Procédures sans réveil

424 souris et 424 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modérés. Chaque animal reçoit une injection dans l'articulation du genou sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés, la boiterie et l'inflammation étant possibles si le produit est mal toléré, avant le prélèvement des tissus de l'articulation. Le projet teste la tolérance et la diffusion de candidats médicaments contre l'arthrose et la polyarthrite. Le porteur décrit une "offre de prestation" commerciale, qui relève aussi de la formation aux gestes techniques.

Objectifs

Les pathologies ostéoarticulaires sont des maladies caractérisées par une perte progressive de cartilage au niveau des articulations. Parmi ces pathologies articulaires, d’après l’OMS, l’arthrose concerne 343 millions de personnes dans le monde et la polyarthrite rhumatoïde 14 millions de personnes. La prévalence augmentant avec l’âge, une augmentation du nombre de patients. ayant besoin de traitements ou de soin de réhabilitation est attendue. Actuellement aucun traitement curatif n’est disponible, seuls des anti-douleurs et des anti-inflammatoires sont proposés, ainsi que la pose de prothèse en tant que traitement ultime de l’arthrose. De nouvelles stratégies thérapeutiques, comme l’utilisation de la thérapie cellulaire ou le développement de formulations à libération prolongée, pour augmenter la durée de l’efficacité des traitements représentent un intérêt croissant pour le traitement de ces pathologies. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet qui a pour objectif d’une part de tester la tolérance des nouvelles molécules développées pour le traitement de ces pathologies et d’autre part d’évaluer la cinétique de libération de nouvelles formulations après leur injection intra-articulaire. Les tests de tolérance et de distribution de ces candidats médicaments seront réalisés sur des animaux après injection intra-articulaire. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement de traitements ayant montré un intérêt thérapeutique pour les patients souffrant de ces atteintes ostéoarticulaires.

Bénéfices attendus

Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des composés et formulations ayant démontré une bonne tolérance et une biodistribution pertinente pour le traitement des pathologies ostéoarticulaires.

Procédures

Administration de composés à tester ou de produit de référence : L’administration de médicaments vétérinaires (anesthésiques/antalgiques) suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 7 jours au maximum. Une administration intra-articulaire unique sous anesthésie générale dans un seul genou. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés : 1 à 2 par semaine (dans la limite des contraintes liées à la récupération des animaux et aux spécificités du site de ponction), jusqu’à la fin de l’étude.( 6 semaines maximum après l'injection intra articulaire) Pour les prélèvements sanguins nous pouvons prélever au maximum : Pour une ponction unique jusqu’à 10% du volume sanguin total suivi d’une période de récupération de 3 semaines. Pour des prélèvements répétés dans la limite de 20% du volume sanguin total sur une période de 14 jours. En fonction de la fréquence et du volume minimum nécessaire aux analyses nous adapterons le site de ponction et éventuellement la réalisation des prélèvements sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Stress/douleur : L’administration de médicaments (anesthésiques et/ou antalgiques) par voie parentérale suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires (introduction d’une aiguille) Douleurs post-opératoires : pour les techniques d’administration nécessitant un abord chirurgical qui sont réalisées sous anesthésie avec traitement antalgique pré et post opératoire. Boiterie et possible inflammation : consécutives à l’injection intra-articulaire si la tolérance du produit n’est pas bonne.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des tissus de l’articulation du genou requiert l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer la biodistribution et évaluer la tolérance d’un composé et d’une formulation en développement. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement des pathologies articulaires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, à partir des données disponibles dans la littérature scientifique et en tenant compte de la variabilité des modèles et des techniques de dosage de pharmacocinétique. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. L’étude statistique prévue sera l’analyse d’un grade obtenu à la suite de l’observation anatomopathologique de l’histologie des tissus en fonction des différents groupes de traitement. Un autre test statistique pourra être réalisé sur des comptages en analyse histologique des tissus. Dans ce projet il est prévu de réaliser 4 études chez chacune des 2 espèces chaque étude incluant 106 animaux au maximum par étude.

Raffinement

Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Nous intégrons également dans ce projet un soin particulier afin de prévenir toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment sera mis sur le sol des cages la veille et durant deux jours après l’injection intra-articulaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Afin de faciliter l’accès à l’eau des biberons adapté (tige longue pour souris) et/ou de l’hydrogel seront mis à disposition des animaux. Les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué lors des anesthésies. Une analgésie adaptée est mise en place (anesthésie locale) avant l’injection intra-articulaire.

Choix des espèces

Le choix des espèces a été fait sur la base des informations disponibles dans la bibliographie. Le choix entre le rat et la souris sera effectué en fonction du volume cible à injecter en intra-articulaire ainsi que des analyses à effectuer : évaluations histologiques et dosages du liquide synovial, la ponction du liquide synovial n’étant possible que chez le rat. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes en fin de croissance c’est-à-dire des animaux d’au moins 6 semaines d’âge.

33 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre eux étant opérés sous anesthésie sans réveil et tués, les trois autres réutilisés pour d'autres études ou l'enseignement. Chaque animal subit une chirurgie de la veine jugulaire, trente recevant en plus une assistance circulatoire mécanique implantée. L'objet est de tester un anticorps censé limiter les hémorragies liées à ces dispositifs de soutien cardiaque. Le porteur affirme que la dégradation du facteur von Willebrand sous assistance circulatoire ne peut pas s'étudier in vitro.

Objectifs

Les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique (ACM) ont révolutionné le traitement de l'insuffisance cardiaque et respiratoire. Un nombre croissant de dispositifs peuvent fournir une assistance circulatoire mécanique aux patients souffrant de complications hémodynamiques aiguës et d'insuffisance cardiaque chronique terminale et sauver des vies. En raison de son efficacité (survie globale de 50 %), l'utilisation de l'ECMO (dispositifs d'oxygénation extracorporelle) a augmenté rapidement au cours des quinze dernières années (30 000 procédures/an), mais elle est confrontée à un risque très élevé de complications hémorragiques majeures et potentiellement mortelles (50 %). Les altérations fonctionnelles du facteur de von Willebrand (vWF) contribue aux saignements. Des études menées chez des patients atteints de la maladie de von Willebrand ont montré que les concentrés contenant du vWF ont une efficacité limitée en raison de la courte demi-vie du vWF. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies de traitement pour prévenir les saignements chez ces patients recevant une ACM. Nous avons développé un anticorps monoclonal de souris interférant avec le clivage du vWF, anticorps que nous avons pu humaniser. Les caractéristiques de cet anticorps permettent une large fenêtre thérapeutique potentielle évitant le risque de thrombose. Des études préliminaires menées ex-vivo nous ont apporté des données sur les capacités de restauration du vWF par cet anticorps. Le but de notre projet est d’évaluer in vivo l’efficacité de cet anticorps dans l’inhibition de la dégradation du vWF dans un modèle animal avec implantation d’une assistance circulatoire. Notre étude sera réalisée chez le porc, espèce reconnue par les sociétés savantes dans les études impliquant des pompes ACM. De plus, le modèle porcin possède une très grande proximité avec l’Homme d’un point de vue hémostase avec la capacité d’effectuer des prélèvements sanguins conséquents et répétés.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies de traitement des complications hémorragiques lors de l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Ces données chez l’animal viendront constituer une partie du dossier efficacité/sécurité permettant de déposer des demandes d’autorisation d’étude clinique.

Procédures

Les 33 animaux auront une procédure chirurgicale : 3 pour la pose d'une voie centrale jugulaire afin d'injecter des molécules et afin d'effectuer des prélèvements sanguins répétés sur 3 heures. 30 pour la pose d'une voie centrale jugulaire et l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Une seule intervention chirurgicale sera réalisée par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances expérimentales directes attendues suite à l’injection d’une molécule d’origine humaine et à la mise en place chirurgicale du dispositif d’assistance circulatoire sont une allergie qui se traduirait par de la fièvre ou l’apparition de boutons, le développement d’un caillot de sang ou un risque de saignement excessif pouvant conduire à une douleur et un stress physique de l’animal.

Devenir

Sur les 33 animaux utilisés, 3 seront utilisés dans d’autres études sans implication cardio-vasculaire ou pour l’enseignement. Les 30 autres animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les variations plasmatiques du vWF dépend de son niveau de sécrétion endothéliale (modulée par la pulsatilité artérielle) et de sa protéolyse (modulée par les forces de cisaillement). Il n’est pas possible d’étudier in vitro la protéolyse du vWF sous assistance circulatoire. Une étude in vivo est nécessaire afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps sur la dégradation du vWF dans la circulation et en présence de forces de cisaillement.

Réduction

Dans la procédure 1, 3 animaux sera nécessaire et suffisant pour déterminer la dose optimale de vWF humain à injecter pour être efficace. Pour les procédures 2 et 3 le nombre suffisant d'animaux pour pouvoir réussir à mettre en évidence un effet statistiquement significatif = 5 animaux par groupe minimum. Le choix orienté sur 7 animaux par groupe permet de palier toute défaillance technique, soit au total 42 animaux pour ces 2 procédures.

Raffinement

Le "Raffinement" est envisagé en réalisant un maximum de prélèvements sanguins par individu ainsi qu'en étant attentif à leur bien-être en utilisant des traitements analgésiques avant et pendant toute chirurgie ainsi qu'à leur conditions d'hébergement.

Choix des espèces

Le modèle porcin est le modèle de référence pour tester les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique. Le porc présente en effet une physiologie cardiovasculaire et un profil d'hémocompatibilité proche de l'homme. Les axes vasculaires sont d'un calibre suffisant et faciles d'accès. Par ailleurs, notre laboratoire a l'expertise de l'exploration biologique du facteur de von Willebrand chez le porc Mini porcs jeunes adultes de 25 à 30 kg

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections répétées, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des modèles de thrombose induits sans réveil. L'objet est d'étudier le rôle du collagène XVIII dans la formation des plaquettes et dans une forme de cancer de la moelle osseuse. Le porteur affirme que la thrombose met en jeu des interactions à étudier sur l'animal vivant.

Objectifs

Le collagène XVIII est une protéine de la matrice extracellulaire, notamment présente au niveau des vaisseaux sanguins. Elle participe à l'organisation des tissus. Par l'un de ses domaines pouvant être libéré, appelé endostatine, elle régule également les phénomènes de développement des vaisseaux sanguins, pouvant être mis en oeuvre dans diverses pathologies telles que l'athérosclérose ou les cancers. Ayant observé de façon inattendue une très forte augmentation de l'expression de ce collagène dans un modèle de souris développant de la myélofibrose primaire, un cancer qui chez l'homme entraine une dégénerescence de la moelle osseuse avec insuffisance médullaire , nous cherchons à comprendre comment la surexpression de ce collagène freine ou au contraire contribue au développement de la maladie. En outre, étant présent dans les vaisseaux sanguins, nous chercherons également un rôle éventuel dans les processus d'arrêt des saignements ou à l'inverse dans le développement des thromboses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension des rôles du collagène 18 dans la formation plaquettaires, dans l'initiation ou le développement des myélofibroses, ainsi que dans l'hémostase et la thrombose. Si le collagène 18 est impliqué dans ces processus, cela constituera de nouvelles pistes pour moduler,chez les différents patients, la formation ou la fonction des plaquettes.

Procédures

Pour les expérimentations nécessitant un traitement d'un mois, celui-ce sera administré sur souris vigile, par injection unique 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Tous les prélèvements sanguins répétés seront effectués sur animal anesthésié, à J0, après 2 semaines et 4 semaines. Pour les expérimentations impliquant un traitement unique par chimiothérapie, le suivi de la numération sanguine sera effectué à J0, J5, J7, J8, J9, J12, J14. L'anesthésie et le prélèvement de sang dure entre 5 et 10 minutes pour chaque souris. Tous les modèles de thrombose seront mis en place sur animal anesthésié sans réveil.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont essentiellement le stress de la contention qui précède l'injection ou l'anesthésie, ainsi que la piqure d'anesthésie ou de traitement par elle-même. Ce stress est minimisé par le recours dans tous les cas à un professionnel expérimenté et diplômé. Le prélèvement sanguin caudal est susceptible d'entrainer un petit saignement, qui est stoppé par un point de compression de 1 à 2 minutes lorsque la souris est toujours sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique et hémostatique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, la thrombose met en œuvre simultanément des interactions entre les plaquettes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Des études pilotes ont permis de déterminer le nombre minimum pour l’obtention de résultats statistiquement analysables. Un certain nombre de souris sont réutilisées au sein de ce même projet. De plus, une fois sacrifiées, les souris seront partagées afin d'utiliser différents organes pour d'autres expérimentations. Les lots sont optimisés afin d'utiliser mâles et femelles. Enfin, dès que possible, nous utilisons des cellules humaines pour nos expériences in vitro qui ne nécessitent pas l'environnement des tissus ou l'animal dans sa globalité.

Raffinement

Les souris sont hébergées par groupe de même sexe et sans défaire les groupes préformés pour éviter le développement de comportements agressifs. Des objets sont placés dans la cage pour enrichir le milieu et permettre une protection contre l'éventuelle agressivité des congénères. De la ouate est également disposée pour favoriser le comportement de fouissage et du coton cardé pour favoriser le maintien de la chaleur corporelle dans le nid. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduit au maximum, notamment par anesthésie pour toute procédure invasive. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites a été établie pour la procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire afin de limiter la souffrance.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris génétiquement modifiée n'exprimant plus le collagène 18 est un modèle unique et précieux pour étudier le rôle de cette protéine par comparaison avec les souris contrôles exprimant cette protéine. De plus, nous possédons une bonne connaissance de la physiologie de la souris et des similitudes avec l'homme, et nous disposons de nombreux modèles d’étude largement maitrisés chez la souris. Cette lignées de souris est donc parfaitement adaptée à cette étude et constitue un outil original et unique. L'absence de collagène 18 n’induit pas d’effet indésirable chez la souris au vu de leur comportement. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, soit entre 8 et 18 semaines et les mâles et femelle utilisés en quantité similaire, ce qui nous permettra à postériori de déterminer un éventuel effet différent selon le sexe.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'environ deux heures avec trépanation, des injections et des tests comportementaux de mémoire spatiale, de reconnaissance d'objets et de mémoire sociale. L'objectif est de décrire le rôle de neurones formés à l'âge adulte dans l'hippocampe, chez des souris saines et des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'aborder cette voie neuronale de façon intégrée.

Objectifs

Nous avons deux objectifs principaux. Tout d'abord, nous voulons étudier comment les nouveaux neurones dans une partie spécifique du cerveau, sont organisés chez des souris normales et des souris atteintes de la maladie d'Alzheimer. Nous souhaitons découvrir s'ils se connectent uniquement à cette région ou s'ils établissent des connexions à la fois avec cette région et avec une autre région du cerveau. Pour ce faire, nous allons marquer ces nouveaux neurones avec des molécules fluorescentes afin d’identifier l’endroit ou ils se connectent. Ensuite, notre deuxième objectif est d'étudier comment ces nouveaux neurones, qui se forment à l'âge adulte, influencent la mémoire. Pour ce faire, nous allons manipuler ces neurones de manière à les activer ou les désactiver chez des souris normales et des souris atteintes d'Alzheimer, puis nous allons tester leur mémoire. Juste avant les tests de mémoire, nous activerons ou désactiverons ces neurones en utilisant des substances chimiques que nous injecterons aux souris. Nous essayerons également d’augmenter le nombre de nouveaux neurones en plaçant les souris dans un environnement stimulant, à la fois sur le plan cognitif, social et physique puis, nous testerons la mémoire des souris.

Bénéfices attendus

Le premier objectif du projet nous permettra de déterminer si les neurones nouvellement formés envoient des informations au niveau de deux régions de l'hippocampe, ou si les nouveaux neurones se connectent de façon spécifique soit à la première région, soit à la deuxième. Si tel est le cas, cela serait la première démonstration de l’existence d'une voie nerveuse specifique qui se connecte à une région liée à la cognition sociale. Si, en revanche, les nouveaux neurones contactent les deux régions, cela suggérerait que les informations contextuelles, spatiales, et sociales, sont intégrées et codées conjointement au sein des nouveaux neurones. Le deuxième objectif du projet permettra de révéler la contribution des nouveaux neurones projetant à cette région dans la mémoire sociale, et de déterminer si des manipulations de ces nouveaux neurones et/ou des neurones qui contribuent à leur survie sont en mesure de restaurer les capacités de mémoire sociale de souris modèles de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

La chirurgie dure environ 2h par animal. Une seule intervention chirurgicale par animal sera réalisée. Les animaux recevront une injection en aigue (une seule injection qui durera environ 10 secondes) d’agent pharmacologique. Pour cela, la souris sera maintenue en contention durant 15 secondes. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux n’excédant pas 1h30. Ces tests comportemenaux auront pour objectif d'étudier la mémoire spatiale, la mémoire de reconnaissance d'objets et la mémoire de reconnaissance d'individus (mémoire sociale).

Impact sur les animaux

Pour la chirurgie, l'incision de la peau ainsi que la trépanation osseuse peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24heures. La contention de l’animal lors des injections peut induire un stress modéré durant une dizaine de minutes. Les injections peuvent induire une douleur modérée lors de l’injection durant les 20minutes qui suivent la manipulation de l’animal. Les test comportementaux n'induisent pas de nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux et /tissus afin de réaliser des marquages immunohistochimiques sur coupes de tissus pour poursuivre les investigations anatomiques, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Les nouveaux neurones naissent dans le cerveau au niveau d'une zone appelé le gyrus denté et se connectent à différentes sous régions de l'hippocampe. Nous comptons explorer le rôle des nouveaux neurones qui se connectent à une sous région bien définie de l'hippocampe. Notre objectif est d'étudier l'impact de ces nouveaux neurones sur les capacités mnésiques des mammifères. De plus, nous nous intéressons à la mémoire sociale qui est altérée dans certaines maladies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. L’utilisation du modèle murin nous permet d’étudier les modulations de cette mémoire sociale chez des individus sains et présentant des troubles de mémoire sociale (souris modèles de la maladie d’Alzheimer). A ce jour, il n’existe pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de cette voie neuronale spécifique de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études comportementales et neurologiques visant à décrire les mécanismes mis en jeu dans les processus mnésiques.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante lors de la réalisation de tests statistiques, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis à partir de grilles de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent. De plus, nous réaliserons plusieurs tests sur les mêmes animaux pour limiter leur nombre.

Choix des espèces

Nous comptons explorer la fonction biologique des nouveaux neurones formés à l’âge adulte. Nous proposons que ces nouveaux neurones ont un effet sur le comportement de l’animal (mémoire). Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder l’impact de ces nouveaux neurones sur le comportement de l’animal. Nous comptons également faire une description anatomique des voies de projections des nouveaux neurones. Il nous faudra donc prélever des tissus pour voir l’organisation cérébrale. De plus, la souris appartient à la classe des mammifères ce qui la rend proche de l’Humain. Son utilisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux sous-tendant les processus mnésiques chez les mammifères. D’autre part, nous utiliserons des souris modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle nous permettra d’étudier les éventuels mécanismes à l’origine des troubles mnésiques dans un contexte pathologique. Les animaux que nous utiliserons seront âgés de 3 à 6 mois. En effet, la neurogénèse adulte diminue avec l’âge. Si nous voulons l’étudier nous devons nous placer à une fenêtre de temps ou elle est suffisamment abondante.