Procédures sans réveil
Rôle de la protéine PAM dans un modèle murin de choc septique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une échographie cardiaque toutes les trente minutes, pendant quatre à seize heures d'anesthésie générale ininterrompue : 144 rats vont être utilisés, 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 sous anesthésie sans réveil. Soixante-douze d'entre eux subissent une chirurgie destinée à provoquer une infection abdominale qui les fait basculer en choc septique après seize heures, avec baisse de la mobilité et des interactions sociales. Tous sont tués pour prélever cerveau, cœur, poumons, reins, foie, rate et peau, le projet cherchant à savoir si une protéine protège les vaisseaux sanguins, avec une étude humaine qui "pourrait être débutée dans les 5 ans". Le rat a été retenu parce que ses vaisseaux et son cœur sont plus gros que ceux de la souris, ce qui facilite la pose des cathéters et l'échographie.
Objectifs
En cas d’infection, certains patients présentent une inflammation excessive qui met en jeu leur pronostic vital. Quand les systèmes de régulation physiologique sont débordés, on dit que le patient est en choc septique. Il s’agit d’une infection sévère qui nécessite le transfert des patients en réanimation. C’est une pathologie grave avec une mortalité élevée. Le choc septique est marqué par une hypotension sévère liée à une dysfonction des vaisseaux sanguins qui deviennent trop dilatés et laissent fuir une partie du contenu des vaisseaux. Les patients présentent également une atteinte du cœur qui se contracte trop faiblement. Ces 2 processus entrainent une baisse majeure de l’apport de sang aux organes. Les organes ne reçoivent alors plus assez d’oxygène. Cela entraine un état de défaillance de l’ensemble des organes induisant le décès du patient. Les médicaments actuellement utilisés (antibiotiques, médicament pour augmenter la tension artérielle) ne jouent pas sur l’atteinte des vaisseaux sanguins. Notre équipe étudie le rôle d’une protéine qui joue un rôle dans le maintien de la stabilité des vaisseaux. L’objectif de ce projet est de savoir si cette protéine permet de diminuer l’atteinte des vaisseaux dans un modèle de choc septique chez le rat. Nous voulons déterminer si la supplémentation en cette protéine protègerait de l’inflammation, puis nous évaluerons si cette protéine peut servir comme traitement dans le choc septique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux définir le rôle de la protéine d’intérêt dans le choc septique et potentiellement être utilisée comme un nouveau médicament dans l’infection grave. Une étude chez l’Homme pourrait être débutée dans les 5 ans.
Procédures
144 animaux auront 1 chirurgies sous anesthésie générale. 72 une chirurgie pour provoquer une infection et 72 une chirurgie contrôle. 144 animaux auront la mise en place de 2 cathéters en regard du cou, réalisé sous anesthésie générale. 144 animaux auront des échographies cardiaques toutes les 30 minutes pendant la durée de l’étude (4 heures ou 16h), l’animal est laissé durant toute cette période sous anesthésie générale. 144 animaux auront des prélèvements sanguins répété, via l’un des cathéter mis dans le cou, les prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, sans nécessité de ponction spécifique. 144 animaux auront des prises de pressions artérielle, celle-ci est mesurée en continu via l’un des cathéters du cou, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale, par une aiguille fine dans le ventre de l’animal (anesthésie et analgésie) entrainent une douleur légère. Par ailleurs, l’anesthésie générale provoque un état confusionnel durant environ 2h. La chirurgie réalisée pour entrainer l’infection est responsable, à court terme de douleur en regard de la cicatrice et à moyen terme d’une infection responsable d’une diminution de la mobilité et une diminution des interactions sociales. Pendant les 16 premières heures, l’animal présente des signes d’infections non sévère puis après 16 h, il rentre dans un état de choc septique avec une infection grave, avec notamment une diminution de la contraction du cœur.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, la mises à mort suivie est de prélèvements d’organes (cerveaux, cœur, poumons, reins, foie, rate, peau) necessaire pour des analyses ultérieures
Remplacement
L’infection et ses conséquences sont des phénomènes complexes résultants de l’interaction de différents types cellulaires soumis à de multiples interactions encore partiellement connues. L’approche in vitro ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions entre les organes. Le modèle utilisé sera celui le plus validé à l’heure actuelle pour l’étude du sepsis. Il permet d’étudier de façon optimale la réponse de l’organisme à l’infection.
Réduction
Les procédures d’exploration physiologiques permettent un suivi longitudinal, sur la durée, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisé et augmente la puissance statistique. Le calcul du nombre d'animaux par groupe prend en compte la variabilité inter individuelle des animaux par rapport à la sévérité de l’infection et la dysfonction du cœur. Cette variabilité a été diminuée par la standardisation de la chirurgie entrainant l’infection via l’utilisation d’outil calibré permettant une chirurgie reproductible. Cela diminue le nombre d’animaux qui ne sont pas inclus dans l’étude, car il ne présente pas de signe d’infection. En post mortem, l’ensemble des organes sont prélevé et pourront être utilisé pour des recherches futur
Raffinement
45 minutes avant la chirurgie, L’animal est traité par un analgésique puissant. L‘ensemble des manipulations invasives sont réalisées sous anesthésie générale. L’analgésie est balancée avec l’utilisation d’anesthésique local en fin de procédure. Durant l’anesthésie, les animaux sont placés sur une table chauffante. En post-opératoire, les animaux sont réchauffés et réhydratés. Après leur réveil, les animaux sont replacés en cage individuelle, avec accès libre à l’eau et à la nourriture. La douleur est surveillée et si besoin l’analgésie sera renforcée. Des points limite seront surveillé, notamment durant le monitorage de l’animal, si la pression artérielle est trop basse, l’animal sera euthanasié avant d’atteindre une phase agonique. Cela permettra notamment de récupérer les organes de l’animal et ainsi pouvoir exploiter les résultats, nous diminuons ainsi le nombre d’animaux utilisé Des points limites ont été établis
Choix des espèces
L’étude de la pression artérielle et de la fonction cardiaque est plus aisée chez le rat que la souris. La mise en place des cathéters artériels et veineux est plus facile (taille des vaisseaux supérieur) chez le rat et l’échographie cardiaque est plus facile (taille du cœur supérieur). Nous utiliserons une souche de rat non consanguine permettant de plus facilement généraliser les résultats. Des rats mâles de 10-12 semaines, pesant entre 300 à 500g seront utilisés. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Humain
Enseignements pratiques de physiologie animale et de pharmacologie : apprentissage des savoir-faire en expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 85
Pour illustrer des cours de physiologie et de pharmacologie devant des étudiants de licence, 265 souris et 85 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Les rats reçoivent la pose de cathéters, des injections et un prélèvement de sang par la carotide, les souris étant utilisées pour l'initiation aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Aucun calcul statistique ne justifie ces effectifs, fixés pour former 175 étudiants par an. Le principal risque décrit tient au dosage de l'anesthésique, un réveil prématuré en pleine séance ou au contraire un arrêt cardio-respiratoire, et le porteur admet qu'il arrive qu'un animal meure pendant une séance.
Objectifs
L’objectif est principalement d’inculquer aux étudiants des notions d’expérimentation animale requises dès la troisième année de licence de biologie et d’autre part d’illustrer les cours théoriques de physiologie animale et de pharmacologie par des applications techniques concrètes réalisées sur le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Acquisition des techniques de base d’expérimentation animale sur animal vigil (préhension, contention et techniques d’injections les plus courantes) et sur animal anesthésié (pose de cathéters, prélèvement carotidien).
Procédures
Après une analgésie préopératoire, les rats seront anesthésiés dès leur entrée dans la salle de TP, puis pose de cathéters, injections et prélèvement unique de sang par le cathéter carotidien. Chez les souris après analgésie/anesthésie, initiation aux techniques d’injections intra¬péritonéale et sous-cutanée. La nuisance principale est un réveil prématuré de l’animal lors de la séance d’expérimentation ou au contraire une surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire de l’animal. Selon les cas, l’enseignant réajuste la dose d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Le stress à la contention est minimisé par l'apprentissage de la réglementation et de l'éthique lors d'une séance de présentation en cours magistral et d'une démonstration préalable par l'enseignant. Un apprentissage sur un modèle d'imitation (maquette inerte conçu avec un matériau qui confère la sensibilité spécifique d'un animal vivant) permet d'acquérir les compétences nécessaires pour manipuler et réaliser les gestes de routine d'expérimentation (injection et pose de cathéter), réalisé par la suite sur un animal vivant. Cet entrainement dans une séance qui précède la séance d'expérimentation sur l'animale vivant permet de réduire le stress de l'étudiant et chez l'animal. L'effet indésirable, bien que rare, est l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal sous anesthésie. Une réanimation est donc réalisée par l'enseignant avec un contrôle du débit d'anesthésiant, mais il arrive qu'un animal meurt pendant une séance d'expérimentation.
Devenir
Procédures sans réveil, compte tenu des manipulations expérimentales et des injections réalisées par les étudiants, les animaux ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure par l’enseignant.
Remplacement
Afin d’acquérir les compétences techniques d’expérimentation animale (contention et techniques chirurgicales) , les étudiants s’entraineront sur des modèles de rats en plastique. Cette initiation leur permettra de se familiariser avec les structures anatomiques et les gestes techniques sans avoir recours à l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux choisi est le nombre minimal permettant d'acquérir les techniques de base en expérimentation animale afin de sensibiliser et former nos étudiants, qui pour la majorité d’entre eux sont destinés à poursuivre leur carrière dans le domaine de la recherche en laboratoire sur le vivant. La première approche est réalisée sur une maquette dans le but d’une acquisition des compétences techniques requises avant leur réalisation sur animal vivant dans la demi-journée qui suit. Cette étape permet de réduire le nombre total d’animaux pour cette formation. Aucune statistique n’est requise pour l’ensemble des procédures proposées. Au bilan, nous utilisons 85 rats et 265 souris pour la formation de 175 étudiants par an.
Raffinement
Pour l’ensemble des procédures, les animaux sont anesthésiés afin d’empêcher toute douleur ou souffrance de l’animal en fonction des gestes réalisés et jusqu’à leur mise à mort à la fin de l’expérimentation. Pour la première séance d’expérimentation sur le rat, l’initiation au préalable sur des modèles plastiques permet de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux anesthésiés/analgésiés. En cas d'atteinte des points limites lors des expérimentations, les animaux en question sont mis à mort par l'enseignant.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles animaux les plus utilisés en recherche et le choix d’animaux jeunes adultes permet une manipulation plus aisée et un meilleur contrôle de l’anesthésie.
Identification des ganglions lymphatiques drainants de l’épididyme murin par injection d’une solution d’antigène fluorescent sous la capsule épididymaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Ouvertes sous anesthésie gazeuse pendant dix minutes pour recevoir une injection de colorant fluorescent sous la capsule de l'épididyme, 42 souris mâles vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. Leurs ganglions lymphatiques sont ensuite prélevés et examinés au microscope. L'étude reste purement descriptive et vise à repérer ces ganglions, que personne n'a encore décrits, première étape avant des travaux sur les infections de l'appareil reproducteur masculin. Le porteur ne mentionne comme nuisances que le stress de contention, la piqûre de l'analgésique et une à deux minutes de stress à l'induction de l'anesthésie, sans dire un mot de l'opération elle-même.
Objectifs
Environ 15% des cas d'infertilité masculine expliqués ont une origine immunologique. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes immunitaires mis en place dans les organes reproducteurs mâles avant d'envisager des traitements adaptés. Si l'environnement testiculaire est bien décrit, celui de l'épididyme reste peu étudié. L'épididyme est pourtant l'organe essentiel de la maturation et de l'acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. Les dérèglements de l'immunité qui touchent l'épididyme ont deux causes principales : des réactions auto-immunes (réponse délétère contre les spermatozoïdes) ou des réponses inflammatoires chroniques contre des pathogènes ascendants des voies uro-génitales (essentiellement des bactéries). La réponse immune est initiée par la reconnaissance d'une partie du pathogène (appelée antigène) par des cellules spécialisées, les cellules présentatrices d'antigène (CPA). Ces CPA migrent dans les ganglions drainants de l’organe où a été détecté l’antigène et le présentent à des cellules effectrices, les lymphocytes T afin de les activer. Les lymphocytes T activés sont en retour recrutés sur le site de l’infection pour éliminer les pathogènes présents. Actuellement, aucune publication ne décrit les ganglions lymphatiques drainants de l’organe alors même qu’il est le lieu d’initiation des réponses immunitaires effectrices. Notre objectif est donc d’identifier les ganglions drainants de l’épididyme murin par l’injection d’un antigène fluorescent dans l’organe et son suivi dans différents ganglions. Une étude préliminaire a permis de mettre en avant certains ganglions qui pourraient intervenir dans le drainage d'une partie de l'épididyme. Cependant, elle nous a aussi fait suspecter un drainage multiple et différentiel selon que l'antigène se trouve dans la partie proximale (tête) ou distale (queue) de l'épididyme. Nous souhaitons donc réaliser des injections d'antigène dans ces deux compartiments indépendemment. Notre première étude a également mis en évidence que seuls les temps d’analyse les plus précoces (5 à 15 minutes post-injection) permettaient d’observer une réelle fluorescence dans certains des ganglions étudiés. Cette première étape est indispensable au bon déroulement du projet qui amènera à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans les réponses aux pathogènes du tractus uro-génital et pourrait à terme permettre une prise en charge adaptée de l’infertilité masculine.
Bénéfices attendus
L’identification des ganglions drainant l’épididyme permettra par la suite d’aller étudier la réponse immunitaire qui se met en place après infection bactérienne de l’épididyme, et en particulier les dérégulations menant à des situations pathologiques comme les épididymites responsables de nombreux cas d’infertilité masculine. Cette question intéresse particulièrement les urologues et andrologues qui sont confrontés fréquemment à des patients présentant des infertilités liées à des infections ascendantes du tractus reproducteur, et en particulier liées à des épididymites, inflammations chroniques délétères de l’épididyme.
Procédures
Les animaux subiront en vigile une seule injection sous-cutanée d'analgésique qui dure seulement quelques secondes. Ensuite, les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie gazeuse au cours de laquelle sera pratiquée une unique injection sous la capsule épididymaire. L'opération chirurgicale dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress dû à la contention est attendu, couplé à la douleur de la piqûre nécessaire à l’injection d’un analgésique par voie sous-cutanée. Par la suite, un stress de courte durée est attendu lors de l’induction de l’anesthésie gazeuse (1 à 2 minutes) dans la cage d’induction.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour le prélèvement des ganglions lymphatiques proches de l’épididyme et leur analyse par microscopie.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation sur animaux ne peut malheureusement pas s'appliquer dans notre étude. En effet, seul le suivi de la migration in vivo de la molécule fluorescente de l’épididyme aux ganglions drainant permettra d’identifier ces derniers.
Réduction
Plusieurs critères ont été pris en compte pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires afin d’avoir une représentation biologiquement valide des ganglions drainant l’épididyme murin, dont des travaux publiés antérieurement par diverses équipes. Il apparaît que nous aurons besoin de 42 souris pour toute l’expérimentation. Notre étude étant uniquement descriptive, elle ne nécessitera pas de tests statistiques à proprement parler, d'où le faible nombre d'animaux requis.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi (maison en plastique, rouleau en carton). Avant toute manipulation de l’animal, celui-ci recevra une injection sous-cutanée d’analgésique pour compléter l’effet de l’anesthésie gazeuse au cours de la procédure. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux en les plaçant sur des tapis chauffants pour limiter le risque d’hypothermie et l’anesthésie profonde sera validée avant le début de la chirurgie.
Choix des espèces
Si la première étape de notre projet de recherche consiste à identifier les ganglions drainants de l'épididyme murin, la suite du projet portera sur l'étude approfondie de la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection du tractus reproducteur. La majorité des études portant sur le système immunitaire se fait chez la souris, aussi notre choix du modèle murin nous permettra de renforcer nos conclusions par comparaison avec les mécanismes de réponse immunitaire établis dans d'autres organes. De plus, le modèle murin nous offre une grande disponibilité d’outils moléculaires nécessaires à nos études. Enfin, de nombreuses homologies sont connues concernant les cellules et mécanismes immunitaires entre la souris et l'homme, faisant de nos études des bases solides pour d'éventuelles applications humaines. Notre étude nécessite d’avoir des animaux ayant des organes matures et fonctionnels, donc âgés de 3 à 6 mois.
Développement d’une méthode de thermométrie IRM in vivo
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Deux heures d'anesthésie continue à l'isoflurane, dont une heure quinze passée dans un environnement thermique modifié : 102 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. L'objectif tient à mettre au point une mesure de température par IRM chez le rongeur, méthode déjà utilisée en clinique humaine pour suivre les thermo-ablations de tumeurs mais peu développée chez le petit animal. Le porteur ramène les nuisances à la durée de l'anesthésie et prévoit un gel ophtalmique sur la cornée. Il justifie l'absence de remplacement par le fait qu'une température corporelle ne se mesure que sur un animal vivant, et annonce deux groupes "indispensables" pour la spectroscopie localisée sans expliquer comment il arrive à 102 souris.
Objectifs
La thermométrie par imagerie par résonance magnétique (IRM) est une des rares méthodes autorisant une cartographie in vivo de la distribution spatiotemporelle de la température de façon non invasive. Elle est actuellement utilisée en clinique pour le suivi des hyperthermies thérapeutiques focales et massives comme pour la thermo-ablation de tumeur. Elle est peu ou pas développée pour des études précliniques chez le petit animal et non adaptée à l’étude des mécanismes de régulation de la température intracorporelle où les modifications de température attendues sont de faibles amplitudes et potentiellement diffuses. L’objectif de ce projet est d’initier le développement de la thermométrie par IRM pour des applications fondamentales et précliniques et plus précisément pour le suivi d’hyperthermies faibles et diffuses, telles que celles attendues chez les mammifères homéothermes lors de challenges thermiques environnementaux. Les performances de la thermométrie IRM seront évaluées au niveau cérébral et musculaire. Ce projet s’inscrit dans la problématique d’adaptation aux changements climatiques et de compréhension des coups de chaleur.
Bénéfices attendus
Une souris est 3000 fois plus petite qu’un humain. La transposition sur le petit animal des protocoles cliniques est loin d’être triviale comme l’illustre la rareté des publications sur la thermométrie IRM en préclinique. L’objectif de ce projet est de proposer un outil de mesure non invasif de faibles variations de température chez le rongeur afin d’évaluer ce paramètre dans des modèles de animaux de dysfonctions métaboliques et/ou mitochondriales par exemple. Il permettra de doter la communauté scientifique d’une méthode nouvelle de mesure de température in situ qui sera à la disposition des équipes de recherche.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane sur une période de 2 heures et seront dans un environnement thermique adapté à l’étude sur une période de 1h15.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux seront liées à la durée d’anesthésie. Nous limiterons l’inconfort des animaux par le dépôt sur la cornée d'une goutte de gel ophtalmique.
Devenir
Les 102 souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L'expérimentation ayant pour objet l'évaluation de la température corporelle, elle ne peut être conduite que sur animal vivant.
Réduction
Les mesures de températures par imagerie de phase sur les tissus cérébraux et musculaires seront réalisées sur le même animal et durant la même acquisition en choisissant un muscle proche de la zone cérébrale afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour la spectroscopie localisée, la température est mesurée au sein d’un voxel qui doit être placé soit sur le muscle, soit sur le cerveau, deux groupes d’animaux sont donc indispensables. Il est à noter que des individus des deux sexes seront intégrés dans l’étude. Une analyse statistique sera réalisée pour évaluer les modifications des paramètres IRM observés lors des challenges.
Raffinement
Les animaux issus de l'élevage interne de l'établissement recevront les soins classiques de la structure avec régulation de température, accès sans limite à la nourriture et à l'eau, enrichissement des cages (frisotti papier, carré bois et cabanes). Lors du protocole d'imagerie, un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué et le suivi de la qualité de l’anesthésie sera évalué par mesure de la fréquence respiratoire.
Choix des espèces
Cette étude préliminaire a pour futur d'être continuée sur un modèle génétique altéré disponible chez la souris et ne peut donc être conduit que chez cette espèce. Des souris C57BL/6J seront utilisées puisqu’il s’agit du fond génétique du modèle génétiquement altéré. Il s’agira d’animaux âgés de 8 à 10 semaines ayant atteint la maturité sexuelle et immunitaire.
Etude du rôle de la GPVI, du fibrinogène et de la fibrine en thrombose artérielle et dans la thrombo-inflammation post-accident vasculaire cérébrale ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
La formation d'un gros caillot dans une artère interdit tout réveil, et les souris concernées sont tuées dès la fin de l'expérience. 576 souris vont être utilisées, 432 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 144 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent l'induction d'une thrombose de la carotide, de l'aorte abdominale ou des artérioles mésentériques pendant 30 à 45 minutes, la pose d'une sonde de mesure du flux sanguin, un accident vasculaire cérébral provoqué sous anesthésie de 30 minutes à 2 h 30, et pour certaines la pose sous la peau du dos d'un dispositif de diffusion continue. Les souris destinées à la thrombose des artérioles mésentériques ont 3 semaines, un âge choisi pour éviter les lipides entourant les vaisseaux et garantir la lésion des couches profondes de la paroi.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement qu’on appelle hémostase. Elles s’accumulent au niveau d’une lésion vasculaire, pour former un caillot qui stoppe les saignements. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade, nommé thrombose artérielle. Elle peut mener à l’occlusion du vaisseau, ce qui diminue l’apport en oxygène d’un tissu, aussi appelée ischémie. Elle est responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Dans le cadre du traitement de l’AVCi, le caillot obstruant la circulation est soit dissous par l’administration d’un médicament, soit retiré mécaniquement, ce qui permet de rétablir le flux sanguin des artères cérébrales. Cependant, ces traitements ont une efficacité modérée, due notamment à la formation de micro-caillots et à l’inflammation ayant lieu à la suite au rétablissement du flux sanguin cérébral. Ce projet, se focalise principalement sur la thrombose artérielle, l’événement pouvant déclencher les AVCi, ainsi que dans la formation de micro-caillots et l’inflammation à la suite d’un AVCi. De récents résultats montrent l’importance de la glycoprotéine VI (GPVI) dans la formation de ces micro-caillots et dans la réduction de l’efficacité des traitements de l’AVCi. Les ligands de la GPVI potentiellement présents dans ces événements sont le fibrinogène et la fibrine. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez la souris l’importance des interactions de la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine dans la thrombose artérielle, et dans l’apparition de micro-caillots et d’une inflammation à la suite du traitement de l’AVCi.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique. On pourrait mettre en évidence de nouveaux mécanisme impliquant la GPVI dans la thrombose artérielle, et améliorer les traitements ciblant la GPVI pour soigner la thrombose artérielle. On pourrait mettre en évidence que l’interaction entre la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine est à l’origine de l’aggravation de l’état de certains patients après le traitement de l’AVC. Ceci ouvrira des perspectives d’amélioration des traitements ciblant la GPVI avec de potentielles nouvelles indications.
Procédures
Les animaux subiront pour l’étude de la thrombose : • Les animaux seront soumis à des injections dans la cavité abdominale (animal vigile) et intraveineuses (animal anesthésié). Dans chaque procédure l’animal vigile recevra une injection pour l’anesthésie, puis il y aura une ou deux injections de quelques secondes sur animal anesthésié avant ou après le début de la thrombose artérielle en fonction des traitements à administrer. • L’induction d’une thrombose, soit au niveau de la carotide, soit de l’aorte abdominale, soit des artérioles mésentériques à proximité des intestins. Procédure : entre 30 et 45 minutes Les animaux subiront pour l’étude de l’AVC : • Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose de la sonde permettant de visualiser le flux sanguin de l’artère cérébrale qui sera obstruée. Procédure : 10 minutes • Une induction d’un accident vasculaire cérébral (AVC) sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie intraveineuse d’un traitement. Procédure : entre 30 minutes et 2h30 selon la méthode d’induction de l’AVC • Une pose d’un dispositif sous la peau du dos pour diffusion continue du traitement. Procédure : 15 minutes
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation, nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence respiratoire et une baisse de la température corporelle provoquée par l’anesthésie. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la sonde de mesure du flux sanguin ainsi qu’un inconfort au niveau de l’incision. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la pompe permettant la diffusion continue du traitement, ainsi qu’un impact sur la mobilité et un inconfort au niveau de l’incision. Nous ne nous attendons pas à un impact du traitement sur les risques de saignements. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la chirurgie permettant d’induire l’AVC. A une réduction de la mobilité causée par l’AVC, pouvant rendre difficile l’alimentation. Egalement, à un inconfort postopératoire au niveau de l’incision.
Devenir
La formation du thrombus de grande taille dans une artère ne permet pas le réveil de l’animal. Ainsi, immédiatement après la fin de l’expérience de thrombose, l’animal sera mis à mort. 24h après la réalisation de la procédure d’AVC, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses post mortem sur les cerveaux.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet des interactions entre la GPVI plaquettaire et le fibrinogène et/ou la fibrine dans un processus complexe et intégré qu’est la thrombose artérielle et sa conséquence, l’AVC ischémique. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo. De plus, les plaquettes sont des cellules sans noyau qui ne peuvent être cultivées dans des boites, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire qui aurait pu être envisagé pour étudier une partie du processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé entre 8 et 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux minimum 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de thrombose artérielle et d’AVC. Les techniques de mutation génétiques ont permis de générer des souris sur un même fond génétique (C57BL/6J) exprimant la GPVI humaine, déficiente pour le fibrinogène ou la fibrine. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. Les souris sont utilisées lorsqu’elles sont adultes (exception faite de la thrombose laser sur artérioles mésentériques) car la thrombose artérielle et les AVC touchent plus souvent les adultes que les enfants. La thrombose sur artérioles mésentériques est réalisée sur des souris de 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux, permettant ainsi de s’assurer de la lésion des couches intermédiaire et profonde de la paroi vasculaire.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 100
Cochons : 600
Chèvres : 80
Moutons : 170
600 porcs, 500 lapins, 170 moutons, 100 chiens et 80 chèvres vont être utilisés pour tester des stents, des prothèses vasculaires et des valves cardiaques avant leur mise sur le marché. Chaque animal subit une implantation chirurgicale d'une à quatre heures selon la difficulté de l'accès au cœur, avec un risque d'hémorragie ou d'ischémie, parfois suivie d'une biopsie d'une heure et de séances d'imagerie dans un autre établissement. 950 sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 160 dans des procédures sévères, 240 sont opérés sans jamais être réveillés, et les 1 450 sont tués pour l'examen des tissus au contact du dispositif. Le donneur d'ordre commande ces essais et s'engage à ne pas les faire refaire à l'identique, le porteur indiquant par ailleurs que la réglementation impose le recours aux animaux avant tout test clinique.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire (exemple : stent, prothèse vasculaire, valve cardiaque...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Certains projets nécessiteront des séances d'imagerie (scanner, IRM), qui seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires disposant de l'ensemble des équipements nécessaires pour la conduite des examens.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 3h voire 4h pour les chirurgies les plus compliquée (accès au cœur par exemple). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Un prélèvement intermédiaire ou biopsie peut être réalisé en cours d'étude (durée de l'intervention estimée à 1h) afin de suivre l'évolution de la réaction des tissus au contact du dispositif. Cette intervention se fera systématiquement sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). Le scanner ou l'IRM seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires, la durée de l'intervention est d'environ 1h pour le scanner, et 1h30 pour l'IRM.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables ne pouvant être résolus par des mesures de raffinement sont, selon les procédures, la survenue d'un hématome ou oedème au niveau du site opératoire, une hémorragie (perte de sang) ou ischémie (manque de perfusion sanguine d'organes) en raison des sites d'implantation (vaisseaux, coeur...). Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les nuisances attendues en lien avec les séances d'imagerie sont le transport entre les établissements utilisateurs, pouvant être une source de stress. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses vasculaires pour évaluer l’élasticité du greffon). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé cardiovasculaire, en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé (exemple : vaisseaux, coeur) et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (contention, palpation, isolement, mise en place de gilets pour porter les constituants de certains dispositifs). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos, augmentation de la quantité de litière…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires par exemple pour certaines espèces). La chirurgie est réalisée sous anesthésie chimique et gazeuse et analgésie (à base de morphiniques). En cas de signes de douleur et signes cliniques, le traitement adapté sera mis en place. Les animaux sont suivis de façon quotidienne sur la base des critères suivants : apparence et état général, consommation alimentaire et hydrique et transit, attitude, comportements, signes cliniques. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Si le traitement mis en place n'a pas d'effet, l'animal est euthanasié. En phase postopératoire, le suivi est renforcé et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée. Le risque infectieux est controlé par l'administration d'antibiotiques. Les transports des animaux vers les établissements utilisateurs partenaires (séance d'imagerie) seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur. Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil et le transport retour. Le risque d'hypothermie sera contrôlée grâce à la température de la salle, l'isolation du sol, les couvertures, lampes chauffantes.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence (normes). Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien, les ovins/caprins ou les porcins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie), ainsi que sur les similarités avec l’Homme. Par exemple, le chien est une espèce communement utilisée dans certains types de test car la thrombose induite par un dispositif médical a tendance à se déclencher plus rapidement que chez l'Homme. Les ovins et les porcins sont généralement de bons modèles en raison des similarités cardiovasculaires et hématologiques avec l'Homme. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requiert, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Nanomédecine pour la transplantation d’organes : évaluation de la tolérance induite par les nanoparticules chez un modèle porcin de transplantation hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Ouverts par laparotomie pendant une heure trente pour qu'on leur prélève le foie, 32 porcs donneurs sont tués sous anesthésie sans reprendre conscience. Les 32 receveurs subissent une transplantation hépatique de deux heures trente, puis des prises de sang quotidiennes pendant une semaine par cathéter jugulaire et hebdomadaires jusqu'à quatre-vingt-dix jours, avant une seconde laparotomie de biopsie et la mise à mort. Les procédures qui les concernent relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec une douleur post-opératoire et un hébergement initial en cage individuelle. Le traitement testé, des nanoparticules d'oxyde de fer censées induire une tolérance du greffon, "pourrait transformer" les suites de la transplantation selon le porteur, qui écarte tout risque de toxicité en s'appuyant sur des études menées chez la souris, alors qu'il justifie le recours au porc par sa proximité anatomique et physiologique avec l'humain.
Objectifs
A l’heure actuelle, la transplantation d’organes est limitée par l’utilisation d’une immunosuppression à vie (pour éviter les rejets de greffe) ce qui entraîne de nombreux effets indésirables parfois mortels tels qu’une plus grande susceptibilité aux infections, une fréquence accrue de maladies cardiovasculaires, et certaines formes de cancers. Le présent projet a été proposé pour explorer l’effet d’un traitement par nanoparticules pour induire une tolérance de l’organe transplanté afin d'éviter le rejet sans utiliser d’immunosuppresseur au long cours. Il s’agit ainsi dans un premier objectif d’évaluer un nouveau type de nanoparticules (nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de protéines capables de se lier à certains globules blancs) comme candidat médicament pour bloquer la réaction immune de rejet et induire la tolérance du greffon hépatique chez le modèle porcin. Ce projet a comme second objectif d’observer le bon fonctionnement des nanoparticules en recherchant la formation de cellules spécifiques du système immunitaire sous la forme de globules blancs aux propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
Il n’est pas possible actuellement de réaliser une greffe d’organe sans avoir recours à un traitement immunosuppresseur à vie. S’il s’avère efficace dans l’induction d’une tolérance durable, le traitement par nanoparticules faisant l’objet de ce projet pourrait transformer les suites à long terme de la greffe d’organes en supprimant les nombreux effets indésirables parfois mortels des immunosuppresseurs.
Procédures
Chez les animaux donneurs de foie : sous anesthésie générale, prélèvement du foie pour transplantation hépatique par laparotomie (incision de l'abdomen), intervention unique (1 heure 30 minutes). Chez les animaux receveurs : sous anesthésie générale, transplantation hépatique par laparotomie, intervention unique (2 heures 30 minutes). Des échantillons de sang de 0,5-1 mL seront prélevés après la procédure, puis tous les jours pendant 7 jours, via le cathéter jugulaire tant que celui-ci pourra être maintenu en place sans infection, puis via un abord périphérique auriculaire, une fois par semaine jusqu'au terme de la période de suivi. En fin de période d’observation, biopsie du greffon par laparotomie sous anesthésie générale avant euthanasie par surdose d’anesthésique (30 minutes). Pour les animaux de l’expérience n°2, le greffon sera complètement explanté par laparotomie avant euthanasie par surdose d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Douleur modérée post-opératoire (laparotomie). Toxicité éventuelle du produit injecté pouvant induire un stress physique (les nombreuses études sur modèle murin utilisant ces nanoparticules aussi bien que des composés similaires n’ont mis en évidence aucun effet secondaire local ou systémique ; aucun effet de l’injection n’est donc attendu sur modèle porcin, mais dans l’hypothèse où cela se produirait, les points limites décrits par ailleurs seront respectés). Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement initial en cages individuelles (même si les animaux ont toujours des contacts avec les congénères voisins).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort soit immédiatement après chirurgie sous anesthésie générale (animaux donneurs de foie, N=32), soit 90 jours maximum après le réveil post-chirurgie (animaux receveurs, N=32) afin de pratiquer des prélèvements post-mortem à des fins d'analyses biologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’une part d’évaluer l’effet thérapeutique in vivo d’un candidat médicament, et d’autre part de confirmer le mécanisme d’action de ce médicament au travers d’un modèle de transplantation hépatique. Le mécanisme d’action a déjà été montré expérimentalement dans un modèle in vitro. Avant d’envisager des études cliniques chez l’humain, ce nouveau traitement doit impérativement être testé et montrer une efficacité sur un modèle in vivo pertinent. Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes ; en effet son système digestif, son anatomie et sa physiologie générale sont proches de ceux de l’humain.
Réduction
Nous avons décidé d’inclure un nombre raisonnable d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante pour observer une différence significative entre les groupes expérimentaux en matière de rejet aigu ainsi que pour pallier d’éventuels imprévus (N=12 par groupe au total). Les différences entre groupes seront analysées par des tests non paramétriques pour données non appariées (indépendantes). Des statistiques descriptives seront utilisées en complément. Chaque animal receveur sera associé à un animal donneur de même sexe. Les donneurs ne pourront pas servir à leur tour de receveur dans une optique de réduction car le foie doit être prélevé largement avec des vaisseaux les plus longs possibles empêchant la survie du donneur et l’implantation d’un foie en lieu et place de celui prélevé. De même, le foie explanté chez le receveur ne peut pas servir de greffon car les vaisseaux sont laissés les plus longs possible du côté du receveur pour permettre l’implantation du greffon.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’humain, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Une prise en charge de la douleur per- et post-opératoire sera effectuée avec un traitement analgésique adapté à l'espèce et aux procédures. Des points limites précis ont été établis et une grille optimisée pour l'évaluation de la douleur et du bien-être animal sera utilisée.
Choix des espèces
Le porc est le modèle gros animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. Des porcs en croissance (30-40 kg) seront utilisés car les modèles porcins publiés en ischémie et transplantation hépatique l'ont été sur ce type d'animaux.
Recherche, localisation cellulaire et quantification de récepteurs olfactifs dans la peau et le cortex somesthésique chez le rat jeune et âgé
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, une perfusion transcardiaque ou un prélèvement de cerveau étant incompatibles avec leur survie, 280 rats jeunes et âgés vont être utilisés. 120 sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 160 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les premiers reçoivent une huile odorante sur la peau puis des prélèvements de peau du ventre, du dos et des pattes, une partie après un repérage électrophysiologique du cortex de cinq heures. Les seconds reçoivent une application quotidienne d'huile odorante pendant un mois, six jours par semaine, à partir de seize à vingt-quatre mois d'âge. Le porteur affirme que la peau humaine âgée disponible provient d'interventions cancéreuses et ne peut pas être considérée comme saine, d'où la "nécessité" qu'il tire d'utiliser un modèle animal.
Objectifs
Dès 30 ans, la peau vieillit : l’épiderme s’amincit, la jonction derme-épiderme s’aplanit, le nombre de glandes sébacées diminue ainsi que la synthèse de collagène, d’élastine et d’acide hyaluronique. Le nombre de mécanorécepteurs et de fibres sensorielles se réduit et la conduction nerveuse ralentit. Enfin, le traitement par le cerveau des informations tactiles est altéré avec, notamment, des latences de réponse augmentées et une dégradation des zones de traitement des informations cutanées. La diminution de la sensibilité tactile qui découle de toutes ces transformations provoque des déficits d’équilibre et de marche chez les personnes âgées augmentant les risques de chutes. Les effets du vieillissement sont bien documentés sur la peau glabre, mais nettement moins connus sur la peau pileuse qui représente cependant 90% de la surface chez l’homme. Des récepteurs olfactifs (RO) ont été découverts chez l’homme dans d’autres tissus que l’épithélium olfactif, comme la peau. L’activation de la plupart de ces récepteurs par des composés odorants appliqués sur la peau favorise la prolifération et la migration des kératinocytes, accélère la réparation de la peau et améliore la sensibilité tactile. L’activation d’autres RO pourrait au contraire avoir des effets délétères. C’est le cas du récepteur OR10G7 surexprimé chez les patients atteints de dermatite atopique. La présence de certains RO a aussi été observée dans le cerveau, notamment dans le cortex frontal où leur expression serait diminuée chez les patients Parkinson ou schizophrènes, ou au niveau du cortex orbitofrontal chez les patients Alzheimer. Notre étude vise à rechercher et quantifier chez le rat l’expression de différents récepteurs olfactifs dans le cortex somesthésique et dans la peau, dans des territoires cutanés glabres et pileux dont la sensibilité et le rôle fonctionnel sont différents (ventre, dos, pattes antérieures et postérieures). Nous caractériserons également le vieillissement spécifique de ces différents territoires cutanés, et nous intéresserons notamment à la préservation avec l’âge des fibres C tactiles impliquées dans le toucher affectif. Nous rechercherons les effets de l’âge sur l’expression des récepteurs olfactifs dans la peau glabre et pileuse, ainsi que dans le cortex somesthésique. Les effets sur la peau d’une activation de longue durée de ces récepteurs seront également recherchés chez des rats jeunes et âgés.
Bénéfices attendus
Plusieurs études ont suggéré que les substances odorantes pourraient avoir des applications thérapeutiques potentielles en dermatologie. Il a été montré que certains récepteurs olfactifs (RO) de la peau sont des médiateurs de la cicatrisation des plaies et de la croissance des cheveux ou d’activités anti-cancéreuses ; Certains sont également associées à diverses maladies de la peau, notamment les troubles de la pigmentation comme le mélanome, ou à de l’inflammation. Ainsi les RO, initialement identifiés comme des protéines membranaires dans les organes olfactifs, joueraient un rôle critique dans la physiologie de la peau, ce qui suggère la possibilité que les RO puissent constituer des cibles moléculaires importantes pour améliorer les maladies et les déficiences de la peau ou la cicatrisation chez les personnes ayant bénéficié de greffes de peau. De plus, la diminution de la sensibilité tactile qui découle du vieillissement de la peau et du traitement cortical des informations tactiles provoque des déficits d’équilibre et de marche chez les personnes âgées augmentant les risques de chutes. Les récepteurs olfactifs pourraient constituer une nouvelle cible thérapeutique pour la lutte contre le vieillissement et la sénescence de la peau humaine. L’étude des effets du vieillissement sur l’expression des récepteurs olfactifs et de leur activation sur de longues durées pourrait ouvrir des perspectives intéressantes dans le cadre d’actions de prévention chez la personne âgée visant à empêcher une évolution vers la dépendance à la suite de chutes. Par ailleurs, alors que le toucher discriminatif diminue avec l’âge, le toucher affectif serait préservé des effets du vieillissement, induisant même des émotions positives plus intenses chez les séniors. L’impact du vieillissement sur la densité des fibres C tactiles, fortement impliquées dans le toucher affectif, est encore totalement méconnu. Sachant que ces fibres C tactiles sont très abondantes dans la peau pileuse et rarissimes dans la peau glabre, une étude comparative du vieillissement des peaux glabre et pileuse fournirait de précieux indices sur le rôle des fibres C tactiles dans les différentes aspects du sens tactile, au-delà de renseigner sur le vieillissement de la peau pileuse très peu étudié.
Procédures
Dans la première procédure (durée totale environ 2 heures), tous les animaux (40) seront anesthésiés et de l’huile odorante est appliquée sur la peau. Une heure après, des échantillons de cette peau seront prélevés (3 échantillons sur chacune des zones d’intérêt : ventre, dos, pattes antérieure et postérieure). Les animaux subiront ensuite une perfusion transcardiaque. Dans la deuxième procédure (durée totale d'environ 5 heures), les animaux (80) seront anesthésiés et un repérage électrophysiologique des zones de traitement cortical des informations tactiles en provenance corps sera réalisé. Puis l’huile contenant la molécule odorante sera appliquée sur les différents secteurs de la peau glabre et pileuse puis, une heure après, quatre échantillons de tissu cortical seront prélevés. Trois échantillons de peau sur chacune des zones cutanées d’intérêt (ventre, dos, pattes antérieure et postérieure) seront ensuite effectués suivis d'un prélèvement de sang dans la veine saphène. Dans la troisième procédure, une manipulation des animaux (160) en présence d’huile odorante dans leur environnement proche sera effectuée pendant une semaine (30 minutes par jour, familiarisation avec l'expérimentateur et habituation à l’odeur). Puis, l’huile odorante sera appliquée sur différentes parties de son corps pendant 1 mois à raison de 1 fois par jour, 6 jours par semaine. Pendant cette période d’application de l’huile odorante (1 mois), l’animal est isolé dans une grande cage pour cobayes, enrichie avec des objets de forme et de texture variées, déplacés et/ou changés quotidiennement. Deux jours après cette période, l’animal sera anesthésié. Trois échantillons de peau seront prélevés sur chacune des zones d’intérêt de la peau (ventre, dos, pattes antérieure et postérieure). Un prélèvement de sang sera réalisé dans la veine saphène. Durée totale de la chirurgie : environ 2 heures.
Impact sur les animaux
Deux procédures du projet seront réalisées chez de vieux rats (16 à 24 mois). Ainsi, les rats âgés pourraient présenter certaines comorbidités et une fragilité de leurs fonctions physiologiques augmentant les risques liées à l'anesthésie. Les deux premières procédures étant des procédures classées « sans réveil », les principaux effets indésirables seront ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’anesthésique lors de l'induction (stress, douleur, accélération du rythme respratoire et cardiaque). Afin de réduire le risque d'excitation pendant l'induction, l'injection sera pratiquée dans un endroit calme. L’anesthésie sera monitorée et maintenue suffisamment profonde pour que les actes chirurgicaux soient totalement indolores. Dans la 3e procédure, l’étude des effets d’une activation de longue durée des récepteurs olfactifs sur la qualité de la peau prévoit l’application de molécules odorantes pendant 1 mois (1 application par jour, 6 jours par semaine). Ce qui pourrait générer du stress lié à la manipulation des animaux et à leur contention. Afin de le limiter au maximum, voire de l'empêcher, nous réaliserons préalablement à l'application journalière de l'huile sur la peau une période d’habituation (une semaine) des animaux à être manipulés (en présence de molécules odorantes dans l’environnement proche). Par ailleurs, Il est possible que l’animal lèche l’huile dans laquelle sont dissoutes les molécules odorantes ; celle-ci étant comestible, aucun effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, des prélèvements cérébraux, de peau ou une perfusion en prévision d’une analyse immunohischimique du cerveau étant incompatibles avec leur survie.
Remplacement
Les études actuelles sur l’expression des récepteurs olfactifs dans la peau sont principalement réalisées sur de la peau prélevée chez l’humain, principalement au niveau de la peau glabre (circoncisions), et plus rarement sur de la peau pileuse (résections abdominales). La plupart de ces interventions chirurgicales sont réalisées chez de jeunes enfants ou des adultes relativement jeunes. Les peaux disponibles chez les plus âgées proviennent d’interventions à visée thérapeutique, notamment cancéreuses, et ces échantillons ne peuvent donc pas être considérés comme sains, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal. De plus, à notre connaissance aucune étude ne s’est intéressée à l’expression de ces récepteurs au niveau du cortex somesthésique. Ainsi, l’utilisation d’animaux nous permettra de caractériser et de quantifier l’expression corticale des récepteurs olfactifs et les effets du vieillissement sur cette expression. Elle nous permettra également, chez les mêmes animaux, d’évaluer le vieillissement différentiel des secteurs glabres et pileux de la peau, et les effets de l’âge sur l’expression des récepteurs olfactifs de ces territoires cutanés.
Réduction
Le nombre de groupes expérimentaux a été établi dans chaque procédure afin de permettre de répondre à nos différents objectifs scientifiques. Nous avons établi le nombre de rats par groupe au regard des données de la littérature. Ainsi, les résultats obtenus chez 7 rats par groupe pourraient nous permettre de baser nos interprétations sur des statistiques suffisamment robustes. Cependant, a été rajouté un nombre d'animaux (1 rat par groupe expérimental) qui, selon notre expérience antérieure, pourraient probablement être écartés de l’analyse statistique de notre étude pour l’une des causes suivantes : une défaillance physiologique de l’animal âgé, des problèmes techniques (parasitage des enregistrements électrophysiologiques, marquages immunohistochimiques peu spécifiques...). Afin d’appliquer le principe de réduction, nous avons limité à l’application de 4 molécules odorantes (3 positives et 1 négative) activant quelques-uns des récepteurs olfactifs dans la peau.
Raffinement
Au cours des chirurgies, le maintien d’un niveau stable d’anesthésie et d’analgésie prévient la souffrance des animaux et garantit des conditions d’enregistrement et de physiologie invariantes. L'efficacité́ de l’anesthésie sera vérifiée, à intervalles réguliers, par l’absence de réaction au pincement de la queue ou d’une patte, la surveillance d’un éventuel mouvement des vibrisses, et du changement du rythme respiratoire. L'animal sera placé sur une couverture chauffante thermorégulée immédiatement après l'induction de l'anesthésie et jusqu'à la fin des actes chirurgicaux. Pour la 3e procédure qui vise à analyser les effets d’une activation de longue durée des récepteurs olfactifs de la peau, une période de manipulation des rats d’une semaine par l’expérimentateur associée à une habituation olfactive à l’huile odorante sera réalisée avant l’application journalière de cette huile sur la peau. Au cours des périodes d’habituation et d’application de l’huile, une surveillance accrue des animaux sera effectuée afin d’analyser leur comportement face aux molécules odorantes. Par alleurs, afin de limiter chez les vieux rats (procédures 2 et 3) l’apparition de comorbidités (surpoids, obésité, diabète) et ses conséquences liées à une alimentation trop riche, les vieux rats seront pesés une fois par semaine et leur poids stabilisé en adaptant leur ration alimentaire quotidienne
Choix des espèces
Les études antérieures du vieillissement tactile ont été majoritairement conduites chez l’homme, surtout sur la peau glabre. Très peu se sont intéressées aux RO ectopiques chez le rongeur, uniquement chez la souris. Une étude chez l’animal nous permettra la recherche de RO dans le cortex somesthésique et leur localisation cellulaire. Nous pourrons aussi étudier les effets spécifiques du vieillissement des zones cutanées glabres et pileuses ainsi que les modifications avec l’âge des fibres C tactiles impliquées dans le toucher affectif. Par ailleurs, les études développées dans le laboratoire au niveau du cortex somesthésique ont été réalisées chez le rat avec des approches électrophysiologiques, immunohistochimiques et comportementales. Notre connaissance du comportement des rats ainsi que des zones de représentation dans le cortex somesthésique faciliteront le repérage électrophysiologique nécessaire à leur prélèvement en vue de la quantification des RO. Cette étude sera réalisée, d’une part, chez le rat adulte (3-5 mois) afin de caractériser et de quantifier l’expression des récepteurs olfactifs dans le cortex somesthésique et dans la peau glabre et pileuse. D’autre part, des rats âgés (24-30 mois) nous permettront d’évaluer les effets du vieillissement sur cette expression ainsi que les effets à long terme sur la peau de l’application de molécules odorantes.
Etude du rôle fonctionnel des canaux ioniques dans la génération et la régulation de la fréquence cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 060 souris issues de quatorze lignées génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 940 sans jamais se réveiller et 1 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Celles qui reçoivent un capteur de télémétrie implanté restent hébergées seules jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. S'y ajoutent des injections intrapéritonéales hebdomadaires, la pose de micro-pompes osmotiques et trois échographies cardiaques. Le porteur justifie la souris par la puissance de la génétique chez cette espèce, tout en reconnaissant que sa fréquence cardiaque est bien plus élevée que celle de l'humain, alors que l'objet du projet est précisément la régulation de cette fréquence.
Objectifs
La fréquence et le rythme cardiaque sont des facteurs très importants pour la qualité de la vie et la santé humaine. Définies comme des dysfonctions du rythme cardiaque, les arythmies sont des maladies très répandues avec des degrés de sévérité et gravité très variables, pouvant aller jusqu’à la mort subite. La bradycardie fait partie des arythmies les plus fréquentes. Elle se caractérise par une fréquence cardiaque trop basse (avec risque de syncope) pour répondre à la nécessité physiologique de l'organisme notamment face à l’effort. Elle est plus répandue chez la population âgée, mais peut aussi affecter de jeunes individus. La fréquence cardiaque est générée au niveau de l’oreillette droite du cœur dans la zone hyperspécialisée du nœud sinusal. Notre projet vise à mieux comprendre le rôle physiologique de protéines spécifiques, appelées canaux ioniques, impliquées au niveau du nœud sinusal dans la genèse et la régulation de la fréquence cardiaque. Ces canaux ioniques pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques dans la prise en charge de la bradycardie. En utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour différentes combinaisons de canaux ioniques (14 lignées différentes), nous allons étudier la génération et la régulation de la fréquence cardiaque. Cette étude se fera par la combinaison d’approches in vivo (électrocardiogrammes et échographies cardiaques) et d’approches ex vivo et in vitro sur le cœur. Dans ces différentes approches, nous effectuerons divers traitements pharmacologiques connus pour réguler la fréquence cardiaque. Notre programme de recherche a trois objectifs : (i) Identifier le rôle de ces canaux ioniques dans la régulation de la fréquence cardiaque (ii) Comprendre comment l’interaction entre le système nerveux autonome et ces canaux de la cellule du nœud sinusal génère les symptômes de la bradycardie (iii) Comprendre le mécanisme de restauration de la fonction cardiaque par blocage (pharmacologique et/ou génétique) du canal potassique activé par l'acétylcholine (IKAch).
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes à la base de la génération et de la régulation cardiaque et proposer de nouvelles stratégies thérapeuthiques pour la prise en charge de la dysfonstion sinusale.
Procédures
injections intrapéritonéales (injection hebdomadaire, durée de l'injection, environ 30 s) implantation de capteurs de télémétrie (implantation unique, durée totale de l'intervention : 30 minutes), implantation de micro-pompes osmotiques (une fois, durée totale de l'intervention : 15 minutes)- Echographies cardiaques réalisées (3 échographies de 15 minutes environ / souris). Ces échographies sont réalisées à différents stades du protocole. Comme les échographies sont réalisées sur les animaux implantés avec le capteur de télémétrie (procédure n°1), l'hébergement individuel est maintenu pour une durée maximale de 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale va induire une légère douleur liée à la piqure de l'aiguille. L'hébergement individuel des animaux suite à l'implantation des capteurs de télémétrie va causer du stress pour l'animal.
Devenir
Des échographies cardiaques sont réalisées pour toutes les souris dont la fréquence cardiaque a été enregistrée par télémétrie. A l'issue de ces procédures in vivo, les souris sont euthanasiées afin d’effectuer des procédures ex vivo et in vitro sur le cœur entier ou le nœud sinusal isolé et de récupérer leurs tissus cardiaques (3R).
Remplacement
La génération et la régulation de la fréquence cardiaque sont des phénomènes complexes encore mal élucidés. L’activité du système nerveux autonome et la tension artérielle font partie des multiples facteurs pouvant moduler le rythme cardiaque. Par conséquent, pour étudier le rôle des canaux ioniques impliqués dans la détermination de la fréquence cardiaque, nous sommes obligés de recourir à un système in vivo. La souris est l'organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc, à ce jour, la seule option pour évaluer avec précision et pertinence les mécanismes associés aux modifications de la fréquence cardiaque.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à un logiciel statistique, à notre expertise et aux données bibliographiques. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différentes procédures in vivo, ex vivo et in vitro afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal des animaux inclus dans les protocoles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Aucune des lignées de souris que nous utiliserons ne présente de phénotype dommageable. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences par du personnel qualifié. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. La douleur induite par l'implantation des transmetteurs pour la télémétrie est prise en charge par un analgésique pendant et après l'anesthésie. Afin de garantir le bien-être des animaux, des points limites seront appliqués.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique et de transgénèse. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes codants pour des canaux ioniques dans la régulation de la fréquence cardiaque et dans les mécanismes pathologiques de la bradycardie. Bien que la fréquence cardiaque de la souris soit significativement plus élevée de celle chez l’humain, il a été montré que l’ablation spécifique des gènes codant pour les canaux ioniques reproduit fidèlement certaines maladies congénitales de l’automatisme cardiaque et du rythme. Le choix de l’espèce est donc approprié pour conduire le projet. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 104 semaines). Bien que les bradycardies d’origine congénitales ou acquise affectent aussi les enfants et les jeunes adultes, nos approches sont optimales uniquement sur des souris adultes (à partir de 2 mois). De plus, limiter l’étude au stade adulte permet l’observation de la fréquence cardiaque après la pleine maturation des mécanismes de régulation du rythme.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Pour déterminer quel site de mesure de température reflète le mieux celle du cerveau pendant le réchauffement d'un patient sous circulation extracorporelle, six cochons de 50 à 60 kilos sont opérés sous anesthésie profonde et tués avant tout réveil. L'intervention dure quatre heures et reproduit une hypothermie profonde avec arrêt circulatoire, avec une perte de sang lors de la pose des canules. Leurs tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur retient le cochon pour la similitude de son anatomie cardiaque et pour un poids suffisant à l'implantation d'une circulation extracorporelle, et note que le modèle est déjà en place dans sa structure, ce qui lui sert aussi d'argument de réduction.
Objectifs
Au cours de certaines interventions de chirurgie cardiaque, il est parfois nécessaire de recourir, à une CEC (circulation extra-corporelle) avec une hypothermie profonde pour permettre un geste chirurgical de qualité. Dès que la chirurgie est terminée, une phase de réchauffement du patient débute permettant de restaurer une température normale en vue d’un arrêt de la CEC en toute sécurité. Durant cette phase de réchauffement, certains organes tels que le cerveau, le cœur, le foie et les reins, se réchauffent plus rapidement que d’autres, ce différentiel de rapidité résulte de mécanismes de protection et de particularités anatomiques et physiologiques. Ce projet propose d’étudier, parmi les sites anatomiques habituellement utilisés pour des mesures de température en CEC, ceux qui sont le mieux corrélés aux valeurs de température interne du cerveau. Le but principal est ainsi de déterminer un site optimal reflétant au mieux la température cérébrale impossible à mesurer en clinique afin de limiter le risque de survenue d’une hyperthermie cérébrale aux conséquences potentiellement délétères. Le second objectif de ce travail sera de vérifier s’il existe une différence significative entre la température cérébrale de référence mesurée au d'une veine du cou et la température intracérébrale mesurée au contact direct du cerveau. Le troisième objectif sera de déterminer si les sites de mesures de température sélectionnés exposent à des risques d’hyperthermie intracérébrale.
Bénéfices attendus
A notre connaissance, il existe très peu d'études comparant les différents sites de mesure de température avec la température cérébrale lors de la phase de réchauffement en CEC suite à une hypothermie profonde avec arrêt circulatoire. Par ailleurs, ces études ont une validité très relative quant à l'interprétation de leurs résultats puisqu'elles prennent comme température de référence cérébrale la température au niveau de la veine du cou, ou nasopharyngée qui peuvent différer des valeurs de la température intracérébrale. Ainsi, l'objectif principal de cette étude de corrélation sera de déterminer le ou les sites de recueils de température qui apparaissent les mieux corrélés aux valeurs de température du cerveau, dans l'optique d'otimiser la phase de réchauffement et de réduire les risques d'hyperthermies cérébrales aux conséquences potentiellement délètéres.
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation ( durée 2 mn) puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale ( 2 mn). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront une intervention chirurgicale qui durera 4h.
Impact sur les animaux
Stress lié au transport et au changement d'hébergement des animaux. Douleur liées à la piqûre lors de la prémédication. Risques inhérents à la procédure chirurgicale: Perte de sang modérée lors de la pose des canules de CEC.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, ils seront euthanasiés en vue d'une étude post mortem des tissus.
Remplacement
Le modèle de circulation extra-corporelle ne peut être effectué que sur un organisme dans son entier avec un relevé des températures sur différents sites. Le modèle porcin développé par notre équipe depuis plusieurs années reproduit une situation chirurgicale induisant des effets cardiologique et cérébral très proches de l'état observé en clinique humaine .
Réduction
Le modèle est déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à un test de puissance stastique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes (au minimum 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins sept jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. Les animaux sont mis à jeun le jour de l’expérimentation et les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés calmantes avec un antidouleur. Les cochons seront ensuite sous anesthésie profonde pendant tout le protocole d'étude et avec un antidouleur en perfusion continue. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon (animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque, et avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Etude d’une voie de signalisation dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Tués sous anesthésie profonde pour qu'on leur prélève le cerveau, 450 rats Wistar-Han vont être utilisés, 250 pour mettre en culture les cellules de leurs vaisseaux cérébraux et 200 pour en isoler les cellules par tri magnétique. Les procédures sont classées sans réveil pour les 250 premiers et en souffrance légère pour les 200 autres, qui reçoivent en plus une injection intrapéritonéale unique trois à vingt-quatre heures avant la mise à mort. L'objet est d'élucider le mécanisme d'activation d'une protéine repérée dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le porteur présente la culture cellulaire comme une réduction du nombre d'animaux utilisés, les rats fournissant le matériel de départ de ces cultures.
Objectifs
L'activité de la protéine d'intérêt a été récemment identifiée dans les vaisseaux sanguins cérébraux chez le rat. L'objectif du présent projet est d'élucider le mécanisme exact d'activation de cette protéine et de comprendre son rôle physiologique. Son mécanisme d'activation sera étudié dans des cellules obtenues à-partir de vaisseaux sanguins de cerveau de rat et cultivées en laboratoire. Son rôle physiologique sera étudié en injectant un inhibiteur spécifique de cette protéine chez les rats puis en analysant les gènes dont l'expression est modifiée dans les vaisseaux sanguins cérébraux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser une nouvelle voie de régulation physiologique de la barrière hémato-encéphalique. Il pourrait aboutir à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans des pathologies associées à une dysfonction de cette barrière telles que l'ischémie cérébrale et les pathologies neurodégénératives.
Procédures
Tous les rats seront mis à mort sous anesthésie générale profonde à l'issue des procédures. Une partie des rats subira, 3 à 24 heures avant la mise à mort, une injection intra-péritonéale unique (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection intra-péritonéale n'engendre qu'un stress léger et de courte durée chez l'animal.
Devenir
Les animaux du Lot 1 (250 rats) sont mis à mort afin de prélever leur cerveau et de réaliser des cultures de cellules à-partir des vaisseaux sanguins cérébraux. Les animaux du Lot 2 (200 rats) sont mis à mort afin de prélever leur cerveau, d'isoler les cellules des vaisseaux sanguins par tri magnétique et d'analyser l'expression des gènes dans ces cellules.
Remplacement
L'étude des mécanismes d'activation de la voie de signalisation étudiée au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux nécessite d'étudier l'effet de nombreux agonistes et inhibiteurs permettant de moduler cette voie à différents niveaux. La réalisation de cette étude sur des cellules, et non sur des animaux, permet de diminuer fortement le nombre d'animaux utilisés puisque les expériences in vitro permettent de tester un grand nombre de composés en parallèle. Seul un petit nombre d'anbimlaux est utilisé pour obtenir les cellules qui sont ensuite mises en culture.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus dans le projet (450 rats) a été calculé au plus juste afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs compte-tenu des tests utilisés. Des tests statistiques spécifiques sont utilisés pour déterminer les lots et pour analyser de façon optimale les résultats.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec enrichissement. L'ensemble des procédures chirurgicales et de mise à mort sont effectuées sous analgésie et anesthésie (chimique). Les animaux sont surveillés sur la base de point limite et si un animal présente des signes de souffrance importants, il sera mis à mort sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les rongeurs possèdent une barrière hémato-encéphalique très similaire à celle de l’Homme. Le métabolisme et les processus physiologiques régulant l’homéostasie sont également très proches chez l’Homme et chez les rongeurs. Ceux-ci peuvent donc valablement servir de modèles dans l'étude et le rat Wistar-Han est une espèce particulièrement recommandée pour les études sur le métabolisme. Rats jeunes adultes de 13 semaines pour que la barrière hémato-encéphalique soit mature
Entrainement et optimisation des techniques utilisées en expérimentation animale.
- Formation professionnelle
Rats : 320
Entretenir la dextérité du personnel d'une unité qui vend des modèles animaux à ses clients : 1 320 souris et 320 rats vont être utilisés pour cela, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, ou menées sous anesthésie sans réveil pour la chirurgie. Chaque souris reçoit jusqu'à quatre administrations de sérum physiologique ou deux prélèvements de sang, le plus souvent sur animal vigile, et celles qui servent à l'entraînement chirurgical subissent une induction de cancer orthotopique de quinze minutes avant d'être tuées sans réveil. Une partie vient des surplus d'élevage déjà destinés à être tués, une autre d'une lignée immunodéficiente que le porteur décrit comme à phénotype dommageable. Il écrit que l'apprentissage de ces gestes bien exécutés contribue au bien-être animal et réduit la douleur lors des études commandées par ses clients.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le contexte d’une unité d’appui à la recherche en expérimentation animale qui propose un certain nombre de modèles animaux (dont modèle de cancer par induction orthotopique) à ses clients. Les actes mis en œuvre chez l’animal nécessitent que le personnel soit toujours opérationnel. Ce projet vise donc à utiliser des animaux pour l’apprentissage, le maintien ou l’amélioration des compétences de notre établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
L’apprentissage de ces gestes bien exécutés a pour objet de contribuer au bien-être animal et de permettre de réduire la douleur lors de leur exécution dans les études de nos clients faisant appel à notre établissement et ainsi obtenir des résultats fiables et reproductibles.
Procédures
Les souris servant à l'entrainement des administrations et prélèvements auront au maximum 4 administrations de sérum physiologiques ou 2 prélèvements de sang (durée 1 minute maximum) avec un délai d'1 semaine entre chaque acte sur une durée d'1 mois maximum. Ces administrations et prélèvements se feront sur souris vigiles exceptées le dépot pulmonaire, la nébulisation endotrachéale et le prélèvement au sinus rétro orbitaire qui se feront sur souris anesthésiées. Les rats servant à l'entrainement des administrations auront au maximum 4 administrations de sérum physiologiques (durée 1 minute maximum) avec un délai d'une semaine sur une durée d'1 mois maximum. Ces administrations se feront sur rats vigiles exceptées la nébulisation endotrachéale et l'injection intrapénien qui se feront sur rats anesthésiés. Les souris servant à l'entrainement de la chirurgie pour l'induction des modèles de cancer orthotopiques auront 1 seul acte de chirurgie (durée 15 minutes maximum) sous anesthésie et antalgiques et sans réveil, elles seront mises à mort à la fin de l'acte.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont limités à un petit hématome après une injection IP, SC, IM ou un prélèvement lorsque ce dernier est « raté ». Lorsqu’une intraveineuse est manquée, un léger gonflement apparait autours du point d’injection due à l’injection de liquide qui disparait dans les 5 minutes. Les animaux utilisés pour la chirurgie seront mis à mort à la fin de la séance sans réveil de ces derniers aussi si une hémorragie se produit ou si ue détresse respiratoire importante apparait, l'animal sera mis à mort sans attente.
Devenir
Les animaux ayant servi pour des entrainements ne peuvent être réutilisés pour des études clients.
Remplacement
L’entrainement et l’optimisation des techniques utilisées en expérimentation animale nécessite l’utilisation d’animaux. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, le remplacement de l’animal n’est pas possible lors de ces séances.
Réduction
Pour ce projet nous utiliserons des animaux de nos élevages en surplus devant être mise à mort (d’où le nombre important de lignées pouvant être utilisé). Nous utiliserons également des souris de notre élevage BalB/c Nude qui sont immunodéficientes et qui sont très utilisées dans le service d'imagerie in vivo pour la création de souris modèle orthotopique de cancer humain obtenu par chirurgie principalement. Ces dernières sont à phénotype dommageable et seront hébergées en portoir ventilé. Pour limiter le nombre d’animaux (Réduire) mis en œuvre, nous utiliserons au maximum 6 souris et 4 rats pour les différents modes d’administration et prélèvement par opérateur et 6 souris par opérateur pour des entrainements d’actes chirurgicaux. Nous comptons former annuellement 8 opérateurs et effectuer 4 séances d’entrainement administrations/prélèvements par opérateur sur la souris et 8 opérateurs et 2 séances d’entrainement administrations /prélèvements par opérateur sur le rat au maximum. Pour la chirurgie, pour le maintiens des compétences, 2 opérateurs feront 6 séances d'entrainements d'actes chirurgicaux par an sur la souris.
Raffinement
L’apprentissage de ces gestes bien exécutés a pour objet de contribuer au bien-être animal et de permettre de réduire la douleur lors de leur exécution et ainsi obtenir des résultats fiables et reproductibles pour les études de nos clients faisant appel à notre établissement. Les souris immunodéficientes seront hébergées en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ces souris de part leur aspect et leur taille sont nécessaires dans l'entrainement des protocoles de chirurgies et des protocoles d'administration et de prélèvement afin d'être dans les mêmes conditions que dans les études clients. Les souris seront hébergées par 2 à 6 maximum et les rats par 2. Les cages seront enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid, de quoi ronger et jouer avec leurs congénères. Ils auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Durant les actes de chirurgie qui se dérouleront sous anesthésie gazeuse, la douleur sera prise en charge par l’administration d’antalgiques et une anesthésie locale avant le début de l’intervention. A la fin de la chirurgie, sans réveil, les animaux seront mis à mort. Les animaux qui auront eu un prélèvement sanguin ou qui auront reçu une administration seront observés durant 24h et des grilles de scoring avec des points limites prédictifs (détérioration de l'aspect général ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin de limiter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces animales classiquement utilisées en recherche (en France en 2022, 66% de souris et 8% de rat). Ces 2 espèces sont élevées et utilisées dans les différents secteurs de l'établissement utilisateur. Les souris seront utilisées de 5 à 20 semaines et les rats seront âgés de 6 à 10 semaines de manière à reproduire les mêmes conditions que dans nos études clients.