Procédures sans réveil

Pour constituer les dossiers réglementaires d'autorisation de mise sur le marché de nouveaux dispositifs d'embolisation, 47 porcs vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une anesthésie générale et une embolisation guidée par imagerie de 30 à 40 minutes, avec pour certains une incision d'un vaisseau du rein provoquant une ischémie rénale douloureuse. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et présente ces données comme exigées par les agences sanitaires. Tous les porcs sont mis à mort pour prélever des organes destinés à l'analyse histologique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouveaux agents d’embolisation utilisés en radiologie interventionnelle (RI), avant leur application chez les patients. La RI est une spécialité médicale qui associe une technique d’imagerie (rayons X, ultrasons, résonnance magnétique) à un geste mini- invasif pour diagnostiquer et/ou traiter un large éventail de maladies, dont les cancers. L’embolisation est une procédure de radiologie qui consiste à injecter à l’intérieur d’un vaisseau un produit pour l’occlure. Le but visé est, soit d’arrêter un saignement (traumatisme, hémorragie du post-partum, hémoptysie…), soit de dévasculariser un tissu pathologique irrigué par ce vaisseau en le privant d’apport sanguin (fibrome utérin, adénome de la prostate, tumeur hépatique, malformation vasculaire…). De nouveaux matériaux sont actuellement à l’étude pour améliorer les traitements par embolisation. On peut notamment citer les matériaux dégradables, la fonctionnalisation des matériaux ou l’introduction d’adjuvants pour rendre les dispositifs visibles en imagerie ou encore chargeables avec des principes actifs. Tous ces agents d’embolisation sont des dispositifs médicaux implantables pour lesquels la performance et l’innocuité doivent être évalués chez l’animal avant de les utiliser en clinique. Les résultats obtenus seront versés aux dossiers réglementaires pour les demandes d’autorisation de mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre technologique et médical. Il s’agit de tester de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme. La radiologie interventionnelle a révolutionné la pratique de la médecine moderne grâce à l'introduction, au développement et à la validation de thérapies peu invasives, dont beaucoup ont non seulement remplacé des procédures invasives, mais ont également offert de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques là où il n'en existait pas auparavant. La radiologie interventionnelle s’inscrit de plus en plus dans les perspectives curatives de maladies cancéreuses, que ce soit par l’efficacité propre de ses méthodes ou dans le cadre de traitements combinés avec d’autres techniques. Ce projet bénéficiera donc directement aux patients, les nouveaux agents d’embolisation testés pourront être appliqués en clinique dès leur sécurité d’utilisation établie selon les bonnes pratiques de laboratoire.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une anesthésie générale pendant laquelle une prise de sang et une intervention chirurgicale mini-invasive guidée par l’imagerie (embolisations 30-40 minutes) sera réalisée. Un groupe d'animaux sera mis à mort à l'issue de cette procédure sans réveil de l'anesthésie, un autre groupe sera réveillé et observé quotidiennement, de 1 semaine à 3 mois selon les lots, avant une deuxieme anesthésie générale sans réveil pour un contrôle angiographique et un prélèvement sanguin. MODIFICATION Chez un autre groupe d’animaux, la même chirurgie, avec ajout d’une incision au niveau d’un vaisseau du rein, sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux sans réveil sont liées à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire. Pour les animaux suivis en post opératoire, le réveil de l’anesthésie peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. L’intervention chirurgicale par voie endovasculaire est mini invasive, l’embolisation de branches de l’artère rénale induit une ischémie qui peut amener des douleurs et occasionner une perte d’appétit passagère. Les effets indésirables consécutifs à l’accès vasculaire sont un hématome et éventuellement une boiterie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélever des organes à but d'analyses histologiques.

Remplacement

Plusieurs mesures alternatives ont été mises en œuvre en amont des tests in vivo: Lors de l’étape de design du dispositif, les fabricants cherchent les données de biocompatibilité disponibles pour les matériaux utilisés. Ceux dont les effets et les doses toxiques sont connus sont éliminés de la composition de l’implant, afin de réduire le risque d’effets pathologiques locaux. Des tests in vitro de performances ou de cytotoxicité permettent également d’exclure certaines compositions qui ne répondent pas aux spécifications du dispositif, et de diminuer le nombre de prototypes à tester in vivo. Après ces tests préalables sur modèles non-vivants, nous arrivons à un stade de développement des dispositifs où un certain nombre de conditions du vivant ne peuvent être modélisées dans des systèmes in vitro : contact avec le sang, déformation des vaisseaux, réaction tissulaire et dégradation des produits, ré-ouverture des vaisseaux ; cicatrisation, persistance de la fonction rénale… Le recours à l’animal vivant devient alors indispensable, les modèles in vitro sont insuffisants du point de vue réglementaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme: des essais sur animaux vivants sont exigés par les agences sanitaires pour apporter des données supplémentaires fiables sur le comportement des dispositifs implantables dans les tissus vivants.

Réduction

Tous les moyens ont été mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir premiers essais initiés sur modèles alternatifs, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs, détermination des effectifs sur la base des attentes réglementaires, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs. Le nombre total d’animaux est aussi optimisé en traitant les deux reins et en réalisant plusieurs embolisations par coté (tout en maintenant une fonction rénale de 50%).

Raffinement

Toutes les interventions (prise de sang, angiographie, embolisations) se font sous anesthésie générale avec traitement de la douleur. Les animaux sont hébergés en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d'habituation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet leur familiarisation et la réalisation des examens cliniques sans contrainte (prise de température, palpation, auscultation...). Une équipe compétente de zootechniciens, vétérinaire et médecins assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins. Une vidéosurveillance 24h/24 permet d'observer les comportements en animalerie et d'intervention rapidement en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. La Structure en charge du bien-être animal accompagne le suivi des animaux. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales, le porc est l’espèce de choix pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses ressemblances anatomiques avec l'homme. Les similitudes vasculaires (arborescence générale, calibres des vaisseaux, flux sanguins) permettent de reproduire fidèlement chez le porc les scénarios d’administration vasculaire des agents d’embolisation en radiologie interventionnelle, avec des imageurs et matériels identiques à ceux utilisés pour les patients. De jeunes porcs charcutiers, âgés de 3 à 5 mois, seront utilisés. A cet âge les animaux ont atteint une taille suffisante pour réaliser les procédures de cathétérisme et embolisation avec le même matériel que chez l’homme.

Opérées du crâne sous anesthésie pendant une à deux heures pour recevoir une injection virale, 1 410 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, quarante d'entre elles tuées sans réveil. Un dispositif est implanté sur le crâne, puis les animaux réalisent une tâche olfactive jusqu'à trois heures par jour pendant six à sept semaines. Pour les motiver, le porteur impose une restriction d'accès à l'eau pouvant entraîner une déshydratation modérée et une perte de poids. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement, l'étude portant sur le filtrage des odeurs par le cerveau.

Objectifs

Notre cerveau est capable de détecter des milliers d’odeurs, mais il ne traite pas toutes ces informations de la même façon. Par exemple, quand nous avons faim, l’odeur d’un plat cuisiné devient bien plus attrayante que lorsque nous sortons d’un bon repas. Un autre exemple est celui de certaines odeurs que nous ne "sentons" pas mais qui deviennent détectables si nous y prêtons attention. Comment le cerveau fait-il pour "mettre en avant" certaines odeurs plutôt que d’autres ? Nous pensons qu’une région cérébrale appelée télencéphale basal joue un rôle clé dans ce processus. Elle envoie des signaux chimiques vers une autre zone, le cortex piriforme, qui est le "centre de traitement" des odeurs. Ces signaux agiraient comme un filtre : ils renforcent la perception des odeurs importantes dans un contexte donné (comme la faim ou l’attention) et atténuent celle des autres. Pour vérifier cette hypothèse nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Grâce à des techniques de pointe, nous pourrons activer ou désactiver spécifiquement les neurones du télencéphale basal et observer comment cela influence la perception des odeurs. Nous enregistrerons aussi l’activité cérébrale des souris pendant qu’elles réalisent des tâches olfactives, pour comprendre l’impact de ces signaux sur le fonctionnement de leur cerveau. L’ensemble de notre projet sera mis en œuvre dans l’application des 3 Rs et le nombre d’animaux utilisé sera le plus faible possible.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation et la fonction des interactions entre deux régions du cerveau, le télencéphale basal et le cortex olfactif. Il nous permettra aussi de mieux comprendre quand et comment le télencéphale basal est mis en jeux et communique avec le cortex olfactif pour moduler la perception des odeurs. Par ailleurs, ce projet examine pour la première fois deux voies issues du télencéphale basal. Elles utilisent des messagers chimiques différents mais pourraient agir ensemble pour moduler notre odorat. Comprendre les interactions entre ces deux voies permettrait d’éclairer les mécanismes cérébraux de l’attention. Chez l’humain, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter notre vie quotidienne. Ces troubles sont aussi parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives. Pourtant, le lien entre odorat et ces pathologies n’est pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies issues du télencéphale basal qui modulensont parmi les premières touchées dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer. En étudiant ces voies chez l’animal, nous pourrions mieux détecter et comprendre l'origine des troubles de l'olfaction chez l’humain.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale (durée 1 à 2 heures) réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde. Certains animaux réaliseront une tâche comportementale de détection olfactive 3 semaines après la chirurgie. Cette tâche dure au maximum 3h/jour pendant au maximum 6 à 7 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement liés aux chirurgies réalisées sous anesthésie. Les chirurgies peuvent induire des douleurs aigües, inflammations, hypothermies, sécheresses oculaires et déshydratations. De faibles pertes de poids peuvent survenir les jours suivants la chirurgie. Les souris auront un dispositif implanté sur le crâne pendant qu'elles réalisent un test comportemental. Cela n’est pas douloureux mais peut être une source de stress pour l’animal et nécessite une phase d’habituation au dispositif. Afin de garantir une motivation comportementale indispensable à l’apprentissage des tests olfactifs, les animaux concernés subiront des périodes de restriction hydrique. Une déshydratation modérée peut survenir et avoir un léger impact sur la prise alimentaire et entrainer une perte de poids.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Notre étude porte sur des circuits cérébraux complexes impliqués dans la perception des odeurs. Malheureusement, il n’existe aujourd’hui aucune alternative (comme des cultures cellulaires ou des modèles informatiques) capable de reproduire fidèlement ces mécanismes et ces circuits. Notre projet inclut aussi des tests comportementaux (comme la réaction des souris à des odeurs dans différents contextes). Ces expériences ne peuvent être réalisées que sur des animaux vigiles et actifs, afin d’étudier leurs performances olfactives et comment leur cerveau traite les informations olfactives en temps réel. Les souris sont le meilleur modèle pour notre recherche, car les outils d’ingénierie génétique y sont les plus avancés, ce qui nous permet de cibler précisément les circuits cérébraux à étudier. De plus, les découvertes faites chez la souris ont déjà démontré leur pertinence pour comprendre des mécanismes similaires chez l’humain, notamment en neurosciences.

Réduction

Même si nous ne pouvons pas remplacer totalement les souris par des modèles artificiels, nous faisons tout pour réduire leur nombre au maximum. Dans notre projet, le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement déterminé pour concilier rigueur scientifique, validité statistique et respect du bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été estimé à partir de protocoles similaires déjà validés dans nos travaux antérieurs, de façon à atteindre des résultats statistiquement fiables, sans excès. Nous utilisons des individus mâles et femelles pour limiter la production globale d’animaux tout en tenant compte des variations biologiques. Comme nous explorons des circuits cérébraux qui n’ont jamais été décrits, le nombre exact d’expériences dépendra des résultats obtenus. Nous ne pouvons pas prédire statistiquement ces découvertes, mais les expériences seront arrêtées dès qu’un résultat significatif et original est obtenu, pour éviter d’utiliser des animaux inutiles. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour confirmer que nos résultats sont fiables. Enfin, grâce à des techniques de pointe qui nous permettent de manipuler uniquement les neurones et circuits cérébraux d’intérêt, nous réduisons de moitié le nombre d’animaux nécessaires par rapport à des méthodes classiques qui stimulent à l’aveugle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (avec bâton à ronger, matériaux de nidification, tube de change). Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants, leurs yeux sont protégés avec du gel, et les conditions d’anesthésie générale avec analgésiques sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après les chirurgies, les animaux retourneront dans leur cage avec leurs congénères sauf dérogation pour les animaux destinés aux tests comportementaux. En phase post-opératoire, de la nourriture sous forme de gel est placée dans les cages afin de minimiser les efforts des animaux pour se nourrir et accélérer leur convalescence. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec la vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Être des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptée des animaux. Les animaux devant effectuer une tâche comportementale ont des phases de récupération de minimum 3 semaines après la chirurgie. Ils sont progressivement habitués à être manipulés par l’expérimentateur, à la pièce et au dispositif expérimental. Cette phase d’habituation vise à minimiser la peur et les réactions émotionnelles des animaux. La restriction à l’accès à l’eau, avec habituation progressive, n’affectera pas leur santé ou leur bien-être, car les animaux auront accès à l’eau deux fois dans la journée (pendant les tests, puis après les tests pendant 1-2h) pour compenser leurs besoins.

Choix des espèces

La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier et manipuler des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris qui seront utilisées dans ce projet permettent ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L'utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l'interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux utilisés dans ce projet entreront en procédure à un âge minimum de 2 mois et maximum de 4 mois. A cet âge le développement est terminé et la souris est considérée comme adulte. La fin de la procédure sera au maximum à 6-7 mois.

Issues de l'élevage interne, écartées d'autres projets ou surnuméraires et déjà destinées à la mort, 1 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Elles sont utilisées pour entraîner le personnel aux injections, prélèvements sanguins et gavages, en dehors de tout objectif de connaissance. Le porteur revendique l'absence de "méthode de remplacement" pour apprendre à ressentir les réactions de l'animal, tout en évoquant l'achat futur d'animaux factices. Toutes sont tuées à la fin, l'apprentissage incluant les gestes d'euthanasie.

Objectifs

Ce projet a pour but d’encadrer l’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques dits « de base » sur la souris, en complément aux formations réglementaires initiales et continues, pour garantir une manipulation optimale des animaux dans le cadre des projets de recherche menés sur notre site.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de nous assurer du bon niveau de technicité des utilisateurs de notre plateau, pour un bien-être optimal de nos animaux sur l’ensemble des projets réalisés dans notre structure. Par ailleurs, il permettra une meilleure reproductibilité des résultats obtenus par la suite.

Procédures

Les deux premiers lots d’animaux seront soumis à 1 à 5 injections (durée approximative 1 minute par geste, 1 geste par jour). Cela concerne maximum 475 animaux éveillés et 125 sous anesthésie. Le troisième lot d’animaux sera soumis à 1 à 3 prélèvements sanguins (durée approximative 5 minutes par geste, 1 geste par semaine). Cela concerne maximum 400 animaux dont entre 100 et 300 sous anesthésie. Le quatrième lot d’animaux sera soumis à 1 à 5 administrations orales / 4 administrations nasales de gouttes de sérum physiologique (durée approximative 5 minutes, 1 geste par jour). Cela concerne maximum 200 animaux en administration orale et 100 animaux en administration nasale. La prise de décision quant à la mise en place d'une anesthésie dépendra de la technique utilisée, des recommandations vétérinaires en la matière et du besoin de travailler avec un animal éveillé pour pouvoir interpréter son ressenti et adapter les gestes à ses réactions. Selon les besoins d'apprentissage que nous transmettrons les apprenants, certains animaux de ces quatre lots seront soumis à un prélèvement sanguin en fin d'étude : ils seront soit anesthésiés pour un prélèvement unique de sang (durée approximative 5 minutes), soit soumis à une chirurgie avec anesthésie et analgésie avant prélèvement unique de sang (durée approximative 15-20 minutes). Un dernier lot d'animaux ne sera soumis qu'à un prélèvement sanguin unique. Maximum 50 animaux seront anesthésiés pour un prélèvement unique de sang (durée approximative 5 minutes), maximum 50 animaux seront soumis à une chirurgie avec anesthésie et analgésie avant prélèvement unique de sang (durée approximative 15-20 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements peuvent entraîner un inconfort et une douleur de courte durée au site d’administration / prélèvement (estimé à entre 5 et 15 minutes selon le geste). Les administrations peuvent entraîner un inconfort et une douleur lors de la réalisation, voire une irritation pour l'administration orale. Les animaux peuvent ressentir un stress durant les manipulations et contentions par des personnels en cours d’apprentissage des bonnes pratiques.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue du projet dans le cadre de l’apprentissage des gestes d’euthanasie et de prélèvements post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour objectif un apprentissage de bonnes pratiques pour les gestes réalisés sur l’animal. Notre structure propose à la communauté de ses utilisateurs des supports de formation : affichages sur les méthodes d'observation de l'animal, les critères d'évaluation et la gestion de la douleur, livret recensant les différentes techniques de préhension et de prélèvement/administration avec photographies et protocoles, vidéos des différents gestes disponibles à la demande. Cela dit, il n’existe pas à ce jour de méthode de remplacement pour pouvoir permettre aux utilisateurs d’appréhender les interactions avec le rongeur, de ressentir les réactions de l’animal lors des manipulations. Cette formation est nécessaire en complément des supports existants pour apprendre aux manipulateurs à interpréter les réactions de l’animal et à réagir correctement en conséquence.

Réduction

Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront issues de notre propre élevage. Ce seront des animaux dont le profil génétique n'est pas adéquat ou surnuméraires de la production destinée à d’autres projets, et destinés à l’euthanasie. Nous réaliserons l’apprentissage de plusieurs gestes sur un même animal pour en limiter le nombre. Avant de manipuler des animaux vivants, les apprenants pourront commencer l'acquisition des gestes sur des animaux déjà mis à mort dans le cadre d'autres projets. Nous nous assurerons de la bonne acquisition des gestes avant la manipulation d'animaux vivants, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Notre plateau envisage également à l'échelle de quelques années l'acquisition ou le développement interne d'animaux factices dans une même optique de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les manipulations seront adaptées en fonction des techniques. Nous proposerons dès que possible l’enseignement de techniques alternatives non invasives sur l’animal. Toutes les injections se feront avec des solutions sans effet sur l’animal. Les volumes de prélèvements de sang seront effectués selon le poids de l'animal aux fréquences respectant sa physiologie. Nous mettrons en place une anesthésie gazeuse et une analgésie quand cela est recommandé pour certaines techniques engendrant une douleur chez l’animal. Le suivi du bien-être animal sera effectué quotidiennement par un personnel compétent, les utilisateurs seront également formés à ce suivi. Les animaux sont pris en charge dès leur naissance ou arrivée dans le service pour un suivi quotidien. Ils seront hébergés en groupe, dans le respect de leurs fratries respectives.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de former nos utilisateurs sur leurs gestes pratiques, nous devons donc réaliser cet apprentissage sur l’espèce qu’ils utilisent dans le cadre de leurs propres projets de recherche : la souris. Les formations seront réalisées préférentiellement sur animaux adultes, entre 6 semaines et 6 mois en nous adaptant à l’âge des animaux qui seront disponibles dans notre élevage au moment des apprentissages. Si un utilisateur souhaite toutefois acquérir ces mêmes techniques sur des animaux d’âge différent (entre 3 et 6 semaines), nous adapterons le contenu enseigné et les protocoles en fonction de la physiologie de l’animal. En effet, le but de ce projet est de former chaque utilisateur à la manipulation de l’animal dans la tranche d’âge qu’il est susceptible d’utiliser dans ses propres expériences par la suite.

Tous tués, y compris des embryons et des souriceaux à quelques heures de vie, 82 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Elles portent la mutation d'un syndrome génétique rare qui provoque des apnées sévères, et leur respiration est mesurée pendant une heure dans les huit heures suivant la naissance. Des femelles gestantes sont isolées jusqu'à la mise bas puis tuées avec leur portée, d'autres subissent une césarienne létale pour prélever les embryons. Le porteur affirme que seule l'approche in vivo évalue les conséquences de la mutation à l'échelle d'un "organisme entier".

Objectifs

Le syndrome auriculo-condylaire (SAC) est une malade génétique très rare qui touche principalement le visage et la machoire. Les personnes qui en sont atteintes présentent des oreilles en forme de point d'interrogation, une machoire inférieure petite et étroite et une transformation en partie de cette machoire inférieure comme une machoire supérieure. Les patients peuvent présenter d'autres anomalies comme un tonus musculaire faible, un retard de développement, une perte d'audition et parfois des troubles du contrôle respiratoire notamment une détresse respiratoire à la naissance. Pour mieux comprendre la maladie, une lignée murine a été créée portant la mutation génétique la plus observée chez les patients et qui est impliquée dans le développment de la machoire. Sur le plan respiratoire, la mutation perturbe la réponse ventilatoire à une augmentation du dioxyde de carbone (CO2) et provoque des apnées sévères. Le projet vise à caractériser la nature de ces apnées et d'identifier les structures du cerveaux atteintes et le mécanismes qui conduisent à ces anomalies.

Bénéfices attendus

Dans le cadre d'une maladie extrêmement rare, la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie permet d'affiner la prise en charge des malades. Elle contribue notamment à améliorer la reconnaissance des complications respiratoires associées, permettant ainsi d'adopter les stratégies de prise en charge plus ciblées.

Procédures

1/ Entre 0 et 8h de vie, la respiration de chaque souriceau est mesurée une fois. La mesure dure une heure. A l'issue de la mesure, les souriceaux sont euthanasiés par un personnel compétent et un petit fragement de la queue (2-3 mm) est ensuite prélevé (prélèvement post-mortem) pour en identifier le statut génétique. 2/ Pour les femelles gestantes dont les portées seront mesurées à la naissance : isolement en hébergement individuel du 15 ème jour de gestation jusqu'à la mise bas et l'euthanasie de la portée (au maximum 9h après la mise bas). Les femelles seront ensuite regroupées. 3/Cesarienne sur des femelles gestantes à différents âges gestationnel. Césarienne réalisée après anesthésie létale et en statut post-mortem puis extraction des embryons. 4/ Embryons prélevés en post-mortem

Impact sur les animaux

1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire pouvant générer du stress 2/ Détresse respiratoire causée par la mutation et le stress engendré par cette situation

Devenir

Tous les animaux (embryons, foetus, souriceaux et femelles gestantes pour la procédure 2) sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

L'approche in vivo permet d'évaluer de façon intégrée les conséquences fonctionnelles d'une mutation à l'échelle d'un organisme entier. Dans le cas du syndrome auriculo-condylaire, les atteintes des populations neuronales impliquées dans le contrôle autonome de la respiration influencent directement l'activité des autres organes. Ces interactions fonctionnelles ne peuvent être reproduites fidèlement sur les modèles cellulaires. L'utilisation de l'animal ne peut alors être évitée

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Nous avons déterminé un lot expérimental réduit de 15 animaux par génotype. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Pour l'étude moléculaire et tissulaire, un effectif réduit de 6 animaux par génotype est suffisant selon la recommandation de la plateforme qui effectue les analyses.

Raffinement

Les femelles gestantes sont isolées à 15 jours de gestation ce qui est bon compromis pour l'habituer et réduire ainsi l'angoisse à l'isolement pour une espèce grégaire. La cage d'hébergement est enrichie en cellulose doux pour le nid.

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Dans notre cas, le modèle murin transgénique permet d'étudier les conséquences de la mutation fréquemment observée chez l’Homme, notamment sur le développement cranio-facial et les troubles respiratoires associés. Des mesures respiratoires sont réalisées entre 0h et 8h après la naissance afin de caractériser les anomalies ventilatoires précoces. Pour analyser la mise en place des structures cranio-faciales et des substrats neuroanatomiques impliqués dans le contrôle respiratoire, des prélèvements seront réalisés à différents stades embryonnaires.

Une partie des 220 souris subit une chirurgie terminale de une heure trente à quatre heures, opérée puis tuée sans réveil, uniquement pour la formation du personnel. Les autres sont opérées pour implanter une fibre optique dans le tronc cérébral, puis exposées à des sons, des lumières, des odeurs et des stimulations chaudes ou froides destinées à distinguer l'alerte de ce qui est perçu comme douloureux. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont tuées pour prélever leurs tissus. Le protocole exige des souris génétiquement modifiées ciblant les neurones étudiés, une ressource que le porteur décrit comme sans équivalent dans d'autres espèces.

Objectifs

Objectifs. Le projet étudie une zone spécifique du tronc cérébral qui freine l’activité de neurones produisant de la dopamine, un neurotransmetteur impliqué dans la motivation et la prise de décision. Nous voulons savoir comment cette zone réagit à différents signaux sensoriels (sons, lumières, odeurs, toucher, chaud/froid), présentés à plusieurs intensités. L’objectif est de distinguer une simple mise en alerte (saillance) de ce qui est perçu comme désagréable ou potentiellement douloureux. Approche. Chez la souris, nous suivons l’activité globale de cette zone grâce à un enregistrement optique via une fibre très fine implantée de façon ciblée (chirurgie sous anesthésie et analgésie), pendant de courtes stimulations standardisées. Les protocoles sont calibrés pour éviter toute lésion (seuils d’arrêt stricts, périodes de repos entre sessions). Intérêt scientifique. On sait que cette zone inhibe les neurones qui produisent la dopamine et s’active face à des signaux désagréables, mais on ignore comment l’ensemble de ses neurones code l’intensité et la nature des signaux. Ce projet apportera des données inédites sur la dynamique de cette région, et précisera si elle encode surtout la valence négative (désagréable/douloureux) ou plus largement la saillance Retombées potentielles. Mieux comprendre ces circuits pourrait orienter des recherches futures sur les troubles liés à la douleur persistante et certaines altérations de l’humeur. Il s’agit de recherche fondamentale : aucune thérapie n’est testée, l’objectif est de comprendre le fonctionnement normal de ces circuits.

Bénéfices attendus

Le projet précisera le rôle d’une zone spécifique du tronc cérébral qui freine l’activité de neurones produisant la dopamine, lorsqu’un organisme est exposé à des signaux sensoriels présentés à différentes intensités. Grâce à un enregistrement optique via une fibre très fine, il fournira des données inédites sur la dynamique d’activité globale de cette zone et permettra de distinguer ce qui relève de la simple alerte (saillance) de ce qui est agréable, désagréable ou potentiellement douloureux. Au-delà de l’avancée conceptuelle, l’étude pourra dégager des profils d’activité (selon la modalité et l’intensité des signaux) utiles comme références expérimentales pour de futurs travaux. À terme, une meilleure compréhension de ces circuits pourra orienter des recherches sur les troubles liés à la douleur persistante et certaines altérations de l’humeur. Il s’agit de recherche fondamentale : aucune intervention thérapeutique n’est testée, l’objectif est de mieux comprendre le fonctionnement normal du cerveau.

Procédures

Une partie des animaux subira une chirurgie terminale d’une durée comprise entre 1h30 et 4h, destinée à la formation du personnel. Les autres animaux subiront une chirurgie sous anesthésie profonde (durée maximale 2H) nécessaire à l'enregistrement de l'activité des cellules cérébrales d'intérêt puis des tests comportementaux sur animal vigile d’une durée inférieure à 30 minutes, espacés d’au moins 2 jours. Chaque animal réalisera au maximum 6 tests sur 80 jours de durée du projet. Tous les animaux subiront une procédure terminale sous anesthésie profonde pour prélèvements de tissus d’une durée d’environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont limités au stress des manipulations, à une possible inflammation locale temporaire après chirurgie, et à une perte de poids passagère. Ces effets sont réversibles et font l’objet d’une surveillance.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus. Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde pour permettre les analyses de tissus nécessaires (vérification du ciblage, analyses histologiques). Ces vérifications sont indispensables à l’interprétation scientifique des données et ne disposent pas d’alternatives fiables sans prélèvement.

Remplacement

Les objectifs nécessitent de relier activité cérébrale et comportement dans un organisme intact. Les approches in vitro/in silico ne permettent pas de reproduire cette intégration ni de tester la dynamique d’une zone spécifique du tronc cérébral en situation réelle.

Réduction

Les expériences sont conçues de façon à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux questions scientifiques. Plan séquentiel par cohortes avec analyses intermédiaires pour n’inclure que le strict nécessaire. Les mêmes animaux sont testés sur plusieurs modalités (limite à 6/11) avec calendrier adapté aux tests et jours de repos, ce qui diminue le nombre total d’animaux. Les animaux pour la formation/validation proviennent en priorité de réutilisations, réformes ou génotypes non conformes.

Raffinement

Les souris sont hébergées en petits groupes dans des cages enrichies, contenant des tunnels, du coton, des bâtonnets à ronger et du matériel de nidification, afin qu’elles puissent se reposer, explorer et exprimer des comportements naturels. Avant toute expérience, les animaux sont habitués progressivement à l’expérimentateur, aux salles et aux dispositifs de test utilisés, dans le but de diminuer le stress pouvant être associé à un environnement nouveau. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et analgésie, et l’état des souris est surveillé attentivement après l’intervention pour vérifier leur bonne récupération et leur bien-être. Les sessions expérimentales sont courtes et espacées de périodes de repos afin d’éviter la fatigue et la sensibilisation. Pour les tests comportementaux, des points-limites sont mis en place afin d’éviter que les animaux ne soient exposés à une stimulation trop longue ou trop intense. À tout moment, si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, les expériences sont interrompues et une prise en charge vétérinaire est assurée. A la fin du projet, la procédure terminale est réalisée sous anesthésie profonde afin que l’animal ne puisse pas ressentir de stress ni de douleur. Toute nouvelle méthode validée permettant d’améliorer le confort ou de réduire la douleur sera intégrée au projet.

Choix des espèces

Le protocole requiert des souris génétiquement modifiées permettant de cibler spécifiquement les neurones de la zone étudiée ; cette ressource n’existe pas de façon équivalente dans d’autres espèces utilisables. Les études exigent des systèmes nerveux matures : les animaux seront adultes (en général ≥ 8 semaines et ≤ 12 mois), afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.