Procédures sans réveil

Deux injections de streptozotocine, quatre semaines de régime gras, un cathéter poussé dans une artère du cou pendant trois quarts d'heure à une heure : ce second volet du projet, réparti sur deux établissements, utilise 100 rats Wistar. La procédure est déclarée sans réveil, dans un protocole qui s'étend pourtant sur environ seize semaines. Le porteur décrit en effet une surveillance de la fréquence cardiaque et respiratoire "jusqu'au réveil complet" après les anesthésies, puis un suivi de cinq jours, ce qui suppose des animaux réveillés entre les étapes. Tous sont tués par surdosage de pentobarbital, cœur, muscle et peau prélevés pour analyses histologiques et biochimiques.

Objectifs

La dapagliflozine est un médicament couramment utilisé pour traiter le diabète de type 2. En plus de son effet sur la glycémie, plusieurs études ont montré qu’elle réduit le risque de décès d'origine cardio-vasculaire, un effet encore mal compris. Nous souhaitons donc étudier comment ce médicament influence le fonctionnement du cœur, en particulier la manière dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie. Normalement, le cœur consomme du sucre et des graisses pour produire l’énergie dont il a besoin. Nous pensons que la dapagliflozine modifie cet équilibre : elle réduirait l’utilisation du sucre et favoriserait celle des graisses, ce qui pourrait améliorer l’efficacité énergétique du cœur. Pour vérifier cette hypothèse, nous observerons comment le cœur des animaux utilise les graisses et le sucre grâce à des techniques d’imagerie avancées (Tomographie par Emission de Positon et Imagerie par Résonance Magnétique). Nous relierons ces résultats à des mesures complémentaires portant sur le fonctionnement du cœur, la composition des tissus et certains marqueurs biologiques. Enfin, nous vérifierons si les effets du médicament sont similaires chez les mâles et les femelles. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : Ce projet permettra de mieux comprendre comment la dapagliflozine agit sur le cœur. Grâce à l’imagerie, nous pourrons observer en temps réel les changements dans la façon dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie après l’administration du médicament. Ces observations seront comparées aux données sur le fonctionnement du cœur, l’inflammation et la structure du tissu cardiaque. Le projet montrera également l’intérêt decombiner les techniques d’imagerie pour mieux évaluer les effets bénéfiques des traitements du diabète sur le cœur. Enfin, il apportera des données expérimentales sur une possible différence d’effet du médicament entre les mâles et les femelles, un aspect encore peu étudié. Bénéfices à long terme : À plus long terme, ce travail contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes d’action des traitements antidiabétiques de la famille de la dapagliflozine. Il permettra notamment de mieux comprendre le lien entre les troubles du fonctionnement cardiaque et les modifications du métabolisme énergétique chez les personnes diabétiques. Ces découvertes pourraient aider à identifier de nouvelles pistes de traitement des complications cardiovasculaires du diabète. Les résultats obtenus pourront également guider la pratique clinique, en précisant quels profils de patients pourraient tirer le plus de bénéfices de la dapagliflozine. Sur le plan méthodologique, le projet favorisera le développement de nouvelles approches d’imagerie cardiaque non invasive. Ces outils pourront ensuite être utilisés pour d’autres maladies du cœur, comme l’insuffisance cardiaque. Enfin, les données issues de ce travail constitueront une base solide pour de futurs essais cliniques chez l’humain. Si les résultats observés chez l’animal se confirment, ils pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des atteintes cardiaques liées au diabète. En résumé, ce projet apportera rapidement de nouvelles connaissances expérimentales sur les effets de la dapagliflozine sur le cœur, et à plus long terme, il pourrait ouvrir la voie à des progrès cliniques concrets dans le traitement des patients diabétiques.

Procédures

Induction du diabète de type 2: Les animaux reçoivent pendant 4 semaines une alimentation riche en graisses afin de reproduire un état de pré-diabète. Ils reçoivent ensuite deux injections à une semaine d’intervalle d’un produit (streptozotocine) qui perturbe légèrement la production d’insuline et permet de stabiliser un diabète modéré, similaire au diabète de type 2 humain. Les injections sont réalisées sous une anesthésie légère pour limiter le stress et la douleur. L’évolution de la glycémie est ensuite suivie pendant 8 semaines. Durée: environ 12 semaines. Traitement médical: Les animaux reçoivent ensuite la dapagliflozine, un médicament utilisé chez l’homme pour traiter le diabète, pendant 4 semaines, administrée dans l’eau de boisson de façon naturelle, sans contrainte pour l’animal. Durée : 4 semaines. Imagerie cardiaque: Chaque animal bénéficie d’un examen d’imagerie (Tomographie par Emission de Positons et Imagerie par Resonance Magnetique) pour observer la manière dont son cœur fonctionne et consomme les graisses comme source d’énergie. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure environ 1 h 30 par animal. Une petite aiguille est placée dans une veine de la queue pour injecter un traceur non douloureux et prélever de très petites quantités de sang (trois fois au maximum, soit moins de 1 mL au total). Nombre d’animaux : 100. Spectroscopie du phosphore et mesures de relaxation cardiaque: Une seconde séance d’Imagerie par Resonance Magnetique permet de mesurer la composition énergétique du muscle cardiaque. Cette étape est aussi réalisée sous anesthésie et dure environ une heure par animal. Test d’effort: Les animaux effectuent un test d’endurance sur un tapis roulant, dans des conditions non douloureuses et sans stimulation électrique. La vitesse augmente progressivement jusqu’à ce que l’animal montre des signes de fatigue. Durée : environ 30 minutes par séance, une à deux fois par animal. Mesure des pressions cardiaques (PV loop): Cette procédure terminale se déroule sous anesthésie générale et analgésie. Un petit cathéter est inséré dans une artère du cou pour enregistrer la fonction mécanique du cœur pendant 45 à 60 minutes. À la fin de la mesure, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. À la fin de l’expérimentation, les tissus (cœur, muscle et peau) sont prélevés après euthanasie pour réaliser des analyses biologiques, histologiques et moléculaire.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires liés aux procédures expérimentales et au traitement par dapagliflozine pourraient inclure : - Des douleurs et inconfort après injection IP de la streptozotocine: bien que limitée grâce aux mesures de gestion de la douleur - Une perte de poids : une surveillance stricte du poids sera effectuée pour détecter toute variation anormale. - En cas d’inactivité ou mobilité réduite : une diminution de l'activité spontanée peut être observée immédiatement après les interventions chirurgicales ou anesthésiques, mais elle devrait se résorber en 48 à 72 heures. - Le stress dû à l’expérimentation pourrait se manifester par une réduction du toilettage, une diminution de l'exploration ou des comportements de prostration. Le suivi post-procédure inclura une surveillance immédiate post-injection, avec observation de la fréquence cardiaque et respiratoire jusqu’au réveil complet. Une plaque chauffante sera utilisée pour maintenir la température corporelle des animaux sans augmenter leur consommation énergétique. Un suivi quotidien ou biquotidien sera assuré tout au long de l’expérimentation afin de détecter rapidement toute anomalie. L'état des animaux sera évalué en se basant sur des critères objectifs : comportement alimentaire normal, absence de perte de poids, comportement de fouissage et de toilettage normal, interactions sociales adaptées (absence d'agressivité), absence de stéréotypies et observation d'un déplacement actif. L’ensemble de ces mesures permettra de limiter au maximum les effets indésirables et d’assurer des conditions expérimentales respectueuses du bien-être animal. Le suivi quotidien des animaux inclura une évaluation clinique systématique. Une couverture analgésique est prévue pour toutes les procédures potentiellement douloureuses. Produit et voie d’administration : buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané (forme standard) ou 0,1 mg/kg (forme à libération prolongée) selon la durée de la procédure. Fréquence et durée d’administration : Une première injection est réalisée 30 minutes avant la manipulation. Une réinjection est prévue toutes les 12 heures pendant 24 à 48 h en cas de signes de douleur légère à modérée (évalués selon les grilles de Morton & Griffiths et l’échelle 4Avet). Si une douleur persistante ou plus marquée est observée, un traitement complémentaire par tramadol per os (5–10 mg/kg) mélangé à la nourriture (gelée aromatisée) pourra être administré pendant 48 à 72 h.

Devenir

A la fin de la procédure, les rats (n=90) seront euthanasiés par surdosage en pentobarbital pour analyses histologiques et biochimiques. Concernant les 10 animaux supplémentaires pour la mise en place du traceur ([¹¹C]Palmitate), ils seront également euthanasiés afin de permettre une analyse histologique de la distribution tissulaire du traceur au niveau cardiaque.

Remplacement

L’étude du métabolisme myocardique et de ses modifications sous l’effet de la dapagliflozine, de même la perte urinaire de glucose qu’elle engendre, nécessite une approche prenant en compte les interactions systémiques entre les organes (cœur, foie, rein, système vasculaire). L’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable pour : étudier les modifications dynamiques du métabolisme cardiaque en temps réel à l’aide d’imagerie métabolique comme la TEP au [¹¹C]Palmitate et la spectroscopie RMN du phosphore, évaluer l’impact fonctionnel du traitement sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose, ce qui ne peut être réalisé sur un modèle ex vivo ou in vitro, reproduire un état pathologique complexe (diabète de type 2) qui intègre l’ensemble des interactions systémiques affectant le cœur. Les cultures cellulaires, notamment les cardiomyocytes en culture, permettent d’étudier certains aspects du métabolisme énergétique et des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, elles ne reproduisent pas la complexité d’un organe fonctionnel, notamment les interactions entre les cellules myocardiques, l’environnement extracellulaire et le métabolisme global. De plus, l’impact de la dapagliflozine sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose ne peut pas être correctement évalué sur un modèle cellulaire isolé.

Réduction

Se basant sur le principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires, l’ensemble du projet inclura 100 animaux : 90 rats pour la phase principale d’imagerie, ainsi que 10 animaux supplémentaires pour la mise en place de l’utilisation du traceur ([¹¹C]Palmitate). En absence de données préliminaires chez l'animal, un calcul d'effectif ne peut pas être réalisé. Toutefois, un calcul de puissance sera réalisé après l’évaluation de 50% de l’effectif de façon a ré-évaluer ce chiffre en fonction des résultats et tenter de réduire le nombre total d’animaux finalement nécessaires.

Raffinement

Concernant le raffinement des conditions expérimentales, les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV) avec une pression de 20-25Pa avec un renouvellement de 25 fois le volume d’air de la pièce toutes les heures et une température de 21°±1C. L’exposition à la lumière sera de 6h45 à 18h45. La nourriture, la boisson et la litière seront changées une fois par semaine. La litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée pour les animaux permet de réduire le niveau de stress. Cette litière est plus chère mais possède les avantages d'être peu poussiéreuse, moins allergisante que le résineux. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 afin de conserver les interactions sociales. La litière est enrichie avec de la litière cellulose Alpha Dry permettant la confection de nid. Les procédures expérimentales sont effectuées sous anesthésie et analgésie. A la suite des procédures, un suivi régulier est effectué pendant 5 jours par du personnel expérimenté et formé à l'évaluation des point limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Dans cette étude, l’espèce sélectionnée est le rat Wistar, un modèle préclinique couramment utilisé pour l’évaluation des effets métaboliques et cardiovasculaires des traitements. Le stade de développement choisi est celui de rats âgés de 8 à 9 semaines au moment de l’expérimentation. L’utilisation de rats adultes permet de limiter les biais liés aux changements physiologiques associés à la croissance.

200 souris vont être utilisées, anesthésiées puis ouvertes au niveau de l'abdomen et tuées avant tout réveil. Une injection intrapéritonéale précède l'endormissement, la paroi abdominale est ouverte et la veine cave perfusée pour récupérer les hépatocytes. Vingt souris sont utilisées pour former le personnel de l'animalerie au geste, les autres sont tuées pour prélever des cellules, à raison de trois par mois pendant cinq ans. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme l'expérimentation animale grâce aux organes sur puce, tout en affirmant que la souris est le "seul modèle utilisable" puisque les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir et varient d'un donneur à l'autre.

Objectifs

Dans l’idée de reconstituer in vitro des organes-sur-puce, nous aurons besoin de cellules provenant de foie de souris (hépatocytes primaires) car les lignées cellulaires de cellules du foie existantes reproduisent mal les caractéristiques de ces cellules primaires. Nous avons donc besoin de pouvoir obtenir des hépatocytes de la souris. Le but du projet est de former le personnel de l’animalerie pour installer la technique de récupération de ces hépatocytes primaires de souris pour ensuite les utiliser pour nos besoins expérimentaux pour le développement de multiorganes-sur-puces in vitro reproduisant les interactions inter organes dans le corps entier et permettra par la suite de réduire l’expérimentation animale pour l’étude des communications inter-organes car les cellules d’une souris permettent de construire plusieurs organes-sur-puces.

Bénéfices attendus

Deux bénéfices sont attendus : Installation de la technique d’isolement des hépatocytes de souris . Développement d’un multiorgane-sur-puce pour la diabétologie

Procédures

Aucune expérimentation ne se fera sur animal vigile, les nuisances pour les animaux dans ce projet seront les injections intrapéritonéales qui seront suivie d’une chirurgie sans réveil, le temps d’endormissement sera de 5 à 10 min (vérifié par pincement de la patte, et réadministration d’anesthésique si réaction), l’ouverture de la paroi abdominale jusqu’à la perfusion de la veine cave durera 1 à 2 min maximum, au moment de la section de la veine porte, la souris ne sera plus vivante : arrêt de la circulation sanguine.

Impact sur les animaux

Aucune nuisances ou effets indésirables ne sont attendus du vivant de l’animal qui sera hébergé dans des conditions habituelles à 5 animaux par cage, la procédure effectuée sur ces animaux sera sans réveil (après analgésie et anesthésie profonde).

Devenir

Procédure terminale sans réveil.

Remplacement

Les lignées cellulaires de foie reproduisent mal les caractéristiques fonctionnelles des cellules natives. Les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir, ont une très grande variabilité inter-donneurs, et ne permettent pas d’investiguer des modèles transgéniques. Les souris sont donc le seul modèle utilisable dans ce projet. Nous aurons un besoin régulier en cellules de foie natives de souris (3 par mois maximum), les cultures ayant une durée de vie autour de 4 jours.

Réduction

S’agissant ici d’une procédure pour formation de personnel dans le but d’obtenir ensuite des cellules de foie primaires sur 5 ans, le nombre minimum de souris pour permettre aux agents de se former a été estimé à 20 (comprenant le nombre de souris utilisées par le formateur ainsi que les nouveaux-formés). Le reste des animaux servira à nous fournir ensuite en cellules (3 fois par mois maximum) pour nos besoins expérimentaux sur la durée du projet. Ce projet permettra in fine d'utiliser moins d'animaux en expérimentation car une souris peut fournir assez de cellules de foie pour environ 5 organes-sur-puces. Les organes-sur-puce comme ceux développés dans ce projet permettront, à terme, de répondre à un plus grand nombre de questions scientifique du fait de l'environnement contrôlé de la culture primaire en évitant les facteurs confondants et les compensations qui existent in vivo. Bien évidemment, nous utiliserons strictement le nombre d’animaux nécessaire dans un souci de « réduction » et le développement du modèle 4-organes-sur-puce pourrait prendre moins de 5 ans et utiliser moins d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront regroupés à 5 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi par des dômes, tunnel, morceau de bois, maison rouge, coton de nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Lors de l’utilisation des animaux pour récupérer les cellules du foie, une solution d’analgésique leur sera administrée 30min avant l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie sera mesurée par vérification des paramètres et constantes de suivi de la narcose chez le rongeur.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle animal car c’est un mammifère relativement proche phylogénétiquement et physiologiquement de l’Homme qui permet l’accès à un maximum de modèles transgénique par la suite lorsque le multiorgane-sur-puce sera mis au point. Les cellules primaires de foie seront récupérées sur souris C57BL/6J mâles et femelles de 6 à 15 semaines.

100 rats vont être utilisés, chacun passant douze semaines à devenir diabétique avant une heure trente d'imagerie TEP, une heure d'IRM, trente minutes de tapis roulant et jusqu'à une heure de cathétérisme cardiaque terminal. Le diabète est provoqué par un régime gras puis deux injections de streptozotocine, dont le porteur reconnaît qu'elles causent douleurs et inconfort. La procédure est classée sans réveil et tous sont tués sous anesthésie profonde à l'issue de la mesure de pression, cœur, muscle et peau prélevés. Les retombées annoncées, mieux prévenir les atteintes cardiaques du diabète et guider la pratique clinique, sont renvoyées au conditionnel et à de futurs essais chez l'humain, quand les douze semaines d'hyperglycémie provoquée sont immédiates.

Objectifs

La dapagliflozine est un médicament couramment utilisé pour traiter le diabète de type 2. En plus de son effet sur la glycémie, plusieurs études ont montré qu’elle réduit le risque de décès d'origine cardio-vasculaire, un effet encore mal compris. Nous souhaitons donc étudier comment ce médicament influence le fonctionnement du cœur, en particulier la manière dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie. Normalement, le cœur consomme du sucre et des graisses pour produire l’énergie dont il a besoin. Nous pensons que la dapagliflozine modifie cet équilibre : elle réduirait l’utilisation du sucre et favoriserait celle des graisses, ce qui pourrait améliorer l’efficacité énergétique du cœur. Pour vérifier cette hypothèse, nous observerons comment le cœur des animaux utilise les graisses et le sucre grâce à des techniques d’imagerie avancées (Tomographie par Emission de Positon et Imagerie par Résonance Magnétique). Nous relierons ces résultats à des mesures complémentaires portant sur le fonctionnement du cœur, la composition des tissus et certains marqueurs biologiques. Enfin, nous vérifierons si les effets du médicament sont similaires chez les mâles et les femelles. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : Ce projet permettra de mieux comprendre comment la dapagliflozine agit sur le cœur à court terme. Grâce à l’imagerie, nous pourrons observer en temps réel les changements dans la façon dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie après l’administration du médicament. Ces observations seront comparées aux données sur la fonction du cœur, l’inflammation et la structure du tissu cardiaque. Le projet montrera également l’intérêt des techniques d’imagerie combinées (TEP et IRM) pour évaluer les effets bénéfiques des traitements du diabète sur le cœur. Enfin, il apportera des données expérimentales sur une possible différence d’effet du médicament entre les mâles et les femelles, un aspect encore peu étudié. Bénéfices à long terme : À plus long terme, ce travail contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes d’action des traitements antidiabétiques de la famille de la dapagliflozine. Il permettra notamment de mieux comprendre le lien entre les troubles du fonctionnement cardiaque et les modifications du métabolisme énergétique chez les personnes diabétiques. Ces découvertes pourraient aider à identifier de nouvelles pistes de traitement des complications cardiovasculaires du diabète. Les résultats obtenus pourront également guider la pratique clinique, en précisant quels profils de patients pourraient tirer le plus de bénéfices de la dapagliflozine. Sur le plan méthodologique, le projet favorisera le développement de nouvelles approches d’imagerie cardiaque non invasive. Ces outils pourront ensuite être utilisés pour d’autres maladies du cœur, comme l’insuffisance cardiaque. Enfin, les données issues de ce travail constitueront une base solide pour de futurs essais cliniques chez l’humain. Si les résultats observés chez l’animal se confirment, ils pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des atteintes cardiaques liées au diabète. En résumé, ce projet apportera rapidement de nouvelles connaissances expérimentales sur les effets de la dapagliflozine sur le cœur, et à plus long terme, il pourrait ouvrir la voie à des progrès cliniques concrets dans le traitement des patients diabétiques.

Procédures

nduction du diabète de type 2 Environ 90 rats reçoivent pendant quatre semaines une alimentation riche en graisses afin de reproduire un état de pré-diabète. Ils reçoivent ensuite deux injections à une semaine d’intervalle d’un produit (streptozotocine) qui perturbe légèrement la production d’insuline et permet de stabiliser un diabète modéré, similaire au diabète de type 2 chez l’humain. Les injections sont réalisées sous une anesthésie légère pour limiter le stress et la douleur. L’évolution de la glycémie est ensuite suivie pendant huit semaines. Durée totale de cette phase : environ 12 semaines. Traitement médicamenteux Les animaux reçoivent ensuite la dapagliflozine, un médicament utilisé chez l’homme pour traiter le diabète, pendant quatre semaines. Elle est administrée dans l’eau de boisson de façon naturelle, sans contrainte pour l’animal. Durée : 4 semaines. Imagerie cardiaque par TEP et IRM Chaque animal bénéficie d’un examen d’imagerie pour observer le fonctionnement de son cœur et la manière dont il consomme les graisses comme source d’énergie. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure environ 1 h 30 par animal. Une petite aiguille est placée dans une veine de la queue pour injecter un traceur non douloureux et prélever de très petites quantités de sang (trois fois au maximum, soit moins de 1 mL au total). Nombre d’animaux : 90 répartis en trois groupes. Spectroscopie du phosphore et mesures de relaxation cardiaque Une seconde séance d’imagerie (IRM haute résolution) permet de mesurer la composition énergétique du muscle cardiaque. Cette étape est également réalisée sous anesthésie et dure environ une heure par animal. Test d’effort Les animaux effectuent un test d’endurance sur un tapis roulant, dans des conditions non douloureuses et sans stimulation électrique. La vitesse augmente progressivement jusqu’à ce que l’animal montre des signes de fatigue. Durée : environ 30 minutes par séance, une à deux fois par animal. Mesure des pressions cardiaques (PV loop) Cette procédure terminale se déroule sous anesthésie générale et analgésie. Un petit cathéter est inséré dans une artère du cou pour enregistrer la fonction mécanique du cœur pendant 45 à 60 minutes. À la fin de la mesure, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. sÀ la fin de l’expérimentation, les tissus (cœur, muscle et peau) sont prélevés après euthanasie pour réaliser des analyses biologiques, histologiques et moléculaire.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires liés aux procédures expérimentales et au traitement par dapagliflozine pourraient inclure : - Des douleurs et inconfort après injection IP de la streptozotocine: bien que limitée grâce aux mesures de gestion de la douleur - Une perte de poids : une surveillance stricte du poids sera effectuée pour détecter toute variation anormale. - En cas d’inactivité ou mobilité réduite : une diminution de l'activité spontanée peut être observée immédiatement après les interventions chirurgicales ou anesthésiques, mais elle devrait se résorber en 48 à 72 heures. - Le stress dû à l’expérimentation pourrait se manifester par une réduction du toilettage, une diminution de l'exploration ou des comportements de prostration. Le suivi post-procédure inclura une surveillance immédiate post-injection, avec observation de la fréquence cardiaque et respiratoire jusqu’au réveil complet. Une plaque chauffante sera utilisée pour maintenir la température corporelle des animaux sans augmenter leur consommation énergétique. Un suivi quotidien ou biquotidien sera assuré tout au long de l’expérimentation afin de détecter rapidement toute anomalie. L'état des animaux sera évalué en se basant sur des critères objectifs : comportement alimentaire normal, absence de perte de poids, comportement de fouissage et de toilettage normal, interactions sociales adaptées (absence d'agressivité), absence de stéréotypies et observation d'un déplacement actif. L’ensemble de ces mesures permettra de limiter au maximum les effets indésirables et d’assurer des conditions expérimentales respectueuses du bien-être animal. Le suivi quotidien des animaux inclura une évaluation clinique systématique. Une couverture analgésique est prévue pour toutes les procédures potentiellement douloureuses. Produit et voie d’administration : buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané (forme standard) ou 0,1 mg/kg (forme à libération prolongée) selon la durée de la procédure. Fréquence et durée d’administration : Une première injection est réalisée 30 minutes avant la manipulation. Une réinjection est prévue toutes les 12 heures pendant 24 à 48 h en cas de signes de douleur légère à modérée (évalués selon les grilles de Morton & Griffiths et l’échelle 4Avet). Si une douleur persistante ou plus marquée est observée, un traitement complémentaire par tramadol per os (5–10 mg/kg) mélangé à la nourriture (gelée aromatisée) pourra être administré pendant 48 à 72 h.

Devenir

A la fin de la procédure, les rats (n=90) seront euthanasiés par surdosage en pentobarbital pour analyses histologiques et biochimiques. Concernant les 10 animaux supplémentaires pour la mise en place du traceur ([¹¹C]Palmitate), ils seront également euthanasiés afin de permettre une analyse histologique de la distribution tissulaire du traceur au niveau cardiaque.

Remplacement

L’étude du métabolisme myocardique et de ses modifications sous l’effet de la dapagliflozine, de même la perte urinaire de glucose qu’elle engendre, nécessite une approche prenant en compte les interactions systémiques entre les organes (cœur, foie, rein, système vasculaire). L’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable pour : étudier les modifications dynamiques du métabolisme cardiaque en temps réel à l’aide d’imagerie métabolique comme la TEP au [¹¹C]Palmitate et la spectroscopie RMN du phosphore, évaluer l’impact fonctionnel du traitement sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose, ce qui ne peut être réalisé sur un modèle ex vivo ou in vitro, reproduire un état pathologique complexe (diabète de type 2) qui intègre l’ensemble des interactions systémiques affectant le cœur. Les cultures cellulaires, notamment les cardiomyocytes en culture, permettent d’étudier certains aspects du métabolisme énergétique et des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, elles ne reproduisent pas la complexité d’un organe fonctionnel, notamment les interactions entre les cellules myocardiques, l’environnement extracellulaire et le métabolisme global. De plus, l’impact de la dapagliflozine sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose ne peut pas être correctement évalué sur un modèle cellulaire isolé.

Réduction

Se basant sur le principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires, l’ensemble du projet inclura 100 animaux : 90 rats pour la phase principale d’imagerie, ainsi que 10 animaux supplémentaires pour la mise en place de l’utilisation du traceur ([¹¹C]Palmitate). En absence de données préliminaires chez l'animal, un calcul d'effectif ne peut pas être réalisé. Toutefois, un calcul de puissance sera réalisé après l’évaluation de 50% de l’effectif de façon a ré-évaluer ce chiffre en fonction des résultats et tenter de réduire le nombre total d’animaux finalement nécessaires.

Raffinement

Concernant le raffinement des conditions expérimentales, les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV) avec une pression de 20-25Pa avec un renouvellement de 25 fois le volume d’air de la pièce toutes les heures et une température de 21°±1C. L’exposition à la lumière sera de 6h45 à 18h45. La nourriture, la boisson et la litière seront changées une fois par semaine. La litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée pour les animaux permet de réduire le niveau de stress. Cette litière est plus chère mais possède les avantages d'être peu poussiéreuse, moins allergisante que le résineux. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 afin de conserver les interactions sociales. La litière est enrichie avec de la litière cellulose Alpha Dry permettant la confection de nid. Les procédures expérimentales sont effectuées sous anesthésie et analgésie. A la suite des procédures, un suivi régulier est effectué pendant 5 jours par du personnel expérimenté et formé à l'évaluation des point limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Dans cette étude, l’espèce sélectionnée est le rat Wistar-Kyoto, un modèle préclinique couramment utilisé pour l’évaluation des effets métaboliques et cardiovasculaires des traitements. Le stade de développement choisi est celui de rats âgés de 8 à 9 semaines au moment de l’expérimentation. L’utilisation de rats adultes permet de limiter les biais liés aux changements physiologiques associés à la croissance.

48 souris porteuses d'une mutation humaine liée à la sclérose latérale amyotrophique subissent une chirurgie unique de moins de cinq minutes, sous anesthésie, et sont tuées avant tout réveil. Le porteur décrit chez 36 d'entre elles une dégradation qui court sur des mois avant cet acte, prise de poids réduite dès dix semaines, tremblements, cardiomyopathie sévère, survie médiane de 10,8 mois. La gravité déclarée pour le projet reste "sans réveil", la maladie qui précède l'opération n'y figurant pas. Les tissus sont prélevés juste après la mise à mort, à un stade précoce de cinq mois ou avancé de dix mois.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes physiopathologiques sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De plus, elle peut dans certains cas être associée à des troubles cognitifs de type démence. Des travaux précédents sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démence, avaient permis d’identifier une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie. Un modèle murin portant la même mutation a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts structurels dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades inflammatoires dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies mitochondriales et neurodégénératives. L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet de l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération grâce au modèle de souris génétiquement modifiées qui a été créé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de la neurodégénérescence. Il permettra également de mieux caractériser un modèle animal pertinent pour tester de nouveaux traitements ciblant les maladies mitochondriales et neurodégénératives, en vue de prévenir ou ralentir leur progression. Si l’invalidation de certains gènes montre un effet protecteur, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet financé et mené en collaboration avec des cliniciens, s’inscrit dans une démarche translationnelle. Il présente des retombées cliniques et sociétales potentielles, notamment en améliorant le diagnostic moléculaire et l’implication des patients pour plusieurs maladies rares. En ciblant les mécanismes pathogènes, il contribuera à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. À ce jour, les options thérapeutiques restent limitées, et la prise en charge de ces maladies a un fort impact sur la santé publique. Si les bénéfices économiques sont difficiles à quantifier à ce stade, les avancées attendues en matière de diagnostic et de traitement pourraient avoir un impact majeur pour les patients.

Procédures

Tous les animaux subiront une unique chirurgie sans réveil de l’animal d’une durée de moins de 5 minutes, sous anesthésie et analgésie

Impact sur les animaux

Chez cette lignée de souris, les animaux naissent sans problème apparent. À partir de 10 semaines, ils prennent moins de poids que les autres, puis commencent à en perdre vers 6 mois, en raison d’un dérèglement de leur métabolisme. Vers un an, ils développent une maladie musculaire liée à un dysfonctionnement des mitochondries. Leur état se détériore alors rapidement, avec une perte de poids importante, des tremblements et de graves problèmes cardiaques, entraînant la mort autour de 14 mois (avec une survie moyenne de 10,8 mois). Des troubles de l’apprentissage et de la mémoire apparaissent dès 10 mois, mais l’atteinte neurologique reste modérée et n’est pas la cause principale de la mort, qui est due à l’insuffisance cardiaque. Les signes visibles de la maladie apparaissent en fin de vie, notamment une perte de poids de plus de 5 pour cent, parfois supérieure à 15 pour cent en une semaine. Les animaux peuvent ressentir un inconfort et une légère douleur passagère lors des injections. L'opération sera pratiquée sous anesthésie générale, qui peut entraîner certains effets secondaires comme un refroidissement du corps, une sécheresse des yeux ou, très rarement, une baisse du rythme cardiaque ou respiratoire.

Devenir

Un total de 48 animaux sera donc utilisé dans cette procédure. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de prélever les tissus d’intérêt à analyser pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Pour mieux comprendre le lien entre mutation génétique et pathologie, une première étape a consisté en la caractérisation d’un modèle cellulaire : des expériences ont été réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt. Ces expériences ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modèles cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme, en particulier la récupération de tissus post mortem permettant des études électrophysiologiques.

Réduction

Avec l’aide de biostatisticiens, des protocoles ont été établis pour analyser plusieurs paramètres à partir d’un même prélèvement, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans cette logique de réduction, un calcul de puissance a été réalisé afin de déterminer la taille minimale des groupes nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des statistiques prédictives ont également été utilisées pour ajuster les effectifs, en tenant compte de notre expérience, de la nature des expériences, des paramètres mesurés et de leur variabilité. Il a ainsi été déterminé que des groupes de 3 souris par stade d’analyse sont suffisants. Deux stades de développement seront étudiés, avec 4 génotypes d’intérêt, chez les mâles et les femelles. Cela représente un total de 48 souris. Parmi elles, 36 développeront un phénotype dommageable, les 12 autres n’en présenteront pas. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats obtenus.

Raffinement

La dimension des cages permettra aux souris d’être hébergées dans un groupe dont la taille dépendra du poids des animaux (6 animaux (25-30g), 5 animaux si poids supérieur à 30g) leur permettant de répondre à leurs besoins comportementaux. Un suivi quotidien des animaux, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur notamment en lien avec le phénotype dommageable des animaux. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids, nous pèserons nos animaux chaque semaine dès leur entrée en procédure, et renforcerons la fréquence de pesée en cas d’observation d’une perte de poids . De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la nourriture et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (maison en carton, coton, etc.). Tous les animaux seront euthanasiés à 10 mois maximum afin d’éviter d’observer une mortalité liée au phénotype dommageable. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car il s’agit de l’espèce la plus utilisée et la mieux caractérisée en recherche biomédicale, notamment pour l’étude des maladies neurodégénératives. Son système nerveux présente de fortes similarités avec celui de l’humain et il existe de nombreux modèles transgéniques validés de sclérose latérale amyotrophique (SLA) permettant de reproduire des aspects essentiels de la pathologie. La souris est également adaptée pour des suivis sur plusieurs mois, grâce à sa durée de vie relativement courte, sa taille permettant des manipulations standardisées et l’existence de nombreuses ressources génétiques. Dans notre projet, nous utiliserons un croisement de deux lignées génétiquement modifiées : l’une reproduit une mutation retrouvée chez des patients atteints de SLA, l’autre est modifiée au niveau d’un gène impliqué dans l’inflammation. Ce croisement nous permettra d’évaluer si l’invalidation de certains gènes liés à l’inflammation peut limiter les effets de la neurodégénérescence. Deux stades de développement seront étudiés, avec 24 animaux par stade : – un stade précoce (5 mois), correspondant à l’apparition des premiers signes moléculaires, sans symptômes visibles ; – un stade avancé (10 mois), proche de la phase terminale de la maladie, où les animaux présentent une perte de poids importante et une cardiomyopathie sévère

Former des internes et des chirurgiens en exercice à la cœlioscopie gynécologique, sur un modèle vivant plutôt que sur des patientes. 20 cochons vont être utilisés dans une procédure unique de chirurgie sous anesthésie générale profonde, tués avant tout réveil. L'intervention peut durer jusqu'à sept heures, plusieurs apprentissages étant enchaînés le même jour sur le même animal par plusieurs chirurgiens en formation, avec les risques d'hémorragie, d'hypotension, d'hypothermie et d'hypoventilation que le porteur énumère. Il justifie le recours au porc par une anatomie thoracique, abdominale et pelvienne proche de celle d'une femme adulte, et cite l'objectif éthique de la Haute Autorité de santé, "jamais la première fois sur le patient".

Objectifs

A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, nous organisons des travaux pratiques en chirurgie et pratiques interventionnelles pour les jeunes chirurgiens en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte (laparotomie) et par coelioscopie (ou laparoscopie), répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue. La formation s’effectue de façon progressive et intégrée au sein 1) du laboratoire de simulation, 2) du laboratoire d’anatomie, 3) du laboratoire de chirurgie ouverte et de laparoscopie sur porcs.

Bénéfices attendus

Ces sessions de formation répondent au rapport aux objectifs de la mission de la Haute Autorité de Santé sur l’état de l’art (national et international) en matière de pratiques de simulation dans le domaine de la santé : « La formation par les méthodes de simulation en santé doit être intégrée dans tous les programmes d'enseignement des professionnels de santé à toutes les étapes de leur cursus (initial et continu). Un objectif éthique devrait être prioritaire : « jamais la première fois sur le patient ». Ces sessions permettent la formation initiale des internes et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine.

Procédures

Procédure unique de chirurgie sous anesthésie générale profonde et analgésie- Durée maximale 7 heures

Impact sur les animaux

Procédure chirurgicale, sous anesthésie générale longue (7h maximum) pouvant causer un stress et de la douleur et soumettant l’animal aux risques chirurgicaux et anesthésiques classiques (hémorragie, hypotension, hypothermie, hypoventilation).

Devenir

L’ensemble des procédures chirurgicales réalisées lors de cet enseignement ne permettant pas un réveil et un maintien en vie dans de bonnes conditions, aussi l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde.

Remplacement

Préalablement à l’accès à la formation chirurgicale sur modèle porcin, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie.

Réduction

Le nombre maximum estimé d’animaux (porcs) nécessaire à cet enseignement est de 20 animaux pendant 5 ans. De façon à réduire le maximum d’animaux nécessaires les différentes procédures d’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs chirurgiens en formation.

Raffinement

Avant la procédure, les animaux peuvent être hébergés par 2 ou 3 par box, au sein d’une même pièce, selon leur taille, le sexe et leur comportement, permettant une communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes. De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique sera donné de façon adaptée à chaque procédure. Un suivi des points limites strict et spécifiques au projet est réalisé tout au long de la procédure.

Choix des espèces

L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Jeunes porcs adultes, 4-6 mois, 80-100kg, similitude anatomique et physiologique avec un être humain féminin adulte au niveau thoracique, abdominal et pelvien.

Deux heures trente d'anesthésie, deux injections dans l'abdomen et une dans une veine, sans réveil prévu. 106 souris porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance cardiaque vont être maintenues sous anesthésie et tuées avant tout réveil, leur cœur étant prélevé pour des examens fonctionnels et histologiques. L'équipe veut appliquer aux petites artères du cœur malade une imagerie par ultrasons capable de mesurer des vaisseaux de quelques dizaines de microns. Sur les effets indésirables, le résumé ne retient que la contention, une injection d'antalgique et le léger stress de la cage d'induction, sans un mot sur les deux heures et demie qui suivent.

Objectifs

La circulation des artères et des veines du cœur est responsable de la perfusion du cœur. Les modifications du débit des vaisseaux du cœur ont des conséquences graves sur ses performances. À ce jour, seules les grosses artères de l’ordre du millimètre peuvent être visualisées chez l'homme par les techniques telles que les scanners ou l’IRM. Ces dernières années, nous avons démontré au laboratoire la faisabilité de l’imagerie des vaisseaux par ultrasons. Cette technique permet de visualiser des vaisseaux de quelques dizaines de microns. En plus de ces données anatomiques, nous avons aussi mis au point les techniques de mesure de flux sanguins dans les vaisseaux qui ont un intérêt thérapeutique important en cardiologie. Une première étude sur des rats a déjà été effectuée au laboratoire pour laquelle nous avons obtenu l’autorisation auprès du comité d’éthique. Cette Étude a été réalisée avec succès avec une publication. Grace à cette technologie, nous sommes maintenant en mesure de mesurer les diamètres des vaisseaux de quelques dizaines de micron et de calculer leur débit sanguin. Nous avons aussi mesuré les variations de leur débit et de leur diamètre lors d’une dilatation des vaisseaux. Nous voudrions maintenant mettre en évidence une différence de réactivité et d’anatomie de ces vaisseaux dans des cas pathologiques. Pour cela, nous proposons d’utiliser cette méthode dans le cas de l’insuffisance cardiaque. Nous utiliserons une souche de souris mutantes développant les symptômes de cette pathologie. Avec ce modèle d’imagerie microscopique non invasif, nous pourrons mettre en évidence les effets précoces du développement de l’insuffisance cardiaque sur la circulation des très petits vaisseaux du cœur.

Bénéfices attendus

Grace à ce modèle de souris mutante développant les premiers symptômes de l’insuffisance cardiaque que nous allons caractériser avec la méthode d’imagerie à l’échelle microscopique en trois dimensions, nous comptons démontrer le rôle prépondérant de l’impact de la dysfonction de l’architecture des petits vaisseaux sur le développement de l’insuffisance cardiaque. Il est bien établi que cette dysfonction est reconnue comme un stade précoce du développement de la maladie. Il est important de bien caractériser ce phénomène afin de pouvoir trouver des outils diagnostics et des cibles thérapeutiques avant les effets plus délétères de la pathologie.

Procédures

Les animaux subiront une contention pour être placés dans une cage d’induction. Ils subiront une anesthésie gazeuse puis pendant l’anesthésie, 2 injections intra péritonéales et une injection intra veineuse. La procédure durera pendant deux heures et demi sera sans réveil.

Impact sur les animaux

La souris sera contentionée et subira une injection intra péritonéale d’antalgique. Elle sera introduite dans une cage d’induction susceptible d’engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prélever le cœur pour d'autres examens fonctionnels et histologiques.

Remplacement

La complexité du système vasculaire ne nous permettait pas de mettre au point cette méthode sans utiliser des animaux. Dans cette étude des mécanismes de développement de l’insuffisance cardiaque nous sommes obligés d’utiliser des modèles qui sont très spécifiques. Ces souris mutantes ont été caractérisées dans d’autres études. Seule L’application de cette méthode qui est nouvelle sur ce modèle nous permettra de découvrir les mécanismes du développement de la maladie.

Réduction

Sur la base de notre expérience sur ce modèle expérimental, ainsi qu’à partir des données de la littérature sur ce modèle, nous avons pu optimiser le nombre d'animaux par groupe pour obtenir des résultats significatifs avec le plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 6 individus pour favoriser leurs comportements sociaux dans un environnement enrichi avec un accès illimité en eau et nourriture. L’expérience est réalisée sous anesthésie avec une analgésie et des points limite précoces ont été définis pour éviter toute souffrance. Les animaux seront mis à mort avant la phase de réveil pour permettre de poursuivre un travail ex vivo.

Choix des espèces

Les développements effectués sur les veines et les artères du cœur de souris dont la structure est élaborée et complexe pourront être utilisés de façon fiable sur les études futures chez l’homme. La souche de ces souris mutantes répond aux critères d’exploration de la méthode. Il a été démontré par des méthodes histologiques la circulation des petits vaiseaux du cœeur de ces souris étaient altérée. Ce qui représente un modèle de choix afin de caractériser « in vivo » ces altérations grâce à nos méthodes.

Trente minutes d'arrêt complet de la circulation, le corps refroidi à 18 °C ou entre 25 et 28 °C : 10 cochons vont être ouverts par sternotomie sous anesthésie profonde et tués avant tout réveil. Une circulation extracorporelle est installée en trente minutes, des capteurs sont posés dans l'œsophage et la veine jugulaire, et des prélèvements sanguins suivent des marqueurs d'atteinte cérébrale pendant toute l'opération. Le projet compare deux stratégies de protection du cerveau employées en chirurgie cardiaque humaine, dont le porteur écrit qu'elles donnent déjà des résultats similaires chez les patients pour des arrêts de 30 minutes. Il retient des cochons de 50 à 60 kg, âgés d'environ six mois, parce que la taille de leur cœur permet d'utiliser la même machine de circulation extracorporelle qu'au bloc opératoire.

Objectifs

Dans certaines opérations du cœur, notamment lorsqu’il faut intervenir sur l’aorte, les chirurgiens doivent utiliser une machine cœur-poumons qui remplace temporairement le travail du cœur et des poumons. Pendant ces interventions délicates, il est aussi essentiel de protéger le cerveau. Aujourd’hui, deux techniques principales existent pour cela : refroidir modérément le corps (25–28°C), arrêter la circulation pendant 30 minutes, et envoyer du sang vers le cerveau par une artère du cou ou du bras pour le protéger, puis réchauffer progressivement le patient ; ou refroidir profondément le corps (18°C), arrêter complètement la circulation pendant 30 minutes sans envoyer de sang au cerveau, puis réchauffer progressivement le patient. Notre projet se déroule dans 2 établissements différents (un pour l'hébergmeent et la pré-anesthésie des animaux et un deuxième pour la procédure à proprement dite)et consiste à comparer ces deux méthodes pour savoir laquelle protège le mieux le cerveau pendant l’opération. Pour cela, nous utiliserons plusieurs types de mesures : un enregistrement de l’activité électrique du cerveau, des analyses de sang pour détecter des substances qui indiquent si le cerveau a souffert, et l’étude du tissu cérébral après l’expérience pour rechercher d’éventuelles lésions. Le but principal est de déterminer les forces et les limites de chaque technique afin d’améliorer la protection du cerveau lors des opérations cardiaques. Le deuxième objectif est de voir comment les différentes mesures (enregistrement cérébral, analyses sanguines, examen des tissus) se complètent et se correspondent pour chacune des deux méthodes.

Bénéfices attendus

Il existe très peu d’études qui comparent directement ces deux techniques de protection du cerveau. Celles qui existent sont difficiles à interpréter, car elles se basent souvent uniquement sur un enregistrement de l’activité du cerveau et elles mesurent rarement des marqueurs biologiques. Surtout, elles n’étudient presque jamais le tissu cérébral lui-même. Comme les deux méthodes que nous voulons comparer semblent donner des résultats similaires chez les patients pour des arrêts de circulation de 30 minutes, il nous paraît important de regarder plus précisément leurs effets sur le fonctionnement du cerveau et sur le tissu cérébral. Cela permettra de mieux comprendre leurs avantages et leurs limites et d’aider à améliorer les techniques de protection cérébrale utilisées en chirurgie cardiaque.

Procédures

Ce projet se déroule dans 2 établissements nommés établissement 1 ou établissement 2. Les cochons auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress du à la manipulation (durée 2 minutes) à l'animalerie (établissement 2). Les expérimentations ont lieu dans l'établissement 1 : une perfusion intraveineuse sera posée (2 minutes) afin de permettre une anesthesie générale. A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde. L'assistance circulatoire sera installée (durée 30 minutes) par sternotomie. Des capteurs seront mis en place pour monitorer l'activité cérébrale, l'activité cardiaque et la température à différents endroits d'intérêt (oesophage, veine jugulaire). Des prélèvements sanguins auront lieu pour suivre des indicateurs sanguins tout au long de l'opération.

Impact sur les animaux

Les injections intra-musculaires d'anxiolytiques peuvent induire un stress léger et une courte douleur (quelques secondes). La contention de l'animal et l'installation d'une voie veineuse périphérique peut induire un stress modéré et une douleur légère. Risque inhérent à la chirurgie : une perte de sang légère peut avoir lieu lors de la pose des canules.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'une étude des tissus post mortem.

Remplacement

Pour cette étude, l’utilisation d’une circulation extra-corporelle est indispensable, car elle permet de recréer des conditions très proches de celles rencontrées lors d’opérations chez l’humain. Les modèles réalisés sur ordinateur ou en culture de cellules ne peuvent pas reproduire correctement les interactions complexes entre la circulation sanguine et le cerveau. Le choix du porc se justifie parce que son système cardiovasculaire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, et parce que sa taille permet d’utiliser une machine de circulation extra-corporelle comme en chirurgie cardiaque réelle.

Réduction

Une estimation statistique a été réalisée pour déterminer combien d’animaux étaient nécessaires afin de comparer correctement les deux techniques de protection du cerveau. Selon ce calcul, 10 animaux au total sont suffisants pour obtenir des résultats fiables. L’étude comparera donc deux approches : une méthode avec refroidissement modéré et apport de sang vers le cerveau, et une méthode avec refroidissement plus profond sans apport de sang. Même si le nombre d’animaux reste volontairement limité pour respecter les règles éthiques, le protocole est conçu pour fournir des résultats solides et utiles. L’analyse des données sera faite de manière rigoureuse et transparente afin d’interpréter correctement les différences entre les deux techniques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en petits groupes pour réduire leur stress et leur angoisse. Leur environnement est aménagé avec des jouets (balles, cordes) pour les stimuler et favoriser leur bien-être. Avant le début de l'expérience, ils ont une période d'acclimatation d'au moins sept jours pour s'habituer à leur nouveau cadre de vie et réduire le stress. Avant l'intervention, on leur donne des médicaments pour les détendre et pour soulager la douleur afin de les manipuler sans qu'ils aient peur ou soient soumis à des traitements douloureux. Durant l'expérience, les animaux sont sous anesthésie et analgésie profonde, et leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, respiratoire, pression artérielle) sont surveillés en continu. Si un signe de douleur apparaît, les médicaments sont ajustés immédiatement pour garantir leur confort. Leur état et leurs paramètres vitaux sont suivis de près pour détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse. Des points limites à chaque étape du protoc ole ont été établis.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser le porc car son organisme présente de fortes ressemblances avec celui de l’être humain, en particulier pour le cœur et la circulation sanguine. Cela en fait un modèle adapté pour étudier des techniques employées en chirurgie cardiaque. Ce modèle animal est couramment utilisé dans des travaux de recherche et a déjà montré qu’il reproduit de manière fiable les conditions rencontrées chez l’homme. Les animaux sélectionnés pèsent entre 50 et 60 kg, ce qui correspond à un âge d’environ six mois. À ce stade de développement, leur cœur et leur système circulatoire ont des proportions similaires à celles de l’être humain, ce qui permet de mener l’étude dans des conditions aussi proches que possible de la réalité clinique.

Ouvertes au niveau de l'abdomen sous anesthésie pour que la veine alimentant le foie soit perfusée, 101 souris ne sont pas réveillées et meurent au terme d'une intervention de moins de 30 minutes. Elles sont utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, le porteur en concluant qu'aucune nuisance n'est attendue au-delà du stress de la manipulation préalable. Le projet vise pourtant à monter des cultures cellulaires permettant d'étudier le dialogue entre cellules leucémiques et cellules du foie "sans utilisation de souris vivantes". Ces cultures exigent des cellules hépatiques fraîches, faute de lignée immortalisée disponible, donc le foie de 101 souris tuées pour cela.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre en place un protocole d’étude en culture (sans utilisation de souris vivantes) du dialogue entre les cellules du cancer du sang et les cellules du foie. Nous avons choisi cet organe car c'est là que les cellules cancéreuses vont migrer lors de la propagation de la maladie. Il a été précédemment montré que les cellules du cancer du sang présentent des modifications de leur capacité de prolifération et de leur propriété cancéreuse lorsqu'elles ont colonisé le foie, les rendant plus agressives et moins sensibles aux traitements anti-cancéreux. Afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de ces modifications, nous souhaitons établir des expériences de culture entre cellules cancéreuses et les cellules du foie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est double : (1) il permettra de réaliser certaines expériences sans l'utilisation de souris vivantes pour répondre à ces questions scientifiques et (2) apportera des pistes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du sang avec métastases dans le foie.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet subiront une chirurgie (ouverture de l'abdomen pour visualisation de la veine alimentant le foie) sous anesthésie et analgésie. Cela permettra la mise en place d'un système de perfusion permettant d'éliminer les cellules du sang dans cet organe et ainsi obtenir les cellules du foie pour leur mise en culture. Cette procédure dure moins de 30 minutes. Les souris ne sont pas réveillées et sont mortes à l'issue de la procédure et le foie pourra être prélevé.

Impact sur les animaux

La manipulation de l'animal pour la préparation de la chirurgie peut générer un éventuel stress. Ensuite, aucune nuisance, ni effet indésirable n’est attendu chez les animaux, car ils seront anesthésiés et analgésiés dès le début de la procédure, et la perfusion du foie ne sera réalisée que lorsqu’ils seront complètement endormis.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans ce projet car cela permet de récupérer le foie afin de mettre en place nos cultures avec les cellules cancéreuses dans des systèmes n'utilisant pas d'animaux vivants.

Remplacement

La mise en place de notre système de culture nécessite l’utilisation de cellules du foie de souris. Ils ne peuvent donc pas être remplacés par un autre modèle car à ce jour, il n'existe pas de lignées de cellules de foie pouvant être cultivées indéfiniment (lignée de cellules immortalisées). Nous avons donc décidé de prélever le foie de souris pour ensuite réaliser nos tests sans recours à d'autres animaux vivants.

Réduction

Le nombre de souris minimal a été déterminé grâce à des expériences antérieures qui ont permis de connaitre le nombre de cellules du foie qui peuvent être isolées à partir d’une souris. Ce nombre d’animaux a été défini pour pouvoir réaliser un grand nombre de d’expériences afin de répondre aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Le protocole expérimental sera réalisé sur des souris préalablement anesthésiées et ayant reçues des anti-douleurs afin qu'elles ne ressentent aucune souffrance, ni douleur. A l'issue de la procédure chirurgicale, les souris ne seront pas réveillées mais immédiatement euthanasiées.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, il intègre les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension des étapes du développement des cancers. De plus, ce projet s'inscrit dans la continuité de nos recherches réalisées sur des modèles souris de cancer du sang. Nous utiliserons des souris adultes (5 à 12 semaines) afin d'être en cohérence avec nos précédents projets et avec les données scientifiques déjà publiées.