises de sang seront réalisées par des personnes compétentes et formées pour réaliser les prélèvements en moins d'une minute entre la contention, le prélèvement, la désinfection et la libération de l'animal. Les animaux prélevés seront observés afin de prévenir d'éventuelles complications. La prise de sang chez les animaux sera réalisée lors de la pesée dans la balance de pesée. Après chaque prélèvement, un renforcement alimentaire sera réalisé en récompensant les animaux avec un morceau de sucre. L'entrainement à la prise de sang n'est pas possible pour les animaux, par conséquent, pour les porcs le lasso nasal sera utilisé. En effet, l'entraînement chez des agriculteurs (5 fermes) et sur 50 animaux par espèce n'est techniquement pas possible avec la taille de l'effectif du personnel habilité à expérimenter.

Choix des espèces

Il s'agit d'évaluer le niveau de chlordécone dans l’organisme des animaux d’élevage à des fins d'obtention d'éléments de réponses pour évaluer en ferme les stratégies de maintien des activités d’élevage en zone chlordéconée. De ce fait, les espèces évaluées font partie des espèces cibles car elles font partie des espèces les plus élevées et pour lesquelles nous disposons des connaissanceses en matière de toxicocinétique de la chlordécone. L'euthanasie des animaux se justifie pour l'évaluation de la qualité de la carcasse et de la viande. -porc : environ de 5 à 8 semaines d’âge en début d’expérimentation et entre 23 et 35 semaines d’âge en fin d’expérimentation. -caprin : environ de 2.5 et 4 mois d’âge en début d’expérimentation et entre 11 et 15 mois en fin d’expérimentation. -ovin : environ de 2.5 et 4 mois en début d’expérimentation et entre 5 et 10 mois en fin d’expérimentation. L'âge des animaux retenu pour ce projet est compatible avec les pratiques courantes d'élevage dans le territoire.

Tuées à la fin de la séance pour servir à l'apprentissage de gestes post mortem, 1 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, dont 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent, en état de veille, jusqu'à deux administrations et un prélèvement sanguin, tentatives infructueuses comprises. Les autres subissent une ovariectomie qui peut occuper deux heures et demie de l'induction de l'anesthésie au réveil complet, les nuisances attendues venant surtout de gestes mal exécutés par les apprenants, avec risque de lésions, d'hématomes, d'infection, de détresse cardio-respiratoire et d'hypothermie. Le porteur précise que ces souris sont des animaux de surplus d'élevage déjà voués à la mort, et que peluches, papier, pièces de boucherie et cadavres de rongeurs servent aux premiers gestes, l'usage d'animaux vivants étant imposé par le ministère pour la partie pratique.

Objectifs

L’objectif du projet est la réalisation des travaux pratiques de formations réglementaires en expérimentation animale, conformément aux attendus législatifs. En effet, la réglementation (Directive européenne 2010/63/UE et Arrêté français du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques) impose à toutes les personnes travaillant avec des animaux utilisés à des fins scientifiques une obligation de formation spécifique : - Une formation initiale destinée aux soigneurs/applicateurs/concepteurs, selon la fonction occupée, dans l’année suivant leur prise de poste - Une formation complémentaire à la chirurgie, dans le cas de la pratique d’actes chirurgicaux Ces formations impliquent une partie d’enseignement pratique, sur rongeurs, permettant aux participants d’apprendre à mettre en oeuvre différents gestes de base, encadrés par des formateurs expérimentés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Au cours des séances de travaux pratiques (d’une durée totale de 4h), les animaux peuvent être soumis soit à quelques techniques d’administration de substances et de prélèvement sanguin réalisées sur animal vigile (formations initiales), soit à une chirurgie réalisée sur animal anesthésié avec analgésie (formation chirurgie). Pour les formations initiales, chaque animal pourra faire l’objet au maximum de 2 administrations et d’un prélèvement sanguin (3 gestes invasifs maximum par animal). Chaque administration/prélèvement sanguin dure au maximum 5 minutes, en comptabilisant la durée des éventuelles tentatives infructueuses, soit 15 minutes maximum pour les 3 gestes par animal. Pour la formation chirurgie, chaque animal pourra faire l’objet d’une unique procédure chirurgicale de stérilisation (ovariectomie), sous anesthésie et avec une analgésie appropriée. Chaque procédure chirurgicale dure au maximum 2h30, du début de l’anesthésie au réveil complet.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles pour les animaux sont principalement le stress ou la douleur pouvant être causés par des gestes incorrectement réalisées par les apprenants. Il y a également un risque de lésions tissulaires, d'hématomes et d'infection pour les gestes invasifs, ainsi que de détresse cardio-respiratoire et hypothermie lors de l'anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des travaux pratiques pour l’apprentissage complémentaire de gestes techniques post-mortem.

Remplacement

Diverses méthodes sont mises en œuvre au cours des formations pour remplacer l’animal. Ainsi, pour les formations initiales, la méthode d’identification par poinçon auriculaire est enseignée sur des morceaux de papier, et des peluches sont utilisées pour les démonstrations et premiers gestes de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. Pour la formation complémentaire à la chirurgie, des substituts synthétiques ou des pièces de boucherie ainsi que des cadavres de rongeurs sont utilisés pour les premiers gestes de suture et chirurgie. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables. Le ministère impose d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour la partie pratique de l’enseignement dans les formations en expérimentation animale. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas totalement envisageable pour ces travaux pratiques.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser 1800 animaux maximum au total sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé à partir d’une estimation du nombre maximum de formations annuelles : 3 sessions de formations initiales et 3 sessions de formation chirurgie, avec un maximum de 30 participants par session. A chaque session, 2 animaux par participant seront utilisés, afin de permettre l’ensemble des apprentissages pratiques. Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus de l’élevage de l’établissement, destinés à l’euthanasie. Si de tels animaux venaient à ne pas être disponibles dans l’établissement, des animaux de réforme d’élevage seront commandés auprès de fournisseurs agréés. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes aux standards réglementaires, avec un enrichissement adapté, eau et alimentation à volonté, et conditions environnementales contrôlées. En termes de raffinement pour les formations initiales, nous limitons au maximum le stress des animaux en amenant les animaux dans la salle au moins 1h avant le début de la séance et en commençant les travaux pratiques par une approche douce : en présentant, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Pour la préhension de l’animal, les méthodes utilisées sont parmi les moins stressantes pour l’animal. Les gestes techniques (administration et prélèvement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Le produit utilisé pour les administrations/injections est du sérum physiologique stérile avec un volume limité. Le volume de sang prélevé est également limité, de même que le nombre de gestes techniques appliqués à chaque animal : chaque animal fait l’objet au maximum de 2 administrations et d’un prélèvement sanguin. Pour la formation à la chirurgie, les souris sont anesthésiées et reçoivent, afin de limiter toute douleur per-opératoire et de raffiner au mieux la technique, un analgésique morphinique dès l’induction de l’anesthésie. Sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Pour éviter toute hypothermie, des tapis chauffants sont utilisés et les techniques enseignées visent à la manipulation atraumatique et aseptique des tissus. L’ensemble de la chirurgie est réalisé de façon aseptique, avec des instruments, des consommables et des gants stériles, après désinfection du site opératoire. Enfin, les encadrants veillent tout au long des séances de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, ils sensibilisent en continu les stagiaires au raffinement des techniques et sont particulièrement attentifs à tout signe de douleur. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant appliquera les points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés pour ces formations sont des souris, car les formations initiales sont spécifiquement destinées aux personnes travaillant avec le groupe d’espèce « rongeurs et lagomorphes » et la souris est l'espèce la plus utilisée à des fins scientifiques. Pour la chirurgie, la formation n’est pas spécifique d’un groupe d’espèce, mais les souris étant les animaux les plus utilisés en recherche, l’enseignement les cible plus particulièrement. Les lignées utilisées sont non transgéniques.Les animaux sont préférentiellement des animaux de réforme de l’établissement (surplus d’élevage voués à l’euthanasie). L’achat d’animaux n’est réalisé qu’en seconde intention en cas de non-disponibilité d’animaux de réforme. Les animaux sont au stade adulte, entre 2 mois et 1 an. Ils ont ainsi les particularités anatomiques représentatives de l’espèce.

Pour comprendre comment l'absence de dystrophine dérègle le calcium dans le muscle, 1 794 poissons zèbres vont être utilisés sur cinq ans, dont 234 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes de 4 mois sont anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour analyse génétique, puis isolés jusqu'à 24 heures derrière un séparateur transparent. Le porteur affirme que ce prélèvement n'entraîne pas de douleur et que la nageoire se reforme en deux semaines, sans dire sur quoi il fonde l'absence de douleur. Les alevins porteurs de la mutation à l'état homozygote sont tués entre 6 et 8 jours pour prélever leurs muscles, les géniteurs à 12 mois quand leur reproduction faiblit, et les surnuméraires issus des croisements annuels le sont aussi.

Objectifs

La contraction du muscle squelettique dépend d’un signal envoyé par un neurone moteur. Ce signal provoque une hausse du calcium dans les cellules musculaires, ce qui déclenche la contraction. Dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique grave, il manque une protéine appelée dystrophine, essentielle au bon fonctionnement des muscles. L’absence de cette protéine perturberait la régulation du calcium, entraînant progressivement la dégradation des fibres musculaires. Des recherches menées chez différents modèles animaux ont montré que les poissons zèbres dépourvus de dystrophine présentent des atteintes musculaires proches de celles observées chez les patients atteints de DMD. Chez ces poissons, les premiers signes de dégradation apparaissent dès 3 jours de vie, et leur survie diminue après 8 jours. Notre projet utilise ce modèle pour étudier la contraction musculaire entre 6 et 8 jours de vie. L’objectif est de mieux comprendre comment l’absence de dystrophine altère la régulation du calcium dans le muscle et provoque la dégénérescence musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment l'absence de dystrophine, une protéine essentielle pour les muscles, perturbe le processus qui permet aux muscles de se contracter. Cela pourrait aider à mieux cerner les problèmes musculaires des personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le poisson zèbre sapje présente des symptômes très similaires à ceux des patients atteints de DMD, et constitue ainsi un modèle fiable pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Les résultats de cette étude pourront contribuer au développement de nouveaux traitements, notamment des médicaments permettant de corriger les perturbations de l’excitation musculaire et la dégénérescence musculaire, afin de traiter cette maladie grave et incurable qui touche environ un garçon sur 3500.

Procédures

Les poissons adultes subiront une procédure pour sélectionner les poissons portant une seule copie mutée du gène de la dystrophine (hétérozygotes), grâce à une analyse de leur ADN. Pour cela, Les poissons âgés de 4 mois sont transférés dans un bac contenant de l’anesthésique qui induit leur perte de conscience en 20-40 secondes. De petits échantillons de nageoires qui serviront à l’analyse ADN sont ensuite prélevées à l'extrémité de la queue : ce prélèvement est rapide (

Impact sur les animaux

- Elevage des poissons hétérozygotes sur 5 ans : aucun effet indésirable dû à la mutation chez les poissons hétérozygotes mais présence d’un stress dû à la capture et la manipulation nécessaire pour anesthésier les poissons et faire le prélèvement d’une petite portion de nageoire - Prélèvement de petits échantillons de nageoire à l’extrémité de la queue - Isolement partiel des individus pendant une période courte (en moyenne 6 h et 24h au maximum) - Pour l'analyse moléculaire de la mutation conduisant à la myopathie: faible perte de mobilité à partir de l’âge de 3 jours et jusqu'à 8 jours (âge maximal des individus utilisé pour l'analyse)

Devenir

La lignée de poissons zèbres est maintenue à l’état hétérozygote pour la mutation du gène de la dystrophine. Les animaux âgés auront une capacité de reproduction affaiblie et peuvent également présenter une dégénérescence liée à l’âge. Ainsi ils seront mis à mort à l'âge de 12 mois. Afin de renouveler la population de géniteurs pour maintenir la lignée sur 5 ans, des accouplements et une analyse du génome des poissons produits seront réalisés tous les ans : les éventuels animaux en excédent seront également mis à mort. Les alevins issus de l’accouplement des hétérozygotes entre eux seront mis à mort entre 6 et 8 jours pour analyser leur génome et à prélever leurs muscles afin d’effectuer l’analyse moléculaire de l’excitation musculaire.

Remplacement

Les alternatives à l’utilisation de l’animal disponibles consisteraient à utiliser des cultures de cellules musculaires. Notre laboratoire a déjà expérimenté sur des cellules musculaires de souris en culture et a constaté que leurs propriétés étaient très immatures, rendant les résultats obtenus peu exploitables et difficilement transposables au muscle humain adulte. La caractérisation détaillée du processus de contraction musculaire ne peut donc se faire que sur des cellules prélevées chez l’animal qui présentent une maturité suffisante.

Réduction

La lignée de poissons sera maintenue sous forme hétérozygote, c’est-à-dire que les animaux porteront la mutation sans être malades. Seul le nombre minimal de reproducteurs nécessaire au maintien de la lignée sera conservé, soit 30 mâles et 30 femelles. Un renouvellement annuel des géniteurs sera effectué. Pour cela, des croisements contrôlés seront réalisés et la descendance sera élevée jusqu’à l’âge de 4 mois. Le nombre total d’alevins produits chaque année est limité à 312 poissons, ce qui correspond au minimum nécessaire pour 1/garantir un équilibre entre mâles et femelles, 2/ assurer la transmission stable de la mutation, et 3/compenser la présence éventuelle de mauvais reproducteurs. À l’âge de 4 mois, un petit fragment de nageoire sera prélevé au niveau de la queue afin d’effectuer une analyse génétique. Le nombre d’animaux prélevés sera strictement limité : les prélèvements seront interrompus dès que le nombre requis de poissons porteurs aura été identifié. Pour l’étude de la fonction musculaire, des croisements entre hétérozygotes seront effectués, produisant une descendance composée de 25 % d’animaux homozygotes mutants, 25 % de type sauvage et 50 % d’hétérozygotes. Les analyses seront menées sur les cellules musculaires de poissons mutants homozygotes et sauvages issus des mêmes croisements, ce qui permet d’éviter la production de poissons contrôles supplémentaires. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude a été calculé statistiquement afin de garantir la puissance nécessaire tout en minimisant le nombre d’animaux, soit 234 poissons âgés de 6 à 8 jours. Enfin, si des résultats concluants sont obtenus avec un nombre d’animaux inférieur, la taille des élevages sera révisée à la baisse.

Raffinement

Le prélèvement de l'extrémité de nageoire des poissons zèbres adultes sera réalisé sous anesthésie générale après 12h de jeûne afin de limiter régurgitation et contamination fécale. Le prélèvement se fera rapidement et sans saignement et concernera la plus petite portion de nageoire possible. A l’issue du prélèvement, le poisson sera transféré dans un bac de « réveil » où il sera surveillé pendant 10 min. Le réveil doit survenir en quelques minutes et si l’activité des branchies ne revient pas rapidement à la normale, une pipette sera utilisée pour aider au passage de l’eau dans les branchies. Le temps de l'analyse génétique, les poissons zèbres seront maintenus isolés en les plaçant 2 par aquarium de part et d’autre d’un séparateur transparent, afin de limiter le stress de l'isolement. Ils seront maintenus ainsi pendant une durée maximale de 24 h. Concernant les alevins comportant la mutation sapje à l’état homozygote, les défauts de motricité restent très faibles avant l'âge de 8 jours. Ainsi, afin de réduire au maximum les atteintes au bien-être tout en s’assurant que les muscles squelettiques soient suffisamment matures pour permettre l’étude de l’excitation des cellules musculaires, tous les alevins seront mis à mort entre 6 et 8 jours. Les alevins seront observés à chaque nourrissage, 4 fois par jour, et tout alevin présentant des signes d’altération du bien-être sera mis à mort. Le nourrissage se fera avec de la poudre de nourrissage très fine qui sera déposée à la surface et qui, une fois dissoute dans l’eau, permettra aux alevins de se nourrir facilement.

Choix des espèces

Nous avons déjà étudié le processus moléculaire de l'excitation dans des cellules musculaires de poisson zèbre sain et celui-ci présente de nombreuses similitudes avec celui du muscle humain. Cette étude préliminaire nous a permis aussi de développer une expertise spécifique à cette espèce et aux cellules musculaires de cette espèce . Par ailleurs, le modèle poisson zèbre, en reproduisant plus fidèlement les symptômes de la dystrophie musculaire de Duchenne en l’absence de la dystrophine, c'est à dire une perte de mobilité progressive, constitue un modèle animal susceptible de fournir des données plus pertinentes que le modèle souris (souris mdx) pour élucider les conséquences de la maladie au niveau de la cellule musculaire. L’entretien de la lignée nécessite des animaux en âge de procréer (agés de 4 à 12 mois) qui seront régulièrement renouvelés grâce à des accouplements réalisées tous les ans. La caractérisation détaillée du processus d’excitation des cellules musculaires sera réalisée sur des cellules obtenues à partir des muscles de poissons de type homozygotes et de type sauvage âgés entre de 6 et 8 jours. A ce stade, les cellules musculaires sont suffisamment matures pour pouvoir étudier de façon fiable le processus de la contraction au niveau cellulaire.

Cinq injections d'un neuropeptide déclencheur de migraine, des filaments appliqués sur la patte et la face pour mesurer le seuil de douleur, une sensation de brûlure induite sur la queue : 3 984 souris vont être utilisées, dont 2 692 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit des vis crâniennes pour l'enregistrement des potentiels évoqués visuels, ou un endoscope fixé sur la tête pour l'imagerie calcique, dont le porteur reconnaît qu'il génère un léger surpoids et de l'inconfort. Le projet cherche à établir si la lumière verte a un effet analgésique, option qu'il présente comme non invasive et peu coûteuse pour les personnes migraineuses. La mise à mort est justifiée par le vieillissement des souris au cours de la procédure, qui interdit de les réutiliser, et des points limites sont annoncés sans être précisés.

Objectifs

Il est estimé qu’une personne sur 7 dans le monde souffre de migraine représentant plus de 1 milliard d’individus. La prévalence de la migraine a augmenté de 732,56 millions à 1,16 milliard de cas entre 1990 et 2021. En France, 12 millions de personnes sont concernées. La migraine affecte environ 15 % de la population. Alors que les femmes ont une incidence et prévalence globale plus élevée que les hommes, les hommes présentent une augmentation 4 à 5 fois plus. La migraine est plus courante chez les individus âgés de 20 à 50 ans qui correspond à la population active. Elle représente la 6ème cause de handicap dans le monde. Alors que la lumière bleue peut aggraver ou déclencher la migraine, la lumière verte présenterait un effet bénéfique (analgésique). Dans un contexte de nécessité de développement de nouvelle approches thérapeutiques sans effet secondaire, la thérapie par la lumière apparait comme une option intéressante, non invasive et peu couteuse. L’exposition à des lumière de longueur d’onde spécifique ont déjà montré des effets bénéfiques dans différentes conditions pathologique tels que les cancers, les maladies de peau, les perturbations du sommeil et de l’humeur. Récemment, la thérapie utilisant de la lumière LASER ou de faible intensité a été utilisée dans le cadre de la douleur incluant des douleurs dorsales, fibromyalgies, neuropathique ou migraineuse. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’analgésie induite par une exposition à la lumière verte dans un modèle de migraine et définir la meilleure stratégie d’exposition pour un efficacité optimale. Le projet se déroulera sur 2 EU (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence la capacité de la lumière à moduler la sensibilité à la douleur. L'objectif étant en particulier de mettre en évidence la capacité analgéqiue de la lumière verte qui pourrait alors être évaluer en clinique et apporter une approches compémentaires du traitment de la douleur.

Procédures

injections sous cutanées de neuropeptides une fois par jour tous les 2 jours avec au total 5 injections par animal; durée de l'injection

Impact sur les animaux

hypersensibilité sensorielle; hypersensbilité à la douleur; la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement; Inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids; Normalement le neuropeptide n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaines souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité; Douleur légère (piqûre) lors des injections; Inconfort lié à la présence des vis pour les VEP et de l'endoscope.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait de leur vieillissement au cours de la procédure.

Remplacement

Le projet prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière) et le cerveau, impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.

Réduction

Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux tout au long des procédures, les souris seront surveillées par les personnes compétentes et manipulées tous les jours par l’expérimentateur pour permettre une habituation optimale. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération suite à une anesthésie, elles auront un environnement enrichi avec accès libre à la nourriture et l’eau. Pour les stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), elles sont limitées en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour le test de sensibilité thermiques, afin de limiter la sensation de brulure ressentie par les animaux, la température est augmentée le plus progressivement possible pour atteindre le seuil le plus précis et limiter cette sensation sans compromettre le test. Après les enregistrements électrorétinographiques, l'oeil est réhydraté. La nourriture est placée dans la cage pour faciliter l'accès en particulier pour les animaux avec l'endoscope et ceux avec les vis pour les enregistrements. Lors de l'implantation des électrodes, les animaux seront placés sous médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) utilisé pour traiter la douleur et l'inflammation. pendant 3 jours (jours de la chirurgie + 2 jours). Avant chaque test les animaux suivront une phase d'habituation. Pour le transport, les animaux seront préalablement habitués aux conditions de transport à savoir placés dans leur cage dans un carton de transport ventillé qui sera soulevé et légèrement manipuler quotidiennement. Les animaux seront placés dans des cages propres la veille du transport. Pendant le transport des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage. Le transport dure 15-20 min. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur ou la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souche est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de la souris permet d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles spécifiques comme c'est la cas dans ce projet. Le choix de travailler chez l'adulte vient du fait que la migraine est plus fréquente chez l'adulte que chez l'enfant. De plus les symptômes et les mécanismes chez l'enfant peuvent être différents. Aussi dans le cadre de ce projet nous nous limiterons à l'étude chez l'adulte. Les injections seront réalisés à l'âge de 8-10 semaines, par conséquent suivant les procédures les animaux seront conditionnés dès l'âge de 6 semaines ou 4 semaines (microendoscopie)

Anesthésiées pour la totalité des procédures, les souris ne reprennent jamais conscience: prélèvement de sang ou accès à un vaisseau pour y placer un dispositif, puis mise à mort immédiate. 253 souris vont être utilisées, 232 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 21 un niveau modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem sur organes. Il s'agit de mesurer l'effet de la carbamylation du collagène sur l'agrégation des plaquettes, le temps de saignement et la thrombose artérielle, à la suite d'une étude déjà menée sur des plaquettes humaines. Le RNT ne nomme ni le dispositif introduit dans le vaisseau ni le modèle de thrombose employé, et le porteur affirme que ce modèle n'a été associé à aucun signe de souffrance chez les animaux traités.

Objectifs

Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, d'ici à 2030, une personne sur six dans le monde aura 60 ans ou plus. Cet allongement de la durée de vie engendre une explosion des maladies chroniques telles que les affections cardiovasculaires. Du point de vue biologique, le vieillissement est le produit de l’accumulation d’un vaste éventail de dommages moléculaires et cellulaires au fil du temps. Au niveau vasculaire, le vieillissement conduit à des modifications des constituants des vaisseaux, dont le collagène. Le collagène voit ses propriétés structurales et fonctionnelles altérées en partie à cause de modifications chimiques appelées réactions de carbamylation. Ces réactions de carbamylation sont amplifiées lors de l'insuffisance rénale chronique, pathologie conduisant à des complications thrombotiques mais aussi hémorragiques qui font intervenir les plaquettes sanguines. Ce projet a donc pour but d'étudier les effets de la carbamylation du collagène sur les fonctions des plaquettes sanguines dans l'hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet d'expérimentation animale permettra de déterminer quels sont les impacts de la carbamylation du collagène et/ou des plaquettes sur l'agrégation plaquettaire, l'hémostase et la thrombose artérielle grâce à l'utilisation de modèles animaux parfaitement maîtrisés par le laboratoire porteur du projet. En d'autres termes, les résultats de ce projet permettront de déterminer si la carbamylation du collagène, qui survient au cours du vieillissement, constitue un facteur de risque d'évènements cardiovasculaires (thrombose, hémorragie) chez les patients insuffisants rénaux, dont le taux de mortalité dû aux maladies cardiovasculaires chez les personnes dialysées est de 10 à 30 fois plus élevé que dans la population générale. L'objectif etant de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques au cours du viellisssement.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour à la conscience. Trois types de procédures de courte durée (10 à 60 minutes maximum) seront menées. Elles incluront des manipulations limitées visant soit à obtenir un prélèvement sanguin, soit à permettre l’accès transitoire à un vaisseau sanguin pour la mise en place d’un dispositif exploratoire, avant euthanasie immédiate.

Impact sur les animaux

Durant l’anesthésie, une surveillance attentive sera assurée afin de détecter tout signe suggérant une dégradation irréversible de l’état général. En cas d’apparition d’un critère indiquant une souffrance ou une détresse non contrôlable, l’animal sera immédiatement euthanasié. La profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée afin de garantir l’absence de perception de douleur ou d’inconfort pendant toute la durée des procédures. En cas de signe de réveil, l’anesthésie sera ajustée afin de maintenir une sédation adéquate jusqu’à la fin de l’expérience. Des mesures seront prises pour prévenir l’hypothermie et assurer un confort optimal pendant l’anesthésie. Enfin, le modèle utilisé a déjà été validé dans des travaux antérieurs et n’a pas été associé à l’apparition de signes de souffrance ou d’effets indésirables chez les animaux traités.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale pour analyses post-mortem sur organes.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d'une étude réalisée ex vivo à partir de plaquettes humaines ayant montré que la carbamylation du collagène modifie l'adhérence des plaquettes. Ce projet vise donc à valider les effets de la carbamylation dans les processus d'hémostase et/ou de thrombose in vivo chez la souris. La formation de thrombose artérielle est un phénomène complexe, multifactoriel, multicellulaire, qui nécessite l'utilisation de modèles intégrés. Par ailleurs, aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer l'effet d'une substance sur le prolongement du temps de saignement. Des mesures d'agrégation plaquettaire et du temps de thrombose artérielle seront également réalisés.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 253. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Les souris sont anesthésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons scientifiques, pratiques et éthiques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris mâles seront agées entre 8 à 20 semaines correspondant à des souris adultes dont les parramètres hémostatiques et vasculaires sont biens définis.