Procédures sans réveil

Les séances entraînent des chirurgiens déjà en exercice à la suture de vaisseaux et de nerfs sous microscope, dans le cadre d'un diplôme d'université. 320 rats vont être utilisés sur cinq ans, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, chaque animal faisant l'objet d'une intervention de quatre à cinq heures. Les exercices suivent une difficulté croissante selon le calibre et la résistance des vaisseaux, des artères abdominales aux veines fémorales, et le porteur affirme qu'aucun modèle inerte n'est acceptable sur le plan éducatif, les tubes de silicone ne servant qu'à la première séance. Soixante-quatre rats par an, quatorze sessions de quatre étudiants et deux jours d'examen : l'effectif suit le calendrier de la formation.

Objectifs

L'objectif du prjet est l'apprentissage de la microsutures vasculaires et nerveuses chez le rat. Ce diplôme d’université a pour but de faire acquérir à des chirurgiens amenés à pratiquer des sutures vasculaires et nerveuses microchirurgicales humaines (chirurgiens maxillo-faciaux, plasticiens, orthopédistes, chirurgiens de la main...) en reconstruction post exérèse carcinologique et post traumatique ou à des chirurgiens amenés à réaliser des greffes d’organe (urologues, chirurgiens digestifs...) une expérience sur l’animal vivant endormi, reproduisant au plus près les conditions retrouvées au bloc opératoire en chirurgie humaine. Les séances durent 5h et sont regroupées en trois séances mensuelles. Au fur et à mesure de leur déroulement, les étudiants (qui ont déjà une expérience macro-chirurgicale humaine) acquièrent l’expérience d’une gestuelle très technique sous microscope et peuvent progresser dans leurs performances en dissection et en suture anastomotique vasculaire. Les exercices sur animal vivant permettent d’apprécier les résultats et les erreurs qui ne seront en principe plus reproduites ensuite en pratique humaine. Les différents exercices pratiques réalisés par ordre de difficulté croissante à la fois du point de vue de la taille des vaisseaux (vaisseaux abdominaux plus gros que les cervicaux plus gros que les fémoraux) mais aussi de leur résistance (artères plus rigides que les veines) permettent une progression de l’habileté des opérateurs. Quatorze sessions sont organisées avec 4 étudiants, soit 56 rats à répéter pendant 5ans. Les examens se font sur deux jours, il faudra donc 8 rats à répéter pendant 5 ans. Un total de 64 rats sera utilisé pendant le DU par ans, à multiplier par 5 ans soit 320 rats.

Bénéfices attendus

Ce diplôme d’université a pour but de faire acquérir à des chirurgiens amenés à pratiquer des sutures vasculaires et nerveuses microchirurgicales humaines (chirurgiens maxillo-faciaux, plasticiens, orthopédistes, chirurgiens de la main...) en reconstruction post exérèse carcinologique et post traumatique ou à des chirurgiens amenés à réaliser des greffes d’organe (urologues, chirurgiens digestifs…) une expérience sur l’animal vivant endormi, reproduisant au plus près les conditions retrouvées au bloc opératoire en chirurgie humaine. Au fur et à mesure de leur déroulement, les étudiants (qui ont déjà une expérience macro-chirurgicale humaine) acquièrent l’expérience d’une gestuelle très technique sous microscope et peuvent progresser dans leurs performances en dissection et en suture anastomotique vasculaire. Les exercices sur animal vivant permettent d’apprécier les résultats et les erreurs qui ne seront en principe plus reproduites ensuite en pratique humaine. Augmeneter l'expertise des chirurgiens en microchirurgie en accélerant leur courbe d'apprentissage, permettant une maitrise des techniques avant passage sur l'homme. Les délais opératoires et complications post-opératoires sont réduites.

Procédures

Chaque animal sera l'objet d'une procédure chirurgicale sous anesthésie générale puis sera euthanasié à la fin de la procédure. Chaque procédure dure 4 à 5 heures.

Impact sur les animaux

Une fois les animaux endormis ils ne sont jamais réveillés. Ils sont sacrifiés après la procédure. Les effets indésirables sur animaux sont le stress de l'animal avant l'anesthésie. Une fois les animaux endormis ils ne sont jamais réveillés. Ils sont sacrifiés après la procédure. Les effets indésirables sur animaux sont le stress de l'animal avant l'anesthésie. Chaque rat endormis servira à une procédure et ne sera pas réveillé. Une fois endormis, aucun effet indésirable n'est prévu pour les animaux.

Devenir

Les lésion chirurgicales faites ne sont pas compatibles avec le réveil de l'animal et même avec sa survie.

Remplacement

Pas de modèle industriel inerte acceptable sur le plan éducatif disponible. En particulier l’étanchéité et la perméabilité des sutures microvasculaires n’est actuellement appréciable que sur modèle animal vivant. L'utilisation de tubes en silicone permet à l'étudiant d'apprendre à régler me microscope, à s'habituer à la vision sous microscope et à utiliser des fils de microchirurgie et l'instrumentation associée mais n'ai pas suffisant pour apprendre à disséquer les plans vasculaires tel que l'adventice, à prendre dans la pince les vaisseaux de façon atraumatique ou à ligaturer les vaisseaux collatéraux. De plus les veines n’ont pas de tonus contrairement aux tubes de silicones, elles d’aplatissent rendant la micro suture plus difficile. L’utilisation des tubes en silicone est le premier TD de la formation. Les supports numériques n'ont toujours pas la précision et la ressemblance avec la réalité d’un être vivant. Pour le moment il n'y a pas de méthode de remplacement assez proche de la réalité clinique, seul l'apprentissage sur animal vivant est équivalent à la microchirurgie sur être humain.

Réduction

un nombre de 16 séances de sutures microvasculaires est nécessaire pour acquérir une expérience suffisante, avant d’envisager une application pratique en chirurgie humaine. Seuls les gestes techniquement les plus demandeurs sont répétés deux fois

Raffinement

Les rats sont hébergés à l’animalerie agréée, hébergés dans des conditions standards de 4 animaux par cage, avec une litière en sciure de bois, dans une salle climatisée, avec un cycle jour-nuit de 12 heures et un libre accès à la boisson et à la nourriture ainsi que des jouets pour avoir un environnement plus stimulant; contrôle vétérinaire quotidien pour dépister inconfort et douleur). Ils sont endormis et analgésiés avant toute procédure, maintenus endormis durant celle-ci et euthanasiés à la fin, sans être réveillés Les points limites pris en compte sont la réapparition d'un réflexe palpébral, de mouvements au toucher des moustaches et éventuellement de réflexe de retrait d'un membre (évènement plus tardif qui en pratique ne survient pas, car une supplémentation analgésique est effectuée avant). L’analgesie est réévaluée toute les 30 minutes Pour prolonger la durée de l'anesthésie et en cas de signes de réveil, il sera réinjecté pour prolonger son état d'inconscience.

Choix des espèces

Les rats présentent une anatomie assez proche de celle de l'homme et un calibre vasculaire ( aorte, carotide, jugulaire, vaisseaux rénaux et inguinaux) et nerveux proche des vaisseaux anastomosés lors de la pratique microchirurgicale humaine. Age: rat adulte 250g, 7 à 8 semaines. Les rats de cet âge et de ce poids présentent une anatomie assez proche de celle de l'homme et un calibre vasculaire ( aorte, carotide, jugulaire, vaisseaux rénaux et inguinaux) et nerveux proche des vaisseaux anastomosés lors de la pratique microchirurgicale humaine.

Une substance est injectée dans le conduit auditif de chaque rat pour supprimer les artefacts magnétiques, un cathéter est posé pour l'anesthésie continue, puis l'animal reste deux à trois heures dans l'aimant, exposé à des flashs lumineux par blocs de six secondes. 48 rats vont être utilisés, anesthésiés du début à la fin et tués avant tout réveil, parce que la substance déposée dans l'oreille altère tout leur système auditif et ne peut pas être retirée. L'objet du projet est technique : comprendre l'origine du signal d'IRM fonctionnelle de diffusion et distinguer les contributions neuronale, astrocytaire et vasculaire. Le porteur ne nomme jamais cette substance, ni ne détaille le calcul statistique qui aboutit à 48 rats, tout en indiquant que l'effectif sera réduit si l'optimisation aboutit plus vite.

Objectifs

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique essentielle pour explorer le cerveau. Elle permet non seulement d’obtenir des images anatomiques détaillées, mais aussi de visualiser les zones cérébrales en activité grâce à l’IRM fonctionnelle (IRMf). En recherche, elle permet d’étudier le fonctionnement cérébral dans diverses conditions, notamment les maladies neurologiques. La méthode la plus courante pour l’IRMf repose sur le signal BOLD (Blood Oxygen Level Dependent), qui mesure les variations du flux sanguin et du niveau d’oxygénation du sang comme un indicateur indirect de l’activité neuronale. Cependant, cette approche présente des limites : elle ne capte pas directement l’activité des neurones et sa résolution temporelle est relativement faible. D’autres techniques émergent, notamment l’IRMf de diffusion. Cette approche, encore peu comprise, pourrait refléter directement des processus cellulaires, comme les interactions entre neurones et astrocytes. L’objectif principal de notre projet est de mieux comprendre l’origine du signal IRMf de diffusion. Nous émettons l’hypothèse que ce signal pourrait refléter non seulement l’activité neuronale, mais aussi celle des astrocytes, des cellules jouant un rôle clé dans le fonctionnement cérébral. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons des études sur des modèles animaux, en combinant IRMf de diffusion et interventions pharmacologiques permettant de distinguer les différentes contributions (neurones, astrocytes, vaisseaux sanguins) à ce signal. Pour atteindre cet objectif, nous devons également améliorer les techniques d’IRMf à haut champ magnétique, qui posent des défis techniques, en particulier sur les petits animaux, (artefacts liés aux variations de susceptibilité magnétique). Nous développons donc de nouvelles stratégies d’acquisition permettant d’optimiser la qualité des images en IRMf-BOLD et IRMf de diffusion. Ce travail permettra d’affiner l’interprétation des images fonctionnelles du cerveau et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour la recherche et la clinique.

Bénéfices attendus

Notre projet ouvrira de nouvelles voies en neuro-imagerie. Pouvoir réaliser des études d'IRMf avec une haute résolution temporelle permettra une compréhension plus précise et plus profonde de l'organisation fonctionnelle du cerveau. Notamment, démontrer que les réponses astrocytaires peuvent être détectées à l'aide de l'IRM fonctionnelle de diffusion est en soi une avancée technique et peut avoir des implications importantes en en neurobiologie et en neuroscience. Dans le cerveau, les astrocytes ont des rôles très importants : ils fournissent aux neurones de l'énergie et un support fonctionnel. Cependant, les astrocytes ont une activité électrique modeste par rapport aux neurones, ce qui les rend très difficiles à surveiller, en particulier à l'aide de méthodes non invasives et in vivo. Si les réponses astrocytaires peuvent être détectées à l'aide de l'IRMf-D, cette technique peut être utilisée dans des études précliniques et cliniques pour étudier des altérations astrocytaires dans des conditions neurologiques spécifiques.

Procédures

Les rats recevront un antidouleur ainsi qu’une anesthésie générale avant toute intervention. À très haut champ magnétique, les propriétés magnétiques de l’air créent des artefacts qui rendent certaines zones du cerveau impossibles à imager. Bien que ce phénomène existe également chez l’humain, il est beaucoup moins marqué en raison des champs magnétiques plus faibles utilisés en clinique. Pour éviter cet artefact et obtenir des images exploitables des régions cérébrales d’intérêt chez le rat, il est nécessaire d’injecter une substance dans le conduit auditif. Cette procédure dure environ 5 minutes et est effectuée une seule fois par animal. Un cathéter sera mis en place pour administrer en continu l’anesthésie générale ainsi que l’une des molécules dont nous étudions les effets sur les différentes méthodes d’acquisition IRMf. Cette procédure est effectuée par des personnes qualifiées qui effectuent ce geste en 2 minutes. Les animaux seront ensuite placés dans l’IRM pour une acquisition d’une durée de 2 à 3 heures. Une stimulation neuronale sera induite par une lumière. Le paradigme de stimulation visuelle consiste en 6 blocs alternant lumière allumée (6s), lumière éteinte (12s) pour une durée totale de 108 s. Pour chaque animal, le paradigme est répété 6 fois, soit un total de 10 minutes de stimulation. À l’issue de l’expérience, les rats seront euthanasiés afin d’éviter les effets secondaires persistants de la substance administrée dans l’oreille, qui ne peut être retirée.

Impact sur les animaux

L’insertion de la substance dans l’oreille et les poses de cathéter peuvent être douloureux si l’animal se réveille au cours de l’intervention (événement très rare). Une anesthésie prolongée présente un risque d’hypothermie.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés après l’examen IRM pour pallier toute douleur et répercussion liée à l’insertion d’une substance dans l’oreille, acte qui altère tout le système auditif

Remplacement

L’objectif global de ce projet est de développer des techniques d’IRM fonctionnelle de diffusion à très haut champ magnétique chez le rat afin de comprendre les différentes contributions (neuronale, astrocytaire, vasculaire) aux signaux mesurés. Par ailleurs, l’utilisation des séquences optimisées est envisagée pour des études cliniques menées à très haut champ magnétique. L'utilisation d'animaux est donc nécessaire, car nous avons besoin d’un modèle exprimant des fonctions similaires à celles du cerveau humain. De telles expériences ne sont pas réalisables directement chez l’Homme, notamment parce qu’elles impliquent des manipulations pharmacologiques ciblées, permettant d’isoler les différentes contributions cellulaires au signal IRMf.

Réduction

Sur la base de l’analyse de la littérature et des considérations statistiques, nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significative. Cependant, si l’optimisation est réalisée avec moins d’animaux que prévu, leur nombre sera réduit.

Raffinement

Hébergement des animaux: Pour respecter la vie en groupes sociaux stables, les rats seront logés à deux par cage. Les cages seront enrichies avec du papier. Anesthésie et analgésie: Les animaux seront anesthésiés avant et pendant les expériences IRM. Afin de minimiser toute source d’inconfort liée aux procédures expérimentales, une analgésie locale sera administrée. Si un animal se réveille durant l’IRM et présente le moindre signe de douleur il sera retiré du protocole et euthanasié (pour les mêmes raisons que l’ensemble des animaux de la procédure). Nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles susceptibles d’indiquer une douleur.

Choix des espèces

Les fonctions et l’anatomie du cerveau des rongeurs sont bien documentées et largement étudiées dans le domaine scientifique. En particulier, le cerveau du rat présente des similitudes fonctionnelles avec celui de l’Homme, tout en offrant un modèle expérimental bien maîtrisé. Cela en fait un outil précieux pour obtenir des résultats robustes et interprétables dans le cadre des études précliniques. L'ensemble du projet sera réalisé sur des rats adultes . Nous utilisons des rats adultes afin de travailler sur un cerveau pleinement développé, dont les propriétés anatomiques et fonctionnelles sont stabilisées. Cela permet d’obtenir des résultats plus représentatifs et transposables aux études précliniques visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau humain.

Tuées à la sortie de l'IRM parce que l'huile déposée dans leur conduit auditif ne peut pas être retirée et détruit leur système auditif, 45 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, sans reprise de conscience. Chaque animal reçoit cette injection dans l'oreille, deux cathéters posés sur le dos et le ventre, puis un examen d'IRM de trente à quarante minutes pendant lequel l'hormone GnRH est administrée en continu. Le porteur qualifie l'IRM d'indolore et non invasive, tout en indiquant que la pose des cathéters et l'insertion de l'huile seraient douloureuses si l'animal se réveillait. Il retient une lignée génétiquement modifiée qu'il déclare "indispensable" pour activer les neurones à GnRH, dans un projet dont la finalité est d'appuyer un passage de cette molécule en clinique.

Objectifs

L’ hormone de libération des gonadotrophines hypophysaires (GnRH) et les neurones qui la sécrètent sont connus pour orchestrer la fonction de reproduction (la puberté, la fertilité, la libido…). Des études suggèrent que le rôle de cette molécule s’étendrait à d’autres paramètres tels que la régulation des fonctions de cognition et le comportement alimentaire. Dans ce cadre, il s’agit d’élucider l’intérêt d’un traitement à la GnRH pour la prise en charge des troubles alimentaires et la régulation de fonctions cognitives dans les pathologies où il est connu que cette hormone ne fonctionne pas bien et dont les patients présentent des altérations cognitives ou métaboliques. Restaurer un fonctionnement optimal de la GnRH pourrait aider à améliorer le confort de vie et diminuer voir éradiquer des symptômes pour un assez vaste spectre de pathologies. Pour exemples, l’obésité, l’anorexie mentale, le syndrome de Prader Willi qui sont des maladies métaboliques mais aussi la trisomie 21, la démence fronto-temporale ou encore la maladie d’Alzheimer présentent des caractéristiques communes bien que leur fonctionnement, leurs causes et leurs conséquences puissent être éloignées. Dans toutes ces maladies, nous pouvons noter des altérations de la fonction de reproduction associée à des altérations du comportement alimentaire, du poids et de la dépense énergétique mais également des altérations cognitives ou tout du moins des risques d’en développer. Notre hypothèse repose sur le point commun du mauvais fonctionnement de la GnRH dans toutes ces maladies. En vue d’un passage de la molécule en clinique pour ces indications, nous avons besoin de montrer que la GnRH peut en effet, bien moduler positivement l’activité cérébrale pour mieux comprendre son fonctionnement et mode d’action et justifier son intérêt et utilité. Pour répondre à cette hypothèse, nous souhaitons utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est la meilleure technique pour imager le cerveau vivant de manière indolore, non invasive et longitudinale. L’examen d’IRM nous permettra notamment de démontrer : si certaines zones du cerveau présentent un changement d'activité (i) après le relargage de la GnRH par les neurones qui la produisent ou (ii) après un traitement à la GnRH. Le but est d’estimer si la GnRH peut bien agir sur le cerveau et de déterminer ses zones d’action pour soutenir son utilisation chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet seraient de s’assurer de la pertinence d’un usage en clinique de cette molécule pour des indications de soin dans le cadre des troubles de l’alimentation et d’amélioration des fonctions cognitives pour un large spectre de pathologies combinant ces symptômes.

Procédures

Les souris recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant toute intervention. Afin d’éviter les artéfacts liés à la présence d’air dans le conduit auditif de la souris et pour pouvoir correctement analyser les images d’IRM dans nos zones d’intérêt, il est nécessaire d’injecter une substance dans le conduit auditif de la souris, l’exécution du geste est de l’ordre de 2 minutes. La pose d’un cathéter sur le dos est nécessaire pour administrer en continu l’anesthésiant durant toute l’intervention, et sur le ventre pour administrer la GnRH durant l’unique examen IRM qui dure de 30 à 40 minutes. Après l’IRM la souris sera euthanasiée pour ne pas subir les effets néfastes persistant de l’huile qui a été déposée dans l’oreille et que nous ne pouvons pas retirer.

Impact sur les animaux

La procédure et toutes les manipulations seront réalisées sous anesthésie générale, après administration d’antidouleurs et les souris seront euthanasiées après l’examen IRM. Toutefois, l’insertion d’huile dans l’oreille et les poses de cathéter peuvent être douloureuses si l’animal se réveille au cours de l’intervention et toutes les mesures sont prises (contrôle de nombre de respiration et du degré d’anesthésie de la souris) pour éviter à tout prix que cela se produise.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées après l’examen IRM afin de pallier toute douleur et répercussion liée à la procédure. En effet, tout le système auditif de la souris est altéré et détruirait son confort de vie, une euthanasie est prévue à la sortie de l’IRM alors que l’animal est encore anesthésié.

Remplacement

La stratégie expérimentale a été planifiée en tenant compte de la règle des 3R. L’objectif de l’étude est d’appuyer un passage en clinique de la GnRH pour la prise en charge de troubles cognitifs et métaboliques. L’impact du traitement sur le cerveau doit être étudié chez l’animal puisqu’il est mesurable uniquement avec des acquisitions sur un cerveau vivant et physiologiquement actif. Il n’est donc pas possible de substituer le modèle animal par des expériences in vitro. De ce fait nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement de manière intégrative et de comprendre ses mécanismes d’action pour un appui de son utilisation en clinique.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux en fonction des nécessités d’effectifs pour réaliser des tests statistiques significatives. Cela a été possible grâce à des expériences préliminaires réalisées sur un autre modèle de souris en IRM . Ces expériences nous avaient permis d’obtenir des résultats significativement exploitables à partir de 15 souris par groupe ce qui nous laisse penser qu’il faudrait un nombre identique pour des expériences dont le fonctionnement méthodologique est identique. Nous avons tenu compte des éventuelles possibilités de décès liés à l’anesthésie durant l’IRM. Nous avons choisi l’IRM qui est une méthode indolore et non invasive et permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces mêmes informations que si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique sera prévu pour chaque cage. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à l’animalerie. Une IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, et se déroulera sous anesthésie générale. Si un animal se réveille durant l’IRM et présente le moindre signe de douleur (points limites adaptés) il sera retiré du protocole et euthanasié pour les mêmes raisons que les animaux restant dans le protocole.

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été développé chez la souris, nous gardons cette espèce pour permettre une reproductibilité du protocole. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir une activation des neurones à GnRH que nous ne pourrions pas obtenir autrement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Le jeune âge comme le vieillissement agissent sur la fonction de reproduction, les fonctions cognitives et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous étudions les souris à l’âge adulte pour ce projet.

Cinq minutes séparent l'incision de la paroi abdominale de la mise à mort. 120 rats vont être utilisés dans ce protocole, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, pour prélever leur foie et en isoler des hépatocytes. Ces cellules alimenteront une biobanque et serviront à cribler des molécules, lipides, médicaments mitotoxiques ou pesticides, au sein des autres projets du laboratoire. Le porteur indique que les échantillons de foie humain disponibles sont rares et de qualité variable, et retient le rat parce qu'une perfusion en fournit environ 500 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.

Objectifs

Nous souhaitons isoler de manière routinière des hépatocytes et cellules non parenchymateuses de rat pour servir de modèles d'études au sein des projets du laboratoire. Notamment les cellules isolées pourront servir à des fins de screening in vitro de molécules (lipides, médicaments mitotoxiques, pesticides...) ou de modèles pour la culture 2D et 3D. Les cellules seront isolées puis distribuées fraichement isolées en fonction des besoins des chercheurs et doctorants ; l'excédant produit sera congelé pour réaliser une biobanque de cellules qui seront caractérisées avant chaque mise à disposition.

Bénéfices attendus

Le projet permettra aux chercheurs de l'unité d'avancer sur leurs études en l'absence de cellules humaines en optimisant le nombre d'animaux et en réduisant la variabilité due à l'opérateur ou aux réactifs. Cela permettra aussi de sélectionner des milieux de congélation qui pourront servir pour l'établissement d'une biobanque de cellules congelées de rat, humaines ou éventuellement issues d'autres espèces.

Procédures

Tous les animaux (120) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. Une injection d'anticoagulant (héparine) par voie intraveineuse en début de chirurgie permettra de limiter le risque d'échec de la perfusion dû aux caillots sanguins formés pendant la mobilisation du foie ; elle sera réalisée sous anesthésie pour ne pas générer de stress à l'animal. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion.

Impact sur les animaux

Un protocole d'anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l'incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.

Devenir

L'isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l'animal sous anesthésie générale.

Remplacement

Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l'évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’ischémie imposée aux tissus humains génère des altérations supplémentaires qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats est donc nécessaire et permettra d’identifier les réactifs permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.

Réduction

La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l'équipe et permet d'obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la sélection des réactifs et formation aux gestes techniques (n=20) permettront d'optimiser les isolements de routine. 50 lots de 2 animaux (n=100) seront utilisés pour réaliser environ 1 session d'isolement par mois pendant 5 ans ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l'utilisation des cellules dans les projets, tout en prenant en compte le risque d'échec de la perfusion.

Raffinement

L'environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l'étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d'anxiété (absence de prise de poids au cours de l'hébergement, troubles du comportement, signes d'agressions), il est retiré de l'étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d'une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l'anesthésie (mouvement de la peau), la procédure est suspendue et l'anesthésie est réadaptée. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l'adaptation de l'anesthésie, la procédure s'arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Une injection intraveineuse d'anticoagulant (héparine) permettra d'améliorer le taux de réussite des perfusions en évitant la formation de caillots sanguins au cours de la chirurgie. Le choix de cette voie d'injection permettra une action immédiate de l'anticoagulant, ce qui permettra de réaliser l'administration sous anesthésie sans générer de stress à l'animal. Tous les prélèvements et la perfusion du foie sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.

Choix des espèces

L'optimisation des conditions d'isolement des hépatocytes est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Les hépatocytes primaires de rat sont un modèle d’étude répandu en pharmacologie préclinique, les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 500 millions/rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaine (110-200g) et utilisés à 6 semaines (180-230g), poids standard d'utilisation pour l'isolement des hépatocytes.

Une chirurgie unique de quinze à vingt minutes, jamais suivie d'un réveil : 115 souris vont être opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout retour à la conscience, pour que leur foie soit perfusé ou prélevé. Les cellules ainsi isolées doivent servir à monter des cultures en trois dimensions, organoïdes et sphéroïdes, présentées comme des modèles substitutifs destinés à réduire l'usage d'animaux dans l'étude du cancer des voies biliaires. Le porteur affirme qu'un système vivant reste "indispensable" pour isoler les sous-populations cellulaires du foie, les lignées commerciales n'en étant pas représentatives. Sur la réduction, il indique que 115 individus suffisent d'après des expériences préliminaires et précise qu'aucune approche statistique n'a été conduite.

Objectifs

Nos études sont centrées sur le cholangiocarcinome (CCA), une tumeur des voies biliaires, qui est un cancer rare, très résistant aux thérapies. Par conséquent, afin d'élucider les mécanismes physiopathologique de cette résistance, des modèles expérimentaux alternatifs ou substitutifs doivent être mis en œuvre au laboratoire pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons donc pour objectif de développer notamment des modèles de culture cellulaire en 3 dimensions (3D) comme des organoïdes ou des sphéroïdes comportant plusieurs types cellulaires dans le but de récapituler la structure d’un tissu biliaire sain in vitro afin de le comparer à des modèles in vitro de tumeurs biliaires. Ainsi avec le développement de tels modèles expérimentaux, nous souhaitons réduire substantiellement le nombre d’animaux. Ces modèles alternatifs nous permettrons de progresser sur les mécanismes physiopathologiques du cancer des voies biliaires. Les objectifs sont de développer des modèles expérimentaux in vitro en culture en 3 dimensions (exemple : organoïdes) afin de recourir à des méthodes substitutives à l’utilisation d’animaux (R=remplacer), limiter le nombre d’animaux utilisés pour atteindre un même objectif scientifique (R=réduire) et assurer et renforcer le bien-être des animaux (R=raffiner).

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, ce projet doit permettre de développer des nouveaux modèles expérimentaux in vitro de tissu sain biliaire. Les bénéfices attendus du projet sont 1/ de réduire drastiquement l’utilisation des animaux ; 2/ d’avoir à disposition des modèles expérimentaux nouveaux (ex = organoïdes) de tissus sains pour les comparer à des modèles in vitro de tissus tumoraux.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale unique et terminale sous anesthésie générale et analgésie d’une durée maximale de 15-20 minutes.

Impact sur les animaux

Les seuls actes réalisés sur les animaux seront effectués sous anesthésie et les nuisances sont donc celles associées à l’anesthésie. Les animaux ne se réveilleront pas à l’issue de l’anesthésie car l’euthanasie interviendra durant celle-ci.

Devenir

L'isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin des procédures pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, Un système vivant est nécessaire 1/ pour isoler toutes les populations cellulaires du foie grâce à des marqueurs spécifiques de chacune de ces sous populations et 2/ modéliser un tissu in vitro, en culture en 3 dimensions. Même s’il existe des lignées de cellules du foie, celles-ci ne sont pas représentatives des sous-populations cellulaires qu’il existe dans le foie et ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 115 animaux. Des expériences préliminaires réalisées au laboratoire, nous indiquent que ce nombre est suffisant pour développer nos modèles cellulaires en 3 dimensions. Aucune apporche statistique n'est réalisée.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie) et avec l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour isoler les différents types cellulaires du foie et ainsi développer des modèles expérimentaux alternatifs car 1/ nous pouvons avoir à disposition des cellulaires d'origine hépatiques facilement pour développer nos nouveaux modèles de culture en 3D et 2/ qu'il existe de nombreux outils commercialisés et à disposition dans la communité scientifique pour étudier les cellules provenant de souris. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte, 5 à 8 semaines dont 1 semaine d’acclimatation.

Six porcelets de 40 kilos vont être opérés du rachis sous anesthésie pendant environ trois heures, puis tués sans reprise de conscience, à raison de deux par an pendant trois ans. La finalité est de mesurer jusqu'où la pression hydrostatique employée en chirurgie endoscopique de la colonne peut monter avant d'altérer la conduction nerveuse, avec relevé de la pression intracrânienne et des potentiels évoqués moteurs et sensitifs. Le porteur justifie le choix du porcelet par son poids, proche de celui d'un jeune humain, et par la possibilité d'utiliser les mêmes instruments et les mêmes gestes que sur un patient. Il écrit ne pas avoir "les moyens techniques" de remplacer cette formation par des méthodes in vitro, désignant ainsi comme une formation ce que le titre annonce comme un projet de recherche.

Objectifs

La chirurgie de la colonne vertébrale est en pleine mutation, il existe des nouvelles techniques endoscopiques qui permettent de traiter des pathologies lombaire mais qui impose de travailler avec une pression hydrostatique augmentée et à côté des éléments neurologiques. Cette situation peut provoquer des troubles neurologiques si la pression hydrostatique est trop importante. A l’heure actuelle on ne se sait pas quelle est la limite de tolérance de la limite du système nerveux a ses augmentions de pression. Pour le savoir nous envisageons une étude d’augmentation progressive de cette pression hydrostatique au niveau lombaire et des réponses du système nerveux de la moelle et du cerveau avec quatre paramètres la pression intra crânienne, la pression au niveau du canal thoracique, des potentiels évoqués moteurs (PEM), somesthésies/sensitifs (PES).

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle on ne se sait pas quelle est la limite de tolérance de la limite du système nerveux à ses augmentions de pression. Pour le savoir nous envisageons une étude d’augmentation progressive de cette pression hydrostatique au niveau la colonne vertébrale et des réponses du système nerveux de la moelle et du cerveau avec quatre paramètres la pression intra crânienne, la pression au niveau du canal thoracique, des potentiels évoqués moteurs (PEM), somesthésies/sensitifs (PES). Il est essentiel de déterminer si une pression appliquée pendant quelques secondes au même effet qu'une pression maintenue plusieurs minutes et d’identifier des seuils temporels responsables de modifications des PEM, PES et de la pression intracrânienne (PIC). Les durées de 30 secondes, 1 minute et 5 minutes ont été choisies pour représenter des intervalles typiques observés en chirurgie endoscopique et en expérimentation animale pour évaluer les troubles neurologiques si la pression hydrostatique est trop importante.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 3h, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le transport de l’animal, dans une table élévatrice couverte d’une couverture au bloc opératoire et la chirurgie, anesthésie longue (risque d’hypothermie), sont les deux points où l’animal pourrait ressentir du stress, douleur ou souffrance. La durée des nuisances est de 3h.

Devenir

Respect du protocole des « animaux sans réveil », selon la réglementation. L’acte d’euthanasie animale peut être justifié par une raison médicale (un état de santé, une souffrance intense ressentie par l’animal.)

Remplacement

Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir des Critères d’évaluation PEM et PES et d’analyser les différentes pressions entre la colonne vertébrale et le canal thoracique.

Réduction

A partir d’une base de la littérature, le nombre de porcs est réduit au minimum, il y aura 2 cochons par an pendant 3 années accompagnée. Pour les analyses statistiques chaque cochon aura son propre référent et sera suffisant pour obtenir les premiers résultats.

Raffinement

La pose d'un cathéter permet de réduire le nombre d'injections. L’injection par IV d’ Analgésie est en continu pendant tout l’intervention afin d’évaluer et soulager les douleurs sur l’animal. L'utilisation d'un monitoring lors de l'anesthésie (Avec mesure des constantes : saturation d'oxygène, fréquence cardiaque, pression artérielle...) permet de définir des points limites précoces et de prendre les décisions sur le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le porcelet de 40 kg est l'animal le plus proche de l'anatomie humaine car la taille de ses organes et son métabolisme permet aux chirurgiens de se mettre en situation similaire à la chirurgie d'un patient humain. Nous pouvons utiliser la même instrumentation et les gestes techniques sont les même que chez un patient opéré. Le choix de ce stade de développement est tout simplement dû au poids de l'animal approchant du poids moyen d'un jeune humain. Un poids supérieur poserait un problème de manipulation (pas de matériel de levage adapté).