Procédures légères

436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune recevant dix à vingt administrations orales sur deux à quatre semaines. Une partie subit une chirurgie qui prive le rein de circulation sanguine, d'autres reçoivent des molécules toxiques pour les reins, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer une dénutrition, une prostration et une altération de l'état général. La mesure de la fonction rénale impose deux anesthésies à deux heures d'intervalle, l'une pour fixer un capteur sur le dos de l'animal, l'autre pour le retirer, et l'opération se répète plusieurs jours différents sur la même souris. Le bénéfice annoncé, des thérapies ciblant les cellules rénales lésées plutôt que le système immunitaire dans son ensemble, reste à l'état de projet, quand l'insuffisance rénale, elle, est bien induite chez les 436 souris.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Le rein est constitué d'unités fonctionnelles de filtration, appelées néphron. Le néphron comprend deux compartiments : le glomérule et le tubule. Nous avons mis en évidence que la voie de signalisation d’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) est activée dans les tubules et les glomérules de patients atteints de maladies rénales. Afin de caractériser le rôle de cette voie dans les maladies du glomérule, nous avons étudié les conséquences de la suppression d’un gène impliqué dans la signalisation de l’interleukine, dans cette structure rénale. Nous avons ainsi montré que ce gène favorise la survie des glomérules lors d'une agression rénale chez la souris, permettant ainsi de réduire les conséquences néfastes de cette agression. Nous devons maintenant caractériser son rôle dans les tubules, ce qui représente le premier objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de la suppression du gène d’intérêt dans les tubules rénaux sur le développement d'une maladie rénale chez la souris. Afin de confirmer que l'activation de la voie de l'interleukine est bénéfique dans le contexte des maladies rénales, nous avons utilisé une molécule qui active sa voie de signalisation. Comme nous l'espérions, cette molécule a réduit les conséquences d'une agression glomérulaire chez la souris. Nous devons maintenant montrer si ce rôle protecteur est médié ou non par le gène d’intérêt. C'est le deuxième objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de l'administration de la molécule dans le développement d'une maladie rénale chez des souris produisant ou non le gène d’intérêt dans les glomérules ou les tubules.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie des cellules rénales conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie aigüe vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Administrations par voie orale ou injections : L’agent utilisé pour induire la modification génétique des souris sera administré par voie orale (pendant deux à quatre semaines, soit 10 ou 20 fois) à l’état vigile. L’administration orale dure 30 secondes. La molécule à tester sera injectée deux fois, diluée dans une solution non irritante. Cette injection est réalisée à l’état vigile. Pour l’induction des modèles expérimentaux, les animaux recevront une injection sous anesthésie gazeuse ou deux injections à l'état vigile. Chaque injection dure 30 secondes environ. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux au moment de l’euthanasie, sous anesthésie, sur un plateau chauffant ; durée entre 5 et 10 minutes. (3) Pesées : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (4) Mesure de la fonction rénale : une partie des souris du projet sera soumise à la mesure de la fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (2) Administrations par voie orale : Elles peuvent occasionner du stress, de l’inconfort, l’irritation de la gorge et des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes qui se traduire par un animal qui se met à gasper. Le composé administré peut entrainer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : une de ces molécules peut entrainer une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (436) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de six ou dix animaux (mâles et femelles sauf pour un modèle) sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 436 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes , de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour l’administration par voie orale : Ella aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables souples et plus ergonomiques. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Une pesée régulière permet de surveiller les points limites. (3) Raffinement injections : Toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Les volumes d'injection sont adaptés. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie : Les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments chirurgicaux sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Pour inactiver le gène d'intérêt, le composé est administré aux souris à l’âge de 5 semaines pour ne pas avoir des animaux trop vieux ensuite. Pour le reste des procédures, les souris seront âgées entre 9 et 11 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

Quatorze jours seule en cage pour mesurer son activité sur roue, quarante heures en chambre métabolique : 150 souris hypermusclées, privées de myostatine, et leurs frères et sœurs témoins subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 54 mâles sont mis en présence d'un congénère pendant un quart d'heure pour mesurer leur agressivité, avec des combats possibles, et 48 autres passent des tests d'anxiété, un jeûne de dix heures et une prise de sang. Le porteur déclare 78 souris replacées en élevage après les tests non invasifs, mais annonce aussi 96 mises à mort en fin d'expérimentation, deux comptes impossibles à concilier sur 150 animaux. Il explique avoir observé "fortuitement" une agressivité accrue chez ces souris et cherche à la relier à la ghréline, l'hormone de la faim.

Objectifs

Pour subvenir à ses besoins de manière discontinue, l’être humain organise sa prise alimentaire en une série d’événements périodiques répartis en trois phases : pré-ingestive, ingestive et post-ingestive. Chaque phase est associée à des sensations alimentaires physiologiques (faim et appétit, rassasiement et satiété) qui permettent de réguler la prise alimentaire. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. La ghréline est une hormone qui contrôle la prise alimentaire. La myostatine contrôle le développement musculaire. Les deux hormones peuvent avoir un rôle dans le comportement en particulier l’agressivité. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. Notre projet a pour but d’étudier le comportement d’activité motrice et d’agressivité d’une lignée de souris hyper musclées, dépourvues de myostatine, et d’établir s’il y a un lien avec l’hormone de satiété Ghreline.

Bénéfices attendus

Plusieurs maladies humaines se traduisent par des modifications de la prise alimentaire et de l’activité motrice spontanée (ex : anorexie). Le comportement relationnel est aussi souvent altéré chez les patients. L’observation fortuite d’une agressivité plus importantes chez les animaux dont la myostatine est inactivée, nous a conduit à rechercher s’il pouvait y avoir un lien entre la ghréline, la myostatine et les enzymes qui modifient la ghréline. Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes pouvant être impliqués dans des pathologies humaines impactant le comportement alimentaire et moteur.

Procédures

48 animaux vigiles seront maintenus en contention lors de la mesure de composition corporelle (moins de 2min, 5 fois). Ils seront individualisés pour l’évaluation de l’activité spontannée sur roue et du métabolisme repiratoire (2 semaines et 40h). 48 autres animaux subiront des tests de comportement permettant d'évaluer leur anxiété (2 tests de 10 min) puis une mise à jeun de 10h et un prélèvement d'une goutte de sang lors de la mesure de glycémie (3 secondes). 54 mâles réaliseront un test de mise en présence avec un congénère pendant moins de 15 minutes pour évaluer leur comportement social. Enfin, au total, 96 animaux auront une contention et une injection d’anesthésique en fin d’expérimentation (moins de 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les tests de comportements, les pesées, les mesures de composition corporelle et l’individualisation de certains animaux peuvent induire du stress. Les expériences de mise en présence de congénères de courte durée (15 minutes maximum) pourront induire un stress plus élevé et entrainer des combats si les animaux sont agressifs. Nous observerons en continu les animaux et appliquerons des points limites pour arrêter le test en cas de blessure. L’évaluation du métabolisme respiratoire, du comportement d’agressivité et de l’activité spontanée nécessitent l’individualisation des animaux (respectivement 40h, 10 jours et 14 jours). Ils garderont cependant le contact visuel et olfactif pour les durées les plus longues. Les animaux pourront présenter une légère perte de poids lors de la mise à jeun de 10 heures. En fin d’expérimentation les animaux ressentiront une légère douleur lors de la mesure de glycémie et lors de l’injection de l’anesthésique.

Devenir

Pour les procédures non invasives d’évaluation du comportement, 78 animaux seront ensuite replacés en élevage. Pour 96 animaux, nous réaliserons des euthanasies en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyse moléculaires et histologiques sur différents tissus de façon à pourvoir vérifier notre hypothèse.

Remplacement

L’étude du rôle d'hormones sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, système endocrinien, flore intestinale). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (système digestif producteur de ghréline, muscle, cerveau), contexte qu’il n’est pas possible de recréer sans étude in vivo. Des variables sur l’organisme entier seront ainsi mesurées (poids corporel, composition corporelle, concentration d’hormone, comportement…).

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre minimum nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Les calculs ont été effectués avec un logiciel spécialisé. Lors de la production des lots expérimentaux nous utiliserons les individus porteurs de la mutation d'intérêt et comme contrôles, les individus non mutés frères et sœurs. Les 78 animaux utilisés pour l'évaluation du comportement et de l’activité spontanée ne seront pas euthanasiés et retourneront en élevage après les tests.

Raffinement

Pour nos expérimentations, nous avons fixé des points limites basés sur la bibliographie et nous ferons un premier essai de mise au point pour les préciser. Pour habituer les animaux au passage dans le tube d’analyse de composition corporelle, nous mettrons dans les cages un tunnel de plexi rouge. Celui-ci servira à la fois d’enrichissement et de tunnel de transport des animaux. Ce paramètre est particulièrement important lors des tests d’évaluation du comportement des animaux. Ce tunnel sera aussi utilisé lors du change pour le transfert des animaux. Pour l’évaluation de l’activité spontanée, nous avons développé des cages qui permettent d’héberger deux roues d’activités. Les animaux sont alors simplement séparés par une grille qui permet de garder le contact social. Comme développé pour chacun de nos protocoles expérimentaux, nous allons porter une attention particulière au bien-être de nos animaux. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (apathie, vocalise, mobilité, alimentation…). Le report hebdomadaire des poids corporels sera un paramètre intégré à nos protocoles. Lors de l'anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter le risque de refroidissement.

Choix des espèces

L’étude du rôle de la myostatine sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, musculaire digestifs). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins génétiquement modifiés car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (muscle, cerveau, tube digestif, glandes surrénales). Ce projet est en continuité avec les nombreuses études déjà réalisées sur les souris dont le gène de la myostatine est inactivé. Les procédures concerneront des animaux âgés de 12 à 16 semaines (jeunes adultes). Nous utilisons des souris à l’âge adulte, âge auquel l'hypermusculation des souris myostatine est acquis.

Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.

Procédures

Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.

Remplacement

Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.

Une chirurgie du cerveau de vingt à trente minutes, ou une injection intraveineuse, puis deux semaines de tests comportementaux. 2 256 souris vont être utilisées, dont 1 278 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne survivant au projet. Le porteur écrit que les souris modèles de la maladie de Huntington ne montrent aucun signe de détresse en dehors des tests et qu'elles n'ont "pas besoin de traitement ou d'attention particulière", et ramène l'ouverture du crâne à une "légère douleur avec perte légère de poids". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus cérébraux, seule voie déclarée pour comprendre les mécanismes du traitement testé.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires) puis inexorablement à leur décès. Lors de la maladie il y a un défaut de transport d'un facteur nécessaire à la survie des neurones. Il est démontré par des études au niveau cellulaire qu'il y a différents régulateurs de ce transport qui pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques. Il est maintenant crucial d'étudier le rôle de ces régulateurs dans un modèle animal, afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

Le déficit de transport d'un facteur essentiel à la survie des neurones est à la base de la dégénérescence des structures du cerveau lors de la maladie de Huntington qui touche 300000 personnes dans le monde. Ce projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soulager les patients.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection intra-veineuse de 5 minutes par souris. Des études comportementales de 2 semaines.

Impact sur les animaux

1) Des souris contrôle et des souris modèle de la maladie de Huntington seront utilisées. Chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales. En revanche, en dehors des tests comportementaux, ces souris ne montrent aucun signe de détresse correspondant à des points limites et n'ont pas besoin de traitement ou d'attention particulière. 2) Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à l'injection intra-veineuse n'a pu être observé. 3) Pour les individus qui vont subir une chirurgie du cerveau, cela peut générer une légère douleur avec perte légère de poids.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Le projet traitant de problèmes fonctionnels du cerveau, il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle de simulation informatique. Il a été précédemment démontré sur un modèle cellulaire qu'il y a des régulateurs du transport d'un facteur nécessaire à la survie du cerveau, la seconde étape consiste donc à démontrer le rôle de ces régulateurs et leur effet sur la survie du cerveau, dans des conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Il est donc crucial de passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de reproduire les mécanismes de déclenchement des traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

Pour cette procédure, le nombre d'animaux est réduit au maximum. Ces effectifs ont été calculées à l'aide de tests statistiques afin de pouvoir réaliser des analyses avec une puissance suffisante.

Raffinement

Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place surtout après la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à des grilles codifiant le niveau de bien-être. Cela permettra une intervention immédiate et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent d'étudier la régulation du transport du facteur de survie des neurones dans les conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Les animaux seront tous en stade postnatal. Des études comportementales seront faites au stade prépuberté et si aucun effet n'est observé on gardera les souris jusqu'au stade adulte où il y aura progression des mécanismes de la maladie.

2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée quotidiennement pendant deux semaines et soumise à trois tests portant sur la mémoire, l'anxiété et la sociabilité. Les procédures impliquent des niveaux de souffrance légers à modérés. Le modèle repose sur une consommation d'alcool laissée au choix des souris, ce qui, écrit le porteur, augmente le stress et l'agressivité entre elles, et l'étude mesure ensuite si un régime enrichi en oméga-3 limite les effets du sevrage. Les géniteurs, gardés le temps de produire les cohortes, sont mis à mort à la fin des reproductions, et le bénéfice annoncé, une modification des pratiques cliniques pour les 23 millions d'Européens dépendants, est renvoyé à des travaux ultérieurs de partenaires cliniciens.

Objectifs

L'Europe est la région du monde où la consommation d'alcool est la plus élevée, avec environ 23 millions d'Européens dépendants à l'alcool. Cette dépendance constitue un trouble psychiatrique fréquent, pour lequel les traitements restent largement insuffisants. Pour combattre efficacement ce fléau, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie liée à la consommation d'alcool. En effet, le niveau de consommation d’alcool est un mauvais prédicteur du risque individuel à développer des atteintes graves. Par exemple, le risque de développer une cirrhose du foie chez les grands buveurs varie considérablement et ce indépendamment de la quantité d'alcool consommée. Cela reflète une grande variabilité dans les réponses individuelles à la consommation d'alcool au sein de la population. Cette vulnérabilité se manifeste particulièrement lors de la phase de sevrage chez les patients atteints de troubles liés à la consommation d'alcool (TCA). Elle se caractérise par une présence accrue de facteurs inflammatoires associés à une aggravation des lésions cérébrales, une rigidité cognitive accrue et un besoin compulsif de consommer de l'alcool. Ce projet cherche à comprendre pourquoi certaines personnes sont plus vulnérables aux effets de l’alcool que d’autres. Nous pensons que cette différence est liée aux interactions entre le système immunitaire, et le cerveau. L’objectif est d’analyser l’inflammation dans le cerveau et le reste du corps lors du sevrage et de voir si les oméga-3, connus pour leurs effets anti-inflammatoires, peuvent améliroer les effets du sevrage et réduire le risque de rechute. Pour cela, nous testerons ces effets sur des souris modèles de dépendance à l’alcool.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier les facteurs de vulnérabilité associés à la rechute après une période d’abstinence dans les troubles liés à la consommation d'alcool. De plus, il a pour objectif de déterminer si les oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) peuvent limiter les risques de rechute chez les patients alcooliques. En l’occurrence il apportera des données objectivées quant à la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans les effets neuroprotecteurs des oméga-3, ce qui est nécessaire pour informer les professionnels de santé et modifier les pratiques cliniques. Ainsi, les oméga-3 pourraient être utilisés chez les patients en stratégie add-on (prévention primaire et secondaire) en association avec l’abstinence pour améliorer la résilience chez les patients. Nos partenaires cliniciens du projet mettront en œuvre les approches en s'appuyant sur nos résultats précliniques. Ainsi notre projet a une forte valeur translationnelle et de transfert de connaissances vers l'homme en plus de générer des nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la vulnérabilité à la rechute après sevrage à l'alcool, qui concerne prêt de 60% des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage gastrique quotidien pendant 2 semaines. Le gavage gastrique est très rapide, il ne dure que quelques secondes. Une collecte de sang sera réalisée au début et à la fin de la période d’abstinence. La collecte de sang est très rapide, pas plus d'une minute. Les tests comportementaux seront réalisés à l'âge adulte pendant quelques minutes, avec 3 tests par animal. Le but de ces tests comportementaux est de regarder l'impact sur la mémoire, l'anxiété, et la sociabilité. Les animaux seront pesés une fois par semaine, pendant la procédure, cela dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le modèle de choix de consommation d'alcool présente un risque d'augmentation de stress et d'agressivité sur les animaux, cependant aucune mortalité n'est documentée sur ce modèle. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes utilisés n'ont pas d'effets délétères sur la santé générale des animaux et ne sont pas toxiques. La contention et le gavage durent quelques secondes et engendre un stress léger sur les animaux, sans altération de leur état général.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les structures et /ou cellules nécessaires du cerveau et du corps pour réaliser les analyses post-mortem dans le cadre des questions scientifiques posées dans le projet. Les géniteurs sont conservés pour permettre de générer les cohortes. A la fin des reproductions, les géniteurs seront mis à mort.

Remplacement

L’étude du rôle de la neuroinflammation, et de l'axe intestin-cerveau dans l'hétérogénéité des troubles de consommation d'alcool nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et le rôle des oméga-3 dans les troubles de consommation d'alcool, pour ainsi mettre en place des approches nutritionnelles comme traitements préventifs pour améliorer la réussite du sevrage. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de consommation d'alcool reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures cérébrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris et les transgéniques sont nécessaire par groupe pour générer des données robustes statistiquement par groupe.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement dans leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ces données sur l'effet des oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) sur le cerveau et la neuroinflammation chez la souris permettra d’affiner les données existantes en les croisant avec les nouvelles données générées. Par ailleurs, les cellules immunitaires du cerveau de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui conduit à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat, car notre laboratoire dispose de nombreuses lignées transgéniques, ce qui n’est pas le cas chez le rat. Ce choix s'inscrit dans une démarche de réduction d'animaux. L’utilisation des souris transgéniques est essentielle pour comprendre précisément le rôle des oméga-3 dans ces cellules cérébrales. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, âge correspond à l’âge adulte chez l’homme, moment auquel débutera la consommation d’alcool. Les tests comportementaux débuteront ensuite sur des animaux âgés de 16 semaines. À partir de 21 jours, les souris transgéniques recevront un régime enrichi en oméga-3, correspondant à la période de sevrage où elles commencent à s’alimenter de manière autonome.