Procédures sans réveil

Anesthésiées pour une échographie cardiaque de dix minutes puis tuées avant tout réveil, 192 souris porteuses de mutations liées à l'albinisme oculocutané entrent dans ce projet. Aucune chirurgie ni traitement autre que l'anesthésie n'est prévu, et le cœur est prélevé ensuite pour analyse moléculaire et tissulaire. Le porteur cherche des anomalies cardiaques qu'il décrit lui-même comme "discrètes" et sans impact sur la viabilité ni la physiologie générale des animaux, la forme d'albinisme la plus rare visée ici comptant moins d'une dizaine de cas recensés dans le monde. Le choix de la souris tient à la présence de mélanocytes dans son cœur, absents chez les vertébrés non mammifères.

Objectifs

Le laboratoire étudie deux nouveaux modèles murins d’une maladie génétique rare, l’albinisme oculocutané. Ces modèles ont été caractérisés principalement sur le plan ophtalmologique. Par ailleurs, des données de la littérature montrent que la souris albinos standard) présente des anomalies cardiaques avec perte d’élasticité des fibres dues à l’absence de pigment au niveau des valves cardiaques. La composition en pigment est altérée chez les patients et les modèles d’OCA3 et OCA8, de telle sorte que des intermédiaires toxiques sont susceptibles de provoquer des anomalies cardiaques spécifiques mais discrètes n’ayant aucun impact sur la viabilité et la physiologie générale. L’objectif de ce projet est de comparer sur le plan morphologique et fonctionnel le cœur des 3 modèles représentant des types distincts d’albinisme par rapport aux individus de référence en estimant la sévérité des phénotypes de chacun des modèles.

Bénéfices attendus

La forme d’albinisme oculocutané de type 8 (OCA8) est très rare. Nous avons identifié les premiers patients OCA8 en 2020 et moins d’une dizaine de cas sont recensés dans le monde depuis. OCA3 est un peu plus représenté, notamment en Afrique. Les modèles murins ont montré des anomalies au niveau cutané et ophtalmologique. Il est attendu que les intermédiaires de pigment accumulés chez ces modèles résultent en une toxicité cellulaire et tissulaire. La mise en évidence d’anomalies cardiaques spécifiques sera une indication pour un suivi cardiaque rapproché des patients souffrant d’une de ces formes rares d’albinisme.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’échographie de type Ultrafast sous anesthésie (durée : 10 minutes). Aucune chirurgie ou traitement autre que l’anesthésie n’est prévue.

Impact sur les animaux

Des animaux en bonne santé et dont l’anesthésie ne présente pas de risque seront sélectionnés. Les nuisances pouvant être attendues sont celles que l’on retrouve lors d’une anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane. Pas d’effet indésirable reconnu lié à l’utilisation des ultrasons. Les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable connu.

Devenir

Après exploration par échographie Ultrafast, les animaux anesthésiés seront euthanasiés. Puis les tissus cardiaques seront échantillonnés pour analyse moléculaire et tissulaire.

Remplacement

Le rôle de la pigmentation des valves sur l’élasticité des fibres doit être exploré sur in vivo. Le modèle animal d’albinisme doit donc présenter un cœur avec des mélanocytes tapissant les valves et 4 cavités : 2 oreillettes, 2 ventricules, ce qui n’est pas le cas des autres animaux modèles potentiels

Réduction

Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour une validation scientifique a été estimé en prenant en compte l’analyse statistique qui devra être menée pour comparer sur un mode quantitatif l’effet des différents variants

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place au cours de l’hébergement (cage collective sur portoir ventilés, 5 animaux maximum, litière et enrichissement adapté). Les animaux photosensibles au niveau de la rétine sont hébergés en éclairage réduit (cages en bas de rack non directement exposées aux néons de la pièce). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. La réalisation de l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris présente des mélanocytes au niveau cardiaque au contraire des vertébrés non mammifères. Des données récentes de la littérature montre que ce modèle est approprié pour le projet. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 2 mois et 6 mois.

Anesthésiées profondément, 1 360 souris subissent une expérience de thrombose ou un prélèvement de sang par ponction du cœur, puis sont tuées par dislocation cervicale sans jamais se réveiller. Les procédures relèvent de la catégorie sans réveil, et le porteur en déduit que les effets indésirables resteront faibles, limités à la contention et aux injections d'anesthésie. L'effectif déclaré ne correspond pas au raisonnement exposé sur la réduction, qui annonce 1 088 souris si un effet du sexe apparaît et 564 dans le cas contraire. Il indique que les chirurgies pratiquées ne seraient pas compatibles avec un retour en cage, ce qui motive la mise à mort.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une étude précédente qui a montré que l'absence d’une pompe à calcium, qui est responsable du stockage de calcium dans des réserves internes dans les plaquettes de souris, entraînait une réduction de l'activité plaquettaire. Nous avons démontré l’existence d’une nouvelle voie de signalisation liée à la libération de ce calcium dans les plaquettes permettant la mise en place d’un mécanisme d’activation plaquettaire même en présence d’un faible taux d’activateur. Ces travaux suggèrent l’existence de réserves de calcium spécifiquement activées par une substance appelée le NAADP. Cette substance active un certain type de canal présent dans les réserves internes des autres types cellulaires. L'objectif de ce projet est de montrer l’implication de ces canaux dans notre voie de signalisation plaquettaire. Le but de ce projet est de montrer l’implication de ces canaux dans notre voie de signalisation dans les plaquettes. En cas de réponse positive, ce projet permettra également d'étudier les effets de la modulation de l'activité de canaux sur la fonction plaquettaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont importants : d'un point de vue scientifique, l’implication de canaux des réserves internes, déjà démontrée dans d’autres types cellulaires du système cardiovasculaire, suggère que la nouvelle voie de signalisation est partagée par plusieurs types cellulaires. D’un point de vue thérapeutique, l'identification du canal responsable de la mobilisation initiale du Ca2+ fournira une cible médicamenteuse potentielle pour réduire l'activation plaquettaire sans complètement l’inhiber. Cela permettrait d’avoir le moyen de réduire les risques thrombotiques sans provoquer de risques de saignement.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie profonde, seront, soit utilisés pour des expériences de thrombose in vivo, (max de 30min), soit pour des prélèvements de sang intracardiaques (5 min).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n'a été observé chez les souris génétiquement modifiées où les protéines d'intérêt sont absentes. Concernant les procédures, les effets indésirables seront la contention et les injections d’anesthésie/analgésie, et ils resteront faibles, car les procédures sont sans réveil.

Devenir

Les souris sont euthanasiées à la fin des procédures, car celles-ci ne prévoient pas de réveil, en raison des chirurgies qui ne seraient pas compatibles avec un retour en cage.

Remplacement

Les plaquettes sont des éléments cellulaires très fragiles dont la conservation in vitro est très courte (quelques heures) et dont la production in vitro reste encore très limitée. Pour caractériser la fonction plaquettaire, il est nécessaire d'utiliser des plaquettes isolées du sang. Les mécanismes que nous étudions ont été observés dans les plaquettes de souris et semblent également présents dans les plaquettes humaines. Cependant, comme il n'existe pas de médicaments pharmacologiques validés pouvant inhiber ces protéines de manière vraiment spécifique, la possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas les PTC constitue la meilleure approche pour mener à bien ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons calculé le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats reproductibles et de prendre en compte la possibilité d'une différence de résultats entre les mâles et les femelles. Cette évaluation a été faite pour une puissance de 90%, un risque alpha de 5%, p

Raffinement

Pendant sa captivité dans l'animalerie, le bien-être de l'animal est contrôlé tous les jours. Pour les procédures, l'animal est totalement anesthésié avec une solution de kétamine et de xylasine. Pendant la procédure, l'animal anesthésié est surveillé (respiration, réflexes) afin de s'assurer qu'il est toujours en état d’endormissement et insensible à la douleur. Comme l'animal ne se réveille pas et qu'il est mis à mort à la fin de la procédure, il n'y a pas d’autres points limites à respecter pendant la procédure. Si l'animal montre le moindre signe de réveil ou de mouvement de la patte, une nouvelle dose d'anesthésique sera administrée immédiatement. À la fin de la procédure, les animaux seront tués par dislocation cervicale sans réveil.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie pour ce projet est la souris, car nous venons d'identifier cette nouvelle voie de signalisation dans les plaquettes de souris. Cette voie de signalisation est abolie chez les souris déficientes en PTC et pourrait avoir un effet protecteur sur la fonction plaquettaire comme observé chez les souris déficientes en SERCA3. La disponibilité d'une lignée génétiquement modifiée est indispensable pour démontrer ces effets protecteurs et permettre le développement ultérieur d'une approche thérapeutique. Les souris seront utilisées à taille adulte, ce qui permetta de récupérer un volume de sang suffisant pour isoler un nombre important de plaquettes de bonne qualité.

Sédatés dans un premier établissement, transportés dans un second, endormis puis canulés à la veine et à l'artère pour être placés sous circulation extracorporelle, 16 cochons de 50 à 60 kg ont ensuite le thorax ouvert et une artère coronaire obstruée afin de provoquer un arrêt cardiaque. Ils vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tués avant tout réveil, au terme de huit heures ponctuées de prélèvements sanguins à l'arrêt cardiaque puis trois et six heures plus tard. L'objet est de comparer deux médicaments, l'angiotensine 2 et la noradrénaline, pour maintenir la pression artérielle de patients sous assistance circulatoire. Aucun cochon ne pourra être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie, et des prélèvements de tissu cardiaque sont prévus.

Objectifs

L'initiation d'une oxygénation par une circulation extra corporelle est devenue une intervention de plus en plus fréquente chez les patients en état de choc cardiogénique et y compris en cas d'arrêt cardiaque réfractaire aux thérapies standards. La survie globale jusqu'à la sortie de l'hôpital en utilisant cette technique se situe entre 29 % (réanimation cardio-pulmonaire extracorporelle) et 41 % (choc cardiogénique réfractaire). La médication la plus couramment utilisée et recommandée pour palier aux effets secondaires de la circulation extracorporelle est un médicament appelé la noradrénaline mais ce médicament à des effets délétères sur le coeur et les vaisseaux. Il est possible que l'utilisation de l'angiotensine 2 sans effet cardiaque spécifiques soit meilleure. Nous allons comparer dans ce projet les effets de ces 2 médicaments sur un modèle porcin reproduisant l'état clinique de tels patients. Ce protocole est réalisé dans 2 établissements utilisateurs (appelés EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

L'un des résultats clés attendus concerne l'efficacité sur la circulation sanguine, mesurée à travers des paramètres tels que la pression artérielle moyenne ou le débit cardiaque. L'Angiotensine 2 est attendue pour démontrer sa capacité à maintenir ou à augmenter la pression artérielle moyenne de manière significative par rapport à l'administration de Noradrénaline, actuellement un traitement standard dans ces situations. Des différences entre les deux groupes de traitement pourraient influencer la décision clinique et le choix d'un médicament optimal.

Procédures

A l'EU1, les animaux subiront l'injection d'un sédatif pour atténuer le stress lié à la manipulation. Ensuite, ils sont transférés dans l'EU2 où se déroul la suite du protocole : une perfusion intraveineuse sera établie pour induire une anesthésie générale. Une fois complètement endormis et sous traitement analgésique, nous procéderons à l'installation d'un dispositif de circulation extracorporelle. Ce dispositif permettra de maintenir un débit cardiaque et d'assurer l'oxygénation du sang. Cette procédure implique la mise en place d'une canule dans une veine et une artère du cochon. Par la suite, une ouverture thoracique sera réalisée pour exposer le cœur, et nous simulerons un arrêt cardiaque en obstruant l'une des artères cardiaques. Des prélèvements sanguins seront effectués au moment de l'arrêt cardiaque, puis après 3 et 6 heures. Toutes ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec maintien d'une normothermie et une administration continue d'antalgiques pendant les 8h de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

Stress lors de la prémédication. Douleur induisant une possible tachycardie ou une hypertension. Effets secondaires à la chirurgie : perte de sang avec choc hémorragique lors de la pose de l'assistance circulatoire.

Devenir

Le cochon ne pourra pas être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie. De plus, des prélèvements de tissus cardiaques sont nécessaires pour une étude microscopique, l’animal ne reprendra pas conscience et sera euthanasié par overdose d'anesthésique.

Remplacement

Le modèle d’arrêt cardiaque suivi de procédures de réanimation ne peut être effectué que sur un organisme dans son entier avec un impact sur les différentes fonctions. L'adaptation à l'environnement physiologique direct du coeur nous conduit à réaliser cette étude sur un modèle animal où toutes les contraintes seront présentes. Ce modèle animal expérimental imite étroitement le scénario clinique des cas réfractaires d'arrêt cardiaque, permettant une évaluation plus précise des résultats microcirculatoires.

Réduction

Ce modèle est déjà en place dans notre structure ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car le personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquement exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à l'animalerie par groupes (au moins 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. L’animal est mis à jeun la veille de l’expérimentation. Le jour de l’expérimentation, les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés sédatives et myorelaxantes avec un produit psychotrope dissociatif aux propriétés analgésiantes. Les animaux peuvent être ainsi manipulés sans recours à des méthodes susceptibles de les effrayer inutilement ou de leur infliger des souffrances évitables. Les animaux seront ensuite sous anesthésie profonde pendant toute la durée de l'opération. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, respiratoire, la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal de cochon, animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque et de circulation sanguine, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.

Le cœur natif est retiré pour laisser sa place à la prothèse, si bien qu'aucun des 140 veaux ne se réveille, tous opérés sous anesthésie générale pendant huit heures puis mis à mort en fin de procédure. Ces veaux charolais de deux à six mois, entre 100 et 130 kg, servent à entraîner des équipes complètes de chirurgiens, anesthésistes, cardiologues, perfusionnistes et infirmières, à raison d'un animal par équipe. Le porteur reconnaît une douleur modérée liée à la nociception pendant l'opération, tout en écrivant ailleurs que l'anesthésie complète entraîne "aucune douleur". La finalité est commerciale et réglementaire, former les hôpitaux à l'implantation du dispositif et obtenir le marquage CE, le porteur avançant que des milliers de patients pourraient ainsi être sauvés.

Objectifs

Le projet vise à former les professionnels de santé sur la procédure d'implantation et le cœur artificiel total, afin que l'implantation puisse être réalisée en toute sécurité chez l'homme, condition préalable à l'obtention du marquage CE. Pour chaque implant on doit recueillir des informations pour optimiser la procédure, vérifier la réponse du dispositif à différentes situations physiologiques. L'insuffisance cardiaque est un grave problème de santé publique. Pour résoudre ce problème, des systèmes d'assistance cardiaque ont été introduits sur le marché, qui, cependant, ne sont pas adaptés aux patients présentant un dysfonctionnement des deux ventricules. De plus ces assistances, provoquent de graves complications qui augmentent la mortalité après opération des patients et limitent ainsi leur accès à la transplantation. Notre dispositif est le seul en Europe capable de remplacer les deux ventricules. Il est essentiel de former les personnels de santé à l'utilisation de notre dispositif car, même si la chirurgie de remplacement cardiaque se rapproche le plus possible de la chirurgie traditionnelle de remplacement d'organes humains, il existe tout de même des procédures spécifiques à réaliser. Pour minimiser les risques liés à ces procédures, il est essentiel de former les médecins sur des phases spécifiques : mise en place de la prothèse, personnalisation de la configuration en fonction des caractéristiques du patient, manipulation de la prothèse. Ces manœuvres, si elles sont mal réalisées ou si les étapes ne sont pas séquencées correctement, peuvent avoir des conséquences très graves. Toutes les complications cliniques possibles (saignement, formation de caillot, blocage d'un vaisseau sanguin, etc.) et les effets sur la circulation sanguine sont importants et significatifs, mais ils ne peuvent pas être testés par des simulateurs. Seuls les tests sur les animaux peuvent garantir que la procédure d’implantation et de retrait est correctement contrôlée.

Bénéfices attendus

Etant donné l’indication de notre dispositif en attente de transplantation cardiaque, les procédures d’implantation et d’explantation doivent être validées et fiabilisées afin de réduire le risque de complications. La prothèse qui a des caractéristiques uniques : capacité à assurer une excellente oxygénation des organes et à maximiser la tolérance biologique, sont directement dépendantes de la bonne implantation du dispositif. De même la réalisation et la réussite de la transplantation sont directement liées au bon retrait du dispositif pour le remplacer par un cœur de donneur (préservation des tissus environnants, adaptation anatomiques au greffon…). L’utilisation de ce cœur artificiel, s’il est correctement implanté et retiré lorsque cela est possible, nous permettra de traiter plus de 4 500 patients qui bénéficient d’un cœur de donneur chaque année. Les patients qui pourront être sauvés seront des milliers de plus et pourront retrouver une vie presque normale

Procédures

Chrirugie d'implantation de la prothèse biomécanique sous anesthésie générale et sédation. Durée 8 heures

Impact sur les animaux

Les nuisances causées aux animaux pourraient être les suivantes : 1. Possible inconfort transitoire et léger lié au stress adaptatif de la nouvelle forme de captivité a) Changements alimentaires : cause un inconfort léger b) Inconfort social : cause un inconfort léger 2. Inconforts liés aux manipulations préopératoires a) Manipulations pour l'anesthésie : cause un inconfort très léger b) Transport de l’animal : cause un inconfort très léger 3. Risques liés à l’acte chirurgical : hémorragies, réactions inflammatoires, douleur (nociception). a)Perception de la douleur pendant l'opération: cause une douleur modérée b) Implantation de la prothèse biomécanique : cause une douleur légère. Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure.

Devenir

Etant donné le retrait du coeur natif pour permettre l’implantation dans son emplacement naturel du coeur artificiel total, la mise à mort des animaux est assurée en fin de chaque procédure.

Remplacement

Seule l'expérimentation animale permet d’assurer la mise en oeuvre des procédures d’implantation et d’explantation de la manière la plus représentative possible en préambule aux essais cliniques. La sécurité du patient dépend directement de la réussite de ces procédures. Les veaux ont été choisis car ils sont plus proches de l'anatomie humaine et, de plus, permettent une insertion plus facile de la prothèse dans le thorax, ce qui rend l'entraînement beaucoup plus efficace.

Réduction

Les procédures chirurgicales d'implantation et d'explantation du coeur artificiel total seront répétées et perfectionnées sur des veaux. Le besoin est estimé à 28 animaux dans le groupe de mise au point chirurgicale. Les tests qui seront réalisés sont relatifs à toutes les phases de l'implantation, c'est à dire les sutures, la section du coeur, le sevrage. Pour chaque veau, nous essayons de former le plus de personnes possible. Un animal est prévu pour chaque équipe complète (chirurgiens, anesthésistes, cardiologues, perfusionnistes, infirmières). Le nombre d’animaux a été soigneusement évalué pour pouvoir former correctement les hôpitaux qui doivent apprendre à implanter la prothèse afin de traiter leurs patients. Toutes les données sont stockées et utilisées pour optimiser la procédure et éviter les redondances inutiles.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Afin de minimiser les risques liés à la captivité, la prise en charge des animaux utilisés est conforme à la norme ISO 10993-02 conformément à la réglementation en vigueur pour le développement des dispositifs médicaux. Les temps d'isolement et de captivité sont réduits au maximum (Max 3 jours hors journée opératoire). Afin de réduire au maximum le stress lié aux manipulations préopératoires, l’animal est confortablement sédaté et analgésié avec un mélange des drogues. Pendant la chirurgie, l'animal est sous anesthésie complète ce qui entraîne une perte totale de connaissance et donc aucune douleur.

Choix des espèces

Nous privilégions, pour les expérimentations animales, le veau de race Charolaise, entre 100 et 130 kg, car il présente les caractéristiques suivantes : - espace thoracique suffisamment important pour recevoir la prothèse - morphologie et anatomie proche de celle de l'homme - réponse physiologique circulatoire représentative. Veaux de deux à six mois, soit de 100 à 130 kg. A cet âge et à ce poids, l'espace thoracique du veau est suffisant pour l'implantation du dispositif, sans que l'animal ne présente trop de contraintes hémodynamiques pour une utilisation normale du dispositif.

Les mises au point chirurgicales ont d'abord été faites sur des cadavres de rats sortis d'expérimentations menées par d'autres équipes. 128 rats vont maintenant être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, le temps d'implanter des électrodes et de léser la moelle épinière en moins de trente minutes, puis de stimuler les circuits nerveux de l'érection et de l'éjaculation. Lors des premiers essais, un même animal est utilisé toute la journée pour "maximiser les données", une seule stimulation par animal étant prévue ensuite. Aucune raison n'est donnée à la mise à mort des rats, le passage qui devrait l'expliquer reprenant mot pour mot celui des effets indésirables.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastrointestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur le fonctionnement de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.

Procédures

Les animaux resteront endormis durant toute la procédure, sans réveil. Les interventions, comme l’implantation d’électrodes ou la lésion de la moelle épinière, seront courtes (moins de 30 minutes). Lors des tests initiaux, un animal sera utilisé toute la journée pour maximiser les données. Une fois les paramètres de stimulation définis, chaque expérience sera plus brève, avec une seule stimulation par animal.

Impact sur les animaux

Les injections d’analgésiques/anesthésiques peuvent induire un léger stress transitoire. S'agissant de procédures sans réveil, les animaux ne subiront pas d’autres nuisances ou effets indésirables.

Devenir

Les injections d’analgésiques/anesthésiques peuvent induire un léger stress transitoire. S'agissant de procédures sans réveil, les animaux ne subiront pas d’autres nuisances ou effets indésirables.

Remplacement

La fonction sexuelle est possible grâce à l'interaction du multiples systèmes (hormonal, sensoriel, autonome et moteur), l'étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet. S'agissant d'un nouveau projet, nous avons besoin d'apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. C'est pour cela que nous avons fait des mises au point méthodologiques sur des cadavres de rats sortant d'expérimentation d'autres équipes, afin de maitriser au mieux les méthodes. La suite logique, que nous développons dans ce projet, est de passer sur animaux vivants avec des procédures sans réveil afin de récolter des données, tout en continuant de maitriser les méthodes sans risquer de douleurs pour l'animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans cette saisine, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faite sur les mêmes animaux : tests de plusieurs molécules sur le même animal... De plus, le nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques.

Raffinement

Les chirurgies ont été mise au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d'autres chercheurs. Cette formation a été faite sous la tutelle de notre vétérinaire. De plus, nous avons prévu une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie. S'agissant d'un nouveau projet, nous commençons par des procédures sans réveil afin de ne pas infliger de douleurs dues à l'apprentissage aux animaux, tout en récoltant les données dont nous avons besoin. Les animaux seront hébergés en groupes de 2, avec de l’enrichissement. L’eau et l’alimentation sont à volonté. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou de douleur.

Choix des espèces

Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation de la moelle épinière après lésion. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement développés et actifs (6 à 8 semaines).

Le seul acte déclaré sur les 90 souris de ce projet est leur mise à mort, sous anesthésie et sans reprise de conscience, suivie du prélèvement de leurs organes et de leur sang. Elles portent une mutation reproduisant la xérocytose héréditaire, une anémie rare accompagnée d'une surcharge en fer, et sont utilisées à l'âge de deux mois. Le porteur décrit longuement les organoïdes intestinaux cultivés à partir de leurs cellules souches comme un moyen de réduire le recours aux animaux non-humains, avant de conclure que la souris reste "indispensable" et "sans solution alternative" pour prélever le sang et les organes. Le choix de l'espèce est justifié par la connaissance du génome murin, par le volume de sang obtenu et par le fait que ces souris développent la surcharge en fer avec l'âge.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de comprendre comment une protéine membranaire et qui permet l’entrée de cations, influence le métabolisme du fer. Plus particulièrement, nous nous intéressons à l’effet de certaines mutations de cette protéine conduisant à une surcharge en fer excessive chez des patients atteint d’une forme rare d’anémie : la xérocytose héréditaire (XH). Nous cherchons à comprendre les mécanismes par lesquels cette protéine interfère dans l’absorption intestinale du fer et/ou dans l’acquisition du fer par les cellules érythroïdes (les cellules formant les globules rouges).

Bénéfices attendus

Ce projet est essentiel pour mieux comprendre la xérocytose héréditaire (XH), une maladie rare encore peu étudiée. Plus particulièrement, nous cherchons à identifier les mécanismes conduisant à une surcharge en fer excessive et toxique chez les patients atteints de cette pathologie. Forte d’une étroite collaboration avec des équipes de recherche travaillant sur d’autres complications de la xérocytose héréditaire, cette étude fera progresser la compréhension de la maladie et sera bénéfique pour les cliniciens, médecins, chercheurs et surtout pour les patients. A long terme, comprendre comment fonctionne la xérocytose héréditaire permettra d’envisager des solutions thérapeutiques ciblées pour les patients. Concernant la surcharge en fer, les connaissances acquises au cours du projet pourront être appliquées à la prise en charge des patients grâce à des molécules-médicaments qui ciblent le fer pour l’éliminer. Une première étape clef du projet est la conception d’organoïdes intestinaux (des mini-intestins cultivés en laboratoire à partir de cellules souches de souris). Il sera envisageable de concevoir des organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules de patients, avec leur accord, dans une démarche de médecine personnalisée pour tester des molécules thérapeutiques. L’intérêt de ce modèle unique est d’étudier directement les mutations génétiques spécifiques de chaque patient et l’efficacité des traitements contre la surcharge en fer de façon individuelle. Enfin, l’intérêt de la communauté scientifique autour de la protéine mutée dans la xérocytose héréditaire ne cesse de croître depuis sa récente découverte en raison de son implication dans de nombreux processus biologiques. C’est pourquoi, notre projet avec l’étude approfondie du rôle de cette protéine dans le métabolisme du fer, son rôle dans l’absorption intestinale et au niveau des globules rouges, représente une avancée fondamentale applicable à d’autres maladies et concepts. Ce projet s’inscrit donc dans un domaine de recherche en pleine expansion et à fort potentiel thérapeutique.

Procédures

Au cours de ce projet, 90 souris seront mises à mort à la fin du protocole selon une méthode réglementaire avec une couverture anesthésique et analgésique afin de permettre à l’animal de ne jamais souffrir en s’appuyant sur une grille de suivi et avec l’aide d’un personnel formé et compétent. Avant tout acte sur l’animal, l’absence de réflexe sera vérifiée par plusieurs méthodes. Après la mise à mort, des prélèvements de plusieurs organes et de sang seront réalisés.

Impact sur les animaux

Au cours de leur élevage, les souris seront suivis par le personnel de la zootechnie, l’équipe de recherche et le service du bien-être animal. Les interventions prévues dans ce projet peuvent entrainer un stress léger ou de la douleur liés à l’anesthésie qui se fait par une piqûre. L’anesthésie profonde de l’animal sera vérifiée avant tout acte invasif.

Devenir

Le projet nécessite 90 souris au total et les interventions sont de catégorie « sans réveil ». Tous les animaux utilisés pour les expériences sont mis à mort de manière éthique afin de récupérer les organes et le sang pour répondre aux questions scientifiques posées.

Remplacement

Des lignées cellulaires intestinales sont utilisées pour des analyses préliminaires. Elles permettent en effet d’étudier dans un premier temps l’effet de la protéine d’intérêt sur le transport du fer grâce à une molécule qui reproduit la mutation de la protéine comme dans la xérocytose héréditaire (XH). Cependant, ce modèle a des limites non négligeables pour des analyses plus poussées. Il s’agit d’un seul type de cellules qui ne reproduit pas la complexité du tissu intestinal (plusieurs types de cellules différentes et en tridimension). De plus, la protéine étudiée est exprimée dans plusieurs types cellulaires. Les interactions cellules/cellules entre différents types cellulaires pourraient jouer un rôle clef dans la régulation du transport du fer, qui ne peut pas être étudié avec la lignée cellulaire. Pour pallier ces limites, nous proposons des organoïdes intestinaux (des mini-intestins produits à partir de cellules souches de souris). Ce modèle, reproductible, fiable et plus proche de la physiologie intestinale, réduit le recours aux animaux : une souris permet d’obtenir des dizaines d’organoïdes utilisables sur une longue période. Ces « mini-organes » permettent d’étudier des mécanismes complexes (architecture et fonctions de l’organe d’origine) et ainsi d’analyser l’effet des mutations de la protéine sur le transport du fer, l’architecture de l’organe et les dialogues entre les différentes cellules. Parallèlement, une lignée cellulaire qui reproduit les cellules à l'origine des globules rouges servira aux analyses préliminaires de l’acquisition du fer avec une molécule mimant la mutation de la protéine étudiée. Cependant, des cellules issues directement de souris porteuses de la mutation de la xérocytose héréditaire sont un modèle plus fidèle à la maladie. Ce modèle va approfondir l’étude des mécanismes de régulation d’acquisition du fer de façon plus fidèle à ce qu’on observe chez les patients atteints de xérocytose héréditaire. Enfin, malgré ces solutions de remplacement, le modèle de souris reste indispensable et sans solution alternative pour le prélèvement de sang et d’organes afin d’établir le profil pathologique des souris et le métabolisme du fer. En combinant les approches in vitro et in vivo, nous comprendrons mieux les dysfonctionnements du métabolisme du fer liés à la mutation de la protéine et la physiopathologique de la XH.

Réduction

Une réflexion a été menée en prenant en compte les outils technologiques qui peuvent être mis en place au sein du laboratoire et en s’appuyant sur des outils statistiques fiables dans la conception des procédures du projet dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque intervention. Tout d’abord, la lignée de souris exprimant la mutation de la xérocytose héréditaire existe déjà. La réception d’une première cohorte de souris se suivra d’une attention toute particulière à la gestion de l’élevage. L’accent sera mis sur le dialogue entre les concepteurs, applicateurs, et membres de l’établissement d’accueil des animaux pour bien réfléchir aux groupes de souris mis en accouplement. Cela permettra de mieux contrôler les génotypes des souris et réduire le nombre de naissances. De plus, les procédures expérimentales se feront étape par étape afin de vérifier que les résultats obtenus sont en accord avec nos hypothèses de recherche. Plus particulièrement, nous nous attendons à des différences de données en fonction du sexe des souris. Si aucune différence entre mâles et femelles n’est observée, un seul groupe mixte au lieu de deux groupes sera étudié. Enfin, la mise en place des organoïdes permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la caractérisation des mécanismes d’absorption intestinale du fer. Il s’agit d’un modèle in vitro qui reproduit fidèlement l’architecture de l’intestin, avec la présence de nombreux types cellulaires et qui est fidèle à la fonction biologique de l’organe d’origine. Ce modèle tridimensionnel permet des tests fonctionnels et de nombreuses analyses sans recourir à un nouvel animal pour chaque expérimentation. La réflexion concernant les tests statistiques appliqués permet de limiter le nombre d’animaux mis à mort tout en garantissant des résultats pertinents pour notre étude.

Raffinement

Le modèle de souris n’a pas été associé à la douleur ou à la souffrance dans l’équipe collaboratrice ayant créé la lignée. Néanmoins, nous nous assurerons que les animaux bénéficient d’une bonne qualité de vie au cours de leur élevage et de leur utilisation. Pour cela, un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé et compétents en contact direct les uns avec les autres. Ce suivi permettra de vérifier le comportement des animaux et de l’absence de signes de souffrance. En cas de doute, les avis du vétérinaire et du service du bien-être animal seront sollicités pour mettre en place les soins adéquats. L’hébergement des souris respectera leurs besoins sociaux. Dans la mesure du possible, les groupes de souris destinés aux différentes procédures seront formés à l’avance et hébergés ensemble en amont des procédures. Cela permettra de limiter un stress lié à la découverte de nouveaux congénères juste avant l’expérimentation, réduisant ainsi les biais causés par le stress de l’animal. De même, en amont des procédures expérimentales, des visites des applicateurs seront anticipées pour familiariser les animaux à leur présence et à la manipulation, diminuant ainsi le stress de l’animal le jour de l’expérimentation. Dans leur cage, le milieu d’hébergement sera enrichi (coton de nidification, dôme…) et les animaux recevront une alimentation standard et de l’eau en libre accès. Dans le cas des procédures sans réveil, l’animal sera sous analgésiant et sous anesthésiant. La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée par différentes méthodes. La qualité de l’anesthésie sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été conçu grâce à la connaissance approfondie du génome de la souris, permettant de reproduire la mutation la plus récurrente de la xérocytose héréditaire (XH). Ainsi, ce modèle présente une grande proximité avec la maladie humaine. Le modèle permet d’obtenir un volume de sang suffisamment important pour l’analyse complète du bilan sanguin, du bilan du fer dans le sang et la récupération des cellules permettant de produire les globules rouges. De plus, la conception d’organoïdes intestinaux, qui réduit considérablement le nombre d’animaux nécessaires au projet, est une technique bien maîtrisée chez la souris. La XH est une pathologie évolutive où certaines complications, dont la surcharge en fer, deviennent plus sévères avec l’âge. Dans un modèle de souris portant la mutation de la protéine comme chez l’Homme, il a été montré que les souris développent une surcharge en fer avec l’âge avec une augmentation du fer dans le sang et dans les tissus ainsi qu’une diminution du taux de l’hormone régulant le fer. Dans notre équipe, des données préliminaires chez des souris âgées de 2 à 3 mois montrent également une surcharge en fer. Cependant, à cet âge, nos données indiquent que la surcharge en fer est uniquement d’origine tissulaire. Il semble donc qu’un mécanisme progressif engendre un changement dans le métabolisme du fer avec l’âge. De plus, nous ne retrouvons pas la diminution de l’hormone du fer chez nos souris jeunes contrairement à ce qui a été observé chez des souris âgées (> 1 an). Il semble donc très important de caractériser les mécanismes conduisant à l’aggravation de la surcharge en fer à un âge précoce grâce au modèle. C’est pourquoi, nous proposons de réaliser nos procédures expérimentales à l’âge de 2 mois.

600 souris et 360 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie gazeuse, chaque animal étant tué environ quatre minutes après le début de l'induction. Ils subissent un unique prélèvement sanguin de large volume, suivi immédiatement de la mise à mort et du recueil des organes. Le porteur écrit que dans ce type de procédure sans réveil l'animal n'est soumis à aucune nuisance, et que le recours à des tissus et cellules fraîchement recueillis n'est "pas remplaçable". Ces 960 animaux ne sont soumis à aucune expérience sur eux-mêmes, ils sont élevés puis tués pour que leur sang et leurs organes alimentent des essais menés ex vivo et in tubo.

Objectifs

Dans de nombreuses situations de développement de méthodes d’analyses ex vivo, ou de réalisation d’essais in tubo qui nécessitent l’utilisation de cellules primaires d’origine animale, il est requis de pouvoir accéder à des animaux sains qui seront donneurs de ce matériel biologique. Des procédures particulières peuvent être mises en place pour utiliser un animal dans ce seul objectif. Elles entrent dans un cadre bien défini prévu dans la réglementation.

Bénéfices attendus

L’accès a des échantillons biologiques obtenus dans les meilleures conditions de prélèvement et de stockage permet de produire des échantillons de qualité supérieure. Cela contribue donc à la réalisation d’expérimentation ex vivo des travaux plus fiables et reproductibles, et qui nécessitent moins de répétitions.

Procédures

Les animaux ne subiront qu'un seul prélèvement sanguin terminal puis seront mis à mort, ensuite les organes seront prélevés. L'induction de l'anesthésie à l'isoflurane (3%) dans la boite prend environ 2-3 minutes, la technique du prélèvement sanguin n'excèdera pas 30 secondes ( sous anesthésie), la mise à mort est réalisée à l'issue du prélèvement. Il s'écoule environ 4 minutes entre le débute de l'anesthésie et lamise à mort du l'animal.

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure sans réveil, l’animal n’est soumis à aucune nuisance ou effet indésirable, seule l’anesthésie gazeuse est appliquée.

Devenir

L'objectif de chaque procédure est de rélaiser un prélvement de sang terminal (de large volume ) , et des recueillir les organes. Les prélèvements sont destinés à être utilisés lors d'expériences ex vivo.

Remplacement

Le recours à des échantillons biologiques animaux fraichement recueillis notamment les tissus ou cellules (en opposition au sérum/plasma) n’est pas remplaçable.

Réduction

Le recours à des échantillons biologiques animaux fraichement recueillis notamment les tissus ou cellules (en opposition au sérum/plasma) n’est pas remplaçable. • Réduction Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques. La contrainte est de synchroniser les évènements.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant leur période d’acclimatation ou d’hébergement dans l’animalerie. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Les animaux sont anesthésiés par voie aérienne ( induction gazeuse en boite) pour permettre la réalisation du prélèvement sanguin. Aucun geste ni action douloureuse n'est appliqué qui justifierait l'application de méthodes analgésiques. .Si au cours de l'induction de l'anesthésie ou du prélèvement sanguin , l'expérimentateur constatait une attitude anormale de l'animal, il appliquerait immédiatement l'arrêt anticipé . Dans ce type de procédure expérimentale, ces observations anormales ou inattendues sont considérées comme des points limites à ne pas atteindre

Choix des espèces

Nos travaux de recherche (développement de modèles d’évaluation de propriétés thérapeutiques de médicaments, protocoles de pharmacologie etc ) sont réalisés chez les rongeurs (rat et souris). Ces espèces sont largement employées dans notre domaine d’étude qui concerne les troubles métaboliques car elles sont bonnes répondeuses à des stimuli et à des actions pharmacologiques. La nécessité d’avoir accès à des échantillons biologiques frais de ces mêmes espèces est donc évidente. Les animaux utilisés seront des anaimaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.