Procédures légères

Une chirurgie du cerveau de vingt à trente minutes, ou une injection intraveineuse, puis deux semaines de tests comportementaux. 2 256 souris vont être utilisées, dont 1 278 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne survivant au projet. Le porteur écrit que les souris modèles de la maladie de Huntington ne montrent aucun signe de détresse en dehors des tests et qu'elles n'ont "pas besoin de traitement ou d'attention particulière", et ramène l'ouverture du crâne à une "légère douleur avec perte légère de poids". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus cérébraux, seule voie déclarée pour comprendre les mécanismes du traitement testé.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires) puis inexorablement à leur décès. Lors de la maladie il y a un défaut de transport d'un facteur nécessaire à la survie des neurones. Il est démontré par des études au niveau cellulaire qu'il y a différents régulateurs de ce transport qui pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques. Il est maintenant crucial d'étudier le rôle de ces régulateurs dans un modèle animal, afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

Le déficit de transport d'un facteur essentiel à la survie des neurones est à la base de la dégénérescence des structures du cerveau lors de la maladie de Huntington qui touche 300000 personnes dans le monde. Ce projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soulager les patients.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection intra-veineuse de 5 minutes par souris. Des études comportementales de 2 semaines.

Impact sur les animaux

1) Des souris contrôle et des souris modèle de la maladie de Huntington seront utilisées. Chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales. En revanche, en dehors des tests comportementaux, ces souris ne montrent aucun signe de détresse correspondant à des points limites et n'ont pas besoin de traitement ou d'attention particulière. 2) Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à l'injection intra-veineuse n'a pu être observé. 3) Pour les individus qui vont subir une chirurgie du cerveau, cela peut générer une légère douleur avec perte légère de poids.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Le projet traitant de problèmes fonctionnels du cerveau, il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle de simulation informatique. Il a été précédemment démontré sur un modèle cellulaire qu'il y a des régulateurs du transport d'un facteur nécessaire à la survie du cerveau, la seconde étape consiste donc à démontrer le rôle de ces régulateurs et leur effet sur la survie du cerveau, dans des conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Il est donc crucial de passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de reproduire les mécanismes de déclenchement des traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

Pour cette procédure, le nombre d'animaux est réduit au maximum. Ces effectifs ont été calculées à l'aide de tests statistiques afin de pouvoir réaliser des analyses avec une puissance suffisante.

Raffinement

Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place surtout après la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à des grilles codifiant le niveau de bien-être. Cela permettra une intervention immédiate et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent d'étudier la régulation du transport du facteur de survie des neurones dans les conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Les animaux seront tous en stade postnatal. Des études comportementales seront faites au stade prépuberté et si aucun effet n'est observé on gardera les souris jusqu'au stade adulte où il y aura progression des mécanismes de la maladie.

2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée quotidiennement pendant deux semaines et soumise à trois tests portant sur la mémoire, l'anxiété et la sociabilité. Les procédures impliquent des niveaux de souffrance légers à modérés. Le modèle repose sur une consommation d'alcool laissée au choix des souris, ce qui, écrit le porteur, augmente le stress et l'agressivité entre elles, et l'étude mesure ensuite si un régime enrichi en oméga-3 limite les effets du sevrage. Les géniteurs, gardés le temps de produire les cohortes, sont mis à mort à la fin des reproductions, et le bénéfice annoncé, une modification des pratiques cliniques pour les 23 millions d'Européens dépendants, est renvoyé à des travaux ultérieurs de partenaires cliniciens.

Objectifs

L'Europe est la région du monde où la consommation d'alcool est la plus élevée, avec environ 23 millions d'Européens dépendants à l'alcool. Cette dépendance constitue un trouble psychiatrique fréquent, pour lequel les traitements restent largement insuffisants. Pour combattre efficacement ce fléau, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie liée à la consommation d'alcool. En effet, le niveau de consommation d’alcool est un mauvais prédicteur du risque individuel à développer des atteintes graves. Par exemple, le risque de développer une cirrhose du foie chez les grands buveurs varie considérablement et ce indépendamment de la quantité d'alcool consommée. Cela reflète une grande variabilité dans les réponses individuelles à la consommation d'alcool au sein de la population. Cette vulnérabilité se manifeste particulièrement lors de la phase de sevrage chez les patients atteints de troubles liés à la consommation d'alcool (TCA). Elle se caractérise par une présence accrue de facteurs inflammatoires associés à une aggravation des lésions cérébrales, une rigidité cognitive accrue et un besoin compulsif de consommer de l'alcool. Ce projet cherche à comprendre pourquoi certaines personnes sont plus vulnérables aux effets de l’alcool que d’autres. Nous pensons que cette différence est liée aux interactions entre le système immunitaire, et le cerveau. L’objectif est d’analyser l’inflammation dans le cerveau et le reste du corps lors du sevrage et de voir si les oméga-3, connus pour leurs effets anti-inflammatoires, peuvent améliroer les effets du sevrage et réduire le risque de rechute. Pour cela, nous testerons ces effets sur des souris modèles de dépendance à l’alcool.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier les facteurs de vulnérabilité associés à la rechute après une période d’abstinence dans les troubles liés à la consommation d'alcool. De plus, il a pour objectif de déterminer si les oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) peuvent limiter les risques de rechute chez les patients alcooliques. En l’occurrence il apportera des données objectivées quant à la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans les effets neuroprotecteurs des oméga-3, ce qui est nécessaire pour informer les professionnels de santé et modifier les pratiques cliniques. Ainsi, les oméga-3 pourraient être utilisés chez les patients en stratégie add-on (prévention primaire et secondaire) en association avec l’abstinence pour améliorer la résilience chez les patients. Nos partenaires cliniciens du projet mettront en œuvre les approches en s'appuyant sur nos résultats précliniques. Ainsi notre projet a une forte valeur translationnelle et de transfert de connaissances vers l'homme en plus de générer des nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la vulnérabilité à la rechute après sevrage à l'alcool, qui concerne prêt de 60% des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage gastrique quotidien pendant 2 semaines. Le gavage gastrique est très rapide, il ne dure que quelques secondes. Une collecte de sang sera réalisée au début et à la fin de la période d’abstinence. La collecte de sang est très rapide, pas plus d'une minute. Les tests comportementaux seront réalisés à l'âge adulte pendant quelques minutes, avec 3 tests par animal. Le but de ces tests comportementaux est de regarder l'impact sur la mémoire, l'anxiété, et la sociabilité. Les animaux seront pesés une fois par semaine, pendant la procédure, cela dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le modèle de choix de consommation d'alcool présente un risque d'augmentation de stress et d'agressivité sur les animaux, cependant aucune mortalité n'est documentée sur ce modèle. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes utilisés n'ont pas d'effets délétères sur la santé générale des animaux et ne sont pas toxiques. La contention et le gavage durent quelques secondes et engendre un stress léger sur les animaux, sans altération de leur état général.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les structures et /ou cellules nécessaires du cerveau et du corps pour réaliser les analyses post-mortem dans le cadre des questions scientifiques posées dans le projet. Les géniteurs sont conservés pour permettre de générer les cohortes. A la fin des reproductions, les géniteurs seront mis à mort.

Remplacement

L’étude du rôle de la neuroinflammation, et de l'axe intestin-cerveau dans l'hétérogénéité des troubles de consommation d'alcool nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et le rôle des oméga-3 dans les troubles de consommation d'alcool, pour ainsi mettre en place des approches nutritionnelles comme traitements préventifs pour améliorer la réussite du sevrage. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de consommation d'alcool reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures cérébrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris et les transgéniques sont nécessaire par groupe pour générer des données robustes statistiquement par groupe.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement dans leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ces données sur l'effet des oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) sur le cerveau et la neuroinflammation chez la souris permettra d’affiner les données existantes en les croisant avec les nouvelles données générées. Par ailleurs, les cellules immunitaires du cerveau de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui conduit à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat, car notre laboratoire dispose de nombreuses lignées transgéniques, ce qui n’est pas le cas chez le rat. Ce choix s'inscrit dans une démarche de réduction d'animaux. L’utilisation des souris transgéniques est essentielle pour comprendre précisément le rôle des oméga-3 dans ces cellules cérébrales. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, âge correspond à l’âge adulte chez l’homme, moment auquel débutera la consommation d’alcool. Les tests comportementaux débuteront ensuite sur des animaux âgés de 16 semaines. À partir de 21 jours, les souris transgéniques recevront un régime enrichi en oméga-3, correspondant à la période de sevrage où elles commencent à s’alimenter de manière autonome.

Deux lignées de souris obtenues par croisements présentent les atteintes musculaires de deux myopathies rares, et la moitié des petits nés de ces croisements n'ont pas le génotype recherché. 691 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester une thérapie génique injectée dans leur première semaine de vie ou après l'apparition des symptômes. Elles passent selon les groupes des courses d'endurance sur tapis, des tests de suspension, des mesures de force des pattes arrière et des examens cardiaques sous anesthésie, ainsi que douze heures d'isolement pour mesurer leur activité spontanée, et le porteur cite "l'angoisse et la douleur durant la course". Les souris testées sont tuées à la fin pour prélever muscles et organes, et les petits sans le génotype recherché le sont aussi, sauf ceux gardés pour renouveler les croisements.

Objectifs

Ce projet s'intéresse à deux maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces myopathies. Le but de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une potentielle thérapie commune pour ces deux maladies. Modification : Dans la première maladie, des atteintes musculaires et cardiaques sont décrites. L’objectif était donc de cibler ces deux types d’organes avec une seule injection de traitement. Cependant, le cœur s’avère beaucoup plus ciblé que les muscles. La modification de projet porte donc sur un changement de voie d’injection. Cette optimisation de délivrance du traitement, s’accompagne également d’une optimisation de la dose à injecter. Enfin, des tests cardiaques légers sont ajoutés pour le groupe qui recevra cette nouvelle stratégie d’injection.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait fournir une preuve de concept commune pour soigner deux myopathies. En outre, cette étude nous permettra de mieux comprendre ces maladies et les acteurs impliqués.

Procédures

Dans ce projet, il y aura 4 groupes d’animaux : les groupes 1 et 3 (Myopathie 1) et les groupes 2 et 4 (Myopathie 2), qui seront soumis à différents tests musculaires et cardiaques. Groupes 1 et 2 : Les animaux recevront la thérapie génique durant la première semaine après la naissance avant l'arrivée des symptômes (prévention de la maladie). Les tests seront réalisés à l’âge attendu d’arrivée des symptômes. Groupe 1 : Les capacités cardiaques seront évaluées par deux tests cardiaques effectués consécutivement au cours de la même anesthésie (30 mins) une fois durant la vie de la souris. Les capacités sportives seront testées une fois par test d’endurance sur tapis de course (moins d’une heure). L’activité spontanée sera également surveillée sur 12h. Groupe 2 : Les capacités sportives seront testées une fois par semaine pendant 1 mois par deux tests de force (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs sous anesthésie générale) durant chacun moins d'une heure. L’activité spontanée sera surveillée sur 12h, une fois durant la vie de la souris. La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin de la caractérisation sous anesthésie générale. Groupes 3 et 4 : Les animaux recevront la thérapie génique après l’apparition du phénotype (réversion de la maladie). Groupe 3 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, mesure de force des membres postérieurs et endurance sur tapis de course) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (activité spontanée et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Groupe 4 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, test de suspension et mesure de force des membres postérieurs) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Modification:Le groupe 3 sera divisé pour améliorer la délivrance du traitement. Les capacités cardiaques seront mesurées deux fois dans la vie de la souris : avant et après traitement. Le groupe 5 recevra des injections, et la force sera évaluée un mois plus tard pour certains animaux.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont le stress dû à l'isolement durant la mesure d'activité spontanée, l'angoisse et la douleur durant la course, ainsi que la douleur lors des injections de traitement ou d'anesthésiants. Il est possible que les animaux ressentent une fatigue physique due aux anesthésies répétées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles et organes nécessaires aux analyses moléculaires, et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies. La moitié des animaux issus des croisements ne possèderont pas les génotypes d'intérêt et seront euthanasiés s'ils ne sont pas nécessaires pour renouveller des croisements.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique d'une thérapie sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisamment proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant peu invasifs, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre et un tube pour permettre la préhension des animaux avec un minimum de stress. En cas de fatigue ou difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Les animaux seront pesés une fois par semaine et observés. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour limiter son stress. Lors des tests sous anesthésie une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Le bien-être global des animaux sera surveillé quotidiennement après injection du traitement pendant une semaine. Pour les nouveau-nés, la poche de lait sera observée, car une diminution de l'alimentation peut indiquer un mal-être, et les animaux seront pesés. Des analgésiques pourront être administrés sur avis du vétérinaire si les animaux montrent des signes de douleur persistante. La zone d'injection du traitement sera surveillée et dès l'apparition de rougeurs, elle sera nettoyée avec une solution antiseptique douce. En cas d'infection importante, l'animal pourra recevoir des antibiotiques ou être euthanasié sur avis vétérinaire.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris récapitulent le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et permettent donc d'évaluer correctement l'efficacité des traitements. Les défauts locomoteurs du premier modèle sont établis à 12 semaines après un exercice forcé et le phénotype cardiaque léger peut être détecté à 7 semaines. Pour les souris injectées avec le traitement dans les premiers jours de vie, les tests seront réalisés entre 7 et 12 semaines. Pour les souris injectées à 12 semaines, les tests seront réalisés de 11 à 16 semaines. Le deuxième modèle est plus précoce, bien que toujours léger, les tests seront donc effectués de 6 à 8 semaines ou de 6 à 12 semaines en fonction de l'injection du traitement (en prévention ou après l'apparition des symptômes). Modification : L'étude pilote pour l'optimisation des doses d’injection sera faite sur des animaux de 12 à 20 semaines, pour permettre la réduction du nombre de souris, mais aussi pouvoir comparer les données avec des données standards du modèle.

Tués dès la fin de la procédure pour les uns, gardés jusqu'à douze mois puis mis à mort pour les géniteurs et génitrices, 16 950 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet consiste à créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées pour étudier les protéines qui structurent les neurones. Chaque poisson subit à quatre mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale destiné au génotypage, geste que le porteur décrit comme sans dommage tout en reconnaissant qu'il peut induire du stress et de la douleur. L'effectif reste sans justification statistique, le porteur indiquant qu'aucune méthode n'a pu servir à le déterminer puisque aucune expérience n'est menée sur les poissons adultes.

Objectifs

Notre programme de recherche porte sur l’étude de neuropathies héréditaires humaines caractérisées par des atteintes neurologiques sensitives et motrices. La prise en charge clinique des patients est actuellement symptomatique et aucun traitement curatif n’existe à ce jour, ce qui pose l’urgence de développer des modèles animaux précliniques pour la mise au point des thérapies. Nous nous intéressons aux protéines qui forment l’architecture du neurone et qui sont mutées dans nombre de maladies neurologiques. Notre programme de recherche vise à comprendre le rôle physiologique de ces protéines structurelles et leur régulation. Afin de mener ce projet à bien, nous avons choisi le modèle du poisson zèbre, qui constitue un modèle/outil de choix pour l’étude du système neuromusculaire, similaire à celui de l'Homme et déjà fonctionnel dès le stade larvaire précoce. En outre, la transparence de l'animal durant le développement nous permet de capturer les processus dynamiques qui nous intéressent par imagerie dans un modèle in vivo. Pour réaliser ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées poisson zèbre transgéniques. Ces lignées nous permettront de générer des embryons dans le but d’étudier les protéines structurelles des neurones par des techniques de microscopie ou de biochimie à des stades larvaires (

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre les fonctions des protéines contrôlant l'architecture des neuroneset leur implication dans des mécanismes pathologiques. L’objectif à long terme (>5ans) est de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit la du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zebres une fois dans leur vie.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seule les formes mutées, avec des mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer un phénotype dommageable (défauts sensorimoteurs). Ces défauts pourraient induire un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité ou de conditions d’hébergement particulières. Nous porterons une attention particulière aux déficits moteurs en évaluant la qualité de la nage des poissons générés (notamment observable lors du nourrissage) et à l’apparition de signes de souffrance. Pour les autres lignées transgéniques, un suivi des poissons zebres sera réalisé afin de s’assurer qu’aucun d’entre eux ne développe de phénotype dommageable dans le temps. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zebres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 12 mois puis mis à mort. Les autres seront mis à mort dès la fin de chaque procédure afin de ne pas garder d’animaux génétiquement modifiés , non nécessaires à la conduite de ce projet et ne pouvant pas être replacés (adoption ou autre projet).

Remplacement

Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines controlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonction de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des oeufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Étant donné qu'aucune expérience ne sera réalisée sur les poissons adultes, aucune méthode statistique n'a pu être utilisée pour déterminer le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a donc été déterminé sur la base du nombre de couples reproducteurs requis.

Raffinement

Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous analgésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Une sédation adéquate sera confirmée en vérifiant l'absence de réaction de fuite provoquée par le toucher. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (24h à 48h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectués par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptés aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.

Choix des espèces

Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives.

Tester les candidats médicaments d'un client donneur d'ordre suppose ici de provoquer une inflammation pulmonaire aiguë par administration de lipopolysaccharide bactérien. 1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations du composé testé et deux prélèvements sanguins sur animal vigile, une partie subissant en fin d'étude une pléthysmographie invasive sous anesthésie profonde, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer les candidats médicaments sur un "organisme vivant entier", et précise que le client s'engage par contrat à avoir eu recours en amont à tous les modèles "nécessaires".

Objectifs

Les lésions pulmonaires aiguës (ALI : Acute Lung Injury) sont considérées comme une sorte de syndrome clinique critique. Le lipopolysaccharide (LPS) est le composant majeur de la membrane des bactéries Gram négatif. De nombreuses études ont indiqué que les infections à ces bactéries sont parmi les causes les plus importantes des lésions pulmonaires aiguës, et que le LPS peut entraîner des lésions pulmonaires et une réponse inflammatoire. Des études ont démontré que l'administration de LPS peut induire la production de médiateurs inflammatoires. Par conséquent, le but de ce projet est de tester de nouveaux traitements contre l'ALI induite par le LPS. Ce projet est un renouvellement, par conséquent le modèle est bien connu et maitrisé.

Bénéfices attendus

Il n’existe pas encore de pharmacothérapie spécifique aux lésions pulmonaires aiguës (ALI) ayant un effet significatif et uniforme sur le développement de la maladie et la mortalité, bien que les essais précliniques aient montré des résultats prometteurs. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie en réduisant l’inflammation pulmonaire. Nous avons pu identifier, dans notre précédent projet, l'effet bénéfique d'une molécule sur la résistance pulmonaire. Grâce à ce nouveau projet, nous espérons pouvoir en identifier de nouvelles ayant également des effets anti-inflammatoires.

Procédures

Administrations de composé: maximum 30 administrations (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 2 prélèvements (30 secondes/souris, maximum 1 prélèvement par semaine) durant l'étude sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Dans certains cas, les animaux vont être soumis à la pléthysmographie invasive sous xylasine/kétamine (anesthésie profonde) (durée: 15 minutes, analyse en terminale sans réveil). Une étude d'efficacité de composés durera au maximum 21 jours dans cas d’un traitement préventif ou maximum 6 jours dans le cas d’un traitement curatif.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie (pic inflammatoires situé de 3.5h à 24h post administration). La douleur pourra générer une perte de poids (2-5% sur 24h) et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). Aucune nuisance n’est attendue lors de l’induction mis à part un léger stress dû à la manipulation. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 99% de animaux étaient en gravité réelle légère et 1% en gravité modéré. Aucune nuisance n'avait été relevée. Lors de l’analyse de la capacité respiratoire, la douleur sera prise en charge par l’ajout d’un analgésique en plus du cocktail de l’anesthésie général. Le rythme cardiaque est régulier et monitoré durant tout l’enregistrement. De plus les animaux seront mis à mort avant réveil, n’engendrant par conséquent aucune douleur post-opératoire

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation pulmonaire chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire, les organoides ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidats médicaments. Les études in vitro ne permettent pas l’étude des intéractions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. Il est indispensable d’évaluer les candidats médicaments sur un organisme vivant entier. Les effets d’un médicament relèvent en effet de mécanismes extrêmement complexes, qui impliquent la plupart du temps de nombreux organes, interagissant les uns avec les autres. Ces tests permettront notamment de déterminer la dose optimale à administrer lors des essais cliniques qui suivront. Le client donneur d’ordre s’engage sur le contrat signé auprès de notre EU à avoir eu recours à tous les modèles nécessaires, s’ils existent, en amont de l’étude afin de limiter l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (n=12/groupe maximum, nombre validé par l’expérience acquise des dernières années), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront: - le test de Kruskal-Wallis non paramétrique (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable) - ainsi que la 2way ANOVA (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables)

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un matelas chauffant. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenue. Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Notre modèle a été initialement mis au point et développé à partir de données de la littérature. Ce projet est un renouvellement, le modèle est maintenant parfaitement maitrisé, et nous a permis de réaliser des études avec succès lors du précédent projet. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un poumon avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).