Procédures sans réveil
Enseignement de techniques chirurgicales chez le Porc, le Mouton, le Lapin, le Rat et la Souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 4000
Lapins : 100
Cochons : 750
Moutons : 100
Former des internes en chirurgie, des vétérinaires et des scientifiques aux gestes de base mobilise ici 5 950 animaux non-humains, dont 4 000 rats, 1 000 souris, 750 cochons, 100 moutons et 100 lapins. 4 950 d'entre eux sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, les 1 000 autres étant utilisés pour l'apprentissage du gavage, des injections et de la contention, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal peut rester une demi-journée à une journée entière sous anesthésie pendant que se succèdent laparotomies, thoracotomies, sutures et anastomoses digestives ou vasculaires, le porteur indiquant faire passer le maximum d'étudiants sur chacun. Les souris viennent de l'élevage maison, écartées pour n'avoir pas le bon génotype, et les rats sont achetés "réformés" chez des fournisseurs, c'est-à-dire déjà destinés à être tués.
Objectifs
Le but est d'aider à la formation médicale pratique initiale des étudiants en médecine (internes des spécialités chirurgicales essentiellement, externes) et des étudiants en sciences (dès le Master 2). Nous assurons également la formation chirurgicale continue auprès des chirurgiens, des vétérinaires et des scientifiques dans le cadre des formations à la chirurgie expérimentale ainsi que pour concevoir ou réaliser des procédures expérimentales obligatoires pour toute personne pratiquant un acte chirurgical chez l'animal de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les étudiants en chirurgie soient formés aux techniques chirurgicales de bases afin d'avoir toutes les compétences nécessaires à leur activités en fin de cursus, que les chirurgiens ou vétérinaires en activité se forment aux nouvelles techniques chirurgicales et que les scientifiques apprennent les bonnes pratiques et gestes avec les différents modèles animaux (contention, gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse,...) encadrés par des personnes compétentes afin de pouvoir poursuivre leurs recherches dans les meilleures conditions pour eux et pour l'animal (Raffinement).
Procédures
Une partie des petits mammifères (rats et souris) serviront à l'enseignement des gestes de base tels que gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse, contention. Pour les autres et les grands mammifères, les formations visent à former les futurs chirurgiens, gynécologues, vétérinaires et toute personne réalisant des procédures expérimentales chez l'animal. Ces enseignements sont axés sur la maîtrise des gestes chirurgicaux de base tels que la suture ou l'hémostase pour les scientifiques. Les internes des spécialités chirurgicales seront davantage formés sur les sutures, l'hémostase, les anastomoses digestives, les anastomoses vasculaires ainsi que la coelioscopie. En fonction du geste à acquérir, l'animal pourra rester d'une demi journée à une journée sous anesthésie générale (avec vérification des constantes en permanence).
Impact sur les animaux
Pour les gestes réalisés de classe légére (procédure 1), une contention de courte durée sera pratiquée (moins de 1 minute). Lors des injections, une douleur légère de très courte durée est possible au site d'administration. Un léger saignement après les injections, très vite contenu par simple pression digitale, est également possible sans douleur associée. Une couverture analgésique locale sera appliquée pour réduire la douleur qui pourrait être engendrée par les injections (xylocaïne en spray 5%). Pour les procédures 2 et 3 (sans réveil), les interventions chirurgicales consisteront en des laparotomies/thoracotomies essentiellement avec techniques chirurgicales digestives et thoraciques. Les animaux seront tous sous traitement analgésique avec utilisation de dérivés morphiniques (buprénorphine et fentanyl) pour optimiser la prise en charge de la douleur jusqu'à leur mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure 1, étant une procédure légére, les animaux sont réutilisés pour les procédures 2 et 3 (sans retour à l'hébergement entre les deux). Les animaux des procédures 2 et 3 seront anesthésiés puis systématiquement euthanasiés à la fin des procédures. Etant des procédures chirurgicales nécessitant l'apprentissage de l'euthanasie ou des procédures chirurgicales trop importantes ne permettant pas leur réutilisation, l'euthanasie a été décidé comme l'issue la plus favorable.
Remplacement
Dès que possible et en 1ère intention, nous aurons recours à des peaux artificielles, des pelvi-trainers, des mannequins rats et souris, à la technique de la double horloge pour la microchirurgie ainsi qu'à des simulateurs de chirurgie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour certaines formations nous sommes également en contact avec des abattoirs qui nous livrent des pièces anatomiques (pieds de porc pour les sutures, périnée de truie pour les sages femmes) afin d'éviter de commander des animaux.
Réduction
Toutes les souris utilisées lors des formations sont des souris provenant de l'élevage de l'animalerie Eops destinées en temps normal à l'euthanasie car elles n'ont pas le génotypage souhaité. En ce qui concerne les rats nous essayons dès que possible de réutiliser des rats en fin de protocole ou nous commandons des rats dits "réformés" chez les fournisseurs, c'est à dire des rats voués à l'euthanasie car incompatibles avec les protocoles de recherche. Enfin, nous faisons passer le maximum d'étudiants sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être et répondant à leurs besoins physiologiques et éthologiques (cycle jour/nuit - 12h/12h ; nourriture et eau ad libitum; enrichissements) les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Une période de 10 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Si une anesthésie est nécessaire les animaux seront systématiquement prémédiqués en intra-musculaire ou en intra-péritonéale. Le relais anesthésique est assuré par un gaz anesthésiant (0,5 à 2,5%). Seuls les grands animaux (porcs et brebis) seront intubés. Dès l'anesthésie maintenue, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée ou intra-péritonéale. Si nécessaire, pour les procédures de classe légère, un traitement à base d'anesthésique local sera pratiqué pour lutter contre la douleur in situ.
Choix des espèces
Le porc et le mouton ont été choisis pour des raisons anatomiques (similarités avec l'homme). Les rats, souris et lapins ont été choisis pour la formation à la chirurgie expérimentale (espèces utilisées par les étudiants dans leurs recherches) ou pour l'apprentissage des anastomoses vasculaires en ce qui concerne les rats (similarité avec l'homme). Nous prendrons des porcs charcutiers juvéniles et des miniporcs adultes pour une raison de taille. En ce qui concerne les moutons, rats, souris et lapins, nous prendrons des individus adultes pour des raisons anatomiques et de taille étant manipulés lors de travaux pratiques. Cela permet aussi de faciliter cette manipulation des petits mammifères par les étudiants.
Étude d’un nouvel agent médicamenteux dans un modèle murin d’athérothrombose induite par rupture de plaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées un quart d'heure pour provoquer la rupture d'une plaque de graisse dans une artère, 141 souris nourries au régime gras jusqu'à leurs 28 semaines sont toutes tuées à l'issue. Soixante-quinze d'entre elles ne se réveillent pas de l'intervention, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à deux injections et une administration orale. Le projet vise à confirmer chez la souris qu'un peptide candidat réduit le caillot plaquettaire sans augmenter le risque de saignement, effet que le porteur dit avoir déjà observé dans un autre modèle murin. Il en attend un "réel bénéfice clinique pour des millions de patients", formule qui repose sur cette seule étape supplémentaire chez l'animal.
Objectifs
Dans le monde, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38 % des décès) devant les cancers. Les complications majeures de la thrombose survenant suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome) dans une artère sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux. À la vue de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles moléculaires originales impliquées dans ces processus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre candidat peptide sont une diminution de la taille voire une absence de caillot plaquettaire (thrombus) suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome). De plus, comme décrit précédemment des traitements limitant la formation de caillots plaquettaires existent actuellement sur le marché. Cependant, ceux-ci sont fortement corrélés à un risque accru de saignement. Le candidat peptide étudié dans notre procédure n’augmente pas le risque de saignement. Ce candidat peptide pourrait donc conduire à un réel bénéfice clinique pour des millions de patients atteints de pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettra de valider et de renforcer les résultats obtenus précédemment et ainsi de démontrer l’effet bénéfique de notre candidat peptide dans un modèle murin, et ainsi permettre d'avoir des données se rapprochant des cas cliniques observés. En effet les patients les plus à risque de thrombose développent, au cours du vieillissement ou lors de pathologies chroniques, des plaques graisseuses à l’intérieur de la paroi de leurs artères.
Procédures
- Injection d’anesthésique et d’analgésique (1 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Injection (au maximum 2 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Administration orale (au maximum 1 fois, temps maximale d’administration : 1 minute) - Chirurgie (15 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée, une douleur de courte durée à l’endroit des injections, et une gêne de courte durée lors de l’administration orale.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés sans douleur et encore sous anesthésie. Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux.
Remplacement
Nos résultats très encourageants dans différents modèles avec les plaquettes de souris (modèle murin d’occlusion carotidienne induite chimiquement) nous permettent de penser que ce modèle permet de réconcilier les limites de chaque approche, et dans le futur, de se rapprocher de la clinique.
Réduction
Le nombre de souris par expérience est calculé pour permettre le plus faible nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats permettant une interprétation fiable basée sur des analyses statistiques adaptées
Raffinement
Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Puis, au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une plaque thermorégulée et une lampe chauffante. Au cours de la phase d’anesthésie, une attention particulière sera également portée aux indicateurs les plus significatifs d’une détérioration irréversible de l’état de l’animal réalisée à l'aide d'une grille d'évaluation de points limites. L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet constitue le modèle de référence pour leur capacité à développer des plaques graisseuses dans la paroi des artères. L'utilisation à 28 semaines de ces animaux après un régime riche en graisse permet de se rapprocher des conditions pathologiques retrouvées chez l'homme.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
6 cochons subissent une intervention de quatre heures sous anesthésie profonde, avec circulation extracorporelle, arrêt circulatoire en hypothermie profonde puis réchauffement, des sondes de température étant placées jusque dans le cerveau. Ils sont opérés sans jamais être réveillés et tués pour une étude post mortem des tissus. Parmi les nuisances attendues, le porteur retient le stress du transport, la douleur de la piqûre de prémédication et une perte de sang modérée à la pose des canules, sans mentionner l'arrêt circulatoire lui-même. Il justifie le recours à des animaux de 50 à 60 kilos par la taille requise pour implanter la circulation extracorporelle et par le fait que ce modèle est "déjà connu de nos équipes".
Objectifs
Au cours de certaines interventions de chirurgie cardiaque, il est parfois nécessaire de recourir, à une CEC (circulation extra-corporelle) avec une hypothermie profonde pour permettre un geste chirurgical de qualité. Dès que la chirurgie est terminée, une phase de réchauffement du patient débute permettant de restaurer une température normale en vue d’un arrêt de la CEC en toute sécurité. Durant cette phase de réchauffement, certains organes tels que le cerveau, le cœur, le foie et les reins, se réchauffent plus rapidement que d’autres, ce différentiel de rapidité résulte de mécanismes de protection et de particularités anatomiques et physiologiques. Ce projet propose d’étudier, parmi les sites anatomiques habituellement utilisés pour des mesures de température en CEC, ceux qui sont le mieux corrélés aux valeurs de température interne du cerveau. Le but principal est ainsi de déterminer un site optimal reflétant au mieux la température cérébrale impossible à mesurer en clinique afin de limiter le risque de survenue d’une hyperthermie cérébrale aux conséquences potentiellement délétères. Le second objectif de ce travail sera de vérifier s’il existe une différence significative entre la température cérébrale de référence mesurée au d'une veine du cou et la température intracérébrale mesurée au contact direct du cerveau. Le troisième objectif sera de déterminer si les sites de mesures de température sélectionnés exposent à des risques d’hyperthermie intracérébrale.
Bénéfices attendus
A notre connaissance, il existe très peu d'études comparant les différents sites de mesure de température avec la température cérébrale lors de la phase de réchauffement en CEC suite à une hypothermie profonde avec arrêt circulatoire. Par ailleurs, ces études ont une validité très relative quant à l'interprétation de leurs résultats puisqu'elles prennent comme température de référence cérébrale la température au niveau de la veine du cou, ou nasopharyngée qui peuvent différer des valeurs de la température intracérébrale. Ainsi, l'objectif principal de cette étude de corrélation sera de déterminer le ou les sites de recueils de température qui apparaissent les mieux corrélés aux valeurs de température du cerveau, dans l'optique d'otimiser la phase de réchauffement et de réduire les risques d'hyperthermies cérébrales aux conséquences potentiellement délètéres.
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation ( durée 2 mn) puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale ( 2 mn). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront une intervention chirurgicale qui durera 4h.
Impact sur les animaux
Stress lié au transport et au changement d'hébergement des animaux. Douleur liées à la piqûre lors de la prémédication. Risques inhérents à la procédure chirurgicale: Perte de sang modérée lors de la pose des canules de CEC.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, ils seront euthanasiés en vue d'une étude post mortem des tissus.
Remplacement
Le modèle de circulation extra-corporelle ne peut être effectué que sur un organisme dans son entier avec un relevé des températures sur différents sites. Le modèle porcin développé par notre équipe depuis plusieurs années reproduit une situation chirurgicale induisant des effets cardiologique et cérébral très proches de l'état observé en clinique humaine .
Réduction
Le modèle est déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à un test de puissance stastique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes (au minimum 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins sept jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. Les animaux sont mis à jeun le jour de l’expérimentation et les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés calmantes avec un antidouleur. Les cochons seront ensuite sous anesthésie profonde pendant tout le protocole d'étude et avec un antidouleur en perfusion continue. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon (animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque, et avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Traitement des caillots sanguins par des particules de taille microscopique à l’aide d’un laser et d’un aimant dans un modèle de caillot artificiel chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Soixante minutes en tout : un caillot formé artificiellement dans les vaisseaux, une injection de microparticules de fer et de sucre, un aimant agité et un laser chauffant pour briser le caillot, puis la mort sans réveil. 237 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures menées sous anesthésie, une partie tuée avant tout réveil, l'autre réveillée puis tuée une heure, six heures ou vingt-quatre heures après l'injection pour repérer où les particules se sont logées. Le projet cherche une méthode de destruction des caillots qui se passe du médicament utilisé aujourd'hui, efficace dans environ 30 % des cas. Le porteur retient la souris parce que la formation de caillots y est bien décrite, et de jeunes adultes parce que la graisse des animaux plus âgés gênerait l'observation des veines par imagerie.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) et les maladies du cœur sont les deux premières causes de mortalité dans le monde. La majorité de ces maladies sont causées par l’apparition d’un caillot sanguin qui bloque la circulation. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin pour éviter des dommages irréversibles. Aujourd'hui, on utilise un médicament pour dissoudre les caillots, mais il comporte des limites : peu de patients peuvent en bénéficier, il n'est efficace qu'environ dans 30 % des cas, et il comporte des risques d'hémorragie (saignements). Ce projet propose une nouvelle méthode pour détruire les caillots sans utiliser de médicament. Elle utilise des particules de taille microscopique (microparticules), faites de sucres et de fer, qui sont guidées vers le caillot par un aimant. Une fois sur place, ces particules sont chauffées avec un laser et l’aimant est agité afin d'induire un déplacement des particules à distance et ainsi de briser le caillot mécaniquement. Des tests sur des animaux seront réalisés pour voir si cette méthode est sûre et efficace, en s'assurant qu'elle ne provoque pas d'inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester un nouveau traitement pour les maladies liées aux caillots de sang et à vérifier s'il est à la fois efficace et sans danger. Ce traitement permettrait d’agir uniquement dans la zone du caillot, sans effet sur le reste du corps, réduisant ainsi les effets secondaires. De plus, des informations sur la manière dont les particules se répartissent dans le corps seront collectées, ce qui est essentiel pour développer ce traitement à l'avenir.
Procédures
Nous allons utiliser une méthode de laboratoire consistant à déclencher la formation d'un caillot de sang dans un animal endormi et anesthésié, durant laquelle ce dernier subira une seule intervention sans être réveillé. Après avoir été mis sous anesthésie, un caillot sera créé artificiellement chez l'animal (20 min). Ensuite, le traitement sera injecté par voie intra-veineuse (1 min). Un aimant et un laser seront appliqués, et les effets du mouvement des particules et de la chaleur au niveau du caillot seront suivis par imagerie (30 min). À la fin, les animaux seront euthanasiés. Cette procédure durera donc 60 min maximum. Pour étudier où vont les microparticules dans le corps, l'anesthésie sera induite chez les animaux (2 min). L'anesthésie sera ensuite vérifiée et du collyre appliqué (2 min). Les animaux recevront une injection unique en intra-veineuse pendant qu'ils sont sous anesthésie (1 min) et le réveil complet de l'animal prendra 5 min maximum. Après un certain délai (1h, 6h ou 24h), ils seront euthanasiés pour examiner dans quels organes les microparticules se sont réparties.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles liées aux procédures de caillot induit et de devenir des microparticules chez l’animal sont les suivantes : une toxicité éventuelle des microparticules, ou une inflammation déclenchée par ces microparticules, globale ou localement dans les organes d'accumulation des microparticules.
Devenir
Afin d'éviter toute souffrance inutile des animaux suite à la procédure chirurgicale de caillot induit, et vu qu'un maintien en vie n'est pas nécessaire après l’opération, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie à la fin de la procédure. Toutes les données d'efficacité de ciblage du caillot par les microparticules et d'efficacité thérapeutique auront été récoltées avant l'euthanasie de l'animal. Des prélèvements dans la zone du caillot après euthanasie permettront d'apporter des données complémentaires, notamment sur la structure du caillot après traitement. Afin de pouvoir observer le devenir des microparticules dans les différents organes des animaux, ces derniers doivent être euthanasiés pour récupérer leurs organes. La présence de microparticules dans ces organes pourra alors être quantifiée par différentes méthodes complémentaires. Des prélèvements sanguins post-mortem permettront également de détecter la présence de marqueurs d'une éventuelle inflammation liée aux particules.
Remplacement
Pour comprendre comment les microparticules activées par un laser et un aimant peuvent dissoudre un caillot dans des conditions réelles (température corporelle, circulation sanguine et composition complexe des caillots), il faut tester cette approche sur des animaux vivants. Les expériences en laboratoire, faites sur des caillots sans circulation ne suffisent pas, car elles ne reproduisent pas la réalité du corps humain et la complexité d'un caillot sanguin. De plus, les modèles actuels ne permettent pas de savoir exactement où vont les microparticules une fois injectées, ni de prédire leur toxicité ou leurs interactions avec le sang et les organes. Il est important de noter que les composants des particules sont déjà considérés comme sûrs : les nanoparticules d’oxyde de fer sont approuvées par l'Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux, et le sucre utilisé pour transporter ces nanoparticules a déjà été testé sur des animaux pour des traitements similaires.
Réduction
Les premières expériences en laboratoire sont en cours et vont permettre de déterminer la dose de particules optimale à injecter, ainsi que les bons réglages du laser et de l'aimant, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour tester le traitement contre les caillots sanguins. Le nombre minimum d'animaux à utiliser a été calculé avec des données statistiques afin d'obtenir des résultats interprétables statistiquement, fiables et représentatifs de la diversité entre individus. Pour l'étude de la répartition des microparticules dans le corps, on attendra d'abord les résultats des premiers tests pour ne tester qu'une seule dose et ainsi limiter le nombre d'animaux utilisés. Le nombre minimum d'animaux à utiliser a également été calculé avec des données statistiques afin d'obtenir des résultats interprétables statistiquement, fiables et représentatifs de la diversité entre individus.
Raffinement
Avant chaque expérience, les animaux auront une semaine pour s'acclimater à leur nouvel environnement. Ils seront gardés dans un milieu enrichi et vivront en groupe pour leur bien-être. Ils seront vérifiés quotidiennement pour s'assurer qu'ils ne montrent aucun signe de stress ou de détresse. Pendant la procédure de traitement des caillots sanguins, les animaux seront sous anesthésie avec en plus un produit pour réduire la douleur. Ils seront surveillés tout au long de la procédure. Si un animal montre des signes de réveil, une nouvelle dose d'anesthésiant sera donnée pour qu'il reste endormi. En cas de problème, comme des saignements, l'animal sera euthanasié. Pour l'étude du devenir des particules dans le corps, les animaux seront endormis pendant l’injection du traitement. Une fois réveillés, ils retourneront dans leur cage, et le site de l'injection sera vérifié pour s'assurer qu'il n'y a pas de blessure. L'état général des animaux sera évalué selon une grille de score afin de vérifier leur bien-être. À la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie, et le prélèvement sanguin sera fait après leur mort pour limiter les manipulations pendant qu'ils sont encore en vie.
Choix des espèces
Les expériences de formation de caillots sanguins et de devenir de particules après injection dans le corps sont bien décrites chez la souris, ce qui n'est pas le cas des traitements avec des particules activées par un laser ou un aimant. C'est pour cette raison que cette espèce est pertinente pour notre projet. Des souris jeunes adultes seront utilisées, car à cet âge, elles ont un système immunitaire et des organes bien formés, et les veines autour des intestins sont plus faciles à observer avec les techniques d'imagerie. Chez des souris plus âgées, la présence de graisse autour des veines rendrait l'observation plus difficile.
Etude de l’impact d’une exposition précoce et chronique à un agent anesthésique sur le développement du réseau vasculaire rétinien et cortical
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Des souriceaux âgés de 4 à 10 jours sont exposés de façon répétée à un anesthésique général, puis suivis jusqu'à l'âge adulte avec pose d'un cathéter intraveineux, IRM, échographie et incision de la peau du crâne pour glisser des électrodes sous-cutanées. 510 souris vont être utilisées, dont 210 anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner la rétine et le tractus visuel. L'enjeu déclaré est de savoir si l'anesthésie générale pratiquée chez le jeune enfant laisse des traces durables sur le développement du système nerveux. Le porteur annonce quatre tests comportementaux de cinq minutes par animal sans préciser lesquels, et écrit ne pas pouvoir "souscrire au principe de remplacement".
Objectifs
L’incidence de l’anesthésie générale (AG) dans l’enfance est en constante augmentation. En effet, 1/7 enfant bénéficie avant l’âge de 3 ans d’une AG à des fins chirurgicales, diagnostiques ou pour l’administration de soins. S’il est désormais admis que l’AG pédiatrique est un acte sûr dont le risque de complications immédiates est faible, la communauté publique et scientifique s’intéresse depuis plusieurs années à ses effets indésirables neuro-développementaux. Au cours des 20 dernières années, il a été décrit que les principaux agents anesthésiques utilisés au bloc opératoire interféraient avec le développement du système nerveux central (SNC) qui débute in utero et se poursuit tout au long de la vie. Des études de haut niveau de preuve chez l’enfant indiquent que la mesure de l’intelligence générale n’est pas modifiée après une exposition courte et unique. Néanmoins, l’effet de cette exposition sur la structure cérébrale n’avait encore pas été étudié. De plus, il demeure impossible d’apporter une réponse univoque sur la question des effets indésirables neuro-développementaux à long terme. Au sein du SNC, la rétine, en miroir du cerveau, apparait comme particulièrement intéressante pour des études neuro-développementales. En effet, de multiples parallèles peuvent être réalisés entre la rétine et le cerveau : origine embryonnaire commune, établissement des réseaux neuronaux et vasculaires en parallèle et un statut immunitaire particulier notamment lié à l’existence de barrières physico-chimiques comme la barrière hémato-rétinienne au niveau de la rétine et la barrière hémato-encéphalique au niveau du cerveau. De plus, la rétinogenèse est régulée par de nombreux facteurs et présente des aspects communs à ceux retrouvés au cours du développement cérébral. Notre premier objectif sera donc de déterminer, suite à une AG précoce et répétée, la présence éventuelle d’atteintes développementales au niveau de la rétine, du tractus visuel et de la vision ; et de les caractériser. Notre second objectif sera de s’intéresser aux atteintes structurelles et fonctionnelles du tractus visuel ainsi qu’à leur potentiel caractère prédictif d’altérations cérébrales, responsables de troubles à long terme. Nous nous intéresserons en particulier à l’intégrité anatomo-fonctionnelle du compartiment vasculaire. L’ensemble de cette caractérisation n’est à ce jour pas encore décrite dans la littérature soulignant ainsi l’originalité et la nécessité d’un tel projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des arguments supplémentaires dans le débat sur l’effet neuro-développemental de l’AG, en particulier à long terme. Nos travaux seront appelés à modifier les pratiques cliniques si nos hypothèses se vérifient. Par conséquent, ils inciteront les professionnels de santé à différer les AG pour chirurgies non urgentes, à utiliser de nouveaux médicaments d’anesthésie moins à risque de toxicité cérébrale, à surseoir le plus possible à l’AG quand cela est possible (e.g. anesthésie loco-régionale, hypnose, etc.) et à adapter la prise en charge et le suivi d’enfants ayant eu une AG. Notre projet aura un bénéfice en clinique mais également en préclinique en mettant l’accent sur un effet de l’AG sur le neuro-développement conduisant à adapter les protocoles expérimentaux associant des questions neuro-développementales et l’utilisation d’agents anesthésiques au cours des protocoles de recherche. De plus, cette étude permettra d’explorer de nouveaux outils diagnostics non-invasifs basés sur l’étude de la rétine et de la fonction visuelle en miroir du cerveau afin de mettre en évidence des atteintes du SNC.
Procédures
1. Tests comportementaux (5 minutes par test, 4 tests seront réalisés pour chaque animal), 2. Pose d'un cathéter intraveineux pour injection de molécules fluorescentes ou traceurs (30 minutes, acte réalisé une seule fois sur l'animal), 3. Protocole d'imagerie par IRM (20 minutes à 1h30 selon les séquences, acquisitions réalisées une seule fois par animal), 4. Protocole d'imagerie par imagerie à ultrasons (45 min par animal, acquisition réalisée en une seule fois) 5.Incision de la peau du crâne et pose d’électrodes sous-cutanées pour prise de mesure de potentiels évoqués visuellement (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal)ou incision de la peau du crâne pourl'acquisition par imagerie à ultrasons (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (incision, perforation) seront empêchées par l’utilisation d'un anesthésique local avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons des agents anesthésiants dont la nature et la posologie seront adaptées à la sévérité du geste sous forme d’une injection unique. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet fera l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification de traceurs injectés afin d’évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire de la rétine d'une part et du tractus visuel d'autre part.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. De plus, ce projet fait suite à une première étude au sein du laboratoire au cours de laquelle un protocole d’exposition précoce et répété des souris à une AG a été mis en place. Ces premiers résultats ont permis une première caractérisation s’intéressant à l’impact structurel et fonctionnel, au niveau cérébral, d’une telle procédure. L’étude a été menée chez une cohorte d’enfants ayant eu une exposition précoce à l’AG au cours de leur développement. L’altération structurale décelée a été associée à une diminution de la régulation émotionnelle chez ces enfants. Ces résultats, plébiscités après leur publication par la communauté scientifique ainsi que par le grand public (articles de presses parus), incitent à poursuivre ce projet de recherche translationnelle afin d’apporter une réponse au débat controversé des conséquences à long terme d’une AG dans l’enfance. Les connaissances et acquis du laboratoire en complément de la littérature scientifique rendent la souris particulièrement intéressante pour l’étude de l’impact d’une exposition précoce et répétée à une AG. Les observations réalisées à partir de l’utilisation d’un modèle murin nous incitent à étoffer la description des effets indésirables neuro-développementaux de l’AG afin d’aiguiller sur une potentielle relation mécanistique entre les atteintes observées et le mode d’action des agents anesthésiques. Le but étant d’améliorer la prise en charge anesthésique des enfants afin de minimiser l’impact sur leur développement. La chronologie du développement de la rétine, du cerveau et de leurs réseaux vasculaires est bien connue chez la souris. Cela permet notamment d'avoir un a priori des mécanismes du développement rétinien ainsi que de certaines étapes du développement cérébral chez l’Homme, via la prise en compte des fenêtres de vulnérabilité intrinsèques à chacune des deux espèces et par projection des résultats murins existants.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. 510 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie non invasifs permettant d'évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire in vivo du tractus visuel et du cerveau. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions d’animaux durant les étapes de la procédure (exposition à l’agent anesthésique, perte de poids, anesthésie au cours des examens d’imagerie...).
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement avec leur mère jusqu’au sevrage puis en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux après le sevrage, l'enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être et leur bon développement. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles .
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les animaux utilisés pour la réalisation du protocole d’AG seront âgés de 4 à 10 jours post-nataux (P4 à P10). Les études de l’impact de cette AG précoce et répétée sur ces animaux sera ensuite étudiée à 15 jours post-nataux (P15) ainsi qu’à 6 semaines (adultes). En effet, les stades P4 à P10 ont été choisis à partir d’expériences déjà menées au laboratoire et publiées dans la littérature. Enfin, les stades P15 et adultes ont été choisis afin d’évaluer à court et long terme l’effet de l’AG.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire chez la souris fat-1 mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées portent une modification génétique qui enrichit tous leurs tissus en acides gras oméga3, à un niveau que le porteur décrit comme inatteignable par l'alimentation. 232 souris vont être utilisées, 72 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les 160 autres soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique pendant huit semaines, restent isolées en cage individuelle sur toute cette durée, subissent des gavages, un prélèvement submandibulaire sous anesthésie et une série de prises de sang à la queue toutes les quinze à trente minutes lors du test de tolérance au glucose. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque à la fin de la huitième semaine, pour prélever sang et colon.
Objectifs
L’obésité alimentaire contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant la quantité et la qualité de la flore intestinale. En tant qu’aliments thérapeutiques, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires) sont connus notamment pour améliorer cette fonction barrière. Dans ce contexte, nous étudions l’impact des lipides dits en oméga3 en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui tapisse l’intestin et la contribution de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris mâles aux tissus riches en lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang, molécules qui sont capables de provoquer une inflammation chronique de faible intensité. Chez la souris mâle, cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale de souris aux tissus riches en lipides en oméga3. Chez la souris, un excès de lipides alimentaires ne provoque pas les mêmes troubles métaboliques chez les mâles et les femelles. Le poids corporel et l’assimilation du sucre sont moins altérés chez les femelles. Il s’avère donc nécessaire, de comparer chez des souris mâles et femelles aux tissus riches en lipides en oméga3 ou non comment l’obésité alimentaire et ses perturbations au niveau intestinal vont s’installer et si la flore intestinale est impliquée. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ainsi, dans le contexte de lutte contre l’obésité, les objectifs de ce projet sont de comprendre le rôle des lipides dits en oméga3, chez la souris mâle et femelle dont les tissus sont riches en ces lipides, dans la protection contre l’inflammation chronique de faible intensité et de comprendre le rôle du système nerveux intestinal, de la couche de protection qui le tapisse et de la flore intestinale, différents éléments de la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
L’obésité induit une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules de la flore intestinale dans la circulation sanguine, qui est en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. L’étude de l’impact des lipides oméga3 est une piste privilégiée d’amélioration. Cependant, les études nutritionnelles, chez l’homme ou le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données peu concluantes. Les souris aux tissus riches en lipides oméga3 représentent donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfice que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons également récemment montré, chez la souris mâle, que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides oméga3 à des souris WT les protègent efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la perméabilité intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Bien qu’il existe des différences entre sexes dans le développement des troubles métaboliques dus à l’obésité, aucune étude n’a encore exploré cet aspect chez la souris femelle afin de comprendre les différences observées. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude afin de comprendre les phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ce projet a maintenant pour but, dans un contexte d’inflammation chronique due à l’obésité, de comprendre le rôle des lipides oméga3, chez le mâle et la femelle, dans l’amélioration de la fonction barrière de l’intestin et sur la structuration de la couche qui le tapisse l’intestin et sur le système nerveux intestinal. Il est également important de déterminer la contribution de la flore intestinale. En effet, ce projet pourrait permettre l’identification de bactéries favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant ou collectives - Aux semaines 1 et 8 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang à la semaine 7 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran-FITC niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, à la semaine 8 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 8 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Afin d’éviter la dominance d’un des congénères pouvant limiter l’accès à la nourriture et empêcher le brassage de microbiote entre les animaux, les souris seront placées en cage individuelle munie d’un couvercle filtrant pour la durée de l’étude nutritionnelle (8 semaines). L’obésité provoquée par un régime hyperlipidique peut être source de difficultés pour les animaux rendant le toilettage ou l’accès à l’eau de boisson difficile. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), le prélèvement submandibulaire après anesthésie à l’isoflurane et les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur est attendue puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la Structure chargée du Bien-être Animal de la plateforme de Zootechnie. Nous leur donnerons comme enrichissement de milieu dans toutes les cages des carrés de coton pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une observation générale quotidienne des animaux sera effectuée et une observation et manipulation individuelle hebdomadaire sera réalisée à l'occasion de la pesée et de l'entretien des animaux. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en lipides en oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement dans ses tissus qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le système nerveux intestinal lors de l’altération par un régime riche en lipides de la fonction barrière de l’intestin en relation avec la formation de la couche qui le tapisse (mucus). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le système nerveux intestinal et les cellules qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le système nerveux intestinal, le mucus et la flore microbienne qui y vit. Cette étude est par ailleurs menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Enfin, aucune étude n’a encore exploré chez la souris femelle cet aspect bien qu’il ait été montré des différences entre les sexes dans le développement des troubles métaboliques induits par un régime obésogène. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des lipides en oméga3 sur le système nerveux intestinal et le mucus intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception des protocoles expérimentaux nous avons déterminé le nombre de 12 et 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre et elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ceux sans génotypage.
Raffinement
En raison de la nuisance et de la souffrance modérée induite par l’isolement en cage individuelle durant toute la durée de l’expérimentation (8 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu . Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, instillations de microbiote par gavage ou gavage avec le Dextran-FITC) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des lipides en oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Modèles in vitro et ex vivo en neurologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 525
Des femelles gestantes de 15 à 20 jours et des souriceaux ou ratons âgés de 1 à 10 jours vont être tués pour prélever leurs neurones. 1 050 souris et rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, dont 450 menées sous anesthésie sans réveil, et tous seront tués pour prélever des structures du système nerveux central. Le projet, intitulé modèles in vitro et ex vivo, consiste à fournir des cellules et des tranches de cerveau pour trier des candidats médicaments avant les expériences sur animaux non-humains vivants, une étape que le porteur présente comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés. Le choix entre souris et rat dépend, selon lui, des expériences déjà faites ou à venir plutôt que d'une propriété biologique, et l'âge retenu va de 1 jour à 2 ans selon la maturité neuronale recherchée.
Objectifs
Les tests réalisés sur des cultures primaires (modèle in-vitro) ou sur des tranches de cerveau de rongeur (modèles ex-vivo) permettent d'obtenir des données préliminaires quant à la sécurité et l'efficacité de candidats médicaments, avant de devoir réaliser des études plus poussées dans des modèles de pathologies in vivo. Plus précisément, les modèles de cultures primaires permettent d’évaluer la réponse physiologique de cellules du système nerveux central (cellules provenant du cerveau ou de la moelle épinière) suite à l’ajout d’une substance toxique (exemple d’agents neurotoxiques ou chimiothérapies). Les modèles ex-vivo sont utilisés pour mimer la transmission synaptique ou la présence de décharges épileptiques induites par des substances chimiques. Ces différents tests permettent d'étudier les effets de substances pharmacologiques pour lutter contre des maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer, l'épilepsie ou la sclérose en plaques ou tester leur innocuité. Ces modèles sont utilisés pour évaluer les nouveaux traitements à un stade très précoce et sélectionner les substances les plus efficaces pour les tester sur des modèles plus complexes (modèles in-vivo).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de cancers ou de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, les traitements chimiothérapeutiques induisent des effets secondaires sur le Système Nerveux Central, l'évaluation de ces effets adverses sur des modèles in-vitro est donc nécessaire. D'autres modèles permettent d'évaluer l'efficacité de traitements anti-épileptiques, les traitements actuels sur le marché n'étant pas efficaces chez tous les patients. Enfin, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la sclérose en plaque ou la maladie d'Alzheimer ; la recherche de nouvelles substances reste donc une priorité. Les modèles in vitro et ex vivo sur cultures primaires ou sur tranche permettent également de raffiner les procédures, sélectionner les meilleurs candidats médicaments et réduire le nombre d'animaux en recherche
Procédures
Les animaux seront soumis à une euthanasie (sous anesthésie) pour prélevement de structures du système nerveux central. Dans certains cas, ils peuvent préalablement être soumis à une administration de substances (bolus rapide, durée de quelques secondes) Cette administration, dans certains cas précis, peut nécessiter une chirurgie préalable (durée de 10 à 60 minutes).
Impact sur les animaux
Pour ces modèles, les animaux sont anesthésiés puis euthanasiés avant le prélèvement des structures/organes nécessaires. L'anesthésie induit un léger stress chez l'animal. L'administration de candidat médicament par voie orale ou systémique est également légèremment stressant chez l'animal même si la procédure est de courte durée. Dans certains cas, les candidats médicaments seront administrés par voie intrathécale ou intracérébrale. L'injection du candidat médicament (trou dans le crâne et canule insérée dans le tissu cérébral ou aiguille insérée au niveau des lombaires) peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les animaux transgéniques utilisés dans ce projet peuvent présenter un phénotype dommageable (des déficits moteurs, difficultés à s'alimenter, symptômes épileptiques) même s'ils sont censés être testés avant l'apparition de ces symptômes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. Chaque procédure nécessite la mise à mort des animaux afin de prélever les structures cérébrales nécessaires pour les tests in vitro ou ex vivo.
Remplacement
Ces modèles constituent des méthodes alternatives permettant de tester un grand nombre de molécules sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Les modèles in-vitro ont l'avantage d'être translationnels mais ne peuvent être utilisés que pour évaluer des molécules sur des modèles simples (cellules).
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires ou sur tranches sont utilisés pour pouvoir sélectionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester. L'utilisation de cellules issues d'animaux permet d'obtenir des données d'efficacité et de sécurité d'un nombre très important de composés et/ou de doses, permettant une réduction importante du nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux est prévu pour réaliser entre 10 et 25 études en fonction de la procédure et pour chacune des espèce (souris et rat).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de mettre à mort précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général). Les animaliers et les techniciens sont formés au suivi des animaux et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas des femelles gestantes, pour éviter les agressions). Les animaux sont anesthésiés avant d'être mis à mort. Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Si une chirurgie est nécessaire, une anesthésie est associée à un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie et pendant 48 heures après l'opération. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. L’animal est placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant).
Choix des espèces
Les études sont effectuées sur des cellules ou organes de rongeur car ces modèles sreproduisent en partie certaines pathologies observées en clinique et permettent de prédire l'efficacité de futurs candidats médicaments de manière fiable. Le choix de l'espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études à venir (modèles pathologiques reproduits chez la souris ou chez le rat). Pour mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques, ces modèles peuvent être également utilisés à posteriori. Le choix de l'espèce est dans ce cas lié aux études précédentes. Pour les cultures primaires réalisées à partir d'embryons, des mères gestantes seront utilisés (mères ayant 15 à 20 jours de gestation en fonction de la structure à prélever, pour des cultures de neurones embryonnaires). Pour les cultures primaires réalisées sur des animaux nés, des rongeurs âgés entre 1 et 10 jours seront utilisés. Le stade de développement choisi dépend du stade de maturation souhaité (les neurones post-nataux étant plus différenciés, et permettant d'étudier un réseau neuronal plus mature). Pour les modèles sur tranches, les rongeurs (souris, rats) sont testés une fois sevrés, l'âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Les procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période de post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Effets de la stimulation transcrânienne sur l’activation du système nerveux central selon le sexe et le cycle hormonal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Huit heures d'enregistrement sous anesthésie profonde, après une trachéotomie, la canulation de la carotide et de la jugulaire et l'ouverture du crâne, sans réveil prévu. 144 rats vont être utilisés, 128 dans des procédures menées sous anesthésie et tués avant tout réveil, 16 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère dont une ovariectomie de dix minutes. L'objet est de comparer, selon le sexe et le stade du cycle hormonal, l'effet d'une stimulation électrique du crâne sur les neurones qui transmettent la douleur de la face et des méninges, le cycle des femelles étant vérifié par frottis sous anesthésie. Le porteur retient le rat Sprague Dawley parce que le laboratoire l'utilise depuis des années et parce que d'autres études sur le sujet ont employé la même souche.
Objectifs
La migraine, caractérisée par des céphalées récurrentes, touche environ 15 % de la population et principalement les femmes. Les approches de neurostimulation telle que la stimulation transcrânienne à courant continu du cortex moteur représente une stratégie thérapeutique prometteuse, mais peu de chose sont connu sur l'effet bénéfique de cette stimulation sur la migraine et sur les mécanismes sous-jacents à cet effet. Nous avons précédemment montré dans notre modèle animal de migraine (induite par une inflammation des méninges) que les mâles et les femelles à différent cycle hormonal i) avaient une douleur migraineuse d'intensité différente et ii) activaient différemment les neurones du complexe sensitif du trijumeau. Certains de ces neurones reçoivent les informations sensorielles issues de la face et des méninges et sont impliqués dans les voies de la douleur. L’objectif général du projet sera d’étudier l’hypothèse selon laquelle l’efficacité thérapeutique de la stimulation transcrânienne est différente selon le sexe et le cycle hormonal des femelles et de déterminer les mécanismes cellulaires associés. Ce projet comportera 3 objectifs. Tout d’abord, les études sur l’efficacité de la stimulation sont très peu comparables entre elles à cause des différents protocoles utilisés. Le premier objectif consistera donc à déterminer in vivo chez le rat mâle anesthésié les paramètres de stimulation les plus efficaces pour inhiber l'activité des neurones du complexe sensitif du trijumeau. Pour ce faire, des enregistrements des neurones chez les rats anesthésiés seront réalisés. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité de la stimulation chez les femelles à différent cycle hormonal et comparer avec les femelles ovariectomisées. Enfin, les mécanismes cellulaires liés à l’effet de la stimulation transcrânienne au niveau des neurones du complexe sensitif du trijumeau étant peu connus, le dernier objectif sera d’étudier ces mécanismes en réalisant des expériences ex vivo.
Bénéfices attendus
En plus de la mise au point d’un protocole de stimulation transcrânienne efficace, ce projet nous permettra de savoir si la stimulation a un effet différent selon le sexe et le cycle hormonal des femelles (à différentes phases du cycle hormonal et chez les femelles ovariectomisées) en condition physiologique. Cette étude nous permettra plus tard d'utiliser le protocole de stimulation dans différents modèles de douleur trigéminale et migraineuse et d’étudier leur efficacité en condition pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales. Un groupe d'animaux subiront une ovariectomie. L'opération durera 10 minutes sous anesthésie générale. Les expérimentations d’électrophysiologie in vivo sont prévues sur une durée maximale de 8 heures sous anethésie générale profonde sans réveil. La chirurgie inclut une trachéotomie, une canulation de la carotide, une canulation de la jugulaire, une craniotomie, et l’exposition de la région d'enregistrement.
Impact sur les animaux
Certains animaux vont subir une ovariectomie sous anesthésie gazeuse. Nous nous attendons au développement d’une douleur suite à la chirurgie. Les animaux auront des injections d’antidouleur. Ces injections pourront induire un stress.
Devenir
La procédure d'électrophysiologie ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est fondamental de réaliser des études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. L’étude sur l’animal permet également de conserver son état hormonal physiologique. Il n'existe pas dans la littérature de méthode alternative pouvant répondre à l'efficacité d'une stratégie à potentiel thérapeutique anti douloureux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sous anesthésie est un moyen de réduire la souffrance et de définir de façon reproductible, l'efficacité des différents protocoles de stimulation sur l’activité des neurones.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Pour les expériences in vivo, chaque animal sera son propre contrôle. Une analyse de variance à une voie suivie d'un test post-hoc seront réalisés. Dans le cas d'une distribution normale, un test paramétrique sera effectué et dans le cas d'une distribution non gaussienne un test non paramétrique de type Mann Whitney sera réalisé.
Raffinement
Les rats bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloérection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, perte de plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit l’ovariectomie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Dans le cas des femelles, les cycles hormonaux seront vérifiés avant la procédure électrophysiologique par la réalisation de frottis chez l'animal anesthésié. Lors de l'enregistrement électrophysiologique in vivo chez l’animal anesthésié, tous les paramètres dits limitants seront évalués (température, pression artérielle, rythme respiratoire). Si une altération durable et irréversible de ces paramètres apparait, les expériences seront interrompues par une mise à mort.
Choix des espèces
Le rat, en particulier la souche Sprague Dawley, est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales et électrophysiologiques dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines. Des animaux adultes sexuellement matures sont requis pour étudier l'influence du cycle hormonal.
Etude pilote : Marquage des neurones du sinus carotidien de souris par injection de molécules fluorescentes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Anesthésiées, épilées et désinfectées au cou, 70 souris reçoivent une injection de marqueurs dans la paroi de leurs carotides au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes, sont réveillées, puis réanesthésiées quatre jours plus tard pour dix minutes d'imagerie. Une à trois semaines après l'opération, elles sont tuées pour prélever les neurones et les mettre en culture, dix d'entre elles étant manipulées sous anesthésie sans réveil. Cette étude pilote doit établir si des marqueurs déjà décrits dans la littérature fonctionnent mieux que la seule référence existante, avec pour perspective lointaine des cibles thérapeutiques contre l'hypertension. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est lié aux molécules injectées, tout en listant hémorragie, infection, détresse respiratoire et perte de poids au titre de la chirurgie et de l'anesthésie.
Objectifs
L'hypertension artérielle est la principale cause des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Malgré les diverses options thérapeutiques disponibles, de nombreux patients hypertendus gardent une tension artérielle non contrôlée. Il a été montré que, dans ces cas d’hypertensions résistantes et/ou réfractaires aux traitements médicamenteux, les mécanismes de régulation de la pression artérielle sont affectés. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initié par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les carotides (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du cœur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser quelles protéines sont spécifiquement exprimées par les différents types de neurones détectant la pression sanguine chez la souris en conditions physiologiques, et, par la suite, leurs modifications dans des modèles d’hypertension. Nous nous intéresserons aux neurones situés au niveau des carotides. Afin de pouvoir les identifier, nous injecterons aux environs de la carotide des molécules permettant de marquer les neurones appelées marqueurs neuronaux. Ce projet est une étude pilote visant à évaluer l'efficacité de différents types de marqueurs neuronaux.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'hypertension.
Procédures
1) Injection de marqueurs dans la paroi des carotides. Les souris seront anesthésiées. Pour éviter toute douleur, nous administrerons par voie sous-cutanée 30 min avant la chirurgie un analgésique morphinique. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante et leur température sera contrôlée. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure qui durera 30 à 40 minutes. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage des carotides. 4 jours après la chirurgie, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) 1 à 3 semaines après la chirurgie, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids; 2) à la chirurgie : hémorragie, infection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but de vérifier la présence effective du marquage dans les neurones.
Remplacement
Le marquage des neurones des carotides ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas.
Réduction
Ce projet est une étude pilote visant à évaluer l'efficacité de marqueurs neuronaux suite à leur injection dans la paroi des sinus carotidiens de souris. Cette technique dispose d'une seule référence utilisant un marqueur qui présente une efficacité très limitée. Nous nous proposons donc de mettre en place cette technique avec des marqueurs déjà décrits dans la littérature et dont l'efficacité pourrait s'avérer supérieure. Etape 1/ Mise au point de l'injection dans les sinus carotidiens. Pour cela, nous injecterons un marqueur visible à l'oeil nu qui nous permettra de nous former sur l'acte chirurgical (isolation de la carotide et suture) et de valider la localisation de l'injection. Nous utiliserons au maximum 10 souris. Etape 2/ Test des différents marqueurs neuronaux fluorescents. Nous injecterons trois marqueurs différents. Pour chaque marqueur, nous effectuerons 10 sessions comprenant 2 souris. Soit 20 souris par marqueur et 60 souris au total pour le test des 3 marqueurs neuronaux. Pour l'ensemble de l’étude pilote, nous utiliserons donc au maximum 70 animaux. Pour chaque procédure, si nous estimons avoir la maîtrise nécessaire du geste chirurgical (procédure 1) ou les résultats suffisants pour conclure sur l'efficacité des marqueurs (procédure 2), nous arrêterons l'expérimentation avant d'avoir utiliser le nombre maximal d'animaux prévus.
Raffinement
A réception, les souris passeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum. Les chirurgies se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur pendant et après la chirurgie, nous administrerons par voie sous-cutanée un analgésique morphinique. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante et leur température sera contrôlée. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la chirurgie qui durera 30 à 40 min. En fin de chirurgie, l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture à volonté. Suite à la chirurgie, les animaux seront 2 par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes et des nids à base de coton. Si une infection de la cicatrice est détectée, une pommade antibiotique à large spectre sera appliquée. Nous utiliserons une grille de score afin d’évaluer le bien-être des animaux tous les jours pendant 4 jours puis 3 fois par semaine. L'évaluation prendra en compte 1) le poids corporel ; 2) l'apparence physique ; 3) le rythme respiratoire ; 4) le comportement non provoqué, 5) les réponses comportementales aux stimuli (réaction à un bruit ou comportement exploratoire suite aux changements de litière) et 6) l'aspect du site de chirurgie. Chaque modification sera cotée et le score total sera comparé aux points limites établis, ce qui nous permettra de mettre en place une action si nécessaire (analgésie ou mise à mort).
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car si l'étude de faisabilité se révèle satisfaisante, nous aurons ainsi accès aux modèles de souris transgéniques. De plus, le marquage des neurones des sinus carotidiens est une méthode qui a fait ses preuves sur la souris. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire aux prélèvements d'organes post-mortem.
Formation et maintien des compétences aux procédures et techniques d’administration et de prélèvement chez la souris
- Formation professionnelle
6 335 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, 500 d'entre elles manipulées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit au maximum trois gestes : prélèvements sanguins par différentes voies, gavages, injections, parfois un test de sensibilité à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie surveillée plusieurs heures. Aucune connaissance n'en sort. Il s'agit de former les techniciens, étudiants et chercheurs de l'établissement, le porteur reconnaissant que des souris factices permettent d'apprendre les mêmes gestes mais les jugeant "en décalage avec la réalité expérimentale" faute de pelage et de tonus musculaire. L'effectif, lui, est présenté comme un maximum théorique qui ne sera vraisemblablement jamais atteint, établi sur le nombre de personnes à former dans l'année.
Objectifs
La règlementation en vigueur concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (Décret n° 2013-118 du 1er février 2013) et relative à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques (Arrêté du 1er février 2013), requiert que le personnel soit compétent. A ces fins, les techniciens de notre institut suivent les formations théoriques obligatoires. En complément de l’aspect théorique, nous devons assurer la compétence des nouveaux arrivants ainsi que le maintien des compétences du personnel avec une formation « pratique » d’administration et de prélèvements sanguins, techniques que nous maitrisons et pratiquons en routine dans nos animaleries. Cette formation continue permet ainsi aux techniciens, étudiants et chercheurs de mener les projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. L’ensemble de nos projets se déroulant sur des animaux vivants, il est impossible de proposer ces formations autrement qu’en utilisant la souris pour modèle. En revanche, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, les animaux servant à cette formation proviendront d’autres projets de sévérité légère à modérée, dès que ceux-ci sont terminés. La règlementation imposant un maximum de 3 procédures par animal, le nombre d’animaux nécessaire pour une année de formations sera de 1234, donc sur l’ensemble du projet (5 ans) 6170 souris. Aucun dommage particulier n’est attendu au cours de ces formations, les procédures étant classées légères ou modérées. De plus, les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon été général et toute procédure potentiellement stressante sera réalisée sous anesthésie générale afin de préserver au maximum le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en place et maintenir les compétences du personnel réalisant les gestes techniques sur animaux, employés durant les protocoles expérimentaux dans notre établissement. Le bénéfice est lié à la parfaite réalisation de tous les projets réalisés sur notre plateforme afin de garantir un raffinement de nos procédure avec des gestes réalisés avec le minimum de stress pour l'animal et une réduction potentielle du nombre d'animaux utilisés dans les autres projets, en lien avec une plus faible variabilité dans les gestes.
Procédures
Les animaux seront soumis à un maximum de trois gestes : des prélevements sanguins réalisés par différentes voies, des gavages ou des injections seront pratiqués. Ces gestes durent quelques minutes et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure. Certaines procédures peuvent durer plus longtemps, tels que le test de sensibilité qui peut affecter l'état des animaux durant plusieurs heures du fait d'une possible hypoglycémie.
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances attendues, des contentions pour les prélevements sanguins ou les gavages seront pratiquées. Le test de sensibilité à l'insuline qui peut entraîner une hypoglycémie passagère, qui sera surveillée durant plusieurs heures afin de s'assurer que les animaux se portent bien suite à cette procédure. Pour réduire l'inconfort des animaux, ceux-ci auront une semaine de repos entre chacune des procédures et un maximum de trois procédures par animal sera pratiqué. Cela nous semble un bon compromis entre réduction et raffinement.
Devenir
Une fois que les animaux ont subi 3 procédures de formation, ils seront mis à mort. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés une fois qu'ils ont subi de nombreuses procédures.
Remplacement
L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations apportant une compétence complète autrement que chez la souris. En effet, il existe des souris factices sur lesquelles on peut s’entrainer aux différents prélèvements et administrations. Parmi les gestes pouvant être pratiqués sur ces modèles: Manipulation et contention, les prélèvements sanguins, l'administration intraveineuse et l'administration orale. Néanmoins, ces modèles sont parfaits pour les personnes devant apprendre le geste dans les premières étapes, mais cela ne permet pas de finaliser la compétence sur animaux vivants qui est requise pour effectuer de manière efficace les expériences. L'absence de pelage, de tonus musculaire et de contraction sont en effet des élements facilitant l'apprentissage mais en décalage avec la réalité expérimentale. Pour les personnes n'ayant jamais manipulé d'animaux, c'est une première étape qui sera mise en place autant que possible pour éviter l'utilisation d'animaux pour apprendre la méthodologie de chaque geste avant une formation aboutie pour devenir compétent
Réduction
Nous avons établis les effectifs nécessaires pour la réalisation de ce projet, selon le nombre de personnels à former durant une année. Ainsi, cela inclut la formation des étudiants, des chercheurs qui arrivent dans notre animalerie, mais aussi le maintien des compétences pour le personnel. Les effectifs indiqués sont à considérer comme des maximum théoriques qui ne seront vraisemblablement jamais atteints. Nous souhaitons pouvoir assurer une formation efficace de toutes les personnes amenées à travailler sur des animaux, mais tous les efforts seront entrepris pour réduire autant que possible le nombre d'animaux employés. Dans le cadre de formation ou de maintien de compétences, aucun résultat scientifique n’est attendu ainsi aucune approche statistique n’est utilisée.
Raffinement
Le personnel réalise toujours ses formations sous la surveillance d’un « tuteur » compétant afin de s’assurer du respect de l’animal et d’éviter toute souffrance ou stress, les procédures les plus stressantes étant faites sous anesthésie générale (prise de sang au sinus infra-orbitaire). De plus, ces animaux sont suivis en respectant les procédures en vigueur dans l'institut
Choix des espèces
Notre institut travaille actuellement quasi en exclusivité avec la souris pour ses projets. Il est donc logique que la formation du personnel se fasse sur la même espèce. Les animaux seront adultes car pour la majorité issus d’autres projets d’une part et d’autre part parce que les projets de notre institut se font sur adulte et le personnel doit donc se former à ce stade.
Rôle de la protéine PAM dans un modèle murin de choc septique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une échographie cardiaque toutes les trente minutes, pendant quatre à seize heures d'anesthésie générale ininterrompue : 144 rats vont être utilisés, 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 sous anesthésie sans réveil. Soixante-douze d'entre eux subissent une chirurgie destinée à provoquer une infection abdominale qui les fait basculer en choc septique après seize heures, avec baisse de la mobilité et des interactions sociales. Tous sont tués pour prélever cerveau, cœur, poumons, reins, foie, rate et peau, le projet cherchant à savoir si une protéine protège les vaisseaux sanguins, avec une étude humaine qui "pourrait être débutée dans les 5 ans". Le rat a été retenu parce que ses vaisseaux et son cœur sont plus gros que ceux de la souris, ce qui facilite la pose des cathéters et l'échographie.
Objectifs
En cas d’infection, certains patients présentent une inflammation excessive qui met en jeu leur pronostic vital. Quand les systèmes de régulation physiologique sont débordés, on dit que le patient est en choc septique. Il s’agit d’une infection sévère qui nécessite le transfert des patients en réanimation. C’est une pathologie grave avec une mortalité élevée. Le choc septique est marqué par une hypotension sévère liée à une dysfonction des vaisseaux sanguins qui deviennent trop dilatés et laissent fuir une partie du contenu des vaisseaux. Les patients présentent également une atteinte du cœur qui se contracte trop faiblement. Ces 2 processus entrainent une baisse majeure de l’apport de sang aux organes. Les organes ne reçoivent alors plus assez d’oxygène. Cela entraine un état de défaillance de l’ensemble des organes induisant le décès du patient. Les médicaments actuellement utilisés (antibiotiques, médicament pour augmenter la tension artérielle) ne jouent pas sur l’atteinte des vaisseaux sanguins. Notre équipe étudie le rôle d’une protéine qui joue un rôle dans le maintien de la stabilité des vaisseaux. L’objectif de ce projet est de savoir si cette protéine permet de diminuer l’atteinte des vaisseaux dans un modèle de choc septique chez le rat. Nous voulons déterminer si la supplémentation en cette protéine protègerait de l’inflammation, puis nous évaluerons si cette protéine peut servir comme traitement dans le choc septique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux définir le rôle de la protéine d’intérêt dans le choc septique et potentiellement être utilisée comme un nouveau médicament dans l’infection grave. Une étude chez l’Homme pourrait être débutée dans les 5 ans.
Procédures
144 animaux auront 1 chirurgies sous anesthésie générale. 72 une chirurgie pour provoquer une infection et 72 une chirurgie contrôle. 144 animaux auront la mise en place de 2 cathéters en regard du cou, réalisé sous anesthésie générale. 144 animaux auront des échographies cardiaques toutes les 30 minutes pendant la durée de l’étude (4 heures ou 16h), l’animal est laissé durant toute cette période sous anesthésie générale. 144 animaux auront des prélèvements sanguins répété, via l’un des cathéter mis dans le cou, les prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, sans nécessité de ponction spécifique. 144 animaux auront des prises de pressions artérielle, celle-ci est mesurée en continu via l’un des cathéters du cou, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale, par une aiguille fine dans le ventre de l’animal (anesthésie et analgésie) entrainent une douleur légère. Par ailleurs, l’anesthésie générale provoque un état confusionnel durant environ 2h. La chirurgie réalisée pour entrainer l’infection est responsable, à court terme de douleur en regard de la cicatrice et à moyen terme d’une infection responsable d’une diminution de la mobilité et une diminution des interactions sociales. Pendant les 16 premières heures, l’animal présente des signes d’infections non sévère puis après 16 h, il rentre dans un état de choc septique avec une infection grave, avec notamment une diminution de la contraction du cœur.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, la mises à mort suivie est de prélèvements d’organes (cerveaux, cœur, poumons, reins, foie, rate, peau) necessaire pour des analyses ultérieures
Remplacement
L’infection et ses conséquences sont des phénomènes complexes résultants de l’interaction de différents types cellulaires soumis à de multiples interactions encore partiellement connues. L’approche in vitro ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions entre les organes. Le modèle utilisé sera celui le plus validé à l’heure actuelle pour l’étude du sepsis. Il permet d’étudier de façon optimale la réponse de l’organisme à l’infection.
Réduction
Les procédures d’exploration physiologiques permettent un suivi longitudinal, sur la durée, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisé et augmente la puissance statistique. Le calcul du nombre d'animaux par groupe prend en compte la variabilité inter individuelle des animaux par rapport à la sévérité de l’infection et la dysfonction du cœur. Cette variabilité a été diminuée par la standardisation de la chirurgie entrainant l’infection via l’utilisation d’outil calibré permettant une chirurgie reproductible. Cela diminue le nombre d’animaux qui ne sont pas inclus dans l’étude, car il ne présente pas de signe d’infection. En post mortem, l’ensemble des organes sont prélevé et pourront être utilisé pour des recherches futur
Raffinement
45 minutes avant la chirurgie, L’animal est traité par un analgésique puissant. L‘ensemble des manipulations invasives sont réalisées sous anesthésie générale. L’analgésie est balancée avec l’utilisation d’anesthésique local en fin de procédure. Durant l’anesthésie, les animaux sont placés sur une table chauffante. En post-opératoire, les animaux sont réchauffés et réhydratés. Après leur réveil, les animaux sont replacés en cage individuelle, avec accès libre à l’eau et à la nourriture. La douleur est surveillée et si besoin l’analgésie sera renforcée. Des points limite seront surveillé, notamment durant le monitorage de l’animal, si la pression artérielle est trop basse, l’animal sera euthanasié avant d’atteindre une phase agonique. Cela permettra notamment de récupérer les organes de l’animal et ainsi pouvoir exploiter les résultats, nous diminuons ainsi le nombre d’animaux utilisé Des points limites ont été établis
Choix des espèces
L’étude de la pression artérielle et de la fonction cardiaque est plus aisée chez le rat que la souris. La mise en place des cathéters artériels et veineux est plus facile (taille des vaisseaux supérieur) chez le rat et l’échographie cardiaque est plus facile (taille du cœur supérieur). Nous utiliserons une souche de rat non consanguine permettant de plus facilement généraliser les résultats. Des rats mâles de 10-12 semaines, pesant entre 300 à 500g seront utilisés. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Humain
Enseignements pratiques de physiologie animale et de pharmacologie : apprentissage des savoir-faire en expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 85
Pour illustrer des cours de physiologie et de pharmacologie devant des étudiants de licence, 265 souris et 85 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Les rats reçoivent la pose de cathéters, des injections et un prélèvement de sang par la carotide, les souris étant utilisées pour l'initiation aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Aucun calcul statistique ne justifie ces effectifs, fixés pour former 175 étudiants par an. Le principal risque décrit tient au dosage de l'anesthésique, un réveil prématuré en pleine séance ou au contraire un arrêt cardio-respiratoire, et le porteur admet qu'il arrive qu'un animal meure pendant une séance.
Objectifs
L’objectif est principalement d’inculquer aux étudiants des notions d’expérimentation animale requises dès la troisième année de licence de biologie et d’autre part d’illustrer les cours théoriques de physiologie animale et de pharmacologie par des applications techniques concrètes réalisées sur le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Acquisition des techniques de base d’expérimentation animale sur animal vigil (préhension, contention et techniques d’injections les plus courantes) et sur animal anesthésié (pose de cathéters, prélèvement carotidien).
Procédures
Après une analgésie préopératoire, les rats seront anesthésiés dès leur entrée dans la salle de TP, puis pose de cathéters, injections et prélèvement unique de sang par le cathéter carotidien. Chez les souris après analgésie/anesthésie, initiation aux techniques d’injections intra¬péritonéale et sous-cutanée. La nuisance principale est un réveil prématuré de l’animal lors de la séance d’expérimentation ou au contraire une surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire de l’animal. Selon les cas, l’enseignant réajuste la dose d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Le stress à la contention est minimisé par l'apprentissage de la réglementation et de l'éthique lors d'une séance de présentation en cours magistral et d'une démonstration préalable par l'enseignant. Un apprentissage sur un modèle d'imitation (maquette inerte conçu avec un matériau qui confère la sensibilité spécifique d'un animal vivant) permet d'acquérir les compétences nécessaires pour manipuler et réaliser les gestes de routine d'expérimentation (injection et pose de cathéter), réalisé par la suite sur un animal vivant. Cet entrainement dans une séance qui précède la séance d'expérimentation sur l'animale vivant permet de réduire le stress de l'étudiant et chez l'animal. L'effet indésirable, bien que rare, est l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal sous anesthésie. Une réanimation est donc réalisée par l'enseignant avec un contrôle du débit d'anesthésiant, mais il arrive qu'un animal meurt pendant une séance d'expérimentation.
Devenir
Procédures sans réveil, compte tenu des manipulations expérimentales et des injections réalisées par les étudiants, les animaux ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure par l’enseignant.
Remplacement
Afin d’acquérir les compétences techniques d’expérimentation animale (contention et techniques chirurgicales) , les étudiants s’entraineront sur des modèles de rats en plastique. Cette initiation leur permettra de se familiariser avec les structures anatomiques et les gestes techniques sans avoir recours à l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux choisi est le nombre minimal permettant d'acquérir les techniques de base en expérimentation animale afin de sensibiliser et former nos étudiants, qui pour la majorité d’entre eux sont destinés à poursuivre leur carrière dans le domaine de la recherche en laboratoire sur le vivant. La première approche est réalisée sur une maquette dans le but d’une acquisition des compétences techniques requises avant leur réalisation sur animal vivant dans la demi-journée qui suit. Cette étape permet de réduire le nombre total d’animaux pour cette formation. Aucune statistique n’est requise pour l’ensemble des procédures proposées. Au bilan, nous utilisons 85 rats et 265 souris pour la formation de 175 étudiants par an.
Raffinement
Pour l’ensemble des procédures, les animaux sont anesthésiés afin d’empêcher toute douleur ou souffrance de l’animal en fonction des gestes réalisés et jusqu’à leur mise à mort à la fin de l’expérimentation. Pour la première séance d’expérimentation sur le rat, l’initiation au préalable sur des modèles plastiques permet de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux anesthésiés/analgésiés. En cas d'atteinte des points limites lors des expérimentations, les animaux en question sont mis à mort par l'enseignant.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles animaux les plus utilisés en recherche et le choix d’animaux jeunes adultes permet une manipulation plus aisée et un meilleur contrôle de l’anesthésie.