Procédures sans réveil
Evaluer le rôle de la protéine TIF2 dans le fonctionnement métabolique du muscle squelettique dans un modèle d’ischémie de l’artère fémorale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
32 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Un garrot placé à la racine d'une patte interrompt la circulation pendant deux heures, suivies de deux heures de reperfusion, pour étudier le rôle métabolique de la protéine TIF2 dans le muscle. Le porteur indique s'attendre à une réaction douloureuse au serrage du garrot, atténuée par un antalgique, et que les tissus sont prélevés avant le réveil des animaux. Il affirme ne disposer d'aucune autre possibilité que la souris pour étudier cette protéine dans un organisme vivant.
Objectifs
Le but de ce projet est d'étudier d'une manière très approfondie le rôle métabolique de la protéine TIF2 (co-régulateur transcriptionnel) dans le fonctionnement du muscle squelettique, stress oxydant et la mort cellulaire. Afin d’analyser les fonctions cellulaires-autonomes de TIF2 dans le muscle squelettique, des souris invalidés d'une manière sélective en TIF2 dans les myofibres des muscles squelettiques sont générés. TIF2 semble liée notamment à certains désordres métaboliques survenant lors d’une diminution du flux sanguin et donc de privation des organes en oxygène, sang et métabolites notamment le muscle squelettique un autre organe majeur du métabolisme mais également lors d’un afflux massif. Pour cela nous mettrons en place un modèle d'ischémie/reperfusion en utilisant la méthode du tourniquet au niveau de l'artère fémorale pour interrompre la circulation artérioveineuse dans la région située en aval et cela pendant 2h suivies de deux heures de reperfusion. Cela entrainera une privation limitée dans le temps du muscle squelettique, en sang et donc en oxygène, suivi d’un apport de sang qui augmente brusquement durant la reperfusion. De manière intéressante, lorsque des souris contrôles sont soumises au stress de l’ischémie/reperfusion, les niveaux de transcrits TIF2 et SRC-3 sont fortement augmentés. Des résultats préliminaires indiquent que les souris invalidées du gène TIF2 sont protégées contre les effets délétères de l’ischémie/reperfusion, cette étude nous permettra d'étudier en détails les voies de signalisation conduisant à ce phénotype de protection.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous analysons dans un modèle d'ischémie/reperfusion les fonctions cellulaires-autonomes d'une protéine TIF2 dans le muscle squelettique. Le bénéfice sera l'accessibilité de ce muscle pour pouvoir transposer les résultats obtenus dans les muscles squelettiques striés des jambes aux muscles striés du cœur avec moins de souffrance pour l'animale et moins de difficulté chirurgicale et plus de bien- être pour l'animale qu'une ischémie myocardique. Ces travaux sont une étape nécessaire dans la compréhension des mécanismes sous-jacents et dans le développement de traitements potentiels de ce type de dysfonctionnements métaboliques qui va améliorer la prise en charge cliniques de l'ischémie myocardiaques.
Procédures
Les animaux subiront une ischémie unilatérale de la patte postérieure droite par la méthode du tourniquet (garrot placé à la racine du membre) pendant 2h suivie d'une reperfusion pendant 2h par desserrement du garrot sous anesthésie générale et l'intervention se terminera par la mise à mort de l’animal pour prélèvement de tissus analysés en extemporané ou congelés pour analyse ultérieure (immuno-histologique RT- PCR …).
Impact sur les animaux
Les animaux seront surveillés tout le temps de la procédure qui se déroulera sous anesthésie gazeuse. On peut s'attendre à une réaction motrice à la stimulation douloureuse d'une patte lors du serrage du garrot mais qui sera estompé par l'utilisation d'un antalgique antinflammatoire avant la procédure.
Devenir
Après la procédure d'ischémie et reperfusion et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus et réaliser des études immunohistopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction d'une protéine dans un organisme vivant et dans le cadre d'atteintes de la fonction du muscle squelettique, le modèle Souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Des analyses de puissance ont permis de définir les effectifs utilisés dans ce projet, afin d'obtenir des conclusions scientifiquement exploitables pour les procédures expérimentales retenues. Pour les analyses histologiques, nous utilisons une seule patte qui a subi l'ischémie et nous analysons la significativité des résultats pour comparer les 3 groupes. Par ailleurs, nous avons déjà utilisé cette approche avec d'autres lignées génétiquement modifiées et avons pu constater que ces effectifs étaient nécessaires et suffisants pour conclure sur les résultats observés.
Raffinement
La procédure expérimentale implique un soin et une surveillance constants des animaux, afin de s'assurer qu'elle n'entraîne pas de souffrance chez les souris. Des points limites spécifiques sont décrits, et suivis avec application pour répondre aux exigences du protocole du bien-être animal de notre institut. Ainsi, nous injectons 30 minutes avant la réalisation de l'ischémie par voie intrapéritonéale un analgésique. L’ensemble de la procédure se déroule sous anesthésie générale avec maintien de la ventilation spontanée au travers d’un masque délivrant un mélange gazeux qui assurera une sédation profonde. Un tapis chauffant permettra aux animaux de maintenir leur température corporelle durant l'anesthésie. Du gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement de la cornée. Par ailleurs, la douleur sera prise en charge au moment de serrer le garrot élastique puis pendant le déroulement du protocole expérimental.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système vasculaire peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin de d'effectuer le modèle d'ischémie/reperfusion sur des fibres musculaires squelettiques bien développé.
Evaluation du travail du cœur par estimation ultrasonore de boucles élasticité déformation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié opérée sans réveil et l'autre moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Quarante-cinq subissent un infarctus provoqué par ligature d'une artère du cœur, suivi de huit à dix semaines de survie, avant une chirurgie finale d'insertion de cathéters sous anesthésie terminale, pour valider une méthode d'imagerie de l'insuffisance cardiaque. Le porteur indique que la thoracotomie peut provoquer infection et douleur, l'infarctus un risque de fibrillation mortelle, et que tous les animaux sont euthanasiés pendant l'anesthésie. Il affirme que le cœur battant ne peut être imité hors d'un "organisme vivant" et présente les résultats comme susceptibles de "révolutionner la pratique clinique".
Objectifs
En 2015, l'insuffisance cardiaque a touché 40 millions de personnes dans le monde. Le risque de décès après le diagnostic est similaire aux cancers les plus agressifs. L'insuffisance cardiaque survient lorsque le cœur ne pompe pas efficacement le sang. Malgré le besoin urgent, il n'existe aucune méthode disponible à l’hôpital pour la détecter avant l'apparition de symptômes aigus. Les principaux effets de l’insuffisance cardiaque sont une modification anormale de l'élasticité et de la déformation du cœur. L’élastographie par onde de cisaillement est une méthode d'échographie développée initialement au laboratoire qui permet d’évaluer l’élasticité. Cependant, le cœur étant un muscle qui se contracte et se relaxe périodiquement, l’altération de son fonctionnement peut survenir à n’importe quel moment du cycle cardiaque. Par conséquent, il est nécessaire de pouvoir mesurer l'élasticité et la déformation tout au long du cycle cardiaque. Lorsqu’on mesure l'élasticité et la déformation du cœur au cours du temps, on obtient une boucle similaire à une boucle pression-volume d’un moteur, qui nous renseigne sur le travail que le cœur fournit. Dans ce projet, nous souhaitons mesurer les boucles élasticité/déformation par ultrasons chez le rat pour évaluer le travail du cœur dans différentes conditions pathologiques et comparer ce nouveau biomarqueur à la méthode de référence qu’est le cathétérisme invasif. Il est crucial de pouvoir valider la méthode sur un système vivant en vue d’une application humaine. Le modèle de cœur de rat a une taille et une complexité suffisante pour permettre cette validation. L’étude s’articule autour de deux procédures : 1) L’imagerie des boucles élasticité/déformation par échographie validé par boucles pression-volume invasives. Des agents pharmacologiques sont injectés pour faire varier ces boucles pour valider notre système. 50 rats sains seront utilisés pour le développement et 40 rats sains seront utilisés dans l'étude des boucles. 2) Un modèle pathologique d’insuffisance cardiaque proche des pathologies humaines est induit en générant un infarctus par ligature d’une coronaire. Un suivi longitudinal des boucles élasticité/déformation sera réalisé sur 90 rats. Des développements complexes dus à la physiologie spécifique du cœur sont à prévoir ce qui implique une durée de 5 ans pour atteindre les objectifs fixés. Il est important de noter que le projet s'inscrit dans la démarche des 3R.
Bénéfices attendus
Malgré le besoin urgent, il n'existe tout simplement aucune méthode disponible à l’hôpital pour détecter suffisamment tôt l’insuffisance cardiaque avant l'apparition de symptômes aigus. Les principaux effets de l’insuffisance cardiaque sont une modification anormale de l'élasticité et de la déformation du cœur. De plus, le cœur étant un muscle qui se contracte et se relaxe périodiquement, l’altération de son fonctionnement peut survenir à n’importe quel moment du cycle cardiaque. Par conséquent, il est nécessaire de pouvoir mesurer l'élasticité et la déformation tout au long du cycle cardiaque pour caractériser l’état du cœur. Dans ce projet, nous souhaitons mesurer les boucles élasticité déformation par ultrasons chez le rat pour évaluer le travail du cœur dans différentes conditions pathologiques. Cette approche pourrait améliorer significativement le diagnostic des patients insuffisants cardiaques ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ces pathologies. De plus, en ayant accès à tous les paramètres définissant l'état du cœur, l'approche pourrait être étendue à plusieurs pathologies cardiaques. Au sein de l’insuffisance cardiaque, les patients atteints de coronaropathie, par exemple, sont classés en cinq catégories différentes décrivant différents ensembles de symptômes. Cependant, le manque de biomarqueurs objectifs rend cette classification très imprécise et entraîne souvent des erreurs de diagnostic altérant les soins et le traitement des patients. L'approche de la boucle pourrait fournir des paramètres objectifs pour le classement des patients. Les boucles ont le potentiel de révolutionner la pratique clinique en proposant pour la première fois un biomarqueur d'imagerie unique pour détecter précocement les insuffisances cardiaques, ainsi qu'en fournissant un biomarqueur pour permettre une évaluation objective des patients atteints de coronaropathie.
Procédures
Un premier groupe de 30 animaux pour la mise au point de la technique chirurgicale et 60 animaux subiront une thoracotomie c'est à dire au cours d'une anesthésie générale , un écartement de deux côtes afin d'intervenir sur le coeur. 45 d’entre eux auront un infarctus. L’opération durera 15 min. Ces animaux auront une réanimation avec des injections régulières d’antalgiques puis un hébergement avec une surveillance régulière en milieu enrichi pendant 8 à 10 semaines. Ce groupe et 90 autres rats auront une opération sous anesthésie générale avec trachéotomie c'est à dire l'introduction d'une canule à l'intérieur de la trachée. Un catheter Millar possèdant des capteurs de pression et de volume sera introduit dans l'artére carotide droite. Un autre catheter sera introduit dans la veine jugulaire gauche pour l'injection ; soit de sérum physiologique , soit d'agents pharmacologiques pendant 20-30 minutes. A la fin de l’opération, tous les animaux seront euthanasiés pendant l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Après la thoracotomie, L’animal peut avoir une infection suite à l’opération chirurgicale ou des douleurs dues à la thoracotomie. Pendant le développement de l’insuffisance cardiaque, il y a un risque de fibrillation cardiaque entrainant la mort, et un risque de fatigue à l’effort due au manque d’oxygénation du corps. Pendant l’étude des boucles de la fonction cardiaque, l’anesthésie peut entrainer l’arrêt du coeur en particulier chez les insuffisants cardiaques.
Devenir
Dans la mesure où l'intervention chirurgicale effectuée est invasive et sans réveil ,tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
Avant d’utiliser les animaux, une grande partie de la mise au point des techniques de mesure de boucle élasticité/déformation sont faites en amont par des modélisations mathématiques et en pratique sur des dispositifs synthétiques (fantômes). Cela permet d’aborder l’expérimentation animale avec des techniques optimisées. Mais la complexité des paramètres étudiés ; volume sanguin et contraction cardiaque qui varient au cours du temps, ne peuvent pas être imités en dehors d’un organisme vivant.
Réduction
Pour réduire un maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’étude, un premier lot mise au point de N=50 rats sera utilisé pour développer la méthode et nous assurer que le système fournira des résultats fiables et reproductibles. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire nous tenons compte de la sensibilité des deux techniques d’études ; Elastographie et mesure pression/volume ainsi que du rendement du modèle physiopathologique que nous allons utiliser. Sur la base de nos expériences antérieures au laboratoire sur certains modèles et avec les données de la littérature, nous avons effectué des tests de puissance pour déterminer le nombre d’animaux de chaque groupe. Les paramètres de la contractilité déterminés à la fois par élastographie et cathétérisme sur le même animal seront comparés par des tests t. L’effet des agents pharmacologiques sera quantifié par la différence des résultats avant, après injection sur le même animal par des tests t pairés.
Raffinement
Les animaux seront reçus au moins une semaine avant la procédure et seront manipulés régulièrement afin de les habituer et éviter le stress le jour de la procédure. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats pour favoriser leurs comportements sociaux dans un environnement enrichi (tunnel en carton et bâton en bois) avec un accès illimité en eau et nourriture. Durant l’opération sous anesthésie générale, la température et les constantes de l’animal (température corporelle, fréquences respiratoire et cardiaque et saturation d’oxygène) seront contrôlés et toute anomalie conduirait à l’arrêt la procédure. En plus de l’anesthésie des antalgiques seront administrés avant et après la chirurgie. Après l’opération, Les animaux seront surveillés très régulièrement. Un barème de quantification de la douleur à partir du comportement et de l’aspect du rat sera utilisé pour estimer la douleur éventuelle de l’animal. En fonction du score établi, des doses supplémentaires d’antalgiques seraient administrés. Dans le cas où les douleurs persisteraient malgré les traitements, les animaux seraient euthanasiés.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, il est crucial de pouvoir valider la méthode d’évaluation du travail du cœur par mesure de courbe élasticité déformation sur un système vivant en vue d’une application clinique humaine. Ceci implique l’accès à un modèle de cœur de taille suffisante et dont la complexité est proche du système humain ce qui est le cas du cœur de rat. Dans toute cette étude, des rats adultes à partir de 4 semaines pour l’induction de l’infarctus du myocarde, puis 15 semaines pour l’étude foncionnelle seront utilisés, afin de s'assurer que l'imagerie sera effectuée sur des coeurs développés. Ils seront systématiquement pesés en début de procédure.
Evaluation de l’efficacité et de l’innocuité de nouvelles technologies de robotique chirurgicale pour la thermoablation percutanée mini-invasive de tumeurs sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
36 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal reçoit sept insertions d'aiguille, quatre dans les poumons et trois dans le foie, suivies de séances de destruction de tissu par la chaleur, pour valider des dispositifs robotisés de thermoablation destinés à l'humain. Le porteur indique que la procédure, sans réveil, dure jusqu'à cinq heures et que les nuisances attendues concernent surtout le stress des phases d'isolement et de préparation. Il affirme que ces dispositifs, déjà testés en laboratoire, doivent être validés sur un animal vivant pour tenir compte des mouvements respiratoires et de la proximité des organes.
Objectifs
D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, à l’origine de 10 millions de décès en 2020. Le choix du traitement du cancer dépend de l'organe cible et du stade d’avancée de la maladie. Par exemple, la transplantation hépatique, la résection chirurgicale ou la destruction percutanée sont les traitements proposés pour un cancer diagnostiqué à un stade peu avancé. La chimioembolisation, la chimiothérapie, les thérapies ciblées, les traitements palliatifs sont proposés dans le cas de cancers plus avancés. La destruction percutanée est envisagée chez les patients ayant des masses tumorales bien définies. Ce traitement peu invasif est une alternative à la chirurgie consistant à introduire une sonde sous repérage scanner afin d’atteindre la tumeur et la détruire par la chaleur (micro-ondes ou radiofréquences). Ce traitement est rapide avec peu de complications reportées. L’insertion de la sonde peut être réalisée manuellement ou à l’aide d’une plateforme robotique. Les objectifs de ce projet sont double: valider de nouvelles technologies de thermoablation, et tester de nouvelles technologies robotisées permettant la réalisation de biopsies et la destruction percutanée mini-invasive de tumeurs. Ces plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs. Elle sera une alternative pour les patients n’ayant pas recours à la transplantation ou aux traitements par chimiothérapie ou radiologie. Des tests in-vitro ont été réalisés afin de s’assurer du bon fonctionnement du robot et/ou du générateur de thermoablation. Néanmoins, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur animaux pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins).
Bénéfices attendus
A l’issu de cette étude, les meilleures combinaisons de conditions seront sélectionnées pour une efficacité optimale des générateurs de thermoablation (puissance et durée d'action). Cette étude permettra également de valider, pour les stations robotisées de positionnement d'aiguilles, le protocole standard et de s’assurer d’avoir une méthode reproductible permettant plusieurs atteintes des cibles, ainsi qu’une évaluation de la sécurité du dispositif.
Procédures
Chaque animal sera impliqué dans une procédure sans réveil après 7 jours d'acclimatation. Les animaux concernés seront isolés la veille de l'intervention en petit groupe de 2 à 3 et mis à jeun ensemble. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqûre intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul). cette étape ne dure que 5 minutes car l'animal est piqué au niveau de la cuisse par une aiguille de 19G reliée à une grande tubulure permettant une injection lente du produit sans contention. Sous anesthésie générale (avec intubation, anesthésie volatile et administration de morphiniques), les animaux auront 7 insertions d'aiguille de thermoablation sous repérage scanner (4 dans les poumons et 3 dans le foie). Des évaluations de zones de thermoablation permettront de valider des générateurs de thermoablation et de standardiser des protocoles en fonction des dispositifs. Des imageries scanners seront réalisées tout au long de la procédure dans un but de repérage anatomique, de vérification de la localisation des aiguilles et de l'efficacité du générateur après thermoablation (zone d'ablation visible au scanner). Les protocoles utilisés (temps et puissance) pour chaque procédure seront déterminés en fonction des caractéristiques du matériel utilisé (fournis par le fabricant), ceux-ci seront compris entre 50 et 150 Watt pour une durée de 2 à 15 minutes pour chaque ablation. La procédure aura une durée de 5h maximum en prenant en compte les possibles contre-temps techniques (30minutes de préparation de l'animal, imageries basales, installation du robot et du générateur, mise en place des aiguilles (n=7), temps de thermoablations, imageries scanner de vérification à chaque positionnement d'aiguille et à chaque ablation).
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale étant sans-réveil, les nuisances ou effets indésirables attendus concernent principalement les périodes d'acclimatation et de préparation. Celles-ci peuvent, en effet, être source de stress, notamment la veille de l'intervention pendant la phase d'isolement en petit groupe (n=2 ou 3) pour la mise à jeun. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqure intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul), cette étape ne dure que 5 minutes (piqure avec une grande tubulure permettant l'injection lente du produit sans contention) mais peut également être source de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale afin d'effectuer des analyses histologiques et immunohistichimiques sur les organes cibles.
Remplacement
Il s’agit d’une étude ayant pour objectif d'évaluer l’efficacité et l’innocuité de nouvelles technologies de thermoablation et de plateformes robotiques chirurgicales pour la pose d'aiguille de thermoablation percutanée. L'ensemble de ces appareils ont été testés in vitro, cependant, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur organismes vivants pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins). Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro. Le modèle porcin, de par sa taille, présente l'avantgae d'avoir des tailles d'organes comparables à l'Homme, ce qui permet de tester directement les appareils dédiés à l'Homme après validation.
Réduction
Pour chaque session (nouvel appareil à tester), 6 animaux seront nécessaires. Cette étude permet de combiner des essais de plateformes robotisées à l'évaluation de générateurs de thermoablation, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux. En effet, un nombre de 6 animaux permet d'obtenir un total de 42 insertions d'aiguille robotisées et zones de thermoablations (4 dans les poumons et 3 dans le foie, ce qui fait 7 insertions par animal; pour 6 animaux: 6 x 7= 42 insertions et thermoablation). Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons ( variation de la puissance et du temps de thermoablation en fonction des générateurs à tester, selon les recommandations du fabriquant). La plupart des analyses de positionnement robotisée dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 6 cochons par session permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale avec utilisation de morphiniques, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal dans les phases de préparation (prémédication, pose de cathéter). Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux durant l'acclimatation, d'une durée d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Lors de celle-ci, des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...).
Choix des espèces
Le porc est devenu l'animal de taille humaine de référence parce qu'il est très proche de l'homme d'un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique). De nombreuses constantes biologiques sont très similaires à l'Humain. Une fratrie habituelle de 10 à 12 animaux fournit un groupe de stabulation et d'expérimentation homogène. Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez le Porc. Ainsi, l'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. Pour des raisons de nursing et de manutention l’animal sera un porc de 40 +/- 5 kg ce qui correspond à un porc de 4 à 6 mois.
Trouble neuroendocrine dans l’encéphalite murine à anticorps anti-RNMDA, interactions tPA/RNMDA et implications du tPA dans les barrières cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant du sans réveil au niveau de souffrance sévère. Elles subissent des injections dans les ventricules du cerveau, une immunisation reproduisant une encéphalite auto-immune, des tests comportementaux et des séjours en cage métabolique isolée, avant une mise à mort par ouverture du thorax et perfusion du cœur. Le porteur indique que l'immunisation provoque une perte de poids allant jusqu'à 12 %, de l'anxiété et des troubles de la mémoire. Il écrit ne pas pouvoir "souscrire au principe de remplacement" et juge "nécessaire d'utiliser des animaux" pour tester ces paramètres.
Objectifs
Nos données préliminaires montrent des troubles de la prise alimentaire dans notre modèle murin d'encéphalite. En effet les souris développent un comportement anorexique en comparaison de leur contrôle sham, seulement l'origine de ce comportement est inconnu au sein de cette pathologie. Aussi nous avons pu montrer la présence en grande quantité de tPA (tissue Plasminogen Activator), dans les épendymocytes et dans les neurones du noyau arcqué, en moindre quantité dans les tanycytes. Ainsi nous désirons déterminer les rôles du tPA au niveau des échanges et des flux entre LCR et parenchyme cérébral, mais aussi dans la plasticité de la barrière épendymaire et tanycytaire situées dans la région médiobasale de l'hypothalamus, où il existe un carrefour de signaux métaboliques impliqués dans le comportement alimentaire et la reproduction. De plus la mise en évidence du récepteur NMDA à la surface des tanycytes suggère une implication dans la plasticité de la barrière hémato-épendymaire, par l'interaction du tPA et du récepteur NMDA. Enfin, il existe chez l'homme d'autres troubles neuro-endocrines associés à cette pathologie. L'étude du sommeil et des variations de la température corporelle dans notre modèle nous permettrons d'établir des liens avec la pathologie chez l'homme et ainsi de permettre une étude de ces troubles visant à leur compréhension et à une meilleure prise en charge thérapeutique.
Bénéfices attendus
En premier lieu, en tant que bénéfice à long terme, nous pensons d'après nos résultats préliminaires, que le récepteur NMDA tanycytaire pourrait avoir un rôle similaire à celui des récepteurs NMDA que l'on trouve sur les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins cérébraux. En effet, ceux-ci possèdent un rôle dans la plasticité de la barrière hémato-encéphalique, l'interaction entre le tPA (tissue Plasminogen Activator) et le récepteur NMDA entraine une ouverture de la barrière. Ainsi la modification de la barrière tanycytaire sous l'influence du récepteur NMDA et du tPA, constituerai une nouvelle cible de traitement thérapeutique des pathologie liés aux troubles de de la prise alimentaire, en vue des résultats observés lors de l'analyse du métabolisme du modèle murin d'encéphalite anti-récepteur NMDA. En effet l’utilisation de l’anticorps Glunomab (en cours de développement pour une utilisation chez l’homme), permettrai d’empêcher cette interaction en tPA et récepteur NMDA. Secondement, à court terme nous pourrons déterminer les bénéfices liés à la présence du tPA épendymocytaire. C’est un évènement nouvellement mis en évidence, nous n’avons alors, aucunes informations quant à son rôle dans ce type cellulaire. Ainsi nous pourrons mettre en évidence de nouvelles fonctions de cette protéase, qui pourrait être lié à la motilité des cils des épendymocytes, et donc aux flux de LCR dans les ventricules et le parenchyme, à la recapture d’ions et autres molécules présents dans le LCR favorisant la clairance de celui-ci, enfin il peut aussi interagir avec d’autres cellules bordants les ventricules mais aussi dans les espaces du parenchyme en bordure des zones perméable des ventricules cérébraux (e.g. murs latéraux du 3e ventricule).
Procédures
1. Injection intraventriculaire de molécules fluorescentes, de MPIO ou Gadolinium (traceur IRM), et des AAV (30 minutes, n=390) 2. Immunisation active avec ou sans peptide GluN1 359-378 (15 minutes, n=220) 3. Tests comportementaux (de 5 à 30 minutes, n=150) 4. Cages métaboliques (6 jours à 3 semaines, n=160) 5. Injection dans la cisterna magna de Dextran fluorescents (15 minutes, n=90) 6. Pose d'un cathéter intraveineux pour injection de molécules fluorescentes (30 minutes n=90) 7. Mise à mort par thoracotomie et perfusion intracardiaque (10 minutes, n=220) 8. Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (1 heure ou 20 minutes, n=90) 9. Mesure du sommeil par système piezoeclectric (15 jours, n=30) 10. Implantation sous cutanée d'un capteur de température corporelle (30 minutes, n=30).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirable sont à prévoir sur les animaux : Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (incision, perforation) seront empêchées par l’utilisation de la lidocaïne en spray 10 minutes avant le geste (procédure 1, 2, 5, 6, 7, 10). Ces douleurs seront temporaires et se résorbe sous 48h. Aussi, pour diminuer la douleur en post-opératoire, les animaux auront, accès à une eau dans lequel a été dilué le paracétamol durant 24h à raison de 300mg/kg (procédure 1,5,6,10). Pour les procédures pour lesquels la douleur est plus importante, nous utiliserons la buprénorphine en injection sous cutanée, à raison de 150ul avec une concentration de 0.5mg/kg, sous forme d’une injection unique. Nous observons une perte de poids 24h après immunisation (procédure 2) jusqu'à 12% de leur poids total, mais retrouve un poids d’origine 48 à 72h après immunisation. De plus, deux semaines après immunisation, des comportements anormaux apparaissent chez les animaux. Ils développent une anxiété, une résilience et des troubles mnésiques. Ces troubles deviennent plus légers 3 semaines après immunisation et inexistant 4 semaines après immunisation (procédure 2). Les procédures 3, 4 et 9 sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, due soit à un nouvel environnement (procédure 3) soit à l’isolement social (procédure 4 et 9). Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation. Toutes les procédures sont effectuées sous anesthésie générale grâce à l’Isoflurane 1% N2O/O2 (80%/20%), aucune souris ne sera vigile lors des procédures.
Devenir
A la suite des procédures 1, 2, 3, 4, 9, 10, les animaux sont maintenus en vie. La procédure 7 est la procédure d'euthanasie, les procédures 5 et 6 sont de classes sans réveil.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. Que ce soit pour les effets de l'immunisation ou bien encore du comportement, il est important de pouvoir tester ces paramètres chez l'animal. De plus, cette étude utilisant des animaux se base sur une bibliographie pertinente rendant cette étude sérieuse et fondée sur des bases déjà établies. Egalement, le système immunitaire est bien connu chez la souris. Il existe notamment d'autres modèles de maladie auto-immunes touchant le système nerveux central tel que l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) mimant une sclérose en plaque. Ce modèle est bien connu et décris dans la littérature scientifique ce qui en fait un modèle pertinent et sérieux au regard de notre travail. Néanmoins, il y a des paramètres que nous devons étudier et qui n'ont pas fait l'objet de publication dans le monde scientifique, notamment le métabolisme des animaux suite à l'immunisation.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 490 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l'activité in vivo des flux cérébrales permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous une couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux, l'enrichissement de leur environement avec maison et matériel de nidification. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été étudiée dans le modèle d'encéphalite à anticorps anti récepteur NMDA par immunisation active (Wagnon et al., 2020). L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le métabolisme. Aussi L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connus et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques tPA WT, tPA Null, de GluN1 Flox +/+ et -/-. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Les animaux seront utilisés au stade jeunes adultes. En effet c'est à ce stade du développement que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature pour des modèles de pathologie auto-immune. En effet le modèle spécifiquement utilisé a été développé chez des animaux de 8 semaines (Wagnon et al., 2020). De plus, l'encéphalite à anti-récepteur NMDA concerne majoritairement chez l'Homme une population de jeunes adultes, rendant le développement de la pathologie et la symptomologie plus approrié pour une étude translationnelle.
Formation pratique à l’endoscopie interventionnelle digestive sur modèle porcin
- Formation professionnelle
90 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit jusqu'à onze interventions d'endoscopie digestive, dix dissections sous-muqueuse et une gastroentéroanastomose, au cours d'une anesthésie d'environ sept heures, pour entraîner des médecins gastroentérologues déjà en exercice. Le porteur indique que le réveil et le maintien en vie seraient accompagnés de douleur et d'inconfort digestif, ce qui motive la mise à mort en fin de séance. Il affirme qu'il est "indispensable" de pratiquer ces techniques sur un animal vivant, les simulateurs ne reproduisant ni les mouvements respiratoires ni les complications opératoires.
Objectifs
L’endoscopie a initialement été utilisée pour le diagnostique (endoscopie de niveau 1), et s’est développée pour réaliser de nombreux actes thérapeutiques (endoscopie interventionnelle de niveau 2 ou 3). Elle permet l’utilisation d’un abord naturel, par conséquent mini-invasif pour traiter des pathologies graves avec le moins de morbidité possible. Parmi les pathologies concernées, nous pouvons citer le cancer colorectal responsable de 18000 morts par an pour lequel un dépistage de masse est organisé afin de découvrir des lésions précancéreuses, les polypes. La dissection sous muqueuse est l’une des techniques qui permet de retirer les polypes, en un seul fragment, permettant ainsi d’éviter une prise en charge chirurgicale plus morbide. Cette technique permet les traitements de cancer du colon mais également de l’estomac, de l’œsophage et du rectum correspondant ainsi à un nombre de patient important. La seconde pathologie cancéreuse en augmentation constante dans le monde et en France est le cancer du pancréas. La survie des patients est inférieure à 10% à 5 ans. Dans certains cas ce cancer comprime le duodénum empêchant l’alimentation de patient en situation de soin palliatif. La technique de gastroentéroanastomose sous échoendoscopie permet de créer en voie de dérivation pour permettre le passage de l’alimentation. Cette technique est plus délicate que la pose de prothèse duodénale mais permet une perméabilité de la prothèse plus importante et ainsi une réalimentation et une qualité de vie amélioré de ces patients palliatifs. Outre son utilité dans le cancer du pancréas cette technique peut être utile dans les sténoses duodénales tumorales, ou pour la réalisation de By pass endoscopique. L’évolution constante des techniques et leur diversité croissante, impose une formation adaptée afin de pouvoir réaliser ces gestes en sécurité chez le patient. L’objectif de ce projet est de réaliser des formations pratiques pour les médecins gastroentérologues dans ces deux techniques :la dissection sous muqueuse et la technique de gastroentéroanastomose. La société européenne d’endoscopie gastrointestinal recommande ou impose la formation à ces techniques sur simulateurs et modèles animaux avant d’être pratiquées chez l’homme afin d’éviter tout risque de complications chirurgicales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les praticiens gastro-entérologues à des gestes techniques complexes de l’endoscopie digestive interventionnelle qui nécessitent un entrainement régulier. Les bénéfices seront importants pour la sécurité des patients qu’ils auront à traiter par la suite.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. Deux types d'intervention seront réalisées: la dissection sous muqueuse et la gastroentéroanstomose sous échoendoscopie. Il y aura au maximum 11 interventions par animal (10 dissections sous muqueuse et 1 gastroentéroanastomose). A la fin des différentes interventions, l'animal sera maintenu sous anesthésie générale et mis à mort . Le temps d'anesthésie sera d'environ 7 heures pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sur l'animal au cours de la procédure peuvent etre le stress avant l'anesthésie de l'animal, et les risques d'hémoragie en cours d'intervention (qui seront traitées rapidement). La procédure est entièrement réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie.
Devenir
Les 90 porcs du projet (sur 5 ans) seront mis à mort à la fin de la procédure car de nombreux actes sont réalisés sur le même animal (10 prélèvement lors des dissections sous muqueuse et 1 gastroentéroanastomose) et le réveil et le maintien en vie de l'animal seraient accompagnés de douleur et d'inconfort digestif pour l'animal.
Remplacement
Des formations pratiques sur simulateur existent pour s'entrainer à des gestes simples d'endoscopie et de manipulation des endoscopes. Cependant , elle ne permet pas de mimer les mouvements respiratoires et les complications opératoires. C’est pourquoi il est indispensable de pratiquer ces deux techniques (dissection sous muqueuse et gastroentéroanastomose sous échoendoscopie) sur modèle animal avant de passer sur l’homme. La formation sur animal vivant est essentielle pour acquérir la maitrise des nouvelles techniques dans des conditions proches de celles observées chez l’homme avec gestion des mouvements respiratoires, prise en charge des hémorragies et gestion des perforations. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter ces éléments.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs actes seront réalisés sur le même animal. Un maximum de 10 dissections sous muqueuse et une seule gastroentéroanastomose (pour des raisons anatomique) seront réalisés sur chaque animal.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. Dans le cas des formations régionales ,ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. Le personnel animalier observera deux fois par jour les animaux (comportements, apétit) afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale (AG) et sous antalgiques.
Choix des espèces
Le porc est l’animal choisi en raison de la proximité anatomique du tractus digestif avec celui de l’homme et d’une composition similaire des muqueuses et sous muqueuse permettant la réalisation de la technique. Pour ces raisons la technique de dissections sous muqueuse peut être réalisée de manière identique à la technique chez l’homme sans matériel spécifique à l’espèce. Les animaux auront un poids entre 40 kg et 50 kg maximum, afin que la taille de l'oesophage et de l'estomac soit le plus comparable à ceux de l'homme et quele matériel endoscopique humain soit de longueur correcte.
Apprentissage de techniques chirurgicales : asepsie, laparotomie et ovariectomie
- Formation professionnelle
440 lapines vont être utilisées, opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. Chaque étudiant vétérinaire de quatrième année pratique l'ablation d'un ovaire par laparotomie, une intervention de deux à quatre heures, non pour soigner l'animal mais pour s'entraîner au geste. Le porteur précise que ces lapines sont des animaux de production destinés à la réforme et que la durée de l'opération, très supérieure à la normale, ainsi que les erreurs d'asepsie liées à l'inexpérience motivent leur euthanasie en fin d'intervention. Il décrit un projet de simulateur en 3D "en cours d'élaboration" qui remplacerait les lapines s'il aboutit sous cinq ans, tout en jugeant les mannequins actuels insuffisants.
Objectifs
L'objectif du projet est de former les étudiants vétérinaires en 4ème année à des gestes chirurgicaux qu'ils auront à réaliser couramment dans la suite de leur cursus (rotations cliniques) et au cours de leur vie professionnelle future. L'apprentissage du comportement à adopter dans un bloc chirurgical et des bonnes pratiques en matière de chirurgie sont des compétences attendues dans le référentiel des études vétérinaires.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu est l'acquisition pratique, par les étudiants vétérinaires, de compétences chirurgicales basiques, qu'ils pourront mettre à profit dans la suite de leur cursus, lorsqu'ils auront à réaliser des ovariectomies sur des lapins ou des carnivores domestiques appartenant à des clients, et lors de leur vie professionnelle future.
Procédures
Injections sur animaux vigiles pour les anesthésier : prémédication : 1 injection sous-cutanée de xylazine (5 mg/kg), induction : 1 injection intramusculaire (muscles lombaires) d'un mélange acépromazine (0,75 mg/kg) /kétamine (35 mg/kg), durée : 10 à 15 secondes par injection. Intervention chirurgicale sur animaux anesthésiés : laparotomie + ovariectomie, durée : 2 à 4 heures. Injections sur animaux anesthésiés : injection éventuelle d'une demi-dose supplémentaire d'anesthésiques (acépromazine/kétamine) par voie intramusculaire (muscle triceps), durée : 3 à 5 secondes ; injection létale de pentobarbital sodique (152 mg/kg) par voie intraveineuse (veine auriculaire) à la fin de l'intervention chirurgicale, durée : 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale, avec contrôle de l'analgésie et, en fin d'intervention, les animaux seront euthanasiés, sans être réveillés. En outre, à tout moment, les encadrants pourront intervenir pour corriger d'éventuels incidents per-opératoires graves (Ex : hémorragie massive). Par conséquent, aucune nuisance majeure n'est attendue.
Devenir
Les animaux utilisés seront des lapines de production, initialement destinées à être réformées, donc sacrifiées. En outre, la durée de l'intervention chirurgicale sera très supérieure à la normale et des erreurs d'asepsie pourront être commises du fait de l'inexpérience et du manque de dextérité des étudiants (comparée à celle d'un chirurgien confirmé), ce qui engendre des risques de complications post-opératoires. La combinaison de ces éléments motive l'euthanasie des animaux sous anesthèsie générale, en fin d'intervention chirurgicale.
Remplacement
Les modèles de simulation actuellement disponibles sur le marché (mannequins reproduisant une portion d'abdomen de chat) ne permettent pas d'obtenir un niveau de réalisme suffisant pour préparer les étudiants aux conditions de pratique "de terrain". L'idéal serait de disposer de modèles qui, au-delà de reproduire uniquement l'anatomie de la cavité abdominale, simuleraient les mouvements respiratoires et des différents organes abdominaux (notamment intestins et vessie) et pourraient également être évolutifs, de manière à pouvoir placer les érudiants dans des situations potentiellement délicates (saignements, patiente obèse, utérus pathologique ...). Un projet visant à concevoir ce type de modèles et impliquant notre établissement et des professionnels de l'animation en 3D est en cours d'élaboration. Si ce projet abouti dans un délai inféreur à 5 ans, nous abandonnerons l'utilisation de lapines au profit des modèles alternatifs ainsi mis au point.
Réduction
Le nombre de lapines nécessaire a été calculé de manière à permettre à chaque étudiant de 4ème année (176 étudiants/promotion en moyenne sur 5 ans) de réaliser l'ablation d'un seul ovaire, ce qui est le minimum pour l'apprentissage de l'ovariectomie.
Raffinement
Au cours de leur cursus universitaire, les étudiants auront préalablement (en 3ème année) participé à une séance de TP portant sur le maniement des instruments chirurgicaux et la réalisation de l’hémostase (manipulation du bistouri électrique), de sutures et de ligatures sur des pieds de porc et de la peau artificielle. Le jour de la séance, avant d'intervenir sur les animaux, ils regarderont un film, commenté en direct par les encadrants, leur présentant les gestes chirurgicaux qu'ils auront à réaliser. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale (prémédication à la xylazine (5 mg/kg), injectée par voie sous-cutanée, puis, 20 minutes plus tard, induction grâce à un mélange acépromazine (0,75 mg/kg) /kétamine (35 mg/kg), injecté par voie intramusculaire) Tout au long de l'anesthésie, le degré de narcose, d'analgésie et de myorelaxation sera évalué par les enseignants chercheurs encadrant le TP, grâce à la mesure des fréquences cardiaque et respiratoire, de l'évaluation du tonus musculaire, de l'observation des globes oculaires (position, diamètre de la pupille) et du réflexe palpébral. Toute diminution de la profondeur de l'anesthésie sera corrigée par l'injection immédiate d'une demi-dose supplémentaire d'anesthésiques par voie intramusculaire.
Choix des espèces
Avec l'augmentation du nombre de nouveaux animaux de compagnie (NAC), les vétérinaires sont de plus en plus amenés à pratiquer des ovariectomies chez des lapines. Par ailleurs, étant donné que le format du lapin est proche de celui du chat, il constitue également un bon modèle pour l'apprentissage de l'ovariectomie chez la chatte. Par ailleurs, son caractère doux et ses caractéristiques anatomiques (peu de graisse en général) facilitent respectivement les manipulations pré-opératoires et la réalisation de l'intervention chirurgicale par les étudiants. Enfin, même si la lapine n'est pas le modèle idéal pour aborder l'ovariectomie de la chienne, si la configurationanatomiques, les procédures et les gestes sont bien compris, les étudiants disposeront des premières bases sur lesquelles s’appuyer pour appréhender l’intervention sur dans cette espèce. Les femelles doivent avoir atteint la maturité sexuelle. L’âge peut varier d’un lot à l’autre, en fonction des disponibilités du fournisseur. Toutefois, les animaux étant euthanasiés en fin de procédure, il a été précisé au fournisseur que l'utilisation de lapines de réforme devait être privilégiée.
Evaluation d’une nouvelle solution de préservation myocardique ex-vivo en condition de préservation hypothermique statique et dynamique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
11 porcelets vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une intervention de trente minutes pour prélever le bloc cœur-poumon, dont le cœur servira à tester une nouvelle solution de préservation d'organe destinée à la transplantation cardiaque humaine. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucun modèle alternatif" à l'animal pour étudier le métabolisme du myocarde et que "seul un modèle sur le gros animal" permet d'extrapoler à l'homme. Il indique avoir écarté la transplantation in vivo, qui aurait doublé le nombre d'animaux.
Objectifs
La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l’insuffisance cardiaque avancée réfractaire au traitement pharmacologique. Durant le prélèvement cardiaque sur donneur, la préservation de l’organe est réalisée par immersion de ce dernier dans une solution de préservation à 4°C, afin de diminuer significativement son métabolisme et permettre ainsi de limiter son altération liée à l’absence d’oxygène pendant son transport vers le centre de transplantation. Plusieurs types de solution de préservation d’organe ont été développés depuis les années 1980. Leur principes communs reposent sur leur capacité à préserver en hypothermie le cœur pendant une durée maximale de 4 heure, une fois l’organe immergé dedans. La préservation du cœur est alors assurée par son arrêt total (réduisant alors de manière importante le métabolisme cardiaque) ainsi que grâce à des agents anti-œdémateux et antioxydant qui permettent de limiter l’altération de l’organe lors de sa préservation. L’objectif de cette étude est d’établir l’efficacité et la sureté d’utilisation d'une nouvelle solution de préservation d’organe extracellulaire. Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif au modèle animal pour étudier le métabolisme myocardique en condition physiologique. Ce métabolisme ne peut actuellement pas être étudié par simulation numérique ni à partir d’un modèle mathématique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait, de démontrer que la préservation myocardique avec cette nouvelle solution de préservation est effective et de comparer cette solution à une autre solution couramment utilisée . Il s'agit de déterminer si cette solution permettent ou non d'améliorer la qualité de la préservation par rapport à la solution déjà connue, afin d'améliorer les performances hémodynamiques et métaboliques du greffon cardiaque une fois transplanté.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 30 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant au prélèvement du bloc coeur-poumon à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La seule nuisance sera l'injection intra musculaire permettant d’obtenir une sédation vigile et une tranquiliation avant de réaliser l'anesthésie générale.
Devenir
La finalité de l'étude est d'évaluer la fonction et les lésions du greffon cardiaque après perfusion hypothermique à l'aide d'un nouveau soluté de préservation. Il n'existe pas d'autre modèle pour étudier ce système de conservation. L'ensemble des procédures impliquent l'explantation du coeur ce qui rend la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux inenvisageable.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif au modèle animal pour étudier le métabolisme myocardique en condition physiologique. Ce métabolisme ne peut actuellement pas être étudié par simulation numérique ni à partir d’un modèle mathématique. De même, la perfusion d’organe ex vivo repose sur l’utilisation d’un organe et non d’un tissu ou d’une culture cellulaire (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un cœur prélevé sur un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan physiologique et métabolique.
Réduction
La fonction contractile du greffon cardiaque sera évaluée sur une machine de perfusion ex vivo après la phase de préservation hypothermique; nous privilégions cette approche d'évaluation fonctionnelle sur organe isolé plutôt qu'une transplantation in vivo qui nécessiterait d'inclure le double du nombre d'animaux (1 animal donneur et 1 animal receveur pour chaque expérimentation) d'autant plus que la transplantation cardiaque sur le porc est une technique chirurgicale difficile qui exposerait à un haut risque d'échec de la procédure sans que nous puissions atteindre notre objectif d'évaluation de la fonction cardiaque. Le nombre d’animaux par groupe est fixé à 3 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Au total 9 animaux seront utilisés pour cette étude afin de mettre en évidence une différence significative entre les groupes.
Raffinement
Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au minimum pour chaque animal - Privilégier les ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de monitoring hémodynamique: moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit
Choix des espèces
Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif au modèle animal pour étudier le métabolisme myocardique en condition physiologique. Ce métabolisme ne peut actuellement pas être étudié par simulation numérique ni à partir d’un modèle mathématique. De même, la perfusion d’organe ex vivo repose sur l’utilisation d’un organe et non d’un tissu ou d’une culture cellulaire (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un cœur prélevé sur un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan physiologique et métabolique. Les animaux utilisés dans chaque protocole expérimental sont des porcelets de 30 à 40 kg. A ce stade de développement les porcs ont un système circulatoire très proche de l’homme et leur gabarit permet une modélisation chirurgicale optimale pour l’implantation du cœur sur machine de perfusion ex vivo. Par ailleurs l’analyse métabolique du greffon cardiaque nécessite des prélèvements plasmatiques et tissulaires d’un volume minimum de 400 microlitres et d’un poids minimum de 35 mg respectivement pour chaque spécimen, sachant que ces prélèvements seront répétés pendant les 4 heures de perfusion ex vivo (toutes les heures pour les échantillons plasmatiques et pour les biopsies myocardiques). En conséquence, seul un modèle expérimental sur le gros animal peut permettre de satisfaire à ces contraintes répétées de volume et de poids des prélèvements biologiques destinées à l’analyse du métabolisme.
Travaux pratiques pour des sessions de formations en expérimentation animale sur modèle rongeur.
- Formation professionnelle
Rats : 1785
3 235 rats et souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil et de gravité légère. Ils servent de supports d'apprentissage à des stagiaires qui s'exercent aux prélèvements, à la pose de cathéters dans la carotide et la jugulaire, à l'intubation, à la trachéotomie et à la neurochirurgie, non pour produire des connaissances mais pour valider une qualification réglementaire. Le porteur reconnaît un stress accru lié à la manipulation par des apprenants et à leur maîtrise imparfaite des gestes. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable", tout en remplaçant certaines sutures par de la peau de cochon et des rats factices.
Objectifs
Ces travaux pratiques sont réalisés dans le cadre de formations dispensées par le CNRS dans le but d'acquérir une qualification rendue obligatoire par la règlementation européenne dans l'exercice de ses fonctions.
Bénéfices attendus
acquérir une qualification rendue obligatoire par la règlementation européenne dans l'exercice de ses fonctions.
Procédures
Prélèvements et injections 14 rats et 20 souris par session 3h. Implantation d'un système de télémétrie 6 rats par session 3h. Implantation de cathéters dans la carotide et la jugulaire 6 rats par session 3h. Réalisation d'une intubation et d'une trachéotomie 5 rats par session 3h. Bonnes pratiques en neurochirurgie 6 rats par session 4h. Implantation de canules intracérébrales chirurgie générale chez la souris 10 souris par session 3h.
Impact sur les animaux
stress à cause du nombre de stagiaires. mauvaise maitrise de la contention, injections, prélèvement car apprentissage. stress de l'introduction de la canule pour le gavage limitée par sedatif
Devenir
Mise à mort
Remplacement
Cette série de travaux pratiques a un double objectif: faire prendre conscience aux stagiaires des contraintes liées à l’expérimentation animale en leur inculquant de bonnes pratiques respectueuses de l’animal mais aussi mettre en œuvre diverses méthodes d’investigation qu’ils n’avaient jusqu’alors peut-être jamais abordées. Le recours à l’animal en conditions in vivo est indispensable pour atteindre ces objectifs. Bien que ce recours ne puisse être évité, le principe de remplacement est utilisé pour les techniques de sutures qui sont réalisées sur de la peau de cochon et l’utilisation de rats KOKEN.
Réduction
Le nombre de rongeurs utilisés est calculé au plus juste : nécessité d’un animal pour l’intervenant à chaque TP pour la démonstration de l’intervention ainsi qu’un animal par binôme/trinôme de stagiaires pour l’apprentissage.
Raffinement
Afin de minimiser l’angoisse de certains animaux dus au contexte d’une activité de formation (nombreuses personnes présentes), ceux-ci sont familiarisés à la manipulation par un technicien avant le déroulement du TP. Ils sont isolés dans une pièce annexe et sont amenés dans la salle de TP au fur et à mesure des besoins. Afin de réduire la douleur lors des actes chirurgicaux, des injections de solution de lidocaïne sont administrées sur les trajets des incisions avant ouverture.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ces TP, le choix du rat et de la souris est justifié pour étudier les espèces les plus couramment utilisées en laboratoire. Le but étant que les stagiaires puissent reproduire les différentes méthodes acquises en formation dans leur laboratoire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces TP sont: • des rats mâles et femelles d'un poids d'environ 300-400 g • des souris mâles et femelles d'un poids d'environ 20-30 g. Le poids de ces animaux est encore limité ce qui rend la manipulation et l’anesthésie plus simples à mettre en œuvre pour les stagiaires.
Contrôle des déficits de la transmission somato-sensorielle par les interneurones spinaux dans un contexte de pathologie autistique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil pour 540 d’entre elles et léger pour 50, la plupart tuées et une partie réutilisée dans d’autres projets. Les 50 souris des tests de comportement subissent un test du ruban adhésif et une mesure du sursaut acoustique, tandis que les 540 autres sont tuées par perfusion du cœur pour prélever leur moelle épinière, afin d’étudier le filtrage des informations tactiles dans un modèle d’autisme. Le porteur emploie un modèle de souris porteuses de la mutation du X fragile étudiées à trois âges. Il affirme que ni la modélisation informatique ni les neurones issus de cellules souches ne reproduisent la complexité du réseau spinal.
Objectifs
Les troubles du spectre de l'Autisme (TSA) sont des troubles du développement neurologique affectant environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans le développement de ce trouble complexe. Les TSA se caractérisent par des troubles de la communication et de l'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes touchées par ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimulations sensorielless, et notament aux stimulations tactiles. Cette sensibilité anormale peut avoir des conséquences dévastatrices sur la vie quotidienne des personnes atteintes de TSA (par exemple, incapacité à porter certains vêtements) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe pas de traitement pharmacologique ciblé pour améliorer la vie des personnes atteintes de TSA. L'objectif de notre projet est d'améliorer notre compréhension du traitement des informations tactiles dans un modèle murin de TSA. Des travaux récents ont démontré qu'une manipulation directe des neurones sensoriels transmettant ces informations tactiles pouvait entraîner le développment de TSA chez la souris. Notre hypothèse est que les réseaux de la moelle épinière dorsale, par ou transitent les informations tactiles avant leur transmission vers le cerveau, opèrent un filtrage anormal de ces signaux chez les individus atteints de TSA. L'information qui parvient alors au cerveau est alors peu pertinente du contexte dans lequel elle a été générée. De plus, en accord avec les données de la littérature, nous formulons l'hypothèse que ce filtrage anormal des informations sensorielles résulte d'un développement anormal des réseaux spinaux durant la période post-natale, particulièrement entre les jours 7 et 24. Les neurones inhibiteurs spinaux jouant un rôle prépondérent dans le filtrage des informations tactiles, nous nous proposons de caractériser ces neurones à différent stades de développement par des méthodes combinant une analyse des propriétés électriques des neurones (électrophysiologie), une analyse des prolongements cellulaires de ces neurones (morphologie) et l'analyse des gènes exprimés par ces neurones (transcriptomique).
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de l'expérience sensorielle atypique dans les TSA. En explorant ces déficits au premier niveau d'intégration (moelle épinière) et au moyen d'approches intégrées (combinaison des approches transcriptomiques, électrophysiologiques, morphologiques et comportementales), le projet permettra i) une milleure compréhension du rôle des interneurones spinaux dasn le filtrage et l'amplification des informations somato-sensorielles, ii) l'identification de mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine du disfonctionnement la transmission somatosensorielle dans les TSA iii) l'identification de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des TSA.
Procédures
Le projet prévoit la mise en place de 2 tests comportementaux (classe de sévérité légère) qui seront appliquées sur 50 animaux. L'ensemble du protocole (de l'arrivée des animaux à l'animalerie d'expérimentation jusqu'à la sortie du protocole) dure 10 jours (5 jours d'acclimatation et 5 jours d'expérimentation).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales exposées dans le projet sont i) des tests comportementaux sans stress de l'animal (test du ruban adhesif, inhibition du sursaut acoustique) ou ii) des procédures sans réveil (perfusion intracardiaque). Les tests comportementaux étant réalisées dans une animalerie expérimentale distincte de l'animalerie de production (mais dans le même batiment), une période d'acclimation de 5 jours est observée avant le début des expériences comportementales pour laisser les animaux récupérer du stress lié au transfert. Les animaux sont surveillés quotidiennement durant ces 5 jours.
Devenir
Le projet comporte trois procédures. Pour les animaux faisant l'objet de tests comportementaux, ils sont dans la mesure du possible réutilisés dans d'autres projets en cours dans le laboratoire. Lorsque cette réutilisation n'est pas possible, les animaux sont mis à mort conformément à la règlementation en vigueur. Les protocoles d'immunohistochimie et d'électrophysiologie, dans lesquels sont engagés les autres animaux conduisent à une mort rapide de l'animal (procédure sans réveil).
Remplacement
Les alternatives actuelles à l'utilisation des animaux dans le domaine des neurosciences comprennent: - L'utilisation de méthodes in silico (modèlisation) - L'utilisation de neurones issus de cellules souches (IPS) Aucun de ces modèles ne permet de reproduire la complexité des interactions neuronales mises en jeu lors du traitement des interactions sensorielles: - Notre connaissance du système nerveux reste trop fragmentaire pour simuler l'intégralité du réseau spinal, - Les neurones induits à parti de cellules souches présentent des propriétés intrinsèques différentes de celles des neurones spinaux ex-vivo, et les réseaux formés par ces cellules ne sont pas comparables à ceux présents chez l'animal entier. Le modèle animal est donc absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaires au traitement de l’information sensorielle.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux a été ajustée sur la base d'expériences pilotes menées précédemment au laboratoire, ainsi que sur la base d'expériences similaires rapportées dans la littérature. Les animaux contrôles et TSA sont obtenus à partir d'une même portée, permettant d'utiliser tous les animaux mâles GFP positifs d'un croisement, indépendemment du génotype Fmr1.
Raffinement
Le projet ne comporte pas de procédure stressante ou dommageable. Pour les expériences de comportement, les conditions de stabulation des animaux sont adaptées de façon à favoriser le bien être des animaux (enrichissement, mise à disposition d'un matériel pour la construction du nid). Les animaux engagés font l'objet d'une surveillance quotidienne portant sur l'état du pelage, la vivacité, la posture et le comportement, et leur état évalué au moyen d'une grille de scorage (fournie en annexe du présent document. Les animaux sont manipulés quotidiennement de manière à éviter la mise en place d'un stress lors de la réalisation de la procédure. Les animaux faisant l'objet d'une mise à mort par perfusion intracardiaque font l'objet d'une couverture analgésique chimique.
Choix des espèces
Cette étude utilise un modèle de souris présentant des troubles autistiques (TSA). Parmi les différents modèles de TSA disponibles chez la souris, nous avons fait le choix du modèle Fmr1-/y car ce modèle présente des similarités remarquables avec les symptomes observés chez les humains atteints par la maladie du chromosome X fragile, une forme héréditaire de trouble autistiques. Ces souris seront croisées avec des souris exprimant un marqueur fluorescents dans les neurones inhibiteurs. Il est ainsi possible, chez les animaux résultatnt de ce croisement, d'identifier viseullement les neurones inhibiteurs de la moelle épinière et de comparer leur propriétés chez les individus contrôles et TSA Il existe une période critique dans le développement des TSA située entre la seconde et la troisième semaine post-natale chez la souris. Afin de mieux caractériser les transformations affectant les neurones au cours de cette période, nous caractériserons les propriétés de ces derniers à 3 stades développementaux: -Chez le nouveau né (7j), avant la période critique -Chez les animaux sevrés (30j), à la sortie de la période critique -Chez les animaux adultes (8 semaines).
Formation et maintien des compétences concernant les gestes techniques chirurgicaux sur les rongeurs (2022-B-017)
- Formation professionnelle
Rats : 860
Cochons d'Inde : 160
Hamsters dorés : 160
1880 rongeurs, souris, rats, cobayes et hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du sans réveil au sévère, 475 d’entre eux en gravité sévère. Chaque animal peut subir deux interventions parmi la pose de cathéter, la craniotomie, l’induction d’une pathologie, l’ablation d’un organe ou la greffe de peau, non pour produire des connaissances mais pour former le personnel d’un prestataire de services à la chirurgie. Le porteur indique que ces gestes sont déclenchés par la demande d’un client et présente le cobaye et le hamster comme des espèces ajoutées pour rester réactif à cette demande. Il affirme que les mannequins ne suffisent pas et que l’apprentissage des gestes rend l’utilisation d’animaux vivants nécessaire.
Objectifs
Tous les personnels impliqués dans des études menées sur des animaux ont pour obligation d'acquérir et de maintenir leurs compétences tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de former et d'actualiser les compétences du personnel sur différents actes techniques impliquant de la chirurgie dans le but de développer et de réaliser des études précliniques pour le compte de clients. Les actes chirurgicaux nécessitant une expertise élevée, l'acquisition de ces compétences est requise afin que ceux-ci soient réalisés de façon maîtrisée et reproductible. Certaines espèces et techniques de ce projet seront utilisées à la marge mais peuvent tout de même être demandée par un client. Afin d'être suffisament réactif par rapport à notre activité de prestatire de services, notre personnel se doit de pouvoir être formé pour ces espèces et ces techniques. Ainsi l'acquisition de nouvelles compétences sera toujours initiée par une demande Client.
Bénéfices attendus
L'acquisition et le maintien de compétences de gestes techniques en chirurgie permet d’acquérir et de maintenir la dextérité et la technicité permettant de limiter les dommages infligés à l’animal et les niveaux de douleurs non conformes au type de chirurgie réalisée. La maitrise des techniques chirurgicales obtenues par le maintien des compétences contribue par la suite à une réduction du nombre d’animaux dans les procédures. D’où l’importance de ce projet, quant à l'acquisition et au maintien des compétences du personnel intervenant sur les animaux. De par notre activité de prestataire de services nous nous devons d'avoir l'ensemble de notre personnel opérationnel sur l'ensemble des techniques utilisées au sein de notre société. Ainsi nous devons envisager tous les cas de figure c'est pour cette raison que notre projet comporte plusieurs procédures sur de nombreuses espèces de rongeurs. Néanmoins, le nombre d'animaux calculé reste un maximum et sera sans aucun doute inférieur.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans deux procédures maximum de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelque soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure chirurgicale sont les suivants : - Procédure 1 (Implantation de cathéter) : moins d’une heure - Procédure 2 (Injection nécessitant une chirurgie) : moins de 20 min - Procédure 3 (Craniotomie) :moins d’une heure - Procédure 4 (Induction d'une pathologie avec réveil) : environ 2h00 - Procédure 5 (Induction d'une pathologie sans réveil) : jusqu’au retrait des clamps temps estimé à 1h30 - Procédure 6 (Exérèse d'organe) : moins de 30 minutes - Procédure 7 (Implantation de dispositifs médicaux) : environ 30 minutes - Procédure 8 (Greffe cutanée) : moins d’une heure.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Pour chaque procédure, la possibilité d’administrer une dose supplémentaire d’analgésique durant la période post-opératoire en cas de signe visible de douleur est prévue. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 48h suivant les interventions, ces paramètres font l’objet d’un suivi durant la période de rétablissement des animaux. Dans le cadre des procédures d’induction d’une pathologie, les signes cliniques de la pathologie (ex : insuffisance rénale ou hépatique) sont attendus et font l’objet d’un suivi spécifique.
Devenir
Les procédures terminant par une exsanguination impliquent forcément une mise à mort de l’animal. Dans un but de réduction du nombre d'animaux utilisés, les animaux impliqués dans un procédure (excepté P4, P5, P6 ) pourront être réutilisés dans une autre procédure de ce projet. Au terme, des deux procédures maximum subies par l'animal, il n’est pas envisagé de les replacer, ces animaux seront alors mis à mort au terme de la période post-opératoire déterminée pour chaque procédure. La mise à mort des animaux pourra également avoir lieu dans le cas de prélèvements d’organes / tissus en vue d’une analyse histologique ou biochimique visant à valider le geste technique de la personne formée.
Remplacement
Des modèles animaux artificiels (exemple : rats ou souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, l’apprentissage des bons gestes en chirurgie ainsi que de la surveillance de la profondeur d’anesthésie/analgésie et du suivi post-opératoire ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Néanmoins, certains gestes de base (exemples : sutures, incision, etc...) inclus dans les différentes procédures décrites dans ce projet pourront être réalisés sur ce type de support dans un but de remplacer l'utilisation de l'animal.
Réduction
Une meilleure maîtrise des gestes techniques permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. De plus, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, naïfs de toute expérimentation (après avis favorable de la SBEA et du vétérinaire référent) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux impliqués dans cette demande pourra également être revu à la baisse dans les cas suivants : - lorsque les gestes techniques auront été pratiqués par un collaborateur lors d'une étude - lorsqu'un collaborateur maitrise le geste technique qu'il aurait pratiqué dans une autre société /laboratoire de recherche - lorsque la personne maitrise le geste technique sur un des 4 types de rongeurs cités dans cette demande. Les animaux utilisés dans ce projet pourront être utilisés dans plusieurs procédures. Par exemple, un animal ayant subi une craniotomie (P3) pourra être réutilisés dans une procédure sans réveil (P5), au terme de sa période de récupération, dans le but de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Pour finir, les modules d'acquisition des compétences ne seront initiés sans qu'ils ne soient motivés par la demande d'un client. L'ensemble de ces conditions s'inscrivent dans le cadre de la réduction du nombre d'animaux.
Raffinement
Le tuteur sera vigilant sur l’exécution des manipulations/gestes réalisés sur l’animal tout au long de la formation/maintien des compétences. Le tuteur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou une douleur chez l’animal. Préalablement à toute formation, des points limites seront définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. Ces points limites permettront un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des gestes techniques mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une intervention précoce et adaptée si cela est nécessaire. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du tuteur de la formation et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie (type, dose, fréquence) ainsi que l’analgésie (type, dose, fréquence) nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire référent. Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex : lampe chauffante, enceinte thermostatée etc…). Les animaux seront hébergés individuellement après chaque chirurgie jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 21 jours). Afin de limiter le stress dû à l’isolement et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisé (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…).
Choix des espèces
D'un point de vue scientifique, nous disposons d'un grand nombre d'articles et de données validées sur le rat et la souris. De plus, les espèces les plus demandées par nos clients sont le rat et la souris. C'est pour cette raison que nous souhaitons accentuer nos efforts d'acquisition de compétences sur ces deux espèces principalement. Néanmoins, notre activité de prestataire de services peut nous amener à développer des modèles de pathologie sur d'autres espèces telles que le hamster et/ou le cobaye, à la demande d'un client. Dans le cadre de notre activité, nous devons être réactifs face à toute demande client ainsi nous avons ajouté comme espèce le hamster et le cobaye à notre projet. Ces derniers ne seront utilisés dans le cadre d'une acquisition de compétence qu'en cas de demande spécifique d'un client, d'où le faible nombre d'hamsters et cobayes impliqués dans ce projet. Seuls des animaux adultes seront utilisés dans les procédures faisant l’objet de ce projet, les protocoles d’anesthésie et de chirurgie décrits ayant été mis au point sur des animaux à ce stade.
Comparaison de l’effet de l’hypothermie, versus bétabloquants, dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë réfractaire sous assistance respiratoire par ECMO dans un modèle porcin – AVENANT
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
24 cochons vont être utilisés, maintenus sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures menées sans reprise de conscience. Une détresse respiratoire aiguë leur est provoquée par une ventilation rendue traumatique et l'injection de sérum salé dans les poumons, sous assistance respiratoire extracorporelle posée par chirurgie, pour comparer l'hypothermie et des bêtabloquants pendant environ six heures. Le porteur indique que les lésions des poumons ne permettront pas de réveil compatible avec la vie et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel. Il affirme que ce dispositif impose un "gros animal" et ne peut être remplacé.
Objectifs
Le syndrome de détresse respiratoire (SDRA) est une pathologie grave nécessitant une hospitalisation prolongée en réanimation et des soins médicaux lourds. La mortalité est de 40 % à 70 %. Le SDRA représente 10 à 15 % des admissions en réanimation. Des séquelles physiques, psychologiques et cognitives graves avec une altération importante de la qualité de vie ont été rapportées jusqu’à 5 ans après un épisode de SDRA. Le SDRA a toujours représenté un problème de santé publique devant sa forte morbi-mortalité, et est revenu au premier plan à la suite de la pandémie COVID 19. Au plus fort de la pandémie, certains services de réanimation avaient 100 % de leurs lits occupés par des patients en SDRA sévère sur une pneumonie liée à la COVID-19. Il correspond à un œdème pulmonaire « lésionnel», causé par une hausse de la perméabilité des micro-vaisseaux (capillaires) pulmonaires survenant à la suite d'une agression directe ou indirecte de la membrane entre les alvéoles ( et les capillaire, associé à une inflammation pulmonaire intense et un faible taux doxygène dans le sang (hypoxémie sévère). La prise en charge du SDRA de l’adulte a fait l’objet de recommandations en 2018, consistant à augmenter l’apport en oxygène, diminuer la consommation en oxygène et éviter d’autres atteintes au niveau pulmonaire grâce à une ventilation mécanique invasive. Une curarisation précoce et courte ainsi que la mise en décubitus ventral dans les formes les plus sévères réduit la mortalité. Dans certains cas, les patients peuvent présenter une hypoxémie persistant malgré l’optimisation de la ventilation mécanique invasive et les différentes thérapeutiques d’optimisation de l’oxygénation. Le SDRA est alors dit réfractaire. Alors, si les comorbidités du patient le permettent, la question d'assistance respiratoire extracorporelle (circuit extracorporel permettant l'enrichissement direct du sang en oxygène en shuntant le circuit pulmonaire, ECMO) est discutée en réanimation. Néanmoins, 40 % des patients présentent une hypoxémie réfractaire et persistante malgré l’optimisation de l’ECMO et de la ventilation mécanique. Il n’existe aucune recommandation officielle de prise en charge de ces patients avec des pratiques diverses et non validées. De plus, la mortalité hospitalière de l’ordre de 60 % est observée chez ces patients avec des coûts de prise en charge élevés. L’enjeu est d’optimiser le rétablissement sous l'ECMO par l’utilisation de bêtabloquant ou la mise en hypothermie.
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices sont attendus. Si notre hypothèse est vérifiée, la diminution du débit cardiaque par l’hypothermie ou par l’action des bétabloquants entrainera une meilleure adéquation entre les paramètres de l'ECMO et l'augmentation du taux d'oxygène dans le sang. Cela permet d’envisager plusieurs bénéfices au niveau individuel : l’amélioration de l'oxygénation permettrait une diminution de la mortalité, ainsi qu’un sevrage de l’assistance respiratoire plus précoce et donc une diminution de ses effets secondaires, essentiellement les évènements thrombo-emboliques (c'est à dire la formation d’un caillot qui peut migrer et obstruer la circulation sanguine), l’hémolyse (destruction des globules rouges présents dans le sang) et les surinfections ; mais également une diminution de la ventilation mécanique (et de ses effets secondaires comme la pneumopathie). Les bénéfices sont également au niveau collectif avec une diminution de la mortalité, une amélioration de la prise en charge des ces malades en réanimation et un séjour en réanimation potentiellement diminué avec possibilité de soigner plus de patients.
Procédures
Les animaux seront maintenus sous anesthésie profonde et analgésie pendant toute la procédure, soit environ 6 heures. L'assistance respiratoire extracorporelle (ECMO) sera mise en place par abord chirurgical au niveau de la veine jugulaire et par abord percutané (passage à travers la peau par introduction d'une aiguille) au niveau de la veine fémorale, et maintenue pendant toute la procédure, soit environ 6 heures. Pour induire le syndrome de détresse respiratoire, la ventilation artificielle sera traumatique par augmentation du volume d'air insufflé et de la pression exercée pendant 1 à 2 heures, et il y aura injection de solution saline directement dans les poumons. Le traitement du SDRA débutera par la mise en place de l'hypothermie ou administration de bétabloquants de courte curée d'action par voie veineuse, pendant les 4 heures du protocoles. Des prélèvements sanguins et de liquide pulmonaire seront effectués toutes les 2 heures (3 fois) pour évaluer l'efficacité du traitement.
Impact sur les animaux
Le stress est diminué par une période de quarantaine dans un environnement adapté et une tranquilisation de l'animal lors de la contention. La douleur est limitée par l'utilisation de médicaments identiques à ceux utilisés chez l'homme, par une surveillance accrue des constantes et l'adaptation de l'anesthésie et de l'analgésie. L'hypoxémie, c'est à dire la baisse du taux d'oxygène dans le sang induite pour les besoins de l’expérience, peut produire des effet tissulaires délétères. Notre protocole ne durant que quelques heures, le cochon ne pourra pas être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie, l’animal est donc mis à mort. S'il y a perte de sang hémorragique, elle sera rééquilibrée par perfusion de solution saline et l'administration de traitements médicamenteux.
Devenir
Le syndrome de détresse respiratoire (SDRA), induit dans notre étude est une pathologie avec une mortalité très importante (autour de 40 % selon les études). Elle nécessite de nombreux jours, voire semaines de ventilation mécanique avec souvent une morbidité très importante : perte de poids, confusion post anesthésie, surinfection bactérienne, évènements thromboemboliques (correspond à la formation d’un thrombus qui peut obstruer la circulation sanguine), neuropathie de réanimation avec trouble de la déglutition (c'est à dire une paralysie temporaire et réversible des muscles suite à l'accumulation des médicaments sédatifs et des curares). A l’issue du protocole, les poumons des animaux ne seront pas guéris et les lésions induites ne permettront pas une respiration spontanée de qualité et entrainerait une mort par détresse respiratoire et manque d'oxygène délivrés aux organes ce qui entrainera une défaillance multiviscérale. La mise à mort dans des conditions de dignité et de traitement du stress et de la douleur sera donc effectuée par surdosage de l'anesthésique en injection intraveineuse sans reprise de conscience de l'animal. Du début à la fin de la procédure l'animal est sous anesthésie et mis à mort en fin de procédure sans réveil de l'animal.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de données scientifiques, ni d’essai clinique ou expérimental, sur la place thérapeutique de l’hypothermie ou des bétabloquants dans le syndrome de détresse respiratoire (SDRA). A l'exception de publications de cas isolés, il n'y a pas à notre connaissance d'études réalisées sur l'impact de l'hypothermie ou des bétabloquants à durée de vie courte dans les SDRA réfractaires sous ECMO. Une vraie étude comparative est nécessaire. Le modèle de SDRA chez le cochon développé par notre équipe reproduit un état proche de l’état observé en clinique. Ce modèle est donc tout indiqué pour cette étude comparative. Le modèle animal de cochon est utilisé pour sa similitude avérée, en termes d’anatomie cervicale, pulmonaire et d’hémodynamique, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. L'adaptation à l'environnement physiologique direct du larynx, du poumon et du coeur nous conduit à réaliser cette étude sur un modèle animal où toutes les contraintes seront présentes (impossibilité de remplacement). Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la machine de l'ECMO ainsi que de mettre en place la ventilation artificielle.
Réduction
Modèle déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animal à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquements exploitables. Il repose sur une revue de la littérature sur ces modèles avec un taux de mortalité entre 20 et 30% ainsi que sur l'expérience de notre centre (taux de 30% de mortalité lors de la dernière utilisation de ce modèle). La mise en place des appareillage (canules...) sera retestée au préalable sur les animaux utilisés dans d'autres projets et après leur mise à mort.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles…). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress.L’animal est mis à jeun la veille de l’expérimentation. Le jour de l’expérimentation, les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés sédatives et myorelaxantes avec un produit psychotrope dissociatif aux propriétés analgésiantes. Les animaux peuvent être ainsi manipulés sans recours à des méthodes susceptibles de les effrayer inutilement ou de leur infliger des souffrances évitables. Ils sont ensuite transportés sur le plateau technique. Les cochons seront intubés, anesthésiés et sous analgésie continue dès le début de l’opération afin d’assurer une anesthésie profonde. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, respiratoire, la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres, comme une augmentation de la fréquence cardiaque, de la fréquence respiratoire ou de la pression artérielle, signes de réveil, de douleur, tremblements, entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Ce modèle animal est bien connu et reproduit bien les conditions observées en clinique du syndrome de détresse respiratoire aigu. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes. Animaux d’un poids entre 50 et 60 kg comparable au poids d’un humain adulte, de morphologie pulmonaire mature, permettant l’usage de thérapeutique à posologie humaine.
Travaux Pratiques pour une formation à la chirurgie : cathétérisme de l’artère carotide et cathétérisme chronique chez le rat.
- Formation professionnelle
105 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures menées sans reprise de conscience. Chaque animal sert à une intervention d'environ une heure et demie de cathétérisme de la carotide, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels à la chirurgie expérimentale. Un second geste, une ablation des surrénales, est montré sur l'animal déjà euthanasié. Le porteur affirme que l'acquisition d'un geste chirurgical rend l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Fournir une formation réglementaire aux personnels engagés dans l'expérimentation animale et désireux de pratiquer des actes de chirurgie sur animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
Formation réglementaire des personnels. Raffinement des compétences en chirurgie. Réduction du nombre d'animaux requis pour les expérimentations à venir.
Procédures
Actes chirurgicaux sur animaux sédatés, analgésiés, et sans réveil. Une intervention par animal d'une durée d'environ 1h30.
Impact sur les animaux
La seule nuisance sera ici l'entrée d'une aiguille par voie intrapéritonéale pour procéder à l'anesthésie puisque l'intégralité de la procédure se réalisera ensuite sous anesthésie générale.
Devenir
Procédure sans réveil faisant suite à l'acquisition des compétences par le personnel.
Remplacement
Une partie de la formation théorique est destinée à faciliter l'execution des gestes de chirurgie. Pour cette partie proprement dirte, il s'agit d'acquérir un geste chirurgical donc l'utilisation d'animaux est indispensable.
Réduction
Chaque binôme travaillera sur un même animal. Une fois le cathétérisme réalisé, un second geste de chirurgie (surrénalectomie) sera montré sur animal euthanasié.
Raffinement
L'intégralité de la procédure sera réalisée sous anesthésie de type chirugicale qui comprend une analgésie tout au long de la procédure. Les élèves auront assisté à une démonstration réalisée par le formateur, ce qui leur permettra de pratiquer les gestes appropriés sur un animal anesthésié. Des points limites adaptés à ce projet sont également mis en place.
Choix des espèces
Il s'agit d'acquérir un geste chirurgical donc l'utilisation d'animaux est indispensable pour acquérir les bases en chirurgie expérimentale. Des rats mâles ont une taille adéquate pour une meilleure démonstration du geste chirurgical. Les rats mâles adultes doivent faire un peu plus de 300g pour correspondre à la taille du cathéter utilisé.