Procédures sans réveil
Diplôme Universitaire de microchirurgie
- Enseignement supérieur
Jusqu'à cinq artères, deux veines et deux nerfs suturés sur un même animal : 960 rats vont être opérés sous anesthésie pendant trois heures au maximum, puis tués avant tout réveil. Les nuisances annoncées comprennent des thromboses, des lésions accidentelles de tissus et une mort par hémorragie, plus fréquentes sur les premiers rats confiés à un étudiant qui débute. Chaque étudiant dispose de seize rats. Ces sutures servent à valider un diplôme universitaire de microchirurgie, dont le porteur décrit la formation pratique comme "primordiale".
Objectifs
La microchirurgie est une discipline chirurgicale qui permet de réparer les petits vaisseaux ou les nerfs des doigts, de la main ou du poignet. Ces techniques permettent, en urgence, de réimplanter les doigts, de suturer les nerfs ou les artères lésés à la main ou au poignet ou de réaliser des reconstructions complexes de la main (lambeaux de couvertures, greffe d’orteil pour reconstruire le pouce par exemple). Ces sutures des vaisseaux et des nerfs doivent être réalisées par un chirurgien spécialisé. Ces gestes doivent être parfaitement maitrisés car ils sont réalisés en urgence et le temps est un facteur primordial pour la survie du membre traumatisé et pour le bon rétablissement du patient. Cette compétence s’acquiert par un Diplôme Universitaire de microchirurgie dans le cadre de la formation initiale du chirurgien de la main, ainsi que par une pratique de la microchirurgie au quotidien. Les éléments à réparer sont extrêmement fins, et nécessitent une grande habileté micro chirurgicale. Le diamètre des artères digitales est de l’ordre du millimètre. Le chirurgien utilise une loupe binoculaire qui va grossir la zone à réparer. Par une chirurgie minutieuse, il va isoler une artère collatérale de doigt, un nerf collatéral de doigt ou une micro veine. Il va relier les éléments sectionnés sur un clamp microchirurgical, puis va suturer bout-à-bout le nerf, l’artère ou la veine afin de rétablir la continuité de ces éléments. Dans le cadre de ce DU, la formation pratique est primordiale. Les entrainements se font d’abord sur un support d’entrainement à l’anastomose pour apprendre à faire les sutures sous la binoculaire, une fois cette étape validée, les étudiants se forment sur des rats de laboratoire car les vaisseaux et les nerfs du rat ont une dimension proche de ceux des doigts humains. La suture du vaisseau est validé grâce à un teste d'étanchéité appelé test de Patency qui permet de voir si le sang passe et donc si l'anastomose est réussie. Il n’est donc pas nécessaire de garder le rat en vie, le rat est mis à mort avant son réveil. Il s’agit d’une procédure réalisée sous anesthésie générale avec emploi d’analgésique où les étudiants sont encadrés par du personnel compétent en expérimentation animale. Le DU est validé avec un examen pratique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet est la formation de chirurgiens compétents en micro-chirurgie qui vont ensuite réaliser ces gestes sur l'Homme, souvent dans des situations d'urgences où les techniques doivent être parfaitement maitrisées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie sous anesthésie générale d'une durée de 3h00 maximum.
Impact sur les animaux
Puisqu'il s'agit d'apprentissage il peut y avoir des effets indésirables sur les rats. Les nuisances possibles sont : le stress généré lors de l'anesthésie (contention, injection), des thromboses sur les vaisseaux, une mort accidentelle par hémorragie, des tissus lésés accidentellement pouvant provoquer de l'inconfort ou un peu de douleur notamment sur les premiers rats lorsque l'étudiants n'est pas encore très habitué ou un problème avec l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la chirurgie avant leur réveil car il n'est pas nécessaire de garder les animaux vivants pour vérifier l'efficacité des sutures, un test d'étanchéité est réalisé directement sur les vaisseaux suffit. Le fait de garder les animaux après la chirurgie pourrait provoquer plus de gêne et d'éventuelles douleurs post-opératoires non-anticipables avant le réveil, n'aurait aucun bénéfice et serait contraire au bien-être animal.
Remplacement
L'apprentissage des sutures sur les vaisseaux ne peut se faire que sur un être vivant avec un circulation sanguine afin de valider l'efficacité de la suture.
Réduction
Avant de passer sur le rat les étudiants s'entrainent sur un support en silicone afin de maitriser la manipulation des instruments et du fil avant de commencer à travailler sur le rat. Le support ne permet pas le remplacement total de l'animal mais permet d'en réduire le nombre. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, jusqu'à 5 artères (2 carotides, 2 fémorales, 1 caudale), 2 veines (fémorales) et 2 nerfs (sciatiques) pourront être suturés par rat. De plus le nombre de rats est limité par étudiants, chacun a droit à un maximum de 16 rats.
Raffinement
Les rats sont hébergés par 2 avec des enrichissements (bout de bois, tunnel...), la nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant le jour de la chirurgie. Les animaux sont sous anesthésie générale avec analgésie et anesthésiant local (pour le nerf) pour qu'ils ne ressent aucune douleur pendant l'opération.
Choix des espèces
Le rat adulte (500-600g) est utilisé car la taille des vaisseaux et des nerfs les plus gros chez le rat est proche de la taille des vaisseaux et nerfs des doigts humains.
Formation au Diplôme d’Etude spécialisé (DES) de chirurgie
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des internes en chirurgie, pas produire des connaissances : 120 porcelets de 40 kg sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal est opéré pendant environ trois heures par quatre chirurgiens de spécialités différentes, qui enchaînent sur lui des gestes thoraciques, abdominaux, digestifs et vasculaires. Le porteur présente cette mutualisation comme une mesure de réduction, tout en indiquant que la demande annuelle d'inscriptions est quatre fois supérieure à ce qu'il peut accueillir. Il affirme que les simulateurs et la réalité immersive ne permettent pas d'apprendre à gérer une hémorragie, et conclut que le recours à l'animal vivant est "indispensable".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de former des internes en chirurgie aux techniques chirurgicales spécialisées par coeliscopie ou laparotomie en chirurgie thoracique, abdominale, digestive, vasculaire... Plusieurs chirurgiens de différentes spécialités pratiquent sur le même porcelet (4 chirurgiens/porcelet) pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Ainsi sur un même animal, plusieurs techniques de diverses spécialités sont réalisés. La durée de la chirurgie sera d’environ 3h.
Bénéfices attendus
Le DES permet aux internes en chirurgie de se former sur des techniques spécifiques de chirurgie pour à terme obtenir le DES et transposer ces techniques chez l’humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 3h, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le transport de l’animal au bloc opératoire et la chirurgie, sont les deux points où l’animal pourrait ressentir du stress, douleur ou souffrance. Afin de d’éviter cela, des protocoles dédiés sont réalisés pour la sédation, l’anesthésie et l’analgésie.
Devenir
Respect du protocole des « animaux sans réveil », selon la réglementation.
Remplacement
Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de chirurgie viscérale pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain. Ces animaux sont opérés sous anesthésie générale. Il existe des méthodes d’entrainement en chirurgie tels que les simulateurs haute et basse fidélité ou la réalité immersive. Cependant, ces dispositifs ont leurs limites. Dans le cadre de notre formation, ils ne permettent pas d’appréhender la gestion de l’hémostase (hémorragie), la faisabilité d’un prélèvement d’organe et de sa réimplantation, la gestion d’une fuite de liquide cérébro-spinal. C'est pourquoi, le recours au modèle animal vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de chirurgie pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain.
Réduction
Nous avons de très nombreuses demandes d’inscriptions sur les formations proposées, la demande annuelle est multipliée par 4. Nous avons investi dans des simulateurs virtuels et nous utilisons des sous-produits animaliers pour réduire le nombre annuel d’animaux vivants. Nous prévoyons 24 animaux/an (soit 120 animaux/5 ans). Ce nombre sera revu à la baisse et uniquement à la baisse en fonction du nombre d’internes inscrits. De plus, toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, plusieurs chirurgiens pratiquent sur le même animal ; plusieurs chirurgiens effectuent plusieurs gestes de diverses spécialités sur un même animal, toujours dans l'objectif d’utiliser moins d’animaux.
Raffinement
La pose d'un cathéter permet de réduire le nombre d'injections. L'utilisation d'un monitoring lors de l'anesthésie (avec mesure des constantes : saturation d'oxygène, fréquence cardiaque, pression artérielle...) permet de définir des points limites précoses et de prendre les décisions sur le devenir de l'animal.
Choix des espèces
Le porcelet de 40 kg est l'animal le plus proche de l'anatomie humaine car la taille de ses organes et son métabolisme permet aux chirurgiens de se mettre en situation similaire à la chirurgie d'un patient humain. Nous pouvons utiliser la même instrumentation et les gestes techniques sont les même que chez un patient opéré. Les porcelets utilisés sont des jeunes adultes de 3 à 4 mois d'environ 40 kg. Le choix de ce stade de développement est tout simplement dû au poids de l'animal approchant du poids moyen d'un jeune humain. Un poids supérieur poserait un problème de manipulation (pas de matériel de levage adapté). De plus, ce modèle permet d’utiliser les mêmes instruments que chez l’humain.
Mise au point et utilisation d’un modèle de circulation extracorporelle chez le rat pour l’étude de la clairance pulmonaire de l’hydrogène
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer la vitesse à laquelle les poumons éliminent l'hydrogène, 45 rats sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit jusqu'à trois heures de chirurgie : intubation, ouverture du thorax et de l'abdomen pour poser des capteurs sur le cœur et le foie, puis incision du cou pour brancher les deux artères carotides à un circuit sanguin extérieur. Le porteur signale un risque d'hémorragie et de détresse cardio-respiratoire au moment de la mise en circulation extracorporelle. Il indique que le réveil ne peut être envisagé, les lésions infligées étant irréversibles, et justifie l'ensemble par la perspective de proposer un jour l'hydrogène comme médicament aux autorités de santé.
Objectifs
Actuellement présenté comme une alternative écologique aux énergies fossiles, l'hydrogène (H2) possède également un potentiel thérapeutique important, notamment pour le traitement des maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, métaboliques ou encore des cancers. Toutefois, avant de pouvoir proposer cette molécule peu coûteuse et facile à produire comme candidat médicament aux authorités de santé, il est nécéssaire de décrire son comportement quand il est administré à un mammifère. Il est notamment important de comprendre comment il se distribue dans l'organisme, quel(s) organe(s) il peut atteindre en fonction de son mode ou de sa voie d'administration et surtout comment il est éliminé de l'organisme et à quelle vitesse. Les études réalisées jusqu'à aujourd'hui ont permis de confirmer que l'élimination de l'H2 est essentiellement pulmonaire et que le mode d'administration qui permet d'atteindre les concentration sanguines les plus élevées est l'inhalation. Notre projet propose de mettre au point un systéme permettant de détourner le sang artériel d'un rat à l'extérieur de son organisme (circulation extracorporelle artério-artérielle (CEC-AA)) pour permettre une hydrogénation du sang qui soit équivalente à l'administration par inhalation, mais qui n'interfére pas avec l'élimination pulmonaire d'H2. Cette approche permettra de mesurer précisément l'élimination pulmonaire d'H2 en maîtrisant son administration au niveau artériel. Cette demande concerne une phase de mise au point de la CEC-AA chez le rat et une phase de mesure de l'élimination pulmonaire d'H2 quand il est directement dissous dans le sang d'un animal par l'intermédiaire de la CEC-AA.
Bénéfices attendus
Le présent projet de recherche permettra de compléter les données pharmacocinétiques de l'hydrogène administré dans le sang artériel et de mettre au point un modèle de l'élimination (clairance) pulmonaire d'H2 chez un mammifère vivant. Ces données sont un prérequis nécéssaire pour proposer, à terme, l'hydrogène comme médicament aux autorités de santé.
Procédures
Chaque animal subira un protocole chirurgical sous anesthésie générale volatile avec analgésie (injection sous-cutanée unique), d'une durée maximale de 3 heures, pendant lequel il subira une intubation, une ouverture thoracique et une ouverture abdominale pour la mise en place de capteurs (coeur et foie), puis une incision cutanée au niveau du cou pour introduire des tubulures dans les deux artères carotides pour la mise en place d'un système de circulation extracorporelle. A l'issue de la chirurgie et toujours sous anesthésie générale, une injection léthale sera administrée.
Impact sur les animaux
Une anesthésie générale profonde avec une couverture analgésique comporte un risque de détresse cardio-respiratoire, particulièrement au moment de la mise en place de la circulation extracorporelle. Par ailleurs, la chirurgie vasculaire présente des risques hémorragiques qui peuvent mettre en danger la vie de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le protocole chirurgical mis en oeuvre induisant des lésions irréversibles à l'animal, le réveil ne peut être envisagé sans l'exposé à des douleurs sévères post-opératoires.
Remplacement
Des études d'efficacité de traitements à l'hydrogène ont été réalisées, sur des modèles cellulaires et sur organes isolés, qui ont confirmé le potentiel thérapeutique de cette molécule. La présente étude a pour objectif de définir un modèle préclinique précis pour permettre l'analyse de l'élimination pulmonaire de l'H2 suite à une administration aiguë dans le sang. Nous disposons également de données concernant la distribution dans l'organisme d'H2 suivant différents modes d'administration chez le rat in vivo. Les résultats de cette étude permettront de les compléter pour construire un modèle physiologique du devenir de H2 qui pourra être appliqué chez l'homme. Le contexte physiologique ne peut donc pas être remplacé par un modèle in-vitro ou in-silico.
Réduction
Un lot de 25 rats est prévu pour la mise au point du système de CEC et pour sa caractérisation. Ce nombre est un maximum qui pourra vraisemblablement être inférieur. De plus, certains des animaux utilisés pour cette phase de mise au point pourront provenir d'autres protocoles (réutilisation). Un total de 20 rats (2 groupes de 10 animaux) sera utilisé pour l'étude de l'élimination pulmonaire d'H2. Afin de réduire le nombre d'animaux pour cette étude chaque animal constituera son propre contrôle. Le nombre d'animaux dans chacun de ces 2 groupes expérimentaux a été établi en tenant compte du risque de mortalité avant la fin du protocole (2 animaux par groupe) de façon à garantir un nombre total de 8 animaux par groupe. Ce nombre est justifié sur un plan statistique rigoureux.
Raffinement
Le protocole expérimental sera réalisé sans réveil et l'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie. L'animal sera placé sur un matelas chauffant et sous une couverture de survie pour garantir le maintien de sa température coroprelle qui sera monitorée par l'intermédiaire d'une sonde rectale. Les paramtère vitaux seront suivis en continu par l'intermédiaire de 3 électrodes électrocardiographiques et deux capteurs de pression artérielle, placés aux points d'entrée et de sortie de la CEC.
Choix des espèces
L'objectif de l'étude est d'établir un modèle physiologique de la distribution dans l'organisme et de l'élimination de l'H2 qui soit transposable à l'homme. Les études in vivo précentes sur l'hydrogène ont été réalisées jusqu'à présent sur le rat, notre modèle doit donc être complété par des données obtenues sur la même espèce pour pouvoir mettre les résultats en cohérence avec l'existant et construire le modèle qui sera par la suite paramétré avec des données humaines. Nous utiliserons des animaux adultes d'un poids corporel minimum de 300 grammes pour qu'ils soient adaptés à la mise en place de la CEC.
Rôle des microglies dans le développement cérébral murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont gavées une fois, ou soumises pendant sept jours à un régime alimentaire modifié. Elles sont ensuite tuées, leurs petits anesthésiés puis tués à différents stades du développement, de l'embryon à l'adulte. 1 750 souris sont concernées, 1 350 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 400 sous anesthésie sans réveil. Le porteur reconnaît que le gavage peut léser l'œsophage, déclencher une inflammation, provoquer des mises bas prématurées et atteindre les embryons, et il justifie le recours à un "organisme complet" par l'impossibilité de reproduire ces mécanismes en culture ou en organoïdes. Toutes sont tuées, leurs cerveaux prélevés pour analyse.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel de progresser dans la connaissance des mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous nous intéresserons au rôle des cellules immunitaires lors la mise en place des circuits neuronaux précoces. Notre projet vise à déterminer le rôle de ces cellules, en conditions physiologique et pathologique, dans la construction des circuits neuronaux. Pour ce faire, nous caractériserons l’impact d’une absence permanente ou locale de ces cellules ainsi que l’effet d’une absence transitoire. Nous analyserons également plus en détails les conséquences de diverses altérations fonctionnelles sur la morphogénèse et le développement des circuits cérébraux afin d’avancer sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués.
Bénéfices attendus
Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leurs origines dans des perturbations complexes du développement cérébral, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie embryonnaire à l'adolescence. Cette complexité découle d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales, comme des perturbations immunitaires lors des étapes cruciales du développement cérébral. Des études ont montré que les perturbations immunitaires modifient non seulement directement les circuits neuronaux, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau, des acteurs clés du développement cérébral. Nos connaissances sur les rôles de ces cellules dans la msie en place du cerveau en cours du développement demeurent encore limitées. Ce projet vise ainsi à approfondir notre compréhension des processus de développement clés dans la formation du cerveau. En fournissant des informations essentielles sur la fonction des cellules immunitiares dans le câblage cérébral, atteindre nos objectifs apportera des connaissances précieuses à la compréhension générale des troubles neuropsychiatriques, ouvrant la voie à la stratification des patients et à des approches thérapeutiques adaptées.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1-Injection d’analgésique et anesthésie en sous-cutanée des animaux, suivi par une euthanasie à différents stades (durée quelques minutes). 2-Changement de régime alimentaire des femelles en gestation (durée 7 jours, prise spontanée) puis euthanasie des femelles par une méthode réglementaire et injection d’analgésique et anesthésie des petits, suivi par une euthanasie à différents stades (durée quelques minutes). 3-Administration par gavage unique de femelles en gestation avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental (quelques secondes sur animal vigil) puis euthanasie des femelles par une méthode réglementaire et injection d’analgésique et anesthésie des petits, suivi par une euthanasie à différents stades (durée quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les injections effectuées par voie sous-cutanée afin de procéder à une analgésie pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. Le changement de nourriture des femelles gestante, peut induire un stress sur les animaux dû à la nouveauté qui peut conduire à une diminution de prise alimentaire transitoire.
Devenir
L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (1750) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.
Remplacement
L’étude du rôle des cellules immunitaires dans la mise en place de la morphogénèse et des circuits cérébraux pendant le développemet embryonnaire et post-natal nécessite impartivement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des microglies et leurs interactions avec le tissu neural. Des signaux hormonaux, immunitaires ou encore de tensions tissulaires émanant du sytème endocrinien, de la circulation sanguine, de l’environnement maternel ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés et dépendants de variations systémiques, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes in vitro, qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité cellulaire et des interactions systémiques nécessaires. Les simulations in silico, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent l’activité des microglies et le développement des circuits neuronaux. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures sur les processus développementaux intégrés au développement de circuits neuronaux et gliaux complexes. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique.
Réduction
Un total de 1750 souris sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animals et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures exprérimentales ont été étblies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissememnt de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections ou des gavages. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgesique pourra être injecté. La présence de points limoites définis et adaptés pour chacune des procéduresnous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigeur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte.
Optimisation de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par une approche d’ultrasons chez le porc pour la délivrance ciblée de médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Sept cochons vont passer trois à cinq heures sous anesthésie profonde, sans jamais se réveiller. Chacun reçoit des cathéters dans la veine jugulaire et la carotide, une craniotomie avec pose d'un implant à ultrasons, puis des injections et des examens IRM destinés à mesurer l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Le porteur reconnaît que les ultrasons peuvent provoquer une micro-hémorragie localisée et une hausse locale de température, et fixe l'effectif à six animaux dans sa rubrique réduction alors que sept sont déclarés. Le choix du porc tient à son poids et au volume de sa tête, proches de ceux de l'humain, et au fait que les animaux de plus de 45 à 50 kg ne rentrent pas dans les installations du laboratoire.
Objectifs
Les systèmes de génération d'ultra-sons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique (BHE) sont utilisés dans le traitement de certains cancers du cerveau. Leur utilisation pour d'autres maladies cérébrales à ouvert de nouveaux espoirs. Cependant, leur utilisation pour des méthodes ne visant pas la destruction cellulaire, requière de nouveaux tests et mise au point en recherche pré-clinique. Ce projet est une collaboration entre des entreprises privées et un laboratoire publique. Grâce à une première collaboration sur modèle rongeur, nous avons pu optimiser les paramètres acoustiques et développer une nouvelle méthode d'analyse d'image utilisant 2 marqueurs de perméabilité membranaires afin de mieux quantifier l'ouverture de la BHE. L'objectif technique de la présente étude pré-clinique vise à valider notre méthode et sa performance sur un modèle plus proche de l'homme (pour les paramètres ultrasonores d'ouverture de la BHE), sur une autre modalité d'imagerie plus proche de la clinique (IRM) en comparant deux agents de contrastes de tailles différentes.
Bénéfices attendus
L'objectif moyen-terme du projet vise à permettre le démarrage des essais cliniques dans le traitement de maladies cérébrales afin d'évaluer si la méthode permet d'augmenter l'entrée des médicaments dans le cerveau. En effet, une première version du système est déjà utilisée en cancérologie. Néanmoins, l'utilisation à des fins de protection cellulaire et non de destruction cellulaire, pour d'autres pathologies cérébrales nécessite une meilleure caractérisation et calibration du système ultrasonores de sorte à ne pas induire de lésions thermiques. L'intérêt long-terme réside l'utilisation de cette méthode en pratique clinique courante dans le traitement pharmacologique des maladies cérébrales.
Procédures
L’animal est anesthésié profondément tout au long de l’expérimentation, jusqu’à l’euthanasie, soit environ 3-5h. L’expérimentation consiste en : - La pose de cathéters au niveau de la veine jugulaire et de la carotide - D’une craniotomie avec mise en place d’un implant - L’injection des produits d’intérêt par le cathéter, activation de l’implant et examens IRM
Impact sur les animaux
Deux effets liés au traitement par ultrasons peuvent survenir : une augmentation locale de la température de 1,5°C (n’engendrant donc pas de brûlure du tissus) et une micro-hémorragie localisée (ne remettant pas en cause la vie de l’animal pendant l’expérimentation et n’entrainant ni douleur, ni souffrance, ni angoisse sur l’animal anesthésié). Il s’agit de procédure sans réveil après l’expérimentation.
Devenir
Il s'agit d'une procédure sans réveil. La chirurgie prévue dans le protocole ne permet pas une récupération sans nuisance majeure pour l'animal. Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de la procédure.
Remplacement
L’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons a déjà été validée sur modèle in vitro, sur un modèle in vivo de rongeur et est déjà utilisé en clinique dans le traitement de certaines tumeurs cérébrales. Dans ce dernier cas, les ultrasons permettent de favoriser l'entrée de chimiothérapies dans la tumeur et génèrent un effet thermique destructeur supplémentaires. L'application à des pathologies dans lesquelles on voudrait apporter un traitement pharmacologique sans destruction cellulaire requière une amélioration et une évaluation du protocole de stimulation ultrasonore. L’impact sur le cerveau nécessite d’expérimenter sur animaux. Notre étude antérieure réalisée sur la souris a permis de tester un nombre important de configuration ultra-sonores et le présent projet vise à valider les meilleurs sur le modèle pré-clinique de porc.
Réduction
- Les effectifs ont été calculés au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement exploitables : le nombre d’animaux a été fixé à 6 afin de pouvoir comparer la diffusion des deux agents de contraste. Cette procédure étant une preuve de concept expérimentale sur gros animal, une augmentation des effectifs pour avoir plus de puissance statistique n'est pas nécessaire. - Afin de réduire le nombre d’animaux, nous réaliserons des tests de positionnement, de chirurgies et d’imagerie sur des animaux en post-mortem, à la fin d’autres protocoles expérimentaux. Ceci nous permettra d’acquérir une expérience pour réaliser notre procédure dans les meilleures conditions. - Enfin, l’utilisation de l’imagerie IRM permet de limiter le nombre d’animaux, chaque animal étant son propre contrôle.
Raffinement
L’intégralité de l’expérimentation (depuis la pose des cathéters jusqu’à la mise à mort de l’animal) sera réalisée sous anesthésie générale profonde et sous couverture analgésique adaptée . En outre, une partie de la chirurgie prévue dans ces procédures est une chirurgie acquise depuis longtemps par nos expérimentateurs : pré-anesthésie, pose de voie centrale veineuse et artérielle. La partie nouvelle de chirurgie, à savoir l’implantation du système à ultrasons, sera travaillée sur des animaux d’autres protocoles en cours, en post-mortem. Une fois les protocoles réalisés, notre équipe viendra travailler, en présences de neuro-chirurgiens afin d’acquérir les gestes adéquats à la réalisation du protocole. Le protocole ne commencera qu’après cette étape, et l’assurance que les gestes sont maîtrisés.
Choix des espèces
Suite à notre étude sur la souris, réalisée pour tester et affiner les paramètres ultrasonores utilisés et mettre au point une nouvelle technique d'analyse d'image permettant de quantifier l'ouverture de la BHE, et avant de pouvoir proposer des essais cliniques chez l'homme, nous avons choisi le porc qui est un bon modèle animal pré-clinique et qui permet d'utiliser le matériel d'usage clinique (poids de corps, volume de la tête et volume sanguins sont assez proches de ceux de l'homme) et de valider l’ouverture de la BHE et l’innocuité sur le tissu cérébral par l’IRM clinique. En outre, les protocoles déjà en cours au sein du laboratoire, nous permettrons d’acquérir les gestes chirurgicaux nécessaires, en amont de la phase pilote, sur des animaux en post-mortem. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Notre laboratoire a une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications, issues de notre laboratoire. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations La taille de ces animaux sera suffisante pour l’implantation et la réalisation des images. Ces tailles seront comparables et transposables à des données cliniques.
Prélèvement chirurgical d’organes chez la souris axénique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Élevées sans le moindre microbiote, 60 souris axéniques constituent ici le seul groupe de comparaison avec des animaux qui en possèdent un. Elles vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, tuées avant tout réveil, à quatorze jours, vingt et un jours ou cinquante-six jours de vie. L'acte tient en quinze minutes : une injection d'anesthésique et d'analgésique, puis une chirurgie terminale pour prélever le cerveau et cartographier les neurones du comportement alimentaire et social. Le porteur qualifie ces techniques de prélèvement d'"irremplaçables" et écrit que ni les méthodes in vitro ni les organoïdes ne reproduisent l'effet du microbiote sur le développement du cerveau.
Objectifs
Le cerveau est divisé en différentes régions produisant de nombreuses molécules ayant chacune leur rôle propre dans le comportement de l’individu. Une région du cerveau nommé l’hypothalamus est le centre de régulation du comportement motivationnel : alimentaire, social. Dans cette partie du cerveau, la sécrétion de certaines molécules peut entrainer une augmentation ou une diminution de l’appétit. L’objectif du projet est de prélever le cerveau pour étudier la structure neuronale impliquée notamment dans le comportement alimentaire et social chez des souris n’ayant pas de microbiote. Les données obtenues seront comparées ultérieurement à d’autres données obtenues de la même façon sur des animaux ayant un microbiote. Le but étant que les souris sans microbiote servent de groupe contrôle pour observer l’influence du microbiote sur le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir une cartographie des cellules nerveuses exprimant différents peptides et récepteurs afin de mieux appréhender les mécanismes de communication neuronale sans l’influence du microbiote. Cela fait partie d’un objectif plus global visant à établir une cartographie de plusieurs lignées de souris afin de les comparer entre elles. Les autres lignées étudiées seront : Une lignée contrôle avec un microbiote, une lignée permettant d’étudier les troubles du comportement social et deux lignées permettant d’étudier les troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection d’anesthésique/analgésique (2 minutes maximum), suivie d’une chirurgie terminale sous anesthésie générale. La procédure complète dure 15 minutes à compter de l’injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des piqures qui peuvent provoquer une douleur au niveau du site d’injection. La contention nécessaire à la réalisation des injections peut provoquer un stress. La durée de ces effets sera de 2 minutes maximum.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d’organes pour des études histologiques.
Remplacement
Les techniques de prélèvement du cerveau pour des études d’histologie et d’imagerie sont à ce jour irremplaçables pour observer comment les différentes régions du cerveau sont connectées au niveau neuronal. Ce sont des techniques classiques utilisées en neurosciences, tant pour observer l’expression génique que l’expression protéique. Des méthodes in vitro existent pour étudier la structure et le fonctionnement d’un organe en conditions physiologique et pathologique. Cependant, dans le cadre de ce projet, nous souhaitons observer les différentes structures anatomiques et l’architecture mise en place dans le cerveau pour relier les différentes structures pendant les premières semaines de vie des souris, ce qui n’est pas reproductible in vitro. De plus, nous souhaitons voir l’impact du microbiote sur le développement du cerveau ce qui n’est actuellement pas reproductible in vitro ni avec des organoïdes.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, des analyses multiples seront réalisées sur un même prélèvement. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les marquages seront analysés sur des lots de 10 souris par condition. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données comparables avec des tests statistiques.
Raffinement
Lors des perfusions, les souris seront anesthésiées profondément. Trente minutes avant, nous injecterons un analgésique. De plus, après ouverture de la cage thoracique, nous appliquerons un anesthésique local. Le test de retrait de la patte sera effectué avant toute intervention afin de s’assurer que les souris sont bien endormies.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère entier, donc in vivo, peut nous permettre de comprendre de façon globale l’organisation des neurones au sein du cerveau. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques liées à la prise alimentaire, le comportement social, permettant ainsi une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Il s’agit également du modèle le plus courant lorsque l’on souhaite étudier des animaux sans microbiote. Nous étudierons les animaux avant le sevrage (J14) ainsi qu’au sevrage à (J21) et à l'age adule (J56), afin d’observer le processus de développement chez les jeunes animaux et comparer les connexions entre les neurones qui se développement principalement après le sevrage.
Pré-conditionnement rénal par un inhibiteur de la protéine SerRS, impliqué dans la résistance à l’ischémie dans un modèle porcin de donneur en mort encéphalique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
59 porcelets de deux à trois mois vont être utilisés et tués, une partie opérée sous anesthésie sans jamais se réveiller, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Un animal greffé passe ses sept à dix premiers jours postopératoires seul en cage métabolique, puis y retourne quatre à sept fois pour 24 heures jusqu'au 90e jour, avec jusqu'à onze prises de sang sur animal vigile et dix biopsies sous anesthésie. Dix-huit d'entre eux sont utilisés uniquement comme donneurs de rein : chirurgie de 2 h 30, deux prises de sang, mise à mort en fin d'intervention. Le porteur décrit le passage chez le gros animal comme une étape "indispensable" avant la clinique humaine, et déclare le retour à l'élevage impossible pour raisons sanitaires, ce qui condamne tous les survivants.
Objectifs
Ce projet vise à concevoir une nouvelle génération d'inhibiteurs pharmacologiques capables de contrecarrer les conséquences d'un épisode ischémique. Ils ciblent une protéine que nous avons récemment identifiée et qui est impliquée dans la résistance des organes à l'ischémie. L'application clinique visée est la transplantation rénale. La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale. Au cours de la transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence intrinsèque du processus de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui induisent une dysfonction du greffon à la phase précoce et peuvent faciliter le rejet de ce dernier. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine. La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en nutriments et oxygène. L’ischémie-reperfusion est impliquée également dans les mécanismes de lésions chroniques à plus long termes. Il est donc nécessaire de développer des moyens de protéger les organes afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, afin améliorer la qualité du greffon et sa survie à court et long terme. Des travaux récents ont permis d’identifier une cible d’intérêt, une protéine régulée durant l’ischémie-reperfusion rénale. Notre objectif est d’évaluer un produit thérapeutique ciblant cette protéine, afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion rénales et ainsi améliorer la qualité du greffon, dans un modèle de transplantation de rein chez le porc. A terme, ces travaux permettront d’optimiser les protocoles de transplantation d’organe chez l’homme et de fournir des organes de meilleure qualité garant d’une survie plus longue.
Bénéfices attendus
Actuellement la transplantation rénale est la meilleure solution pour le traitement de l’insuffisance rénale terminale, moins coûteuse pour la société et moins contraignante pour le patient que la dyalyse chronique. Malheureusement, la durée de vie d’un greffon rénal est limitée et les lésions précoces, dues à l’inévitable succession d’ischémie (arrêt de l’irrigation sanguine oxygénée) et reperfusion (reprise de l’irrigation sanguine oxygénée), sont en grande partie responsables de la reduction de cette durée de vie. L’utilisation des machines de perfusion des greffons a permis d’élargir les critères d’acceptabilité d’un greffon mais n’a pas permis d’améliorer la durée de vie des greffons. Pour l’instant la meilleure façon de réduire les lésions d’ischémie – reperfusion est de réduire au maximum la durée d’ischémie et réaliser la greffe le plus rapidement possible. L’inhibiteur de la protéine étudiée a montré in vitro et sur organe de petit animal une activité intéressante qui permet de réduire les lésions d’ischémie reperfusion. Il est donc indispensable de passer par l’étape de modèle pré-clinique chez le gros animal avant de pouvoir le proposer chez l’homme.
Procédures
Pour les 18 animaux donneurs : procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 2h30) , avec 2 prises de sang au cours de la chirurgie, puis mise à mort en fin de procédure. Pour les animaux de groupes d’étude (n=30) : procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec analgésie postopératoire et surveillance, d'une durée de 1h30 à 2h30. 2 prises de sang sous anesthésie générale en début et fin de chirurgie. 9 prélèvements sanguins sur animal vigile, à l’aide d’un cathéter laissé lors de la procédure initiale (durée 5 minutes). 10 prélèvements d’urine en cage métabolique. Hébergement individuel en cage métabolique durant les 7 premiers jours post greffe, puis 4 fois 24 heures à J10, J14, J30 et J90. 3 prélèvements de tissus par biopsie sous anesthésie générale (durée 20 minutes chacun). Pour les 2 animaux de l'avenant : procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec analgésie postopératoire et surveillance, d'une durée de 3h30. 2 prises de sang sous anesthésie générale en début et fin de chirurgie. 11 prélèvements sanguins sur animal vigile, à l’aide d’un cathéter laissé lors de la procédure initiale (durée 5 minutes). 11 prélèvements sanguins sous anesthésie. 17 prélèvements d’urine en cage métabolique. 10 prélèvements de tissus par biopsie sous anesthésie générale (durée 20 minutes chacun). Hébergement individuel en cage métabolique les 10 premiers jours post greffe, puis 7 fois 24 heures à J10, J28, J42, J56, J71, J84 et J90.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont prévisibles : - stress lors de la réalisation des prises de sang et des transferts - douleur postopératoire - limitation de la possibilité de déplacement car la surveillance sera effectuée en cage métabolique. Les injections intraveineuses peuvent provoquer un hématome. Comme pour toute intervention chirurgicale, une infection, un hématome au site d'intervention pourraient survenir. Néanmoins dans notre expérience c'est rare (moins de 5% des cas).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. En effet, pour des raisons sanitaires, le retour à l'élevage est impossible en fin d'expérimentation.
Remplacement
La transplantation et l’appreciation de l’évolution post-greffe d’un organe ne peut être faite autrement que sur un animal vivant. Nous avons naturellement commencé par des études en vitro (cultures cellulaires) puis des études sur des organes chez le petit animal. Le projet est arrivée à l’étape pré-clinique, de mise en situation complète chez le gros animal.
Réduction
Nous avons effectué des études pour calculer la dose à tester afin de ne pas utiliser plusieurs dosages de la molécule testée. Le nombre d’animaux a été déterminé en s’appuyant sur un score de lésions histologiques très sensible et en prenant en compte le taux de reduction des lésions observées in vitro. Le calcul des effectifs a été fait pour réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés, en s’appuyant sur les methodes statistiques définies pour les petits effectifs qui utilisent les tests non-paramétriques. Nous avons estimé le nombre d’animaux (porcs de race commune) utilisés dans ce projet à 57. Il y a 30 animaux dans les 5 groupes précisés plus haut, dont la taille a été calculée en se basant sur des tests statistiques non paramétriques (très petits échantillons). En plus des animaux étudiés, il nous faut des donneurs SLA (Swine Leukocyte Antigen (comme le HLA chez l’homme)) compatibles de la même fratrie. Le fait de vérifier la compatibilité SLA permet de ne pas utiliser d’immunosuppression et d’éviter le phénomène de rejet. Il y a 4 groupes d’animaux qui reçoivent une transplantation rénale, donc en théorie il faudrait 24 donneurs. Nous avons calculé l’effectif total avec seulement 18 donneurs, car dans le groupe contrôle, on effectue l’ablation d’un rein, rein qui peut être conditionné et tranplanté ensuite à un receveur. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. En plus des groupes d’étude nous avons prévu 4 animaux test pour la mise en place chirurgicale du projet, qui seront mis à mort immédiatment à la fin de la procédure et 5 animaux en réserve, en cas d’échec de la procédure chirurgicale. 2 animaux supplémentaires sont demandés pour l'avenant.
Raffinement
Les animaux seront sous anesthésie générale lors des chirurgies. Un suivi quotidien sera mis en place pour évaluer et réduire la douleur animale. Des analgésiques et des antibiotiques seront administrés systématiquement au moment des procédures et occasionellement pendant la période du suivi si l’état de l’animal l’impose. Les animaux seront logés en case individuelle avec des cloisons ajourées pour qu’ils puissent interagir avec les congénères. L’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide de paille, de bidon ou autres jouets. Une surveillance vidéo des animaux sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle porcin de transplantation rénale est un modèle largement utilisé, reconnu et proche de la tranplantation rénale chez l’homme. C’est de loin le modèle de gros animal le plus utilisé en transplantation rénale ce qui nous permettra d’identifier toute anomalie d’évolution post-opératoire et d’obtenir des résultats robustes. Les animaux utilisés seront des porcelets de 2-3 mois d’âge (25-40kg), issus de la même fratrie et compatibles SLA (Swine Leukocyte Antigen). Cette tranche d’âge est utilisée à cause de la possibilité chirurgicale (greffe plus ou moins proche de celle chez l’homme) tout en laissant la possibilité de manipuler facilement l’animal 3 mois après la transplantation.
PhotoBioModulation (PBM) : Évaluation préclinique de Sécurité, de Performance et d’Efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigu (SDRA) par PBM sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Valider la sécurité d'un dispositif médical de photobiomodulation avant un essai chez des patients : le projet répond à une demande de l'ANSM et mobilise 60 porcs adultes miniatures, tous tués à l'issue. Trente d'entre eux sont opérés sous anesthésie générale et tués sans jamais se réveiller, après six heures de procédure et huit prélèvements sanguins. Les trente autres, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger, reçoivent le dispositif par voie percutanée dans la jugulaire, vivent seuls en loge pendant huit jours, subissent une séance quotidienne de photobiomodulation de quinze à quatre-vingt-dix minutes sous sédation, puis sont tués à J7 pour prélever cœur, poumons et veine jugulaire. Le porteur prévoit qu'une instabilité hémodynamique et respiratoire trop forte pendant l'induction de la détresse respiratoire obligerait à tuer l'animal en cours de procédure.
Objectifs
La thérapie par photobiomodulation (PBMT) se définit comme une irradiation lumineuse non thermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge, notamment, pour stimuler la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et en réduire l’inflammation et stimuler la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie. A l’heure actuelle, la PBMT bénéficie de nombreuses études cliniques de hauts rangs montrant son intérêt par irradiation externe dans de nombreux domaines médicaux tels que l’accélération des processus de cicatrisation, la récupération fonctionnelle post AVC, ou le traitement de la DMLA… Elle est également utilisée en irradiation intravasculaire pour diminuer l’inflammation post angioplastie coronaire. Le syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA) tel que nous l’observons dans le cadre du SARS CoV 2 est lié à une exacerbation du système inflammatoire survenant entre le 7ème et le 14ème jour. On observe une surproduction des cytokines inflammatoires liée à l’augmentation de la production excessive de ROS (Radicaux libres). Certains patients présentent également un très faible degré d’oxygénation sanguine (hypoxémie profonde) entrainant une insuffisance respiratoire. La PBMT dans le SDRA a montré son intérêt dans plusieurs études animales, en diminuant les phénomènes inflammatoires par la réduction des cytokines ou de l’expression des facteurs pro-apoptotiques. L’objectif de notre dispositif médical est de traiter le SDRA par la PhotoBioModulation (PBM) dont le principe est d’augmenter l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène et d’induire un effet anti-inflammatoire et immuno-modulateur. La thérapie par PBM n’étant pas applicable de façon externe sur l’ensemble du volume pulmonaire, nous envisageons d’utiliser notre dispositif médical par voie intravasculaire en irradiant la masse sanguine. Par ce biais, les hypothèses sont de réduire l’hypoxie pulmonaire en modulant les facteurs pro-inflammatoires circulants, de diminuer le risque pro-thrombogène et d’accélérer le processus de régénération de la barrière alvéo-capillaire. Une première version de notre dispositif médical a fait l’objet d’une étude antérieure sur un modèle aigu (sans réveil) d’hypoxie chez le porc. Suite aux résultats de cette étude, nous avons décidé d’améliorer la conception et le design de notre dispositif médical (version n°2) qui fait donc l’objet de cette nouvelle demande
Bénéfices attendus
Ce projet a été construit à la suite des recommandations des autorités règlementaires (ANSM). Les bénéfices sont doubles : - au niveau scientifique : la mise au point et la validation de notre modèle aigu et chronique d’hypoxie ainsi que les résultats obtenus avec notre traitement par PBM pourront faire l’objet d’une publication et pourront contribuer à l’avancement des connaissances scientifiques dans les domaines de l’expérimentation animale et de la PBM. - au niveau clinique humaine : Sur la base des résultats obtenus et dans les circonstances de non-risques potentiels (sécurité, performance et efficacité du dispositif médical), un essai pilote d’étude clinique sera proposé afin d’évaluer la sécurité du dispositif médical chez des patients atteints de SARS-Cov-2 lié au COVID-19.
Procédures
Procédure en phase aigüe : - Cette phase est sans réveil et sera réalisée sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les animaux seront prémédiqués (environ 15 minutes), intubés (environ 5 minutes) et sous anesthésiés profonde durant toute l’intervention. L’oxymétrie sera contrôlée par un capteur approprié qui vérifiera la saturation en oxygène. - La procédure chirurgicale sera réalisée sur tous les animaux, 1 seule fois (durée de 1h à 1h30 pour la pose des cathéters), pendant 6h de procédure environ, suivi de l’euthanasie (animal toujours placé sous anesthésie générale) - Prélèvements sanguins sur tous les animaux, 8 fois, durant les 6h de procédure (3 minutes par prélèvement sanguin). - Prélèvements des tissus et organes à l’euthanasie (durée 1h). Procédure en phase chronique : - Cette phase est avec réveil. La procédure mini-invasive d’implantation du dispositif médical par voie percutanée (durée 1h) sera réalisée sous anesthésie générale sur tous les animaux, 1 seule fois. - sous sédation légère (kétamine + xylasine + perfusion continue de propofol par voie IV) : - prélèvements sanguins sur tous les animaux, 1 fois (5 minutes), à J0, J2, J4 et J7 - traitements par PBM sur les animaux (15 à 90 minutes), 1 fois/jour pendant 7 jours - sous anesthésie générale : euthanasie de tous les animaux à J7 pour prélèvements des tissus et organes pour analyses histologiques (durée 1h).
Impact sur les animaux
Lors de la procédure en phase aiguë, tous les animaux seront placés sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les effets indésirables attendus pourraient être une trop forte instabilité hémodynamique et respiratoire des animaux lors de la phase d’induction du modèle de détresse respiratoire qui nous obligerait à euthanasier l’animal durant la procédure. Lors de la procédure en phase chronique, les effets indésirables attendus pourraient être une infection au niveau du point d’introduction de notre dispositif médical au niveau du cou ainsi qu’une possible thrombose partielle de la veine jugulaire. Ces possibles effets indésirables seront minimisés au maximum en travaillant sous conditions stériles et en réalisant une antibiothérapie et une anticoagulation systématique de tous les animaux durant les 7 jours de suivi longitudinal.
Devenir
Tous les animaux (placés sous anesthésie générale) seront euthanasiés afin de prélever les tissus (veine jugulaire) et organes (cœur, poumons) qui seront observés macroscopiquement lors de l’explantation. Ces échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Les effets de la PBM ont été testés au préalable sur des cellules cardiaques en cultures et sur des embryons de poulet. Notre dispositif médical a fait l’objet d’une étude antérieure de faisabilité sur un modèle aigu (sans réveil) d’hypoxie chez le porc et nécessite aujourd’hui une évaluation de sécurité et de performance. Le modèle préclinique (utilisation animaux) est obligatoire avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre total d'animaux a été réduit à 10 individus au maximum par groupe pour ces essais. Pour la détermination de ce nombre d’échantillons nécessaires, nous avons utilisé des données issues de notre expérience, à savoir : une réduction de 15% de la taille de l’infarctus dans le groupe traité pour conclure sur le bénéfice du traitement, une variabilité de la taille de l’infarctus de ± 15%, et en fixant une puissance de 70 % et α = 5 %. Cet effectif permettra de détecter des anomalies ou des évènements indésirables majeurs avant une demande d'approbation d'un essai d'implantation chez l'Homme. A cette étape, aucune approche statistique n’a été réalisée. Après expérimentation, du matériel biologique (organes, tissus) pourra être prélevé. Ces prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole, sans utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Pour réduire le mal être de l’animal à tous les stades de nos interventions: - Nous utilisons les techniques mini-invasives pour la pose des cathéters veineux (méthode de Seldinger) - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention…). Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupe sociaux avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire. - Les animaux de l’étude chronique seront placés en loge individuelle durant les 8 jours de l’étude car ces animaux nécessitent un suivi individuel (vérification de la prise alimentaire, pansement, médication si besoin, …). La mise en loge individuelle de l’animal diminuera également le risque que ses congénères arrachent les pansements et le dispositif médical mis en place. - Les traitements quotidiens par PBM (durée moyenne du traitement : 15 à 90 minutes) seront réalisés sous sédation légère de l’animal. - Pour la mise à mort, l’animal est toujours préalablement anesthésié avant induction d’une surcharge anesthésique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite âgés de plus de 12 mois, 55-70kg). Ce stade physiologique et cette taille "adulte" est nécessaire pour tester notre dispositif médical et être au plus près des conditions humaines. L'anatomie vasculaire est à ce stade plus proche de l’homme, ce qui en fait un modèle parfaitement adapté pour nos essais précliniques. Cette lignée nous permet de faire notre étude sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les accidents vasculaires cardiaques. Selon notre expérience, le porc charcutier (de type Large White) est moins intéressant, car pris à un âge très jeune (de 3 à 4 mois et pesant de ce fait 40/60 kg) pour avoir un poids manipulable, il présente une anatomie vasculaire plus éloignée et moins prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 1 an, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur ce type d’expérimentation, nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal ou en chronique. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser notre dispositif médical en taille réelle. - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation clinique humaine.
Mécanismes cellulaires régissant le développement normal et pathologique des circuits sensoriels et moteurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
9 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue : 992 femelles gestantes, 3 325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4 387 embryons prélevés au dix-huitième jour de gestation. Les femelles subissent une ouverture de l'abdomen de trente minutes pour une injection d'ADN dans le cerveau ou l'œil de leurs embryons, geste dont le porteur indique qu'il peut rompre le sac embryonnaire et conduire à la mort in utero ou à la naissance d'un petit non viable. Les nouveau-nés reçoivent une injection de marqueur dans les deux yeux, ou sont anesthésiés par le froid et opérés sans réveil. 8 960 de ces animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un travail de recherche fondamentale sur la formation des circuits visuels et moteurs.
Objectifs
Notre système nerveux est un réseau complexe au sein duquel une connectivité précise entre les neurones est essentielle au bon fonctionnement du système. Cette connectivité neuronale est établie au cours du développement embryonnaire par une succession de processus incluant : (i) la migration neuronale, une étape qui détermine la position des neurones dans le système nerveux, (ii) le guidage axonal, un processus permettant aux axones en croissance d'atteindre les cibles avec lesquelles ils doivent établir des connections, et enfin une dernière étape permettant l’élimination des connexions surnuméraires ou inappropriées. Le dysfonctionnement d’une ou plusieurs de ces étapes est à l’origine d’un spectre de maladies neurodéveloppementales allant des malformations cérébrales aux maladies psychiatriques et est à l’origine de certaines maladies neurodégénératives. Au cours du développement embryonnaire, le comportement des neurones et de leur axone en croissance est dicté par un environnement très complexe incluant des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécaniques (rigidité du tissu). Si de nos jours, ces signaux environnementaux sont pour la plupart connus, les mécanismes intracellulaires qui adaptent le comportement des axones en croissance à ces signaux restent largement ignorés. Notre projet vise à décrypter ces mécanismes en se concentrant sur deux acteurs cellulaires essentiels au développement neuronal: les molécules de signalisation et le squelette neuronal. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale combinant (i) le développement d'outils innovants pour moduler ces signaux et régulateurs du squelette neuronal, (ii) l'utilisation de systèmes biologiques complémentaires (systèmes acellulaire, cultures cellulaires et modèles murins) ainsi que (iii) des techniques de chirurgie (électroporation in utero) et d’histologie permettant étudier les conséquences sur le développement des circuits neuronaux d’une modulation de ces signaux et régulateurs du squelette. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux mécanismes essentiels à l’établissement des connectivités neuronales, d’apporter un éclairage nouveau sur l’origine de certaines pathologies visuelles (Ambliopie) et neurologiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour préserver ou rétablir une connectivité fonctionnelle dans certaines conditions pathologiques (glaucome).
Bénéfices attendus
En décryptant les mécanismes cellulaires qui dictent les changements morphologiques et comportementaux des neurones en développement, notre projet apportera un éclairage nouveau sur les mécanismes fondamentaux régissantla formation des circuits visuels et moteurs au cours du développement embryonnaire ainsi que sur l’origine de certaines pathologies visuelles (albinisme, Ambliopie) et neurologiques (maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives). Il devrait également fournir de nouveaux outils et nouvelles cibles thérapeutiques pour pour prévenir/freiner la dégénérescence axonale et/ou rétablir des connectivités neuronales fonctionnelles dans certaines conditions pathologiques (ex : glaucome).
Procédures
Au cours de notre projet les animaux seront soumis à différentes interventions. Parmi elles : (I) une injection unique de marqueurs neuronaux dans les deux yeux sous anesthésie et analgésie. Cette intervention concerne des nouveau-nés âgés de 3 ou 15 jours et sa durée est de 20 minutes. (II) Une Injection in utero d’une solution d’ADN dans le cerveau ou l’œil d’embryons à 18 jours de gestation. Cette injection nécessite une chirurgie abdominale (laparotomie) sur des femelles gestantes préalablement analgésiées et anesthésiés. La procédure dure 30 min. (III) Une étape de chirurgie sans réveil pour l’animal sur des souriceaux âgés de 2 à 15 jours analgésiés et anesthésiés. Cette procédure a une durée inférieure à 30 min.
Impact sur les animaux
L’anesthésie par le froid des nouveaux nés peut entrainer un stress thermique. Il existe un très léger risque de réaction inflammatoire de courte durée (48 h) suite à l’injection intraoculaire des molécules permettant de marquer les axones rétiniens. Un faible risque de détresse respiratoire et de mortalité est également associé à l’anesthésie générale. Lors de la procédure d’électroporation in utéro, la rupture du sac embryonnaire entourant l’embryon peut conduire à la naissance d’un embryon sous développé et non viable en période postnatal voir même à sa mort in utero. De plus, dans le cadre de l’électroporation in utero, la femelle gestante pourrait éprouver une gêne, des douleurs et/ou du stress suite à la chirurgie abdominale. De plus, des problèmes au niveau de la mise bas pourrait survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire et adaptée à l’âge de l’animal et ce afin de réaliser des analyses histologiques sur les embryons et nouveau-nés.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons chaque fois qu’il le sera possible des modèles cellulaires pour remplacer ou minimiser l’utilisation des modèles animaux. Notamment, nous effectuerons toutes les expériences de préselection des molécules d’interêt de notre étude sur différents modèles de cellules en culture. Seules les molécules les plus prometteuses seront ensuite analysées in vivo. Cette approche in vivo reste indispensable à la validation de l’importance des molécules étudiées pour le façonnage des connections neuronales et/ou de leur potentiel thérapeutique, les modèles in vitro ne pouvant pas récapituler la complexité des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécanique (rigité du tissu nerveux) guidant les axones en développement.
Réduction
La dissection des mécanismes cellulaires régissant l’établissement des réseaux neuronaux est complexe et requière grand nombre de conditions expérimentales. Afin de réduire au maximum les approches in vivo chez l’animal, nous utilisons des approches in vitro basées sur différents modèles cellulaires pour faire une pré-sélection de molécules ou gènes candidats. Sur la base de ce crible, nous avons pu réduire au maximum le nombre de lots expérimentaux nécessaires pour valider la pertinence de ces candidats pour la formation des circuits neuronaux in vivo. Ainsi, le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet sera de 9128. Ce nombre inclus 992 femelles gestantes, 3325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4387 embryons à 18 jours de gestation. Cette estimation se base sur des études précédentes de l’équipe utilisant des approches expérimentales équivalentes et des tests statistiques prédictifs. Ces analyses, nous permettent de réduire et d’estimer à 10 le nombre d’animaux par condition expérimentale requit pour obtenir des résultats statistiquement robustes compte-tenu de la variabilité inter-individus. L’analyse de nos données sera faite à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Pour les animaux provenant de l’extérieur 5 jours d’acclimatation seront respectés avant expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement selon les conditions respectant la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. La température (entre 20 et 24 degrés), l’hygrométrie (entre 45 et 55 pourcents) et l’éclairage sont contrôlés et conformes à la règlementation. La Structure Chargée du Bien-être Animal et le personnel qualifié de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne des animaux. Les chirurgies sont réalisées par des personnels titulaires des formations adéquates et sont réalisées sous analgésie pré et post-opératoire et anesthésie générale. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur coussin chauffant pour éviter toute hypothermie. Leurs yeux sont protégés par un gel lubrifiant pour prévenir la sécheresse oculaire. Le réveil se fait dans une chambre thermostatée à 30 degrés sous surveillance, avant le retour dans leur cage initiale. Après réveil, les animaux sont surveillés une fois par heure pendant 2 heures, puis tous les jours par les expérimentateurs ou le personnel de l'animalerie pour détecter d’éventuelles complications post-chirurgicales ( points limites) et réaliser les gestes nécessaires et adaptés (soin ou euthanasie). Une surveillance quotidienne des nouveau-nés sera également faite dès la naissance. En cas de détection de signes de souffrance, de rejet par la mère ou d’absence de lait dans l’estomac les petits seront euthanasiés. Après l’électroporation in utero, les femelles ayant subi une chirurgie au niveau de l’abdomen s’occupent moins bien de leur portée. Ainsi, des femelles gestantes sur lesquelles aucune procédure ne sera réalisée seront utilisées comme mères adoptives afin d’augmenter les chances de survie des petits électroporés. Enfin, afin de réduire le nombre d’animaux exclus des analyses statistiques pour électroporation non-optimale, une femelle gestante sauvage sera dédiée au raffinement de l’électroporation dans certains lots expérimentaux pour optimiser le ciblage des neurones d’intérêt.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’Homme génétiquement, anatomiquement et physiologiquement. De plus, l'organisation des circuits visuels et des circuits moteurs contrôlant la motricité volontaire est bien conservée entre la souris et l'humain, contrairement à d'autres vertébrés (zebrafish, poulet). La souris est aussi un modèle utilisé de longue date pour l’étude du système nerveux et visuel. De nombreuses données sont donc disponibles dans la littérature sur lesquelles notre étude peut se reposer. Encore, la souris reste le modèle de choix pour la génération d’animaux transgéniques (permettant l’étude de la fonction d’un gène dans un tissu d’intérêt ou à l’échelle de l’organisme entier) ou de modèles de pathologies humaines (visuelles, neurologiques) comme celles étudiées dans notre projet. Pour l’étude du système visuel comme pour le système moteur, nous nous intéresserons principalement aux stades embryonnaires et post-nataux afin d’étudier comment la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau ou le cerveau et la moelle épinière se met en place pendant le développement embryonnaire et se raffine en période post-natale. Nos études seront donc menées sur des embryons au 18ème jour de gestation et sur des nouveau-nés âgés de 2, 3, 8 ou 15 jours. Cette analyse temporelle, nous permettra d’identifier à quelle étape de ces processus développementaux la formation de ces circuits neuronaux, nos molécules de signalisation ou gènes d’intérêts jouent un rôle déterminant.
Comparaison de l’efficacité de l’administration d’Angiotensine 2 versus Noradrénaline dans un modèle porcin d’arrêt cardiaque réfractaire réanimé 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Le thorax ouvert pour exposer le cœur, une canule posée dans une veine et une artère, une artère coronaire obstruée pour provoquer un arrêt cardiaque : 16 cochons de 50 à 60 kilos subissent huit heures d'expérimentation sous anesthésie générale et sont tués avant tout réveil. Le porteur compare deux médicaments destinés à soutenir la circulation, l'angiotensine 2 et la noradrénaline, chez des patients placés sous circulation extracorporelle après un arrêt cardiaque réfractaire. Il prévoit parmi les effets une perte de sang avec choc hémorragique au moment de la pose de l'assistance circulatoire. Le réveil est exclu d'emblée, l'animal ne pouvant selon lui être ramené à un état compatible avec la vie, et des prélèvements de tissu cardiaque sont attendus.
Objectifs
L'initiation d'une oxygénation par une circulation extra corporelle est devenue une intervention de plus en plus fréquente chez les patients en état de choc cardiogénique et y compris en cas d'arrêt cardiaque réfractaire aux thérapies standards. La survie globale jusqu'à la sortie de l'hôpital en utilisant cette technique se situe entre 29 % (réanimation cardio-pulmonaire extracorporelle) et 41 % (choc cardiogénique réfractaire). La médication la plus couramment utilisée et recommandée pour palier aux effets secondaires de la circulation extracorporelle est un médicament appelé la noradrénaline mais ce médicament à des effets délétères sur le coeur et les vaisseaux. Il est possible que l'utilisation de l'angiotensine 2 sans effet cardiaque spécifiques soit meilleure. Nous allons comparer dans ce projet les effets de ces 2 médicaments sur un modèle porcin reproduisant l'état clinique de tels patients. Ce protocole est réalisé dans 2 établissements utilisateurs (appelés EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
L'un des résultats clés attendus concerne l'efficacité sur la circulation sanguine, mesurée à travers des paramètres tels que la pression artérielle moyenne ou le débit cardiaque. L'Angiotensine 2 est attendue pour démontrer sa capacité à maintenir ou à augmenter la pression artérielle moyenne de manière significative par rapport à l'administration de Noradrénaline, actuellement un traitement standard dans ces situations. Des différences entre les deux groupes de traitement pourraient influencer la décision clinique et le choix d'un médicament optimal.
Procédures
A l'EU1, les animaux subiront l'injection d'un sédatif pour atténuer le stress lié à la manipulation. Ensuite, ils sont transférés dans l'EU2 où se déroul la suite du protocole : une perfusion intraveineuse sera établie pour induire une anesthésie générale. Une fois complètement endormis et sous traitement analgésique, nous procéderons à l'installation d'un dispositif de circulation extracorporelle. Ce dispositif permettra de maintenir un débit cardiaque et d'assurer l'oxygénation du sang. Cette procédure implique la mise en place d'une canule dans une veine et une artère du cochon. Par la suite, une ouverture thoracique sera réalisée pour exposer le cœur, et nous simulerons un arrêt cardiaque en obstruant l'une des artères cardiaques. Des prélèvements sanguins seront effectués au moment de l'arrêt cardiaque, puis après 3 et 6 heures. Toutes ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec maintien d'une normothermie et une administration continue d'antalgiques pendant les 8h de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
Stress lors de la prémédication. Douleur induisant une possible tachycardie ou une hypertension. Effets secondaires à la chirurgie : perte de sang avec choc hémorragique lors de la pose de l'assistance circulatoire.
Devenir
Le cochon ne pourra pas être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie. De plus, des prélèvements de tissus cardiaques sont nécessaires pour une étude microscopique, l’animal ne reprendra pas conscience et sera euthanasié par overdose d'anesthésique.
Remplacement
Le modèle d’arrêt cardiaque suivi de procédures de réanimation ne peut être effectué que sur un organisme dans son entier avec un impact sur les différentes fonctions. L'adaptation à l'environnement physiologique direct du coeur nous conduit à réaliser cette étude sur un modèle animal où toutes les contraintes seront présentes. Ce modèle animal expérimental imite étroitement le scénario clinique des cas réfractaires d'arrêt cardiaque, permettant une évaluation plus précise des résultats microcirculatoires.
Réduction
Ce modèle est déjà en place dans notre structure ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car le personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquement exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à l'animalerie par groupes (au moins 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. L’animal est mis à jeun la veille de l’expérimentation. Le jour de l’expérimentation, les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés sédatives et myorelaxantes avec un produit psychotrope dissociatif aux propriétés analgésiantes. Les animaux peuvent être ainsi manipulés sans recours à des méthodes susceptibles de les effrayer inutilement ou de leur infliger des souffrances évitables. Les animaux seront ensuite sous anesthésie profonde pendant toute la durée de l'opération. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, respiratoire, la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon, animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque et de circulation sanguine, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Etude de l’immuno-hépatotoxicité après transfert de gènes à l’aide de fortes doses de vecteurs adéno-associés recombinants (AAVr) dans un modèle de rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le rat est présenté comme le seul petit animal développant contre les vecteurs viraux adéno-associés une réponse immunitaire et une toxicité du foie comparables à celles observées chez l'humain. 75 rats vont être utilisés à ce titre, tous tués à l'issue, 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 15 opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil. Ils reçoivent une injection intraveineuse de fortes doses de vecteur, subissent une chirurgie de perfusion du foie d'environ une heure et sept prélèvements de sang étalés sur trois mois. Le porteur signale une douleur modérée possible au niveau de l'incision pendant sept à dix jours de cicatrisation et annonce une grille de scoring de la douleur mise en place "dès que celle-ci s'avère nécessaire", sans préciser qui en juge ni sur quels signes.
Objectifs
Les vecteurs viraux dérivés des virus adéno associés recombinants sont des vecteurs de choix pour la thérapie génique et sont actuellement à l’essai notamment pour les dystrophies rétiniennes, les maladies hépatiques et musculaires ou encore les pathologies du système nerveux. A ce jour, les essais cliniques ont permis l’autorisation sur le marché de sept médicaments. Les rapides progrès du domaine permettent de cibler des pathologies plus complexes qui nécessitent des injections intraveineuses de fortes doses de vecteurs viraux .Malheureusement, ces nouvelles stratégies peuvent entrainer des effets secondaires de toxicité aigüe ou des réponses immunes cytotoxiques contre le vecteur. Parmi les effets indésirables, l'hépatotoxicité a été décrite comme un problème majeur avec des conséquences tragiques chez un certain nombre de patients. Récemment, notre équipe a observé que l'injection chez le rat de vecteurs viraux de type 8 ou 9 pouvait résulter en une inflammation hépatique et une perte d'expression des vecteurs dans le foie. Etonnamment, dans ces mêmes modèles, l’expression du vecteur peut persister à long terme dans d’autres organes comme le muscle périphérique, organe décrit pourtant dans la littérature comme moins tolérogènes que le foie. Les mécanismes précis entrainant la perte d’expression dans le foie ne sont pas encore connus. L’objectif de ce projet est d’étudier si l’inflammation hépatique et la perte d'expression des vecteurs viraux est lié à une réponse immune périphérique. Pour répondre à cette question les vecteurs seront injectés dans le foie isolé temporairement de la circulation générale. Nous vérifierons ensuite si l’immunohépatotoxicité est la même qu’après injection des vecteurs par voie Intra veineuse . A l’euthanasie nous étudierons la réponse immune périphérique vis-à-vis du vecteur et des protéines de capside. Nous analyserons aussi la biodistribution du vecteur et plus particulièrement l’histologie du foie, notamment le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrées dans le parenchyme.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’’immunotoxicité après utilisation de fortes doses de vecteurs viraux dans des modèles pertinents de rongeurs in vivo. Il va permettre notamment de savoir si l’hépatotoxicité observée chez les patients après injection de fortes doses est liée ou non à la réponse immune périphérique. Cette étude pourrait contribuer à mieux comprendre et mieux anticiper l’impact potentiel de l’immunotoxicité du transfert de gènes sur l’efficacité et la sécurité du traitement dans les essais cliniques.
Procédures
Mise au point technique (procédure sans réveil) Evaluation des doses d’anesthésies et d’analgésies pour la chirurgie. Temps de la chirurgie : environ 30 mn . Pour la perfusion de foie, la chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie sur les rats pour la perfusion hépatique dure en totalité environ 1 h. Des prélèvements sanguin sous anesthésie gazeuse seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole (3 mois) soit 7 prélèvements au total. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les injection intraveineuse, les rats recevront sous anesthésie gazeuse une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral . La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn.
Impact sur les animaux
Pour les prélèvements sanguin et les injections de vecteurs viraux en intraveineuses, les animaux seront sous anesthésie gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection de l’intraveineuse dû à la pénétration de l’aiguille. Les perfusions hépatiques seront réalisées sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée. Malgré tout, les animaux pourraient ressentir une douleur modérée au niveau de la zone d’incision pendant la période de cicatrisation (maximum 7 à 10 jours).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.
Remplacement
L’enjeu majeur des protocoles de thérapies géniques développés à l’aide de virus adéno associés consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat , car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti virus adéno associés et une immunotoxicité vis-à-vis des vecteurs viraux similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des rats injectés avec des virus adéno associés de type 9 développent une réponse immunitaire. Le nombre d’animaux par groupe (10) est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Récemment, nous avons développé un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire et de l’hépatotoxicité après injection de fortes doses de vecteurs viraux. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection de vecteurs viraux à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune et de l’hépatotoxicité. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature. C’est à cet âge également qu'il s'avère le plus facilement opérable tout en conservant un foie avec quelques capacités de réplications cellulaires nécessaires à une bonne intégration du vecteur dans les hépatocytes.
Etude par IRM in vivo de la biodistribution d’agents de contraste chez la souris wild type
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
300 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune reçoit un cathéter, une injection d'agent de contraste et jusqu'à une heure d'acquisition IRM, puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort et le prélèvement d'organes. L'objet est d'observer où se distribuent et comment s'éliminent de nouveaux agents de contraste synthétisés au laboratoire, dont la toxicité a déjà été testée sur cellules. Le porteur qualifie le modèle animal de "fondamental", annonce des lots de dix souris réduits au minimum, et n'explique nulle part le passage de ces lots à un total de 300.
Objectifs
Notre équipe synthétise régulièrement de nouveaux agents de contraste afin d’améliorer le contraste sur les images IRM pour une détection précoce de pathologies (cancers, inflammation, maladies neurodégénératives). Ces agents sont issus des agents de contraste déjà utilisés en routine clinique. Le but de ce projet est d’étudier la biodistribution de ces nouveaux agents de contraste synthétisés une fois injectés dans la souris afin, d’apporter des informations sur leur cinétique d’élimination ou sur une éventuelle rétention dans les organes. La toxicité de ces agents de contraste aura été préalablement testée sur des cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’améliorer la connaissance sur la biodistribution des agents de contraste dans l’organisme (voie d’élimination, éventuel stockage dans les organes) vivant. Notre projet permettra de faire avancer la connaissance en chimie pharmaceutique. L’objectif est de concevoir des molécules moins toxiques pour l’organisme et qui s’élimine plus rapidement.
Procédures
Les injections durent quelques secondes. La pose du cathéter se fait en moins d’une minute. Les acquisitions d’images IRM durent 1 heure au maximum. Uns seul prélèvement de sang sera réalisé à la fin des expériences IRM sous souris encore anesthésiées. Ce prélèvement dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. L'anesthésie peut entraîner une baisse de la température corporelle de la souris. La pose du cathéter peut entrainer une petite "douleur" liée à la piqure de l'aiguille.
Devenir
Toutes les souris encore sous anesthésie seront par la suite mises à mort à la fin des procédures pour prélèvement de sang et d’organes.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental puisque l’étude de la biodistribution des agents de contraste ne peut se faire que sur organisme vivants avec des organes en fonctionnement puisque l’on s’intéresse au passage d l’agent de contraste dans le sang puis dans les divers organes. Une attention particulière est menée sur les organes d’élimination de stockage et d’excrétion (rein, foie, rate).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (à savoir 10 souris par lot) pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Ce projet nécessitera 300 souris.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées par groupes sociaux de 5 dans les cages en portoir ventilé, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h. Divers objets d'enrichissement du milieu sont utilisés (maison transparente rouge, celluron, granulés ainsi que bâtonnets de bois à ronger). Les souris auront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des études IRM. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Durant les acquisitions IRM les souris sont sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane : ceci permet de réduire le stress de l’animal et surtout les mouvements qui sont rédhibitoires pour la réalisation des images IRM. Leur rythme respiratoire est contrôlé au cours de l’anesthésie à l’aide d’un appareil de suivi (patch placé sous la cage thoracique et relié à un ordinateur). Leur température corporelle est maintenue constante grâce à un tapis d’eau chauffée).
Choix des espèces
Notre établissement, utilise des souris, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animalerie, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris a un génome possédant 99% de similitude avec le génome humain. - Ce projet est réalisée sur des souris wild type. Elle sera le point de départ (témoin) d’autres études que nous réalisons sur des modèles souris de tumeurs Des souris de 8 semaines seront utilisées; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).