Procédures sans réveil

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Charcot, elles développent une paralysie progressive et sont suivies jusqu'au point limite, fixé à l'incapacité de se retourner en quinze secondes ou une perte de poids dépassant 15 %. Certaines reçoivent un transfert de lymphocytes T régulateurs par voie intraveineuse, d'autres un prélèvement intracardiaque après injection létale. Le porteur revendique une approche de thérapie cellulaire à amener "au plus proche de la clinique".

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie du motoneurone adulte qui se caractérise pas une paralysie progressive. Bien que les neurones moteurs soient sélectivement atteints dans la maladie, le système immunitaire se retrouvent également impliqué dans cette maladie. En effet, des lymphocytes T dits régulateurs (Treg), une population de globules blancs dont la fonction est de supprimer les réponses immunitaires potentiellement dangereuses, voient leur nombre et leur propriétés régulatrices fortement diminuées chez les patients et les souris. L’hypothèse de départ est que les altérations métaboliques présentes dans la maladie de Charcot contribuent au dysfonctionnement des lymphocytes T régulateurs dont la fonction est directement gouvernée par l’environnement métabolique. Notre projet consiste donc à étudier le métabolisme des lymphocytes T régulateurs dans la maladie et d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une correction métabolique de ces cellules dans un modèle de maladie de Charcot.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour vocation d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. En ciblant l'interaction entre système nerveux et système immunitaire, notre objectif est d'amener le plus proche possible de la clinique une approche de thérapie cellulaire compatible avec les contraintes cliniques.

Procédures

L’étude du métabolisme implique des prélèvements intra-cardiaques suite à une injection léthale d’un mélange anesthésique/analgésique chimique sur des animaux modèles de la maladie de Charcot avec un phénotype dommageable. Un total de 54 animaux avec phénotype dommageable seront soumis à ce prélèvement sanguin. Le prélèvement prend moins de 5 min par animal. L’étude de l’effet thérapeutique d’un transfert de lymphocytes régulateurs d’origine différente dans des souris modèles de la maladie de Charcot comprend une injection de cellulaire en intra-veineuse sur un total de 192 souris à phénotype dommageable. 4 souris à phénotype dommageables serviront de souris donneuses de lymphocytes qui seront modifiés in vitro avant réimplantation. 72 souris qui ont été transfusées seront incluses dans une étude comportementale qui débute à l’âge de 60 j jusqu’à son incapacité à effectuer le test moteur, et qui atteint donc le point limite. Chaque test moteur est non-invasif et non-contraignant prend entre 20 sec et 5 min par souris. Un total de 168 souris seront utilisées pour une étude de cytométrie et d’histologie. Ces souris recevront une injection terminal d’un mélange anesthésique/analgésique chimique pour ensuite être soumis à un prélèvement sanguin ou une perfusion intra-cardiaque pour préparation à l’histologie. L’anesthésie profonde et très rapide, la manipulation prend moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Le modèle de maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie de Charcot ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.

Devenir

Les souris porteuses de la mutation causant la SLA ont une espérance de vie limitée. L'ensembles animaux seront euthanasiés selon les critères d'interuption définis préalablement

Remplacement

Le modèle murin de la maladie de Charcot que nous utilisons mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine. Un effort est réalisé pour minimiser et optimiser le nombre d’animaux. Cependant, la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie cellulaire.

Réduction

Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèle de la maladie.

Raffinement

Une connaissance extensive de ces deux modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement enrichi. Cet environnement permet d’améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une grille de suivi est scrupuleusement suivie avec une définition claire des points limites. Les souris sont euthanasiées par injection d’une dose léthale d’anesthésique chimique (kétamine) en combinaison avec un analgésique (xylazine).

Choix des espèces

Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.

1 540 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent contention, gavage, injections répétées par plusieurs voies et des prélèvements sous anesthésie (carotidien, intracardiaque, rétro-orbitaire, vésical), non pour produire des connaissances mais pour former des techniciens de laboratoire. Le porteur mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels et signale que des surcharges anesthésiques provoquent des arrêts cardio-respiratoires tuant un ou plusieurs animaux par session. Il présente les vidéos et modèles inertes comme une préparation, mais affirme qu'il reste "indispensable" que les étudiants pratiquent sur animaux vivants.

Objectifs

Depuis 2010, l’Europe fait reposer la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sur quatre points : l’agrément des établissements, le contrôle de leur origine, l’autorisation des projets et la formation des personnels. Notre formation universitaire a pour objectif de former des techniciens de laboratoire dans divers domaines de la biologie incluant le métier de technicien en expérimentation animale. Notre nouvelle offre de formation est basée sur une spécialisation dès le premier semestre, une approche par compétences et des mises en situation professionnelles. La formation des étudiants au métier de technicien de laboratoire en expérimentation animale a été particulièrement accentuée avec notamment l’intégration en tout début de la première année, de la formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures expérimentales chez les rongeurs. Notre formation universitaire dispense donc les cours théoriques réglementaires, des cours spécifiques sur les rongeurs et des visites d’animalerie. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux sont destinés à l’acquisition de deux compétences : l’observation et la quantification du comportement des souris et l’acquisition de différents gestes techniques de base chez le rat et la souris (contention, prélèvements, injections). Avant de commencer les travaux pratiques, l’utilisation de vidéos et de modèles animaux inertes est proposée aux étudiants afin de les mettre dans les meilleures conditions avant l’utilisation de l’animal. Cependant, pour une formation efficace, les étudiants doivent ensuite être confrontés à l’animal. La formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures est également dispensée au personnel extérieur à notre établissement. L’objectif est de former les étudiants à la réglementation et l’éthique en expérimentation animale, au bien-être animal et à l’acquisition des compétences techniques de bases afin de pouvoir les appliquer dans le monde professionnel dans les meilleures conditions possibles en veillant au respect des animaux.

Bénéfices attendus

La formation théorique et technique du personnel est l’un des piliers de la réglementation concernant l’expérimentation animale. Notre établissement forme des techniciens de laboratoires pouvant exercer dans le domaine de l’expérimentation animale. La formation réglementaire destinée aux personnes appliquant les procédures que notre établissement propose depuis presque 20 ans est maintenant intégrée au programme en tout début de cycle de notre nouvelle offre de formation. Cela permet aux étudiants d’être sensibilisés à la réglementation et à l’éthique (et d’obtenir l’attestation de formation) avant toute manipulation sur les animaux. Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale. Cela garantit des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. La formation est donc axée sur deux points essentiels : - l’observation du comportement des animaux pour déceler tout comportement anormal le plus rapidement possible. - l’acquisition de gestes techniques de base : l’approche de l’animal, la préhension, la contention et les techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes Ces séances sur l’animal sont dispensées par des enseignants expérimentés, fortement impliqués dans la pédagogie et particulièrement attentifs au bien-être des animaux.

Procédures

Sur animaux vigiles : préhension, contention, gavage et techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes : injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, à la veine de la queue, dans la veine mandibulaire. Quantification du comportement par différents tests comportementaux. Sur animaux anesthésiés : pose de cathéters, prélèvements carotidien, intracardiaque, au sinus rétro-orbitaire, dans la vessie.

Impact sur les animaux

Les séances d’observation n’induisent aucune nuisance chez l’animal. Les séances avec contention et gestes techniques avant anesthésie impliquent un stress chez l’animal. Ce stress est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur environnement une semaine avant les séances de travaux pratiques, l’apprentissage théorique de la réglementation et de l’éthique ainsi que l’utilisation de vidéos et de modèles inertes au préalable afin de préparer au mieux les étudiants aux manipulations. L’effet indésirable le plus fréquent est l’accident de surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire, particulièrement chez les souris. En premier lieu une réanimation est effectuée par un enseignant, il arrive cependant qu’un ou plusieurs animaux meurent lors de la session. Les procédures de cette saisine sont effectuées au moins depuis 2011. L’expérience des enseignants sur les différents anesthésiques, le suivi de l’anesthésie, la gestion de la douleur, les stratégies de réanimation et les erreurs des étudiants permettent de limiter fortement les accidents.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons qu’il est indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette nouvelle offre de formation sera fortement diminué par rapport au projet d’enseignement précédent. En effet, suite à l’utilisation de vidéos et au recentrage des procédures strictement nécessaires, nous passons de 9 à 6 procédures par rapport à l’ancienne saisine. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux ne concernent désormais que la moitié de la promotion (56 étudiants) contrairement à l’ancienne saisine pour laquelle certaines procédures concernaient l’ensemble de nos étudiants (112). Dans le projet d’enseignement précédent, il y avait 712 souris et 272 rats par an soit 3560 souris et 1360 rats sur 5 ans. Dans ce nouveau projet, nous proposons 224 souris et 84 rats par an soit 1120 souris et 420 rats sur 5 ans. Cela correspond à une réduction de 69 % du nombre de souris et de rats. Par ailleurs, certains lots de souris font l’objet de plusieurs séances de travaux pratiques (les souris de la procédure 1 auront en amont été utilisées pour une séance d’approche de l’animal et une séance de comportement général et seront utilisées en aval pour une séance de dissection). Enfin, il est à noter que certains organes seront prélevés après mise à mort des animaux pour être utilisés dans les travaux pratiques de biologie cellulaire, biochimie et biologie moléculaire.

Raffinement

Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cela garantira des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal. Par ailleurs, un certain nombre de gestes sont réalisés sur animal anesthésié. Une antalgie est également proposée lorsque cela est nécessaire. Enfin, les animaux sont acclimatés une semaine dans l’animalerie avant toute utilisation. Ils sont hébergés, en groupe, en présence de tubes en carton, de buchettes en peuplier pour les rats et de papier kraft pour les souris pour enrichir l’environnement. Une surveillance quotidienne est assurée par l’ensemble du personnel concerné : technicienne, enseignants et enseignants-chercheurs.

Choix des espèces

Le rat sprague Dawley et la souris Swiss sont des animaux très utilisés en recherche. Par ailleurs, ces souches sont intéressantes pour leur faible agressivité permettant un apprentissage plus serein. Les animaux sont des mâles avec un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats. Les animaux ont un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats, pour une meilleure gestion de l’anesthésie.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au modéré, 128 individus étant menés sans réveil. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 intestinal, elles reçoivent par gavage des agonistes et de l'huile après une mise à jeun de douze heures, avant prélèvement sanguin sous anesthésie et mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur cherche à établir le rôle du CD36 intestinal dans l'obésité et présente ce récepteur comme une éventuelle cible thérapeutique. Il affirme le remplacement "impossible" au motif que l'étude met en jeu plusieurs organes.

Objectifs

L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.

Bénéfices attendus

Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.

Procédures

L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, huit dans une procédure menée sous anesthésie de trois heures sans réveil, les autres avec un suivi de 24 heures. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère cérébrale au moyen d'un filament, puis un chélateur de fer ou un placebo est administré à la reperfusion. Le porteur suit une grille de score assortie de points limites, la mise à mort pouvant être décidée à partir d'un score de 9. Il décrit cette phase pilote comme "indispensable" avant un essai préclinique et conclut qu'un remplacement total n'est pas possible.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. La reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi au déficit clinique global. Cette évolution clinique défavorable dénommée « recanalisation futile » concerne 50% des patients. A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Cette étude pilote a pour objectif d’évaluer la faisabilité et la sécurité du mode d’administration d’un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC ischémique. La molécule testée est en cours d’évaluation pré-clinique dans un modèle d’hémorragie cérébrale. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour concevoir correctement de futurs essais cliniques. Le modèle d’ischémie cérébrale transitoire par occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) à l’aide d’un filament chez le rat est largement utilisé en recherche préclinique afin de tester des traitements neuro-protecteurs pouvant diminuer la taille de la zone atteinte du cerveau et par conséquent de limiter les dommages cognitifs et moteurs. Dans cette phase pilote, il s’agit de positionner un traitement original qui vise à limiter les dégâts liés à l’ischémie-reperfusion en chélatant le fer. Pour évaluer la sécurité de la voie d’administration, les objectifs de cette phase pilote chez le rat sont : 1/ évaluer l’innocuité du traitement lors d’une administration intra-artérielle au moment de la recanalisation et sa biodistribution cérébrale en IRM avec une séquence T1 permettant d’évaluer l’effet d’un produit de contraste qui apparaît en blanc sur l’image. 2/ évaluer la possibilité d’administration locale par voie intra-cérébrale lors de la reperfusion pour limiter le développement de l’œdème malin.

Bénéfices attendus

Ce traitement peut être administré soit par voie systémique sous forme soluble, soit délivré localement sous forme d’un gel lors d’une intervention chirurgicale. Le traitement est marqué pour être suivi en IRM avec une séquence T1 permettant d’évaluer sa présence par l’image (un traitement pouvant être détecté par l’imagerie est dénommé théranostic). Ce traitement permettrait de limiter les risques d’hémorragie et de protéger des effets secondaires du stress oxydant et de l’inflammation. L’impact clinique potentiel pourra être un traitement protecteur administré directement dans l’artère traitée après le retrait du caillot en utilisant le guide et le cathéter de la thrombectomie. L’administration intra-cérébrale permettrait de limiter l’extension des lésions dans les cas graves d’œdème malin nécessitant un acte chirurgical.

Procédures

La procédure 1 d’induction d’un AVC ischémique par voie endovasculaire chez le rat (8 animaux) est de classe sans réveil avec une anesthésie d’une durée de 3h suivi d’une mise à mort. La procédure 2 d’induction d’un AVC ischémique par voie endovasculaire chez le rat et d’injection d’un traitement par voie intra-cérébrale avec un suivi à 24h est de classe modérée. La chirurgie d’une durée de 30 minutes réalisée sous analgésie et anesthésie générale. La durée de l’ischémie est de 90 minutes et le traitement ou le placébo sera administré à la reperfusion, d’où une anesthésie totale de 3 heures. Le suivi est limité à 24h post-AVC avec une analgésie en post-chirurgie, une surveillance au réveil et au minimum deux fois au cours des 24h et une évaluation selon les points limites pré-définis.

Impact sur les animaux

Selon la procédure, la durée totale est de 3h ou 24h. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients) ; l’analgésie donnée de manière systématique vise à prévenir la douleur liée à la chirurgie et à d’éventuelles complications rares telles qu’un œdème cérébral malin. La durée de l’ischémie est de 90 minutes et le traitement sera administré à la reperfusion selon les modalités de chaque groupe, d’où une anesthésie totale de 3 heures. Pour la procédure avec suivi de 24h, une seconde injection de sous-cutanée de buprénorphine est réalisée avant le réveil. Nous utilisons une grille de score (en pièce jointe) associée à des points limites pré-définis, afin d’évaluer et de limiter au maximum une éventuelle souffrance liée à ces déficits sensoriels et/ou moteurs. Dans tous les cas, le post-AVC est limité à 24h, et immédiatement suivi de l’euthanasie des animaux.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux devront être mis à mort, par injection d’un produit euthanasiant (sous anesthésie), pour permettre le prélèvement, puis l'analyse, des tissus cérébraux d'intérêt.

Remplacement

Ce projet s’appuie sur des données in vivo déjà publiées. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme. Le nouvel agent thérapeutique que nous allons tester a des propriétés théranostiques, ce qui permet le suivi de sa biodistribution directement par l’imagerie. Une phase pilote est indispensable pour disposer de données préalables à un essai thérapeutique pré-clinique avec la modalité d’injection la plus adaptée. Il n’est pas possible de remplacer totalement mais la phase pilote avec un très petit effectif et l’imagerie in-vivo correspondante permet d’être décisionnel pour l’essai pré-clinique.

Réduction

L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Cette étude pilote sur un nombre réduit d’animaux a pour but de préparer l’essai pré-clinique en s’assurant de la sécurité de la voie d’administration et en garantissant l’optimisation du protocole. Nous avons prévu 18 animaux soit 6 animaux par groupe. Nous avons limité le nombre d’animaux dans la première procédure en supprimant le groupe contrôle (injection intra-artérielle de sérum physiologique) considérant qu’il n’apporterait aucune information dans cette procédure sans réveil puisque seul le traitement peut être détecté en imagerie dans la lésion.

Raffinement

La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Une grille de score (en pièce jointe) associée à des points limites pré-définis, a été mise en place afin d’évaluer et de limiter au maximum une éventuelle souffrance liée à ces déficits sensoriels et/ou moteurs. La grille de score comprend une observation de l’apparence de l’animal (pelage, yeux, poil, nez, toilettage), de l’évolution de son poids, de son état d’hydratation (normal ou pli de peau), de son comportement naturel (normal, modifié de manière mineure ou majeure), de signes cliniques (respiration) et propose un système de cotation détaillé pour chaque catégorie. En cas de score entre 4 et 8, un 2ème avis sera demandé pour observer plus attentivement l’animal et décider l’utilisation d’antalgiques. A partir d’un score de 9, la mise à mort de l’animal pourra être considérée (injection intrapéritonéale d’Euthasol à 140 mg/kg, sous anesthésie isoflurane).

Choix des espèces

L’évaluation de l’innocuité de la voie d’administration d’un nouveau traitement neuroprotecteur nécessite une expérimentation animale. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie, d’administration intra-cérébrale et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Les rats sont de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant du sans réveil au niveau modéré. La microglie de la descendance est altérée in utero, puis les petits subissent une occlusion d'un œil, une imagerie du cortex visuel après incision du cuir chevelu et une perfusion intracardiaque sous anesthésie, les 40 mères étant tuées par dislocation cervicale. Le projet cherche à savoir si la microglie participe à l'établissement de la période critique de plasticité cérébrale. Le porteur renvoie au conditionnel les retombées thérapeutiques, rouvrir un jour la plasticité chez l'adulte, et affirme qu'aucune culture cellulaire ni simulation ne peut remplacer l'enregistrement d'un cerveau intact.

Objectifs

La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.

Procédures

Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: 3 procédures distinctes seront réalisées sur le site demandeur. Les animaux subiront d'abord une occlusion monoculaire (environ 20 min, classe légère). La plasticité induite par cette occlusion sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h, classe modérée) suivie d'une perfusion intracardiqaue (environ 30 min depuis l'analgésie initiale, classe sans réveil). Pour les mères: Aucune intervention ne sera effectuée sur le site demandeur.

Impact sur les animaux

Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: La procédure d'occlusion est rapide (environ 15 minutes, une seule fois) et de classe légère. Néanmoins, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’œil. Pour l’enregistrement par imagerie intrinsèque (environ 2h, une seule fois), la peau au-dessus du crâne sera incisée ce qui peut engendrer une douleur. Pour les mères aucune nuisance particulière n'est attendue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés: Par dislocation cervicale pour les mères ayant servies à altérer l'expression de la microglie in utero ou par perfusion intracardiaque pour les autres.

Remplacement

Des données préliminaires obtenues in vitro par l'équipe partenaire indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir utiliser le test statistique approprié. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 520 le nombre d'animaux total (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui accompagneront les animaux en plus bas âges)

Raffinement

Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à l'occlusion monoculaire, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’œil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local (lidocaïne). Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique (Metacam) pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, pour pallier à la douleur induite par l'incision de la peau au-dessus du crâne, de la lidocaïne sera injectée avant. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité́ des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit à P21, P28, P50 et P100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers P28. - A P21, la période critique commence à s’ouvrir. - A P50, la plasticité est largement réduite - A P100 la période critique est totalement fermée.