Procédures légères

Pour tester si des cellules de rétine humaine cultivées in vitro peuvent restaurer la vue, 515 rats immunodéficients, atteints d'une dégénérescence rétinienne qui, dans la lignée décrite, les rend aveugles vers trois mois, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les 240 rats transplantés reçoivent ces cellules sous la rétine à 22 jours, sous anesthésie, passent un test d'acuité visuelle de 20 minutes la veille puis jusqu'à trois fois après la greffe, et sont, à la fin de l'étude, opérés sans réveil et tués pour l'analyse de leurs yeux et de leur cerveau. Le porteur associe ce test, dont la méthode n'est pas précisée, à du stress et à une photophobie. 265 rats sont déclarés réutilisés, et le porteur indique que les rats "surnuméraires" seront proposés à d'autres projets. Il annonce des points limites "gradés" qui "conduiront sans délai à un arrêt de la souffrance", sans dire en quoi consiste cet arrêt.

Objectifs

Chez l'Homme, la thérapie cellulaire et l’utilisation des cellules souches est une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de nombreuses maladies dégénératives telles que les dystrophies rétiniennes. À l’heure actuelle, la majorité des essais cliniques ont mis en évidence la faisabilité et l’innocuité de l’utilisation des cellules souches. Malgré des résultats encourageants, ces approches doivent être améliorées afin d’optimiser la récupération de l’acuité visuelle. Le but de ce projet est d'améliorer les conditions de thérapies cellulaires en testant différents types de cellules dans plusieurs modèles de rat présentant spontanément une dégénérescence rétinienne. Après transplantation rétinienne chez le rat de cellules de la rétine humaine obtenues par culture in vitro à partir de sujets sains (sans pathologie oculaire), nous étudierons à différents temps après transplantation l'intégration et la survie des cellules transplantées et nous mesurerons l'acuité visuelle des rats.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont d'évaluer les effets de la transplantation (innocuité, intégration et maintien de l’acuité visuelle) de différentes populations rétiniennes dans plusieurs modèles de rat présentant spontanément une cécité. A long terme, ce projet permettra d'améliorer les thérapies cellulaires des pathologies rétiniennes dégénératives chez l'Homme. En effet, le développement de l’utilisation des cellules souches est une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de nombreuses maladies dégénératives.

Procédures

Les animaux seront transplantés sous anesthésie (durée de l'anesthésie : 30 minutes). L'acuité visuelle sera mesurée sur les animaux vigiles la veille de la transplantation et en fonction des groupes d'animaux, à une, deux ou trois reprises supplémentaire plusieurs semaines après transplantation. Le test d'acuité visuelle dure 20 minutes par animal, sans intervention directe de l’expérimentateur. A la fin de l'étude, une chirurgie (sous anesthésie) sans réveil sera réalisée pour des prélèvements.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : stress et photophobie des animaux lors des tests comportementaux lié au changement d’environnement (durée courte de 1 à 5 minutes).

Devenir

Les 240 animaux transplantés seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à coupler les résultats de mesure de l'acuité visuelle à des analyses moléculaires des yeux et des cerveaux. Les nimaux surnuméraires seront proposées à la communauté pour d'autres projets.

Remplacement

En amont de ce projet, nous avons développé et caractérisé des cellules rétiniennes in vitro. Ces cellules sont vouées à restaurer l'acuité visuelle grâce à la thérapie cellulaire. Ainsi, il nous est indispensable d'avoir accès à un modèle animal modélisant les dystrophies rétiniennes, nous permettant d'apprécier les bénéfices amenés par la transplantation

Réduction

Afin de diminuer le nombre d’animaux, nous procéderons par étape : les résultats de la première étape conditionneront la réalisation de l'étape suivante. De plus, les croisements seront faits au besoin et non pas en continu. Ainsi le nombre d'animaux indiqués ne sera pas nécessairement utilisé. La réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation a été calculé en s’assurant d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour garantir la qualité statistique des données et ainsi empêcher la reproduction de ces expérimentations.

Raffinement

Les méthodes expérimentales utilisées dans cette étude sont validées, reproductibles et classiquement retrouvées en laboratoire. Différents dispositifs seront mis en place afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Les animaux seront observés tous les jours afin de mettre en évidence des signes de détresse. Ainsi, des points limites gradés ont été prévus et conduiront sans délai à un arrêt de la souffrance. La transplantation sera réalisée sous ansthésie et sous couverture antalgique. Par ailleurs, les animaux utilisés sont immunodéficients afin qu'il n'y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. Pour éviter que ces animaux ne développent des infections, ils sont hébergés dans des conditions sanitaires strictes. De plus, le test comportemental utilisé dans ce projet, ne nécessite pas d’intervention directe de l’expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est largement décrit dans de nombreuses études précliniques des pathologies rétiniennes. La cécité débute vers 18 jours et est totale environ 3 mois après la naissance. Par ces caractéristiques, l’utilisation d’une telle espèce animale est pertinente et justifiée pour tester la capacité des transplantations sous rétiniennes sur la restauration visuelle. Dans cette étude, nous souhaitons réaliser des transplantations à 22 jours post-natal, période précoce de la dégénérescence, qui est représentatif de la fenêtre temporelle qui serait utilisée dans le cas d’une transplantation chez l’Homme (phase précoce et diagnostique de la maladie).

Soumis à des stimulations thermiques, tactiles ou chimiques poursuivies jusqu'à ce qu'ils retirent le membre stimulé, 7 500 rats, 4 500 souris et 200 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit en plus une chirurgie de trente à soixante minutes pour la pose d'un cathéter, ou une opération destinée à produire une douleur postopératoire mesurable. Il s'agit d'évaluer deux à huit candidats médicaments par an, le choix de l'espèce dépendant du produit testé. 300 souris, 500 rats et 20 cochons d'Inde seront gardés en vie pour être réutilisés, à condition de n'avoir reçu aucun traitement aux effets inconnus et de n'avoir subi aucun prélèvement de structures nerveuses.

Objectifs

La douleur aiguë est un signal d’alarme essentiel pour l’organisme, permettant de détecter et de répondre rapidement à des stimuli potentiellement nocifs. Ce processus repose sur la nociception, qui est définie comme la détection et la transmission des signaux liés à des stimuli nocifs par les récepteurs sensoriels périphériques (nocicepteurs) jusqu’au système nerveux central. Contrairement à la douleur, qui inclut une dimension sensorielle et émotionnelle subjective, la nociception correspond strictement au mécanisme physiologique de détection de ces stimuli. Les nocicepteurs peuvent répondre à 3 types de stimuli : tactiles, thermiques, ou chimiques. Dans le cadre du développement préclinique de nouveaux traitements, il est crucial d’évaluer les candidats médicaments pour leurs effets à la fois sur la douleur aiguë et sur les mécanismes de nociception. Les modèles animaux jouent un rôle fondamental dans cette démarche en offrant un cadre contrôlé pour étudier les réponses nociceptives, notamment chez des animaux naïfs (non exposés à des expériences douloureuses antérieures) afin de garantir une réponse non biaisée. Ces modèles permettent d'une part de réaliser l'évaluation préliminaire de substances à potentiel analgésique, et d'autre part d’examiner les effets anti-nociceptifs des composés, en explorant leur potentiel à moduler les voies physiologiques impliquées dans la transmission et la perception des signaux nocifs. Les objectifs de ce projet sont donc 1/ de définir les effets des candidats médicaments sur la nociception dans des modèles animaux de douleur aiguë, 2/ d'étudier la capacité des molécules à moduler les voies nociceptives centrales et périphériques, en mesurant des paramètres tels que la latence de réponse aux stimuli et 3/ d'identifier les candidats les plus prometteurs pour une évaluation dans des modèles de douleur plus translationnels, en amont d'une transition clinique.

Bénéfices attendus

L’évaluation des effets des candidats sur la nociception offre une opportunité d’approfondir les connaissances sur les voies centrales et périphériques impliquées dans la douleur aiguë. Ces informations peuvent orienter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ou aider à repositionner des molécules existantes. De plus, en identifiant les candidats médicaments ayant un fort potentiel anti-nociceptif, ce projet permettra sélectionner les molécules les plus prometteuses pour les essais précliniques et cliniques. Cela contribue à une meilleure allocation des ressources et à une progression plus rapide des projets de recherche et développement. Enfin, les douleurs aiguës sévères restent souvent mal prises en charge avec les thérapies actuelles, en raison de leur efficacité limitée ou de leurs effets secondaires importants. Ce projet vise à répondre à ces lacunes en identifiant des solutions thérapeutiques innovantes et adaptées aux patients dans ce cadre particulier. En fonction des espèces et des procédures, il est prévu d'étudier de 2 à 8 nouveaux traitements par an dans ce projet.

Procédures

Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée. L'administration est majoritairement unique dans ce type de tests. Elle pourra être chronique dans certains cas précis (en général 1 fois par jour, pendant 1 à 2 semaines en fonction de la spécificité du traitement). En cas de nécessité d'implanter un cathéter, la chirurgie dure environ 30 à 60 minutes. Les tests de stimulation thermique ou tactile incluront l'injection du composé suivie de l'évaluation des animaux dans maximum deux tests de douleur évoquée à 4 temps (de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes par test). Lorsqu'une chirurgie sera nécessaire pour l'injection d'un composé, les animaux seront évalués dans maximum deux tests à 2 temps. Dans le cas de la stimulation chimique, l'induction sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie). Les animaux seront évalués dans maximum deux tests de douleur évoquée à deux temps. Dans le cas du modèle de douleur post-opératoire, les animaux seront soumis à une courte phase de chirurgie (de l'ordre de 10 minutes, sous anesthésie). Les animaux seront évalués dans maximum trois tests de douleur évoquée à trois temps. Pour chacune des procédures, le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de 5 à 15 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 1 par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Les tests de douleur aigue entraînent de fait une douleur brève (le temps de la stimulation), localisée sur la zone stimulée ; la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal et il est attendu que la douleur soit de courte durée. En cas de chirurgie, une douleur post-opératoire sera observée, sans impact significatif sur l'activité locomotrice (l'animal pourra continuer à se déplacer de manière à assouvir ses besoins fondamentaux).

Devenir

Les animaux témoins, sans lésion et ne présentant aucun signe de douleur, pourront être maintenus en vie pour réutilisation s'ils ont bien récupéré des tests (observation par un vétérinaire et par le personnel compétent), et s'ils n'ont pas été soumis à des prélèvements de tissus pour analyse de biomarqueurs notamment (par exemple, prélèvement de structures nerveuses, ce qui rendrait impossible leur maintien en vie). Les animaux ayant reçu l'administration d'un traitement en voie de développement dont les effets ne sont pas connus et pourraient être délétères seront euthanasiés.

Remplacement

Les cultures cellulaires et les organoïdes permettent d’étudier des processus spécifiques, tels que la signalisation nociceptive au niveau des neurones sensoriels. Cependant, ils ne reproduisent pas l’ensemble du contexte biologique d’un organisme, comme l’interaction entre les organes périphériques et le cerveau. En effet la nociception résulte d’interactions dynamiques entre le système nerveux périphérique, le système nerveux central, et de multiples médiateurs biochimiques, et la douleur plus particulièrement, réfère à un ressenti et une adaptation comportementale face à ce ressenti. Ces processus impliquent des boucles de régulation complexes (neurotransmission, neuroinflammation, modulation centrale, etc.) qui ne peuvent pas être reproduites de manière complète dans des modèles in vitro ou in silico. Bien que les candidats médicaments puissent donc être sélectionnés en amont pour leur potentiel à répondre via certaines voies spécifiques, il reste nécessaire d'évaluer les molécules sélectionnées dans des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pendant la phase chirurgicale (le cas échéant), les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.

Choix des espèces

Le rat, la souris et le cobaye sont des modèles très couramment utilisés en recherche préclinique dans le domaine de la nociception et douleur, car les circuits impliqués dans la nociception et la modulation de la douleur sont bien conservés entre ces différentes espèces et l'Homme. De plus, chez le rat et la souris, la disponibilité de lignées transgéniques permet d’explorer les mécanismes spécifiques de la douleur mais aussi des voies humanisées pour certains gènes. Le choix de l'espèce sera déterminé par les connaissances disponibles sur le produit testé. Après le sevrage (âge minimum 4 semaines), en général autour de 2-3 mois (jeunes adultes), afin d'étudier les traitements chez des animaux présentant un système nerveux mature.

436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune recevant dix à vingt administrations orales sur deux à quatre semaines. Une partie subit une chirurgie qui prive le rein de circulation sanguine, d'autres reçoivent des molécules toxiques pour les reins, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer une dénutrition, une prostration et une altération de l'état général. La mesure de la fonction rénale impose deux anesthésies à deux heures d'intervalle, l'une pour fixer un capteur sur le dos de l'animal, l'autre pour le retirer, et l'opération se répète plusieurs jours différents sur la même souris. Le bénéfice annoncé, des thérapies ciblant les cellules rénales lésées plutôt que le système immunitaire dans son ensemble, reste à l'état de projet, quand l'insuffisance rénale, elle, est bien induite chez les 436 souris.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Le rein est constitué d'unités fonctionnelles de filtration, appelées néphron. Le néphron comprend deux compartiments : le glomérule et le tubule. Nous avons mis en évidence que la voie de signalisation d’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) est activée dans les tubules et les glomérules de patients atteints de maladies rénales. Afin de caractériser le rôle de cette voie dans les maladies du glomérule, nous avons étudié les conséquences de la suppression d’un gène impliqué dans la signalisation de l’interleukine, dans cette structure rénale. Nous avons ainsi montré que ce gène favorise la survie des glomérules lors d'une agression rénale chez la souris, permettant ainsi de réduire les conséquences néfastes de cette agression. Nous devons maintenant caractériser son rôle dans les tubules, ce qui représente le premier objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de la suppression du gène d’intérêt dans les tubules rénaux sur le développement d'une maladie rénale chez la souris. Afin de confirmer que l'activation de la voie de l'interleukine est bénéfique dans le contexte des maladies rénales, nous avons utilisé une molécule qui active sa voie de signalisation. Comme nous l'espérions, cette molécule a réduit les conséquences d'une agression glomérulaire chez la souris. Nous devons maintenant montrer si ce rôle protecteur est médié ou non par le gène d’intérêt. C'est le deuxième objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de l'administration de la molécule dans le développement d'une maladie rénale chez des souris produisant ou non le gène d’intérêt dans les glomérules ou les tubules.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie des cellules rénales conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie aigüe vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Administrations par voie orale ou injections : L’agent utilisé pour induire la modification génétique des souris sera administré par voie orale (pendant deux à quatre semaines, soit 10 ou 20 fois) à l’état vigile. L’administration orale dure 30 secondes. La molécule à tester sera injectée deux fois, diluée dans une solution non irritante. Cette injection est réalisée à l’état vigile. Pour l’induction des modèles expérimentaux, les animaux recevront une injection sous anesthésie gazeuse ou deux injections à l'état vigile. Chaque injection dure 30 secondes environ. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux au moment de l’euthanasie, sous anesthésie, sur un plateau chauffant ; durée entre 5 et 10 minutes. (3) Pesées : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (4) Mesure de la fonction rénale : une partie des souris du projet sera soumise à la mesure de la fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (2) Administrations par voie orale : Elles peuvent occasionner du stress, de l’inconfort, l’irritation de la gorge et des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes qui se traduire par un animal qui se met à gasper. Le composé administré peut entrainer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : une de ces molécules peut entrainer une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (436) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de six ou dix animaux (mâles et femelles sauf pour un modèle) sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 436 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes , de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour l’administration par voie orale : Ella aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables souples et plus ergonomiques. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Une pesée régulière permet de surveiller les points limites. (3) Raffinement injections : Toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Les volumes d'injection sont adaptés. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie : Les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments chirurgicaux sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Pour inactiver le gène d'intérêt, le composé est administré aux souris à l’âge de 5 semaines pour ne pas avoir des animaux trop vieux ensuite. Pour le reste des procédures, les souris seront âgées entre 9 et 11 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

Quatorze jours seule en cage pour mesurer son activité sur roue, quarante heures en chambre métabolique : 150 souris hypermusclées, privées de myostatine, et leurs frères et sœurs témoins subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 54 mâles sont mis en présence d'un congénère pendant un quart d'heure pour mesurer leur agressivité, avec des combats possibles, et 48 autres passent des tests d'anxiété, un jeûne de dix heures et une prise de sang. Le porteur déclare 78 souris replacées en élevage après les tests non invasifs, mais annonce aussi 96 mises à mort en fin d'expérimentation, deux comptes impossibles à concilier sur 150 animaux. Il explique avoir observé "fortuitement" une agressivité accrue chez ces souris et cherche à la relier à la ghréline, l'hormone de la faim.

Objectifs

Pour subvenir à ses besoins de manière discontinue, l’être humain organise sa prise alimentaire en une série d’événements périodiques répartis en trois phases : pré-ingestive, ingestive et post-ingestive. Chaque phase est associée à des sensations alimentaires physiologiques (faim et appétit, rassasiement et satiété) qui permettent de réguler la prise alimentaire. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. La ghréline est une hormone qui contrôle la prise alimentaire. La myostatine contrôle le développement musculaire. Les deux hormones peuvent avoir un rôle dans le comportement en particulier l’agressivité. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. Notre projet a pour but d’étudier le comportement d’activité motrice et d’agressivité d’une lignée de souris hyper musclées, dépourvues de myostatine, et d’établir s’il y a un lien avec l’hormone de satiété Ghreline.

Bénéfices attendus

Plusieurs maladies humaines se traduisent par des modifications de la prise alimentaire et de l’activité motrice spontanée (ex : anorexie). Le comportement relationnel est aussi souvent altéré chez les patients. L’observation fortuite d’une agressivité plus importantes chez les animaux dont la myostatine est inactivée, nous a conduit à rechercher s’il pouvait y avoir un lien entre la ghréline, la myostatine et les enzymes qui modifient la ghréline. Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes pouvant être impliqués dans des pathologies humaines impactant le comportement alimentaire et moteur.

Procédures

48 animaux vigiles seront maintenus en contention lors de la mesure de composition corporelle (moins de 2min, 5 fois). Ils seront individualisés pour l’évaluation de l’activité spontannée sur roue et du métabolisme repiratoire (2 semaines et 40h). 48 autres animaux subiront des tests de comportement permettant d'évaluer leur anxiété (2 tests de 10 min) puis une mise à jeun de 10h et un prélèvement d'une goutte de sang lors de la mesure de glycémie (3 secondes). 54 mâles réaliseront un test de mise en présence avec un congénère pendant moins de 15 minutes pour évaluer leur comportement social. Enfin, au total, 96 animaux auront une contention et une injection d’anesthésique en fin d’expérimentation (moins de 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les tests de comportements, les pesées, les mesures de composition corporelle et l’individualisation de certains animaux peuvent induire du stress. Les expériences de mise en présence de congénères de courte durée (15 minutes maximum) pourront induire un stress plus élevé et entrainer des combats si les animaux sont agressifs. Nous observerons en continu les animaux et appliquerons des points limites pour arrêter le test en cas de blessure. L’évaluation du métabolisme respiratoire, du comportement d’agressivité et de l’activité spontanée nécessitent l’individualisation des animaux (respectivement 40h, 10 jours et 14 jours). Ils garderont cependant le contact visuel et olfactif pour les durées les plus longues. Les animaux pourront présenter une légère perte de poids lors de la mise à jeun de 10 heures. En fin d’expérimentation les animaux ressentiront une légère douleur lors de la mesure de glycémie et lors de l’injection de l’anesthésique.

Devenir

Pour les procédures non invasives d’évaluation du comportement, 78 animaux seront ensuite replacés en élevage. Pour 96 animaux, nous réaliserons des euthanasies en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyse moléculaires et histologiques sur différents tissus de façon à pourvoir vérifier notre hypothèse.

Remplacement

L’étude du rôle d'hormones sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, système endocrinien, flore intestinale). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (système digestif producteur de ghréline, muscle, cerveau), contexte qu’il n’est pas possible de recréer sans étude in vivo. Des variables sur l’organisme entier seront ainsi mesurées (poids corporel, composition corporelle, concentration d’hormone, comportement…).

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre minimum nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Les calculs ont été effectués avec un logiciel spécialisé. Lors de la production des lots expérimentaux nous utiliserons les individus porteurs de la mutation d'intérêt et comme contrôles, les individus non mutés frères et sœurs. Les 78 animaux utilisés pour l'évaluation du comportement et de l’activité spontanée ne seront pas euthanasiés et retourneront en élevage après les tests.

Raffinement

Pour nos expérimentations, nous avons fixé des points limites basés sur la bibliographie et nous ferons un premier essai de mise au point pour les préciser. Pour habituer les animaux au passage dans le tube d’analyse de composition corporelle, nous mettrons dans les cages un tunnel de plexi rouge. Celui-ci servira à la fois d’enrichissement et de tunnel de transport des animaux. Ce paramètre est particulièrement important lors des tests d’évaluation du comportement des animaux. Ce tunnel sera aussi utilisé lors du change pour le transfert des animaux. Pour l’évaluation de l’activité spontanée, nous avons développé des cages qui permettent d’héberger deux roues d’activités. Les animaux sont alors simplement séparés par une grille qui permet de garder le contact social. Comme développé pour chacun de nos protocoles expérimentaux, nous allons porter une attention particulière au bien-être de nos animaux. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (apathie, vocalise, mobilité, alimentation…). Le report hebdomadaire des poids corporels sera un paramètre intégré à nos protocoles. Lors de l'anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter le risque de refroidissement.

Choix des espèces

L’étude du rôle de la myostatine sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, musculaire digestifs). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins génétiquement modifiés car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (muscle, cerveau, tube digestif, glandes surrénales). Ce projet est en continuité avec les nombreuses études déjà réalisées sur les souris dont le gène de la myostatine est inactivé. Les procédures concerneront des animaux âgés de 12 à 16 semaines (jeunes adultes). Nous utilisons des souris à l’âge adulte, âge auquel l'hypermusculation des souris myostatine est acquis.

Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.

Procédures

Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.

Remplacement

Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.