Procédures sans réveil

195 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Sous anesthésie, elles subissent un prélèvement de sang dans la veine cave, une mesure du temps de saignement à la queue, puis une lésion thrombotique de la carotide provoquée par un patch de perchlorure de fer, pour étudier l'effet de la carbamylation du collagène sur la thrombose. Le porteur indique que les animaux, anesthésiés puis mis à mort par dislocation cervicale, ne présenteraient aucune douleur. Il affirme qu'aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer le temps de saignement, la thrombose étant un phénomène "complexe, multifactoriel, multicellulaire".

Objectifs

Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, d'ici à 2030, une personne sur six dans le monde aura 60 ans ou plus. Cet allongement de la durée de vie engendre une explosion des maladies chroniques telles que les affections cardiovasculaires. Du point de vue biologique, le vieillissement est le produit de l’accumulation d’un vaste éventail de dommages moléculaires et cellulaires au fil du temps. Au niveau vasculaire, le vieillissement conduit à des modifications des constituants des vaisseaux, dont le collagène. Le collagène voit ses propriétés structurales et fonctionnelles altérées en partie à cause de modifications chimiques appelées réactions de carbamylation. Ces réactions de carbamylation sont également amplifiées lors de l'insuffisance rénale chronique, pathologie conduisant à des complications thrombotiques mais aussi hémorragiques. Ce projet a donc pour but d'étudier les effets de la carbamylation du collagène sur les fonctions des plaquettes sanguines dans l'hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet d'expérimentation animale permettra de déterminer quels sont les impacts de la carbamylation du collagène et/ou des plaquettes sur l'agrégation plaquettaire, l'hémostase et la thrombose artérielle grâce à l'utilisation de modèles animaux parfaitement maîtrisés par le laboratoire porteur du projet et ayant fait l'objet de validations antérieures par le comité d'éthique. En d'autres termes, les résultats de ce projet permettront de déterminer si la carbamylation du collagène, qui survient au cours du vieillissement physiologique et qui est amplifiée lors de l'IRC, constitue un facteur de risque d'évènements cardiovasculaires (thrombose, hémorragie) chez les patients insuffisants rénaux, dont le taux de mortalité dû aux maladies cardiovasculaires chez les personnes dialysées est de 10 à 30 fois plus élevé que dans la population générale. Il permettra également de déterminer si la carbamylation des plaquettes affecte leur capacité à agréger.

Procédures

Pour la première procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à un prélèvement sanguin au niveau de la veine cave inférieure. Pour la deuxième procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une mesure de temps de saignement mesuré au niveau de la queue. Pour la troisième procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une lésion thrombotique par application d'un patch de perchlorure de fer au niveau de l'artère carotide afin de suivre la formation du thrombus en temps réel par vidéo-microscopie intra-vitale. Au préalable, une injection de rhodamine 6G sera réalisée afin de rendre les plaquettes des animaux fluroescentes.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances, effets indésirables, ou critère prévisible de douleur dans la mesure où les animaux seront sous anesthésie générale (100 mg/kg kétamine, 10 mg/kg xylazine) durant les manipulations, puis sacrifiés en fin de protocole (pas de réveil). Par ailleurs, le modèle basé sur l'ajout de cyanate de sodium (jusqu'à 15 mM) dans l'eau de boisson des souris a déjà été validé et utilisé précédemment dans d'autres projets de l'équipe. Les souris recevant ce traitement n'ont jamais montré quelconque signe de souffrance ou effet secondaire.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales à la fin des expérimentations.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d'une étude réalisée ex vivo à partir de plaquettes humaines ayant montré que la carbamylation du collagène augmente l'adhésion des plaquettes en condition statique alors qu'elle la diminue fortement en condition dynamique de cisaillement artériel en lien avec une diminution de la capacité du collagène carbamylé à lier le facteur von Willebrand plasmatique. Ce projet vise donc à valider les effets de la carbamylation dans les processus d'hémostase et/ou de thrombose in vivo chez la souris. La formation de thrombose artérielle est un phénomène complexe, multifactoriel, multicellulaire, qui nécessite l'utilisation de modèles intégrés. Par ailleurs, aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer l'effet d'une substance ou d'une alimentation (ici riche en cyanate de sodium) sur le prolongement du temps de saignement. Enfin, les récepteurs présents à la surface des plaquettes pouvant différer entre l'homme et la souris (exemple des récepteurs à la thrombine PAR1 et PAR4 exprimés chez l'homme et PAR3 et PAR4 exprimés chez la souris), il convient de débuter ce projet par des mesures d'agrégation plaquettaire avant de considérer les études de mesure du temps de saignement et de thrombose artérielle.

Réduction

L’étude considérée dans son intégralité est susceptible de concerner un nombre maximal de 195 souris C57BL/6 mâles, répartis en trois groupes : souris alimentées pendant 12 semaines avec 1 mM NaCl (groupe 1, contrôle), souris alimentées pendant 12 semaines avec 1 mM NaCNO (groupe 2), souris alimentées pendant 8 semaines avec 1 mM NaCNO puis pendant 4 semaines avec 1 mM NaCl (groupe 3). L'arrêt de l'alimentation en cyanate de sodium pendant 4 semaines permet la clairance totale du cyanate et des produits de carbamylation plasmatiques. Ainsi, seules les protéines tissulaires, et notamment vasculaires, restent carbamylées. Dans un premier temps, un nombre limité de 4 souris par condition expérimentale sera considéré pour une étude préliminaire qui permettra de juger de la nécessité de poursuivre l’expérimentation. Cette étude servira également à déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat statistiquement significatif avec un nombre maximal considéré de 10 à 15 souris par condition expérimentale. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sera réalisée grâce au logiciel G-power et l’analyse statistique de la significativité sera réalisée en utilisant le test U de Mann-Whitney dans sa configuration bidirectionnelle

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages de 30 cm x 40 cm à raison de 5 souris par cage au maximum. En cas d'affrontement entre les animaux, le nombre de souris par cage sera réduit en conséquence. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 10 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de l'expérience (jusqu'à la mise à mort), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est la souris (Mus musculus). Il s'agit du modèle de référence pour l'étude du temps de saignement et de la thrombose artérielle et l'évaluation des propriétés anti-thrombotiques de composés. Par ailleurs, l'animalerie est agréée pour l’espèce souris. Des souris mâles seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond au stade adulte (avant 12 mois chez la souris).

54 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est anesthésié pour l'incision de la paroi abdominale, puis mis à mort dans les cinq minutes pour prélever le foie et en isoler les cellules par perfusion. Le porteur présente le foie isolé de rat comme un modèle "alternatif" à l'expérimentation sur animaux vivants, tout en jugeant le recours aux rats "nécessaire" pour identifier des molécules améliorant le rendement cellulaire. Il retient le rat plutôt que la souris parce qu'un foie de rat fournit environ 700 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.

Objectifs

Lorsque des échantillons de foie sont prélevés pour l'isolement des cellules ou pour la greffe, les cellules sont soumises à de nombreux stress dus notamment au manque d'oxygène et à la reperfusion du tissu. Les mécanismes à l'origine de ces lésions ont été mis en évidence dans des modèles de foie isolé perfusé de rat et montrent une atteinte encore plus importante des foies stéatosés. Ces lésions peuvent être réduites en utilisant des antioxydants et des anti-inflammatoires en prétraitement ou dans la solution de préservation du foie. Nous savons que d'importantes modifications du métabolisme ont lieu au cours de l'isolement des cellules du foie, cependant les différentes voies de stress présentes lors de l'ischémie-reperfusion n'ont pas été évaluées dans un contexte d'isolement des cellules. Les objectifs du projet sont d'évaluer l'effet du protocole de référence d'isolement des cellules de rat par perfusion sur le stress cellulaire et le métabolisme des cellules isolées dans un premier temps ; de cribler l'effet d'inhibiteurs de ces voies de stress sur la fonctionnalité des cellules après leur isolement ainsi que sur la résistance des cellules à la congélation ; puis d'évaluer la combinaison des molécules sélectionnées dans le liquide de perfusion. Cette étude servira de base pour proposer un milieu de préservation de foies humains avant isolement des cellules.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de comprendre les mécanismes qui jouent sur la qualité des cellules isolées de foie de rat et de sélectionner un cocktail de molécules candidates pour prétraiter des échantillons de foie humains. La validation du cocktail de préservation des cellules chez le rat permettra de répondre au problème du manque de disponibilité d'échantillons de foie humain tout en réduisant la variabilité des réponses due à la variabilité des échantillons. L'utilisation des molécules identifiées contribuera à améliorer le rendement et la qualité des cellules isolées des échantillons de foie humain et d'animaux pour répondre à la forte demande en cellules de foie humain.

Procédures

Tous les animaux (54) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion et les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Un protocole d'anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l’incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.

Devenir

L'isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l'animal sous anesthésie générale.

Remplacement

Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l'évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’isolement des cellules génère des altérations qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats pour étudier les mécanismes d’altération est donc nécessaire et permettra d’identifier des molécules permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.

Réduction

La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l'équipe et permet d'obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la formation aux gestes techniques (n=6) d'hépatectomie partielle au cours de la perfusion permettront aussi d'évaluer de façon préliminaire l'effet de l'hépatectomie sur l'isolement des cellules. 8 groupes de 6 animaux (n=48) seront utilisés pour réaliser deux cinétiques avec et sans cocktail de molécules ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l'analyse statistique par des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des valeurs tout en prenant en compte le risque d'échec de la perfusion.

Raffinement

L'environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l'étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d'anxiété (absence de prise de poids au cours de l'hébergement, troubles du comportements, signes d'agressions), il est retiré de l'étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d'une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l'anesthésie (mouvement des membres ou de la peau), la procédure est suspendue et un tiers de dose d'anesthésique supplémentaire est administré. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l'administration supplémentaire d'anesthésique, la procédure s'arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Tous les prélèvements, la perfusion du foie et l'administration des molécules sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.

Choix des espèces

L'optimisation des conditions d'isolement des cellules du foie est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Le rat est un modèle classique d’étude du stress cellulaire au cours des lésions dues à l'arrêt de la circulation sanguine puis sa reprise (lésions d'ischémie-reperfusion). Les hépatocytes primaires (cellules principales du foie) de rat, notamment de rat Sprague Dawley, sont un modèle d’étude de référence en pharmacologie préclinique. Les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 700 millions/Rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/Souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaines (180-200g) et utilisés à 6 semaines (200-230g), poids standard d'utilisation pour l'isolement des cellules du foie.

5 730 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une chirurgie puis des mesures de pression artérielle, de fréquence cardiaque et d'électrocardiogramme sous anesthésie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer les effets cardiovasculaires de candidats médicaments avant leur mise sur le marché. Le porteur présente cette évaluation comme un passage "obligatoire" des études réglementaires de pharmacologie de sécurité. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne suffit à étudier les effets d'un composé sur la fonction cardiovasculaire de l'animal entier.

Objectifs

Le projet a pour objectif d'évaluer les potentiels effets secondaires d'un futur médicament sur le système cardiovasculaire chez le rongeur sous anesthésie. En effet, avant la mise sur le marché d'un nouveau médicament, l'évaluation de ses effets hémodynamiques (sur les pressions artérielle/ ventriculaire et la fréquence cardiaque) et électrophysiologiques (sur l'électrocardiogramme) est indispensable. Ce projet est réalisé dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité précliniques réglementaires.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. L'évaluation de potentiels effets secondaires sur le système cardiovasculaire de l'animal est un passage important et obligatoire avant une administration chez l'Homme. Ainsi, ce projet permet de réaliser des études de pharmacologie de sécurité obligatoire et donc, de vérifier si des substances ont des effets secondaires sur les fonctions cardiovasculaires. Ainsi, les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires cardiovasculaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme.

Procédures

La procédure de ce projet décrit différents types d'interventions. Les animaux subiront une chirurgie, sous anesthésie générale, afin de pouvoir faire les mesures des paramètres cardiovasculaires (toujours sous anesthésie). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant cette procédure, sous anesthésie également. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (=procédure sans réveil). La durée totale d'une expérience n'excédera pas 4 heures. Les animaux seront traités avec le futur médicament soit avant la phase de chirugie, soit après.

Impact sur les animaux

La contention de l'animal vigile pour induire l'anesthésie ou administrer le produit peut engendrer un stress mineur à l'animal. Concernant la chirurgie, son protocole est maitrisé et la profondeur de l'anesthésie est suivie tout au long de l'expérience pour éviter toutes douleurs à l'animal (i.e monitoring de l'état de non conscience de l'animal). Dans tous les cas, l’impact négatif pour l’animal sera réduit au maximum depuis l'hébergement jusqu'à la fin de l'expérience.

Devenir

Les procédures décrites dans ce projet sont des procédures sans réveil. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, le cobaye ou la souris car il n'existe pas de méthode de substitution in silico ou in vitro pour étudier les effets d'un candidat médicament sur la fonction cardiovasculaire des animaux. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre à l'intégralité des objectifs scientifiques du projet. Or, avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier (l'animal) constitue un passage obligatoire pour l'évaluation des effets secondaires sur la fonction cardiovasculaire d'un candidat médicament. A ce jour, le rat, le cobaye et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=6-8/groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, dont l'anesthésie qui sera si necessaire associée à un anti-douleur (type morphinique/opiacé) ou anti-inflammatoire (en cas d'instabilité des paramètres cardiovasculaires après chirurgie)• Un monitoring complet de l'anesthésie pour éviter la reprise de conscience • la formation du personnel • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Des conditions d’hébergement (avant expérience) adaptées et optimisées pour améliorer le bien-être animal • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux avant la chirurgie terminale.

Choix des espèces

Le rat, le cobaye et la souris sont les espèces animales couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire, de façon à limiter l'utilisation d'espèces animales plus grandes. Ce projet concerne des animaux adultes. Il n’a pas pour objectif d’étudier les effets d'un produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

60 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune sert à entraîner un doctorant à poser des cathéters dans la veine fémorale et l'artère carotide, lors d'une chirurgie pouvant durer deux heures, non pour produire des connaissances mais pour acquérir un geste technique. Après la mise à mort, les corps pourront resservir à des formations à la dissection. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour s'entraîner à ces poses de cathéters.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de former le doctorant à des techniques de microchirurgies spécifiques nécessaires à ses expérimentations (pose de cathéter chez la souris au niveau de la veine fémorale et de l’artère carotide). Le doctorant porteur de projet (réglementairement compétent Diplôme Universitaire d'Experimentation Animale et Diplôme Universitaire de chirurgie) a déjà expérimenté la microchirurgie (repères anatomique, abord et préparation des vaisseaux cibles) sur une dizaine de souris dans un projet précédemment autorisé mais qui arrive à terme, et nécessite encore de l’entrainement pour valider un modèle de souris anesthésiée avec paramètres vitaux maintenus à valeurs physiologiques (fréquence cardiaque et pression artérielle) pendant 1 heure (durée des expérimentations qui seront réalisées ensuite sur ce modèle dans le laboratoire partenaire).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra au porteur de projet de valider un modèle murin (contrôler l’induction et le maintien de l’anesthésie, pose de cathéters vasculaires qui nécessite de l’entrainement afin d’acquérir les bons gestes de microchirurgie, et maintien des paramètres vitaux sous anesthésie). Ainsi, les expérimentations à réaliser dans le laboratoire partenaire seront sécurisées et de meilleure qualité, nécessitant moins d’animaux et respectant le bien être de ceux qui seront utilisés dans les expérimentations communes

Procédures

une seule procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie, de durée limitée à 2h

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont d'une part le stress de la prehension de l'animal qui sera réduit par une socialisation des animaux, et d'autre part, la, douleurs liées à la chirurgie qui seront réduites grâce à l’utilisation d’un analgésique (buprénorphine). De plus il s’agit d’une procédure sans réveil et tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l’expérience.

Devenir

Comme il s'agit d'un entraînement à la microchirurgie vasculaire, les animaux n'ont pas vocation à être maintenus en vie -après mise à mort, ils pourront être utilisés pour des formations à la dissection

Remplacement

Pas de remplacement possible pour s’entrainer à poser des cathéters vasculaires, nécessires pour la mesure de paramètres cardiovasculaires lors de projets ultérieurs

Réduction

L'utilisation de souris surnuméraires sera privilégiée pour les premiers apprentissages lorsque cela sera possible. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, sur la base de 1 souris par jour pendant 30 jours jusqu’à validation des gestes par l’encadrant du doctorant porteur de projet (pose d’un cathéter artère carotide et un cathéter veine fémoral). Dés que la procédure sera un succès, les paramètres vitaux seront mesurés sous anesthésie pendant 1 h, soit 30 souris maximum. En cas de difficulté, le nombre d'animaux pourra etre étendu à 60 animaux maximum

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir dans des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage dans des cages de 500cm². Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un antalgique sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C par plaque chauffante asservie ; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la longueur et la qualité des cathéters sont adaptées à chaque vaisseau pour ne pas perforer au niveau des bifurcations) ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 2h sous anesthésie (chirurgie + contrôle des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques).

Choix des espèces

C’est ce modèle de souris qui sera utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires prévues dans les projets ultérieurs. Souris adultes acclimatées à leur nouvel environnement (1 semaine après leur arrivée à l’établissement utilisateur)

23 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil, chaque intervention durant de quatre à huit heures. On leur implante des caillots dans les vaisseaux et on y navigue un guide instrumenté, pour tester un dispositif d'analyse des caillots destiné à la thrombectomie de l'AVC. Le porteur indique viser le marquage CE et l'autorisation FDA, soit une finalité commerciale et réglementaire. Il décrit avoir écarté les essais in vitro, ex vivo et in silico et juge le test sur l'animal "essentiel".

Objectifs

Le projet vise à développer et valider pour l’utilisation clinique un dispositif médical, un guide intelligent, qui aidera les médecins dans le traitement des Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) par trombectomie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des patients avec AVC ischémique éligibles à la thrombectomie. Les résultats obtenus sur animaux, en complement d’une étude de recherche clinique, seront directement utilisés pour améliorer la performance de détection du guide vasculaire instrumenté et seront inclus dans le dossier technique réglementaire en vue de l’obtention du marquage CE pour une autorisation de mise sur le marché en Europe, de même pour les USA (FDA).

Procédures

Chaque animal est anesthésié et soumis à une chirurgie sans réveil de 4 à 8 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux sont en lien avec l’intervention chirurgicale : -Anesthésie : nausées et désorientation pendant l’induction, apnée pendant l’intubation, hyperthermie maligne (hypersensibilité aux gaz halogénés d’origine génétique). -Pose de cathéter artériel : saignement, hématome. -Navigation endovasculaire et injection de caillots : vasospasme, occlusion vasculaire, saignements.

Devenir

les animaux sont mis à mort à la fin de l'opération, sans réveil de l'anesthésie. Des prélèvements post mortem sont réalisés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Avant de débuter ce projet, toutes les possibilités de méthodes alternatives ont été étudiées et prises en comptes. Des études in vitro ont permis de confirmer la possibilité de discriminer des thrombi de différentes compositions. Cependant, il est impossible de reproduire au laboratoire des conditions vasculaires physiologiques, notamment vis-à-vis de l’interaction entre le thrombus et la paroi artérielle (friction entre le thrombus et la paroi, interactions cellulaires et moléculaires, contraintes spatiales, flux perturbé autour du caillot). Ces paramètres sont tous susceptibles de modifier la mesure électrique effectuée par le capteur. De plus, des données préliminaires laissent penser que le guide se positionne entre la paroi artérielle et le thrombus, augmentant la complexité de la mesure réalisée par le capteur puisqu’il doit être capable de distinguer les deux signaux provenant des deux tissus, et ce à quelques microns près. Des expériences d’artères cultivées ex vivo ont été réalisées mais ne sont pas satisfaisantes, en particulier vis-à-vis de la physiologie endothéliale. Des analyses in silico ont été réalisées pour simuler la portée des mesures électriques mais sont d’une efficacité limitée pour la prise en compte systémique des interactions biologiques, biochimiques et mécaniques entre la paroi et le caillot. Il est donc essentiel de tester les performances du capteur in situ en vue d’une utilisation efficace chez le patient.

Réduction

Le nombre total d’animaux nécessaires pour cette étude est de 23. Les données in vitro ont permi d'établir le nombre minimal de mesures nécessaires pour une efficacité satisfaisante de classification des caillots avec une approche statistique basée sur des méthodes d’apprentissage machine. L’effectif animal a été réduit au mieux en exploitant plusieurs artères, en augmentant le nombre de caillots implantés par sujet et en testant plusieurs fois les dispositifs avec des médecins différents sur un même animal, sans réveil à l’issue de l’intervention.

Raffinement

Les porcs sont hébergés en groupe social dans de larges box enrichis de jeux à macher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation de quelques jours permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés avant d’être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute la procédure. Des points limite sont établis pour arrêter l'intervention en cas de souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales, le porc est celle dont les paramètres physiologiques cardiovasculaires sont les plus proches de l’Homme : fréquence cardiaque de 90-110 batt/min contre 60-100 chez l’Homme, pression aortique systolique de 90-120 mmHg contre 100-140 chez l’Homme, dimensionnement du système vasculaire comparable. De ce fait, le porc est largement reconnu comme modèle de choix pour toutes les études cardiovasculaires. De plus, la composition du sang de porc est très similaire à celle de l’Homme, permettant des mesures électriques similaires. Les porcs seront utilisés à un poids compris entre 20 et 25 kg. En effet, la taille de leurs carotides sera ainsi proche de celle des artères cérébrales humaines que l'on veut mimer pour l'AVC, soit 2 mm environ.

336 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie au cou, l'induction d'un caillot dans l'artère carotide par électrolyse de la paroi du vaisseau, puis 40 minutes d'imagerie de fluorescence. Le porteur teste si un anticorps ciblant les plaquettes empêche la formation d'un thrombus occlusif, dans la perspective d'un futur essai clinique. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.

Objectifs

Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Un nouvel agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique. Nous avons récemment observé que cet agent entraine une désagrégation d’un thrombus plaquettaire non occlusif. Ce projet vise à déterminer si cet agent est également capable de prévenir la formation d’un thrombus occlusif dans l’artère carotide chez la souris. Cette étude pourrait suggérer qu'un tel agent soit particulièrement efficace pour traiter la thrombose artérielle occlusive et ainsi justifier l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme et pour de nouvelles indications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement l'agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité anti-thrombotique lors d’un essai clinique en prévention d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral). Nous souhaitons poursuivre l’étude de l’effet de cet agent dans le cas cette fois ci de thrombus occlusif plus sévère pour proposer de nouvelles indications. •Dans un deuxième temps si les résultats sont encourageant, une étude clinique pourra être envisagée sur des patients souffrant d’un thrombus occlusif.

Procédures

L’ensemble de la procédure expérimentale est réalisée sous anesthésie générale plus anestésie locale de la peau au moment de l’incision et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : • Une anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale de la peau. • Une injection d’un mélange d’un anticorps anti-fibrine couplé à un fluorochrome d'un marqueur fluorecent des plaquettes • Tonte de la face ventrale du cou et nettoyage de la peau • Induction du thrombus par electrolyse à la paroi externe du vaisseau • Imagerie par macroscopie de fluorescence pendant 40 min

Impact sur les animaux

Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du cou de la souris sera réalisée sous anesthésie générale et anesthésie locale au moment de l’incision de la peau. A l’issu de l’expérience, les animaux anesthésiés seront mis à mort.

Devenir

Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Les groupes expérimentaux seront comparés en utilisant des tests statistiques pertinents permettant d’évaluer le potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humain chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.