Procédures sans réveil
Formation et maintien des compétences aux techniques d’administrations et de prélèvements chez le rat
- Formation professionnelle
300 rats vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures classées légères ou menées sous anesthésie sans réveil, non pour produire des connaissances mais pour entraîner du personnel aux gestes d'injection et de prélèvement. Les animaux vigiles reçoivent jusqu'à trois injections ou gavages espacés d'une semaine, le gavage pouvant irriter l'œsophage, tandis que les gestes plus invasifs sont pratiqués sous anesthésie terminale. Le porteur indique s'entraîner d'abord sur des "rats factices" et récupérer la majorité des animaux dans d'autres projets terminés ou surnuméraires. Il affirme que la réglementation "requiert" un personnel formé et que ses projets sur animaux vivants imposent ce type d'entraînement.
Objectifs
La règlementation en vigueur concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, requiert que le personnel soit compétent et formé. Le personnel de notre Institut suit les formations théoriques obligatoires. Afin de compléter cette formation, nous offrons à nos nouveaux arrivants ainsi qu’au personnel souhaitant maintenir ses compétences techniques, la possibilité de réaliser les techniques d’administration ou de prélèvements sanguins faits en routine dans nos animaleries. Cette formation permettra ainsi à nos techniciens d’être compétents et de réaliser l’ensemble des projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. Ils seront sous la supervision d'un tuteur en interne qui maîtrise parfaitement ces gestes techniques. L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations autrement qu'avec des rats. Cependant, il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants.
Bénéfices attendus
Cette formation continue permet ainsi à nos techniciens d’être compétents et de réaliser l’ensemble des projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. Elle permet donc un meilleur raffinement des procédures. Ces formations permettent également de garantir un résultat robuste et sans biais expérimental dans les divers projets menés qui font appel à des techniques de prélèvement ou d'administration sur les rats.
Procédures
Les procédures de classe légères (injections et gavages) seront réalisées sur animaux vigiles. Une contention de quelques secondes sera nécessaire pour réaliser le geste technique. Chaque animal pourra recevoir deux injections et un gavage avec un délai minimum d'une semaine de repos entre chaque procédure. Les procédures de classes sans réveil seront réalisées sous anesthésie générale après injection d'un mélange d'anesthésiques et les animaux seront mis à mort directement après la fin des gestes techniques, sans réveil. L'injection se fera sous contention de quelques secondes. L'anesthésie durera maximum une heure durant laquelle les gestes de prélèvements et administrations seront réalisés, puis l'animal sera mis à mort directement avant son réveil.
Impact sur les animaux
Pour certains types de gestes techniques à réaliser, ils doivent être réalisés sous contention. La contention, est un geste non invasif et de courte durée qui permet l'immobilisation de l'animal le temps de réaliser l'acte souhaité. Le gavage est réalisé à l'aide d'une sonde qui est introduite dans l'oesophage pour aller déposer directement une substance dans l'estomac. La sonde peut créer une légère irritation temporaire de l'eosophage. Les autres modes de prélèvements et administrations ont recourt à l'utilisation d'une aiguille (tailles différentes en fonction de l'acte réalisé) Les sites d'injection seront surveillés pour éviter toute inflammation ou infection (rougeur, gonflement, écoulement...)
Devenir
Les animaux utilisés pour les procédures peu invasives peuvent recevoir un maximum de 3 actes d'administration à une semaine d'intervalle à chaque fois, puis seront mis à mort. Pour les actes plus invasifs, ils seront réalisés sous anesthésie, sans réveil de l'animal.
Remplacement
L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations autrement que chez l'animal. Cependant, il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux par procédure a été évalué en fonction des besoins des différents services de l'Institut en termes de formation initiale des personnes n'ayant jamais manipulé de rat d'une part et selon les besoins de maintien des compétences au fil du temps d'autre part. Voici le détail du calcul : Pour la première partie du projet : • Formation initiale nouveaux arrivants : 8 rats prévus par personne sur 5 ans • Maintien des compétences : 1 rat x 4 personnes tous les 4 mois sur 5 ans. Pour les animaux de la seconde partie du projet : • Formation initiale nouveaux arrivants : 10 rats prévus par 1 personne sur 5 ans • Maintien des compétences : 1 rat x 5 personnes tous les 2 mois sur 5 ans. Le nombre d'animaux utilisés est plus grand et la fréquence d'entrainement est plus grande pour la seconde partie du projet car les gestes techniques à réaliser nécessitent plus d'entrainement. Il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants. Par ailleurs, afin de réduire au minimum le nombre de rats utilisés, la très grande majorité des animaux servant aux formations proviendront d’autres projets terminés ou surnuméraires.
Raffinement
Les rats sont hébergés en groupe pour respecter leur caractéristique d'animaux grégaires. De l'enrichissement sera placé dans les cages d'hébergement ( nid, bâton et balle à ronger, croquettes d'alimentation dans le fond de la cage). Pour les premières phases d'entrainement sur les différents prélèvements sanguins, des rats factices seront utilisés. Les animaux utilisés en vigile seront particulièrement surveillés post manipulation pour déceler toute forme d'inconfort ou de douleur. Les points limites selon la procédure que les rats auront subi seront particulièrement surveillés. -Point d’injection : une attention particulière est mise sur ces sites afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’infection./d’inflammation (rongeur, écoulement…). Dans ce cas, les animaux seront soit traités, soit euthanasiés. -Gavage : l’animal sera surveillé après l’administration pour s’assurer de l’absence de fausse route. En cas de fausse route, l’animal sera immédiatement euthanasié. La bonne prise alimentaire et de boisson sera surveillée après le gavage. En cas de problème decelé, l'animal sera mis à mort. Afin de garantir une non douleur de l'animal et un confort de manipulation de l'expérimentateur, nous ferons les procédures les plus invasives sur animaux anesthésiés et sans réveil.
Choix des espèces
L’Institut développe de nouveaux modèles de rats génétiquement modifés depuis quelques années. Une fois ces modèles prêts, il s'avère scientifiquement nécessaire de les caractériser et pour cela, le personnel doit être formé aux différentes techniques de manipulation, administration et prélèvements. Les animaux seront adultes (8 semaines à 20 mois) car pour la majorité issus d’autres projets d’une part et d’autre part parce que les projets de l'institut se font sur adultes et le personnel doit donc se former à ce stade. Les animaux seront indifféremment des mâles ou des femelles selon la disponibilité en animaux «inutilisés» dans les animaleries.
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères ou menées sous anesthésie terminale sans réveil. Le porteur indique que 160 d'entre elles reçoivent une injection intrapéritonéale de fer et 80 un prélèvement sanguin à la queue, l'ensemble étant euthanasié pour des nécropsies et des cultures cellulaires. Il décrit peu d'effets attendus de l'injection de fer, l'euthanasie survenant sept jours après. Sur le remplacement, il affirme recourir à des cultures issues des animaux mais conclut que la complexité du cerveau impose pour l'instant le modèle in vivo, en disant surveiller les avancées des organoïdes.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Formation aux actes techniques réalisés sur les animaux utilisés en cours de procédures expérimentales
- Enseignement supérieur
Rats : 515
Cochons d'Inde : 475
Hamsters dorés : 150
Lapins : 635
635 lapins, 515 rats, 475 cochons d'Inde, 225 souris et 150 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du "sans réveil" au sévère. Ils sont utilisés pour entraîner le personnel aux gestes techniques, injections, prélèvements, intubations et chirurgie, non pour produire des connaissances mais pour maintenir des compétences. Le porteur reconnaît une douleur et un stress lors des procédures, un hébergement isolé après chirurgie et un risque infectieux. Il présente l'entraînement préalable sur mannequins et sur animaux déjà tués comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet a pour but de maintenir et de compléter les compétences acquises au cours des formations initiales et réglementaires (formation en chirurgie et formation spécifique à l'expérimentation animale) et de ce fait, d'assurer à la fois le bien-être animal et la pertinence scientifique des résultats obtenus lors de ces procédures.
Bénéfices attendus
La maîtrise des actes techniques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, en assurant la pertinence scientifique des modèles expérimentaux et en limitant le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire pour obtenir les résultats escomptés. De plus, ce haut niveau de maîtrise permet de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse que peuvent subir les animaux au cours de leur utilisation.
Procédures
1/Les administrations seront effectuées sur animaux vigiles : injection intradermique, sous cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale et per os. Le temps estimé pour réaliser 1 administration hors intubation est de moins d’1 min. Ajouter 2 min environ pour mettre en évidence le site d’administration à l’aide d’une contention adaptée et 5 min si une tonte de la zone. Les intubations seront réalisées sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour mettre sous inhalation, implique une prémédication (1 min), action des molécules 15 à 20 min, mise sous gaz anesthésique (environ 4 min). Procédure complète : 25 à 30 min. 2/Les animaux seront soumis à des administrations intraveineuses, effectuées vigiles. Le temps estimé pour réaliser 1 administration ou un prélèvement est d’environ 1 min. Ajouter 2 min pour mettre en évidence le site et 5 min si tonte. Procédure complète : 5 à 10 min. 3/Les administrations / prélèvements seront réalisées sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour réaliser 1 administration / prélèvement est de moins d’1 min. Ajouter l’anesthésie (prémédication 1 min) action des molécules 15 à 20 min puis mise sous gaz anesthésique (4 min). Procédure complète : 25 min. 4/Les administrations / prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le temps estimé pour réaliser 1 administration / prélèvement est d’environ 1 min. Ajouter l’anesthésie avec la prémédication (1 min), action des molécules 15 à 20 min, réaliser la tonte et l’aseptie. Procédure complète : 25 à 30 min. 5/Les applications seront effectuées vigiles. Le temps estimé pour réaliser 1 application est d’environ 1 min. Ajouter 2 min pour mettre en évidence le site d’administration et 10 min si une tonte de la zone est nécessaire. Procédure complète : entre 5 et 15 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - douleur et stress lors de la réalisation des procédures expérimentales. - en phase post-opératoire, les animaux pourront être hébergés individuellement de façon temporaire, ce qui peut également causer un stress à l’animal chez les espèces sociables. - effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours : perte de poids ou d’appétit, baisse d’activité, comportements atypiques... - risque infectieux suite à la chirurgie.
Devenir
Utilisation des animaux en continue jusqu’à la mise à mort pour des formations de prélèvements d’organes, de tissus.
Remplacement
Des méthodes de remplacement sont mises en place pour l’acquisition de certaines compétences : par exemple, entrainement sur mannequins ou sur animaux euthanasiés (contention, injection intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvement sanguin intraveineux, administration orale, suture...). Cependant, certains actes nécessitent malgré tout le recours à des modèles animaux pour finaliser la formation des opérateurs dans des conditions les plus proches possible des situations réelles..
Réduction
Le recours aux mannequins ou l’utilisation d’animaux euthanasiés provenant d’autres procédures permet également de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour l’entraînement et la formation du personnel. De plus, la réutilisation d’animaux permet de réduire encore le nombre d’animaux utilisé pour la formation.
Raffinement
Grâce à l’entrainement préalable sur mannequins et sur animaux euthanasiés permettant des gestes plus assurés de la part des opérateurs, les manipulations des animaux provoquent moins de stress. En cas de signes de stress ou de douleur, ou en amont lorsqu’ils sont prévisibles, une analgésie associée si besoin à une anesthésie sera réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce animale se fera conformément au besoin de la formation, et en adéquation avec les exigences de compétence pour la mise en œuvre des projets. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Porteuses d'une tumeur cérébrale issue de cellules humaines de glioblastome, injectées lors d'une chirurgie de 30 minutes, les souris de ce projet peuvent perdre du poids de façon excessive et présenter des troubles neurologiques à mesure que la tumeur grossit. 207 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Après un transport en voiture vers un second établissement, une partie d'entre elles passe quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie, avec des injections sur souris éveillées que le porteur dit capables de provoquer des problèmes respiratoires. Ce volet, numéroté 2/2, reprend mot pour mot le texte du volet 1/2 et annonce le même effectif de 207 souris, que le porteur justifie seulement par la recherche d'une analyse statistique "pertinente".
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/2 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Mise à mort. Un groupe subira les procédures : A et E. Un groupe subira les procédures : A, puis B, suivi D puis E. Un groupe subira les procédures : A, puis C, suivi D puis E.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les deux EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de récupérer les cerveaux pour des analyses ex-vivo.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les deux Etablissements Utilisateur (1/2 et 2/2) (maximum 10 minutes). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire et de la nourriture et de l’eau gélifiée avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
207 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Opérées 30 minutes pour recevoir dans le cerveau des cellules humaines de glioblastome, elles sont ensuite transportées en voiture vers un second établissement, où une partie passe quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie, jusqu'à deux heures par séance. La tumeur peut provoquer une perte de poids excessive et des troubles neurologiques, et les injections faites avant l'imagerie, sur souris éveillées, peuvent entraîner des problèmes respiratoires. Le projet met au point cette greffe intracrânienne pour étudier ensuite l'oxygénation des tumeurs et leur réponse à la radiothérapie. Le porteur affirme avoir établi des points limites "pour éviter toute souffrance animale".
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/2 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/2 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l'EU 2/2 nous ferons une Mise à mort. Un groupe subira les procédures : A et E. Un groupe subira les procédures : A, puis B, suivi D puis E. Un groupe subira les procédures : A, puis C, suivi D puis E.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les deux EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de récupérer les cerveaux pour des analyses ex-vivo.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les deux Etablissements Utilisateur (1/2 et 2/2) (maximum 10 minutes). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire et de la nourriture et de l’eau gélifiée avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Création et recanalisation d’une thrombose veineuse par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le dispositif à ultrasons testé ici est un prototype conçu par le laboratoire pour rouvrir les veines bouchées par un caillot, avant de futures études chez l'humain. 28 porcs charcutiers de 40 à 50 kg vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chacun subit une procédure endovasculaire de trois heures, par ponction de la veine jugulaire et de la veine fémorale, pour créer une thrombose veineuse profonde, puis une heure de traitement par ultrasons. La mise à mort permet de prélever les poumons, la veine et l'artère fémorales, et le porteur la présente aussi comme "motivée par le souci du bien-être animal" et destinée à "assurer une conclusion éthique" à leur participation, pour des porcs qui ne sortent pas de l'anesthésie.
Objectifs
L'objectif principal de notre projet est l'évaluation de l'efficacité de notre dispositif en termes de recanalisation de la thrombose veineuse aigue. Nous évaluerons l'efficacité de ce dispositif grâce à la mise en évidence d'un chenal et la présence d'un flux sur l'écho-doppler veineux réalisé en fin de procédure. Les objectifs secondaires du projet sont l'évaluation de la sécurité du dispositif, à la lumière d'un examen clinique de la jambe de l'animal pour constater l'absence de lésion cutanée, d'une échographie doppler afin de constater l'absence de lésion artérielle ou veineuse, et d'un examen histologique de la veine de l'artère et des poumons du porc permettant de conclure à l'absence de lésion artérielle ou veineuse ainsi qu'à l'absence d'embolie pulmonaire.
Bénéfices attendus
Nous avons obtenu des résultats très encourageants avec le dispositif préliminaire. Nous souhaitons évaluer le nouveau dispositif de thérapie développé au sein du laboratoire qui sera le prototype utilisé chez l'homme afin de valider la sécurité et l'efficacité pour pouvoir ensuite envisager des études chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure endovasculaire sous anesthésie générale sans reveil avec une ponction jugulaire et fémorale pour la création de la thrombose veineuse profonde : 1 fois par procédure pour une durée de 3h et une procédure sous anesthésie générale de thérapie par ultrasons non invasive : 1 fois par procédure pour une durée d'1h
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'a eu lieu lors des premières expérimentations. Nous surveillerons les points limites pouvant entrainer une prescription d'antalgique ou une mise à mort de l'animal. - Hémorragie - Ischémie du membre - Hypotension - Tachycardie - Hypothermie - Mouvement anormaux de l'animal - Plaie avec écoulement - Oedeme du membre inférieur
Devenir
La décision de mettre à mort les animaux à l'issue de la procédure est prise après une réflexion approfondie et dans le strict respect des principes éthiques qui guident notre recherche. Les raisons sous-jacentes à cette mesure sont les suivantes : - Nécessité scientifique : La mise à mort des animaux est considérée comme essentielle pour obtenir des données cruciales à la compréhension des mécanismes biologiques ou des effets de la procédure étudiée. Il est impératif d'analyser les tissus ou organes spécifiques post-mortem afin d'obtenir des informations détaillées et pertinentes pour les objectifs de recherche.Cette mise à mort est nécessaire ici car le projet requiert un prélèvement des poumons, de la veine et de l'artère fémorales pour analyse histologique après mise à mort de l’animal afin d'évaluer la sécurité de notre dispositif. - Minimisation des souffrances : La mise à mort des animaux à l'issue de la procédure est également motivée par le souci du bien-être animal. Cette approche permet d'éviter toute détresse inutile ou prolongée qui pourrait résulter de complications postopératoires ou d'effets à long terme de l'intervention. - Respect des lignes directrices éthiques : Notre protocole s'aligne strictement sur les lignes directrices éthiques nationales et internationales régissant l'utilisation d'animaux dans la recherche. La mise à mort est envisagée comme une étape nécessaire pour garantir la conformité avec ces normes et pour éviter toute prolongation injustifiée de la présence des animaux dans des conditions potentiellement inconfortables. - Responsabilité envers le bien-être animal : Nous nous engageons à assumer notre responsabilité envers le bien-être des animaux participant à notre étude. La décision de mettre fin à leur vie est prise dans le souci de minimiser leur éventuelle souffrance et d'assurer une conclusion éthique à leur participation à la recherche.
Remplacement
Nous accordons une importance primordiale à la considération des alternatives avant de recourir à l'utilisation d'animaux dans nos recherches. Avant d'atteindre le point où l'utilisation des animaux devient nécessaire, nous nous engageons à explorer des alternatives viables et éthiquement justifiables. Dans le cadre de l'évaluation de ce dispositif, nous avons initialement travaillé sur un modèle in vitro de thrombus de sang frais dans un tube en silicone, nous permettant l'optimisation des paramètres ultrasonores et l'évaluation de l'éfficacité. En revanche le modèle animal est indispensable pour réunir les conditions les plus proches de l'homme, et faire une analyse de sécurité. Pour ce travail, seul un modèle de gros animal pouvait convenir du fait de la nécessité d’un calibre de veine accessible de plus de 2 mm, d’où l’utilisation d’un modèle porcin indispensable déjà validé pour la thrombose aiguë, limitant ainsi l’utilisation d’animaux pour la création d’un nouveau modèle. Nous continuerons à surveiller les avancées scientifiques afin d'incorporer de nouvelles méthodes et technologies alternatives, garantissant ainsi que notre utilisation des animaux reste minimale, justifiée et respectueuse des principes éthiques.
Réduction
Dans le cadre de notre engagement envers le respect du bien-être animal, notre projet de recherche intègre activement des mesures visant à réduire le nombre d'animaux utilisés tout en assurant la rigueur scientifique de nos investigations. Les principales stratégies mises en œuvre à cet égard sont les suivantes : - Optimisation expérimentale : Nous avons minutieusement conçu notre protocole expérimental pour maximiser l'information obtenue à partir de chaque animal participant. Cela comprend la mise en place de mesures permettant d'atteindre nos objectifs de recherche avec un nombre minimal d'individus. - Échantillonnage raisonné : L'approche statistique prévue pour notre projet repose sur un échantillonnage stratégique visant à garantir la représentativité tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires. Les techniques statistiques appropriées seront appliquées pour assurer la validité des résultats avec un nombre optimal d'individus. Nous évaluons à 28 le nombre total de porcs nécessaires. Concernant la détermination du nombre d'animaux spécifique à notre projet, celui-ci a été évalué en tenant compte des considérations éthiques, scientifiques et statistiques. Nous avons pris en compte la variabilité biologique attendue, la puissance statistique nécessaire pour détecter les différences significatives. Nous sommes engagés à maintenir une utilisation minimale et justifiée des animaux dans le cadre de notre recherche, en mettant en œuvre des pratiques rigoureuses et en évaluant continuellement les possibilités d'optimisation tout au long du projet.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par l’utilisation de points limites validés avec l’animalerie, et dédiés pour les procédures sous anesthésie générale avec la possibilité d'une mise à mort précoce en cas de mauvaise tolérance de l'animal.
Choix des espèces
Pour rendre l’expérimentation possible, il nous faut un animal d’un poids suffisant, un diamètre de veine fémorale ≥5mm. Les animaux plus petits ne permettent pas d’obtenir ces conditions. Pour rendre des résultats interprétables, l’anatomie doit être comparable aux caractéristiques humaines et le porc présente un système veineux proche de l’homme. Par ailleurs, la technique de création d’une thrombose veineuse profonde a déjà été validée dans un modèle porcin. Jeunes porcs charcutier avec un poids variant entre 40 et 50kg ce qui correspond a 14- 15 semaines d’age. (suffisamment âgés pour obtenir un diamètre de la veine fémorale commune > 5mm). Le poids est choisi afin de pouvoir realiser les echographies-Doppler veineux comme déjà publié dans la litterature et pour tester la faisabilite de notre therapie ultrasonore sur une anatomie similaire a l’homme.
Rôle d’un facteur de croissance dans le vieillissement vasculaire pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant maintenue sous anesthésie jusqu'à la mort. Elles sont placées 21 jours dans un caisson à 9 % d'oxygène pour induire une hypertension pulmonaire, ou reçoivent de l'élastase dans la trachée par chirurgie pour provoquer un emphysème, avec mesure de la pression cardiaque et de la fonction pulmonaire sous anesthésie. Le porteur indique une perte de poids modérée et un stress liés aux manipulations, ainsi qu'une douleur légère au poinçonnage de l'oreille servant à l'identification. Il mène en parallèle des cultures de cellules humaines mais affirme que la souris génétiquement modifiée reste "incontournable" pour étudier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Le vieillissement des vaisseaux sanguins avec diminution du nombre de capillaires est un élément clé du vieillissement de l'organisme, ce qui réduit l'apport de nutriments et d'oxygène aux tissus. Ce phénomène semble lié à la diminution d'un facteur synthétisé par les cellules endothéliales des vaisseaux. L’action de ce facteur serait perturbée par une protéine. En absence de ce facteur sécrété par les cellules endothéliales, celles-ci vieillissent plus rapidement, avec un arrêt de leur multiplication et la libération de facteurs nocifs pour le poumon. Il a été démontré qu'un nombre élevé de cellules endothéliales vieillissantes est associé au vieillissement prématuré du poumon et à plusieurs maladies pulmonaires. Notre objectif est de comprendre comment l'absence de ce facteur contribue à ce vieillissement prématuré entrainant des maladies comme l'hypertension et/ou l'emphysème pulmonaires. Pour cela, nous étudierons la protéine, le vieillissement des cellules endothéliales pulmonaires, la fonction pulmonaire et la densité des vaisseaux sanguins chez des souris jeunes et âgées, avec ou sans maladies pulmonaires. De plus, nous travaillerons avec des souris génétiquement modifiées pour produire plus du facteur synthétisé par les cellules endothéliales afin de prévenir l’action de la protéine le perturbant, et ainsi protéger les souris du vieillissement prématuré du poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de décrire le lien suspecté entre la diminution de l'action du facteur VEGF et le vieillissement des vaisseaux pulmonaires. Nous étudierons ce lien au cours du vieillissement et dans deux maladies, l'hypertension artérielle et l'emphysème pulmonaires. A l’issue de ce projet, nous souhaitons tester le sVEGFR1 comme un marqueur du vieillissement et de la sévérité de la maladie pulmonaire chez des patients atteints d’emphysème.
Procédures
Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. A l'issue de la procédure d'hypoxie, les animaux seront profondément anesthésiés pour la mesure de la pression au niveau du coeur droit. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) par injection dans la trachée sous anesthésie générale lors d'une intervention rapide (5 minutes). Une petite incision à partir de la base du cou est effectuée afin de visualiser la trachée, la souris est maintenue anesthésiée tout au long de l'injection. Une fois le traitement effectué, un point de suture à l’aide d’un fil résorbable sera réalisé. A la fin de la procédure d'injection d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil (Flexivent) durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectées grâce à une sonde. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (1 seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois), nécessaire à leur identification.
Impact sur les animaux
Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, instillation intratrachéale, Flexivent) peuvent générer un stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cages. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit alors également un stress. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (un seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois). Cette méthode d'identification peut causer une douleur légère de courte durée.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (quantification des marqueurs de sénescence, expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude sera portée sur des cellules issues d’échantillons pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. La culture de cellules endothéliales permet d’étudier et de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l’augmentation du VEGF sur des souris avec des maladies pulmonaires, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de ces maladies.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris porteuses d'hypertension pulmonaire. Aucune perte de poids supérieure à 10% n'est attendue.
Choix des espèces
Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour étudier l’effet de l'augmentation de cellules vieillissantes chez ces souris mutantes.
Caractérisation du phénotype métabolique de la lignée de souris POMC-Cre:SELENOTfl/fl – Etude fonctionnelle du rôle de la SELENOT dans la régulation du métabolisme énergétique sous régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Jusqu'à dix prises de sang à la queue en une demi-journée : 624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Chez celles qui reçoivent un régime riche en graisses, le porteur attend surpoids et hyperglycémie, et les tests imposent un jeûne d'une nuit, des injections de glucose ou d'insuline et un isolement qui peut durer un mois pour mesurer ce qu'elles mangent. Le projet étudie le rôle de la SELENOT, une protéine antioxydante, dans l'obésité et le diabète de type 2, chez une lignée génétiquement modifiée, POMC-Cre:SELENOTfl/fl. Seuls des mâles sont utilisés, car inclure des femelles imposerait de caler les expériences sur leur cycle œstral, ce qui selon le porteur "augmenterait fortement le nombre d'animaux".
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle protéine anti-oxydante impliquée dans le contrôle du stress des cellules neuroendocrines. Elle est notamment impliquée dans la production des hormones la pro-opiomélanocortine (POMC) et de l’insuline, suggérant que cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. En effet, il est maintenant bien établi que le cerveau obèse est stressé et que le stress cellulaire dans l'hypothalamus joue un rôle central dans la résistance à la leptine et le développement de l'obésité. Lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress cellulaire qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. Les données récentes ont permis d’établir que le développement des neurones POMC et la maturation de la POMC sont altérés par le stress cellulaire qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion d'alpha-MSH dérivé de la POMC, le régulateur central de l'équilibre énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones POMC hypothalamiques pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress du RE et associés à l'obésité.
Bénéfices attendus
L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie de "diabesity" actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. La SELENOT que nous avons mise en évidence pour ses fonctions protectrices des cellules sécrétrices présente plusieurs avanatges qui peuvent en faire une cible thérapeutique très intéressante pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, la SELENOT réduit le stress du reticulium endoplasmique et le stress oxydant en général. Elle peut agir aussi bien au niveau central que dans des tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser avec les souris d'intérêt requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.
Procédures
La perfusion intracardiaque durera environ 20 min par animal. Les injections intrapéritonéales dureront moins d'une minute par animal. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline dureront environ 1 h. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux vigiles comme décrit dans les différentes procédures (10 maximum par animal sur une demi-journée, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). Pour la mesure de la tolérance au glucose, les souris reçoivent une injection de glucose par voie intrapéritonéale. Après anesthésie, une goutte de sang est prélevée au niveau caudal et est déposée sur une bandelette glycémique pour la lecture de la glycémie. Pour la mesure de l’insulinosensibilité, le même type de méthode de mesure de la glycémie est effectué après administration d’insuline.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Les souris seront mises à jeun pendant une nuit, une procédure largement utilisée pour la mesure de la glycémie basale et de tolérance au glucose et qui est bien tolérée par l'animal qui récupère son poids normal au bout de quelques heures post-jeûne. Pour les mesures de prise de nourriture, les animaux sont placés individuellement dans des cages de vie normales avec sciure et enrichissement pendant toute la durée de l'expérimentation (jusqu'à 1 mois). Ces cages sont équipées de mangeoire muni d'une balance pour peser la nourriture. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. L'éventuel stress relatif à l'individualisation des souris peut être évalué selon un barême de mal-être.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des expérimentations afin de prélever des organes.
Remplacement
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de la SELENOT dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec une période de repos de 5 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur (pose des puces de traçabilité, incision, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique avant l'acte qui peut être poursuivi après l'acte si nécessité pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle physiologique de la SELENOT dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations. Les protocoles seront mis en place chez des souris mâles et non chez des femelles pour nous affranchir de toutes variations dues aux modifications de sécrétion des hormones gonadiques au cours du cycle oestrien qui peuvent impacter significativement les résultats. L'utilisation de souris femellles nous obligerait à effectuer toutes les expériences à un stade précis de l'oestrus, ce qui complixiefirait lourdement l'étude et augmenterait fortement le nombre d'animaux.
Développement d’un implant olfactif chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil ou modéré. Ils reçoivent une injection destinée à provoquer une anosmie durable, subissent l'implantation chronique d'électrodes dans le cerveau lors d'une chirurgie d'environ une heure et demie, puis une restriction alimentaire pour les tests de discrimination des odeurs. Le porteur développe un implant olfactif visant à restaurer l'odorat et indique laisser un rat sentant auprès des rats rendus anosmiques pour atténuer les effets de la perte d'odorat. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de paramètres comportementaux et de physiologie intégrée impose le recours au rat vivant.
Objectifs
L'anosmie, ou perte complète de l’odorat, est une maladie qui affecte gravement la qualité de vie, étant donné l’importance de ce sens pour la prise alimentaire et les interactions sociales. L'anosmie est également liée à un risque accru de dépression et de décès, et peut handicaper les individus face aux dangers (nourriture avariée, fuite de gaz…). Les données épidémiologiques concernant sa prévalence sont rares, cependant il a été estimé que 5% de la population générale est anosmique. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté l'incidence de cette maladie et a également sensibilisé le grand public à ce sujet. Toutefois, il n'existe actuellement aucun traitement pour l'anosmie de longue durée, en dehors de l'entraînement olfactif, qui a un bénéfice significatif mais limité, principalement pour les dysfonctions olfactives post-infectieuses. L'implant olfactif représente une approche prometteuse pour traiter l'anosmie, toutefois il est nécessaire d'évaluer un tel dispositif sur des modèles animaux in vivo. Notre objectif est d’induire une anosmie à long terme chez des rats ce qui nous permettra de tester des dispositifs de récupération olfactive. Nous avons choisi le rat, qui a un système olfactif dont l’organisation est proche de celle de l’Humain.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de tester les paramètres permettant de valider un dispositif de récupération olfactive chez le rat. Cette validation nous permettra de développer de tels dispositifs pour l'homme.
Procédures
Nous réaliserons des chirurgies pour l’implantation chronique d'électrodes de stimulation et d'enregistrement chez le rat éveillé (chirurgie environ 1h30). La stimulation du bulbe olfactif sera ajustée pour ne pas générer d'inconfort chez le rat (objectif de la procédure numéro 3). Pour le test comportemental de discrimination olfactive (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours) la quantité de nourriture donnée aux animaux est diminuée dans la cage d'hébergement, diminution contrebalancée par la récompense obtenue dans la cage de comportement, l'eau est donnée ad libitum.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourront se produire lors de l'injection de methimazole, lors de la chirurgie cérébrale, lors de la mise en restriction alimentaire pour le test comportemental. La toxicité du composé sera évaluée post-mortem après prélèvement de la muqueuse olfactive et du cerveau, toutefois les données de la littérature indiquent que l'inflammation à court terme est spécifique de l'épithelium olfactif. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement. Les animaux seront hébergés en groupes (au moins 2 animaux) et nous laisserons au moins un animal normosmique en compagnie des rats anosmiques, ce qui pourra atténuer les effets négatifs de la perte d'odorat. Les tests olfactifs seront réalisés en condition de restriction alimentaire en s'assurant au préalable que l'état des animaux le permet. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération.
Devenir
Mise à mort pour tous les animaux afin de prélever des tissus pour analyses.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des rats in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des rats, et de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton et des batons de bois. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
La rat a une taille de crâne adaptée à la chirurgie que nous souhaitons mener. Les rats Wistar et Long Evans seront utilisés, ils ont de très bonnes capacités olfactives, ils peuvent apprendre facilement les odeurs. Les animaux sont utilisés à l'age adulte (à partir de 3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.
Traitement de l’information nociceptive chez l’animal naïf et parkinsonien
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance du sans réveil au sévère. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie crânienne pouvant aller jusqu'à deux heures et des stimulations douloureuses répétées trois fois par semaine pendant un mois, avec des lésions reproduisant la maladie de Parkinson entraînant perte de poids et déficits moteurs. Le porteur précise que les altérations de la sensibilité à la douleur ne peuvent être soulagées car elles sont l'objet même de l'étude, dont le but reste fondamental, la compréhension d'une région cérébrale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit les réseaux cérébraux en jeu, l'animal vigile étant présenté comme "indispensable".
Objectifs
Le traitement des informations douloureuses est un des éléments essentiels à notre survie. Il apporte en effet un signal d’alarme pour limiter les dommages que pourraient potentiellement subir l’organisme. Ces réponses impliquent des réflexes rapides, des mécanismes attentionnels et l’intégration plus complexe des informations liées aux stimulus douloureux et au contexte. La douleur peut également être considérée comme pathologique et/ou être associée à une pathologie. C’est notamment le cas dans la maladie de Parkinson, dans laquelle de nombreux malades rapportent des douleurs spontanées, mais également des réponses exacerbées à des stimulus douloureux (hyperalgésie) et des douleurs en réponse à des stimulations normalement non douloureuses (allodynie). L’objectif de ce projet est double. Il s’agit : 1 / d’évaluer l’implication d’une région cérébrale dans l’intégration des informations liées à une douleur aigue. 2/ d’évaluer les altérations de cette intégration dans le contexte des symptômes douloureux liés à la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
L'objectif premier de cette étude est fondamental et concerne une meilleure compréhension fonctionnelle d’une région cérébrale encore peu connue. Mais les données obtenues amèneront aussi des informations sur des différences ou non de réponse selon le sexe et selon l’état pathologique, ici pour mieux comprendre les bases de la douleur présente dans la maladie de Parkinson. Cette information constitue un point de départ pour ultérieurement évaluer cette région cérébrale comme cible anatomique thérapeutique potentielle dans le cadre de la symptomatologie de la maladie de Parkinson.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de queue autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie de maximum 2h, et des tests comportementaux d’identification du seuil de sensibilité douloureuse et d’enregistrement de l’activité neuronale seront effectuées 3 fois par semaine, sur une période d’un mois et d’une durée moyenne allant de 10 minutes à 1h en durée selon les tests.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue nécessaire aux génotypage des animaux (autour de 6 jours post natal) induit une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crâne). Les stimulations nociceptives entraînent potentiellement une douleur aiguë ponctuelle, objet de l’étude. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle reproduisant la complexité des réseaux de structures cérébrales mis en jeu dans cette étude. Ainsi, les réponses cérébrales et comportementales à des stimulations douloureuses nécessitent l’animal entier, vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs maximum nécessaires pour conclure ont été calculés statistiquement, mais des analyses intermédiaires des résultats en cours d’expériences permettront de potentiellement réduire ce nombre.
Raffinement
Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être (perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué…). Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargé du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichis (bâton et fissure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nid)
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que l’étude des comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés
FORMATION DES CHIRURGIENS A LA REALISATION DE MODELES DE RONGEURS OPERES
- Formation professionnelle
Rats : 1250
2 500 animaux non-humains vont être utilisés, moitié souris moitié rats, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil ou modéré. Chaque animal subit une chirurgie unique de trente minutes à une heure et demie sous anesthésie, avec parfois des injections répétées et un hébergement isolé jusqu'à 21 jours, pour entraîner des techniciens à produire des modèles chirurgicaux standardisés. Le porteur présente cette formation comme un moyen de fournir aux chercheurs des modèles prêts à l'emploi et de mieux prendre en charge la douleur des animaux opérés. Il indique commencer l'entraînement sur cadavres et simulateurs quand la technique le permet, mais juge l'apprentissage sur animal vivant nécessaire pour valider la viabilité du modèle dans le temps.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’assurer le développement et le maintien des techniques du personnel dédié à la réalisation de modèles de rongeurs opérés pour répondre aux besoins des chercheurs dans le cadre de leurs études et protocoles de recherche. Ces formations s’adressent à des techniciens habilités et dédiés aux activités de chirurgie. Les techniciens sont considérés comme habilités après avoir participé à la formation réglementaire en chirurgie expérimentale et avoir reçu, en interne, la formation théorique commune à tout modèle chirurgical par le formateur du service ou le vétérinaire désigné: anatomie générale du rongeur, formation à l’anesthésie et l’analgésie et leur gestion per opératoire, formation à l’asepsie.
Bénéfices attendus
La formation de chirurgiens, selon des procédures et des protocoles prédéfinis, permet de proposer à la communauté scientifique, des modèles d’intérêts prêt à l’emploi, leur permettant d’accroître leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines (mécanismes physiologique, physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention…) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal. Elle permet aussi de proposer des modèles standardisés et homogènes dont la communauté scientifique a besoin pour leurs études. La formation initiale du chirurgien à un modèle cible est nécessaire au préalable à toute mise à disposition d’un modèle chirurgical permettant une bonne anticipation de la procédure, une meilleure reproductibilité par la suite du modèle ainsi qu’une meilleure prise en charge per opératoire de l’animal, contribuant à son bien-être et à la minimisation des nuisances subies.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure et demi sous anesthésie général. Selon le modèle et en cas de besoin (douleur, récupération post oépratoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections sous cutanées ou intra péritonéales (maximum 10 injections par jour). Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 21 jours.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids pouvant être provoqué par les contentions, les procédures chirurgicales, la présence du matériel implanté pour les modèles de cathétérisation et d’implantation et la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel jusqu’à 21 jours si besoin selon le modèle (par exemple : cathétérisation vasculaire couplé à un harnais, partie externe pouvant être dégradée par un congénère).
Devenir
Les animaux sont mis à mort.
Remplacement
La formation des chirurgiens a pour objectif d’acquérir des gestes techniques permettant de mettre à disposition des modèles rongeurs opérés reproductibles et standardisés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (simulateur de suture, mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux défini dans notre procédure et utilisé pour la qualification et la requalification de chaque modèle est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour la formation, 1 pour la reformation) et d’un maximum (de 25 pour la formation, 10 pour la reformation) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. La formation ou reformation s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une qualification ou requalification sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et des points limites en fonction des spécificités du modèle en formation seront appliqués. La première phase de qualification sera effectuée sur des cadavres frais, dès lors que la technique le permet puis sur des animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés. Après les gestes maîtrisés, les chirurgiens effectueront une phase d’entraînement sur animaux analgésiés, anesthésiés et réveillés. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle, le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes d’inconfort ou de douleur, absence de fécès). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire (ouverture invasive, ouverture de la cavité abdominale, ouverture au niveau de la région crâniale). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Pour nos modèles chirurgicaux dont le taux de survie est inférieur ou égal à 80%, une habituation par la manipulation des animaux est effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche pour ce projet est directement lié au modèle chirurgical ciblé pour la formation. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Ne sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt en formation, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Enseignement pratique de physiologie et d’expérimentation animale sur rongeur (rats et souris)
- Enseignement supérieur
Rats : 200
675 animaux non-humains vont être utilisés, 475 souris et 200 rats, en majorité tués et 25 souris proposées à l'adoption, dans des procédures allant du sans réveil au léger. Les étudiants s'entraînent à la contention et aux injections, mesurent la glycémie après injection de glucose et prélèvements de sang à la queue, tandis que d'autres souris sont euthanasiées pour prélever l'intestin et que les rats sont canulés puis tués sans réveil pour prélever le cœur. Le porteur décrit une formation à la physiologie couplée à la formation réglementaire, réservée aux étudiants volontaires ayant validé leurs examens, et affirme utiliser surtout des animaux de réforme déjà destinés à l'euthanasie. Il revendique le maintien de travaux pratiques sur animaux non-humains comme nécessaire à l'apprentissage des gestes, malgré des simulations numériques employées en amont.
Objectifs
Le projet que nous proposons est un projet de formation des étudiants à la physiologie animale et s'inscrit dans la troisième année de notre parcour. Afin de réduire l'utilisation d'animaux pour la formation d'un étudiant à la physiologie nous avons modifié notre programme de cours afin qu'il soit couplé à la formation réglementaire d'applicateur des procédures et de soins aux animaux décernéé par notre établissement et habilitée par le ministère de l’Enseignement supérieur et la CNEA. Notre formation nécessite la réalisation de travaux pratiques sur des rongeurs pour compléter les connaissances acquises pendant les enseignements par des études expérimentales et pour initier aux techniques de l’expérimentation animale (préhension, contention, anesthésies des animaux, prélèvements d’organes, études de mécanismes in vitro et in vivo). Le maintien des travaux pratiques permet d’augmenter les chances de réussite des étudiants à leur arrivée sur le marché du travail. Ils permettent aussi de maintenir une confrontation directe des étudiants avec l’expérimentation animale et de les conforter dans leur plan de formation ou au contraire de leur laisser la possibilité d’une réorientation afin d’éviter des prises de conscience trop tardive, source d’échec et de difficultés pour les étudiants. Tous les étudiants de la formation n'effectuent pas ces travaux pratiques nécessitant l'apprentissage des techniques d'expérimentation animale. Seul les étudiants volontaires et ayant validés les enseignements de physiologie avec une note supérieure à 10/20 et un examen éthique et réglemantaire avec une note supérieure à 12/20 peuvent réaliser les procédures décrites dans cette saisine. Les autres étudiants réalisent des travaux pratiques sur des logiciels de simulations.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de maintenir une confrontation des étudiants destinés à la recherche médicale avec la manipulation et l'expérimentation animale. Cette confrontation de l'étudiant à la réalité de l'expérimentation animale permet de conforter ou à l'inverse d'infirmer les choix d'orientation des étudiants. Ce projet est aussi nécessaire pour l'initiation des étudiants à la physiologie animale. Avec ce projet, chaque étudiant qui travaille en trinôme aura utilisé en tout 1 animal pour apprendre la contention d'animaux vigiles, les injections sur rongeurs, pour étudier la régulation de la glycémie, la régulation de la pression artérielle, la régulation de la fonction digestive et cardiaque, l’analyse électrocardiographique du cœur, la réalisation d’une culture primaire, mais aussi l’anesthésie d’une souris. Avec un animal (majoritairement des animaux de réformes qui étaient destinés à l'euthanasie pour tri génétique par exemple), les étudiants volontaires, sélectionnés sur leur maitrise de l'éthique et la réglementation en expérimentation animale et ayant les prérequis académiques necessaires à la poursuite de leur cursus en physiologie pourront valider leur diplome de physiologie et la formation réglementaire d'application des procédures et de soins aux animaux. Le couplage de notre formation avec la formation réglemantaire agréeé par la CNEA permet de former directement les étudiants aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et à l'utilisation de méthodes alternatives quand cela est possible. Pour les laboratoires de recherche, cela permet de recruter dès le master 1 des étudiants formés aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et detenteur d'une habilitation d'applicateur des procédures.
Procédures
Durant nos trois procédures les animaux seront soumis à différentes interventions. Dans la première procédure , les animaux seront manipulés par les étudiants afin d'apprendre la préhension, la contention, l'injection intrapéritonéale et la mesure de glycémie. Dans cette procédure ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose suivie de 5 prélevements de 3µl de sang au bout de la queue afin de mesurer la glycémie. Dans la seconde procédure, les souris recevront une injection d'anésthésiant et une injection intrapéritonéale soit d'un régulateur sympathique soit d'un régulateur parasympatique. Certaines souris seront euthanasiées afin de prélever l'intestin et du tissu adipeux dans l'objectif d'étudier la physiologie intestinale et de réaliser une culture primaire d'adipocytes. Dans la troisième procédure les rats reçoivent une injection de morphinique suivie d'une anesthésie sans réveil. Pendant l'anesthésie, les rats sont canulés sur la jugulaire et la carotide afin de mesurer la pression arterielle et de recevoir une injection en intraveineux d'un régulateur sympathique et parasympathique. Ensuite le coeur de ces animaux est prélevé afin de réaliser un TP la physiologie cardiaque.
Impact sur les animaux
Afin d'éviter toute nuisance pour les animaux, les travaux pratiques sont réalisés par trinôme d'étudiants dans un box isolé en présence d'un enseignant. Lors de nos protocoles la préhension des animaux pourra générer du stress. Afin de le limiter, la préhension sera réalisée avec un tube et les animaux seront habitués à être manipulés. Ensuite lors de la contention et des injections intrapéritonéales qui dureront moins d’une minute les animaux ressentiront du stress et la douleur d’une piqure d’aiguille. Pour le protocole de mesure de glycémie comme pour le protocole de mesure d’un électrocardiogramme les nuisances attendues seront aussi du stress lié à la manipulation des animaux et la douleur d’une piqure d’aiguille. Cette nuisance sera très courte et durera moins d’une minute. Pour la mesure de glycémie le protocole nécessite aussi le retrait de la nourriture pendant 6h. Pendant ces 6 heures les animaux pourront néanmoins boire à volonté. Pour les deux protocoles, suite à l’injection qui générera la douleur d ‘une piqure d’aiguille nous gardons la souris sous surveillance pendant 1 heure afin d’observer les signes cliniques et de comportement. Si le comportement de la souris est anormal après l’injection (souris prostrée, qui évite les interactions avec les congénères, saignements apparents) nous procédons immédiatement à son euthanasie. Pour le protocole sur les rats les nuisances attendues seront aussi un stress lié à la préhension et la douleur d’une piqure d’aiguille. Sinon pendant la période d’hébergement le projet n'aura aucun impact sur les 5 libertés individuelles de l'animal. Nos animaux pourront s'alimenter à leur convenance ce qui n'induira aucune sensation de faim ou de soif. Comme nos conditions d'élevages seront adaptées à la physiologie des animaux, nos souris ou nos rats n'auront aucune sensation de peur, de détresse, de stress physique ou thermique et de manque d'interaction sociale. Enfin, notre surveillance régulière aura pour but de prévenir toute douleur, lésion ou maladie sur nos animaux.
Devenir
Quand cela sera possible nous essaierons de placer à l'adoption des souris. Par expérience nous arrivons à faire adopter tous les ans quelques souris aprés l'accord de la vétérinaire responsable de notre animalerie en lien avec la ddpp. Les autres souris seront euthanasiées car non replaçable dans d'autres procédures. De plus dans la plupart des cas, il s'agira de souris qui étaient déja destinées à l'euthanasie et reutilisées pour nos séances de travaux pratiques. Pour les rats il s'agit d'une classe sans réveil ou le coeur est prélevé
Remplacement
Afin de remplacer les animaux nous avons arrété tous les travaux pratiques qui utilisaient des animaux jusqu'en fin de deuxieme année de notre formation. Nous les avons remplacés par des expériences de simulation numérique ou par des vidéos (par exemple pour le comportement). En trosième année de notre formation nous utilisons des logiciels de simulations afin de remplacer au maximum l'utilisation d'animaux. L'utilisation de logiciels de simulation permet parfaitement aux étudiants avec des prérequis académique trop faible , ou n'ayant pas validé les examens sur l'éthique et la réglemantion avec une note supérieure à 12 /20, ou ne désirant pas utiliser d'animaux d'acquerir les compétences en physiologie animale. Pour les autres étudiants le maintient de travaux sur animaux et l'apprentissage des techniques d'expérimentation (contention, préhension, injection ...) l'utilisation d'animaux est necessaire pour l'obtention du niveau d'applicateur des procédures et de soins aux animaux. Cependant pour remplacer les animaux vivants, les étudiants commencent l'apprentissage sur des souris de substitutions en Latex.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés nous avons remplacé des séances de TP initialement pratiquées sur des animaux par des méthodes alternatives utilisant par exemple des logiciels de simulation en expérimentation animale, mais aussi par des supports vidéos que nous avons réalisés. L’enchainement des travaux pratiques est effectué de façon séquencée, cad que nous commençons par les expériences in vivo, puis après mise à mort nous récupérons les organes pour les expériences ex-vivo. Enfin, concernant les souris nous utilisons quand cela est possible des souris de réforme, normalement destinées à l’euthanasie pour tri génétique ou fin de protocole. Pour terminer, afin de réduire le nombre de rats et de souris utilisés dans l'étude, les groupes sont constitués en fonction du nombre strict nécessaire d’animaux pour chaque groupe de TP (il y a 5 trinômes dans chaque groupe d’étudiants et il y a 6 à 8 groupes en moyenne chaque année). Nous prévoyons pour la formation d’un étudiant qui dure 3 ans qu’il utilisera 1 animal. Enfin, pour réduire nous permettons seulement aux étudiants volontaires, avec des prerequis académiques solides et validant des compétences en éthique et reglementation de réaliser les TP necessitant l'utilisation d'animaux. Par cette approche quand dans le passé tous les étudiants utilisés environ 3 souris et 3 rats pour leur formation, aujourd'hui seulement 60 à 70% des étudiants vont utiliser des animaux à raison de 1 animal par étudiant.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, infligées aux animaux nous avons réorganisé complétement nos programmes de physiologie pour intégrer des nouveaux enseignements sur la réglementation, l’éthique, les modèles murins, la prise en charge de la douleur, etc ... Cela permet de sensibiliser et de former les étudiants avant toute manipulation. Concernant l’hébergement, tous nos animaux sont dans un environnement enrichi de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour réaliser des nids. Afin de réduire le stress et la souffrance des animaux au maximum, nous utiliserons un prétraitement avec un morphinique avant l’anesthésie. Les animaux sont manipulés dans des petits box isolés pour réduire tout le stress pouvant venir de l'environnement. Enfin pour terminer l'entrainement des étudiants est d'abord réalisé sur des souris en latex permettant d'apprendre le geste avant d'utiliser des animaux vivants.
Choix des espèces
Nous adaptons les espèces en fonction des besoins. Les rats présentent l’avantage de pouvoir être manipulés plus facilement pour les expériences in et ex vivo. Les souris sont parfaites pour apprendre aux étudiants à manipuler un animal avec moins d’appréhension. Enfin, notre formation d'applicateur des procédures et de soins aux animaux est agréée sur rongeurs souris et rats. Pour les rats nous utilisons une lignée non-consanguine (Srague-Dawley) de 10-14 semaines c’est l’âge idéal d’utilisation des animaux et celui le plus utilisé dans la littérature. Pour les souris : nous utiliserons des souris adultes et quand cela est possible de réforme. L'âge précis n'a pas d'importances dans notre cas. Pour la souche elle peut varier avec les animaux de réforme mais dans la majorité des cas nous aurons des souris de lignée consanguine (C57BL6) et quand nous les commandons nous achetons des souris non consangunes (Swiss) de 10 semaines.