Procédures sans réveil

365 mini porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie abdominale allant jusqu'à quatre heures, avec pose d'un ballonnet gastrique, laminectomie et implantation d'électrodes pour stimuler le système nerveux, afin de développer un dispositif contre l'obésité. Les retombées annoncées pour les patients, un traitement moins invasif que la chirurgie de l'estomac, restent au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne convient et que l'obésité, phénomène complexe, doit être étudiée sur un "organisme vivant", retenant le mini porc pour sa proximité anatomique avec l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux chez le mini porc. Il existe de nombreux arguments et données scientifiques en faveur de l’existence d’une neuromodulation du système nerveux pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés par le système nerveux semblent jouer un rôle important dans la prise alimentaire. Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. En effet, les traitements les plus efficaces sont les approches chirurgicales lourdes comme la réduction de l’estomac, la technique du court-circuit des aliments, visent à limiter le volume de l’estomac pour réduire les prises alimentaires. Cependant, ces traitements sont très invasifs et entraînent de nombreux effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical, permettant par électrostimulation du système nerveux la régulation de la prise alimentaire, pourrait être un outil très prometteur pour lutter contre l’obésité. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par l'Agence fédérale américaine des produits alimentaires et des médicaments pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds (chirurgie de l'obésité), engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires pourraient apporter des solutions plus satisfaisantes pour les patients souffrant d’obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale qui n’excèdera pas 4h afin de réaliser les stimulations/enregistrements du système nerveux. Les durées des interventions sont : - Prémédication, injection de l’analgésique et l'analgésie 30 secondes, - Induction de la narcose par voie IV après pose d’un cathéter : 5 minutes - Intubation puis anesthésie à l'isoflurane 5 minutes - ouverture abdominale et identification des nerfs cibles 30 minutes, - pose d'un ballonnet gastrique par chirurgie ou par endoscopie 10 minutes - laminectomie et pose des électrodes 30 minutes - stimulation et enregistrement 3h sous anesthésie volatile à l’isoflurane Les animaux ne seront pas réveillés et seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Les 2 procédures de ce projet décrivent des actes chirurgicaux. Un certain niveau de douleur est attendu nécessitant des protocoles d’anesthésie / analgésie adaptés à l’espèce de façon à limiter au maximum la douleur. Les animaux seront mis en diète hydrique entre 16h et 20h avant le début de l'expérimentation. La paille du box pourra etre retirée la veille de l'intervention pour faciliter l'intubation. Le protocole d'anesthésié / analgésie, comporte une injection par voie intramusculaire puis une seconde par voie intraveineuse. L'animal sera ensuite intubé pour maintenir une anesthésie sous isoflurane. Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale; La chirurgie et les stimulations/enregistrements seront menés dans le respect de la règle des 3R.

Devenir

Les procédures comportent des chirurgies lourdes et invasives, il n’est pas envisagé de réveiller les animaux. Ils seront tous mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale. Des prélèvements des cibles d’intérêt comme les nerfs, ganglions, etc … pour une analyse histologique pourront être réalisés après mise à mort selon une méthode réglementaire dans les 2 procèdures.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de mini porc a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables grâce à l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Un suivi des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par le personnel de l’établissement utilisateur. A la fin de la période d’acclimatation, les animaux seront observés 2 fois par semaine minimum par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés selon la fiche annexée à ce projet. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude /ou du vétérinaire désigné. Lors des expérimentations, réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux seront sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Le mini porc est choisi comme espèce non-rongeur permettant d’étudier et d’évaluer l’efficacité d’un traitement afin de prédire une efficacité clinique chez l’Homme. Le mini porc est une espèce largement utilisée du fait de ses nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec l’Homme, en faisant une espèce de choix dans l’évaluation d’un dispositif médical implanté. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 14 semaines)

600 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil, dans le cadre d'un diplôme universitaire de microchirurgie. Chaque animal subit une à six interventions de suture d'artères, de veines ou de nerfs, sur des séances de quatre à six heures, non pour produire des connaissances mais pour former des chirurgiens. Le porteur indique gérer la douleur par analgésie peropératoire et mettre à mort les rats en fin de journée pour éviter les douleurs post-opératoires. Il affirme entraîner d'abord les internes sur des nouilles Konyaku et des modèles artificiels avant le passage sur rat vivant.

Objectifs

La chirurgie plastique et reconstructrice permet la réparation et la reconstruction de structures anatomiques pluritissulaires (peau, muscle, os, nerf, vaisseaux), à la suite de traumatismes ou de procédures chirurgicales. Parmi les options de reconstruction, le chirurgien plasticien est amené à réaliser des lambeaux libres, qui impliquent le prélèvement de tissus (peau, muscle, os) avec leurs vaisseaux nourriciers, pour la reconstruction d’une structure à distance (par exemple suite à une chirurgie carcinologique du sein, de la face, ou des membres). Cette technique nécessite le branchement des vaisseaux nourriciers (artère, veine) sur d’autres vaisseaux proches de la structure à reconstruire. Lors de sa pratique chirurgicale, le chirurgien plasticien est également amené à réaliser des réimplantations digitales ou de segments de membre en urgence (1-3 cas/100 000 habitants/an). Dans ces procédures, la réparation des vaisseaux est cruciale : il est toujours nécessaire, pour que le sang circule à nouveau et que la structure réimplantée survive, qu’une artère et une veine soient réparées. La chirurgie plastique et la chirurgie de la main sont réalisées et enseignées dans des centres spécialisés. Les internes en chirurgie plastique, et les internes en chirurgie orthopédique qui souhaitent se former à la chirurgie de la main, doivent obligatoirement se former aux techniques particulières de la microchirurgie, et détenir un diplôme universitaire de microchirurgie. L’enseignement de formation continue dispensé dans le cadre du diplôme universitaire de microchirurgie a pour but de permettre aux chirurgiens en formation de repousser leurs limites techniques sous microscope opératoire. L'objectif est d’acquérir, outre la maîtrise des gestes et des techniques, l’adaptabilité nécessaire en pratique clinique afin de permettre aux internes d'être autonomes dans la prise en charge des patients SOS main. Après avoir suivi u n enseignement théorique en microchirurgie médicale, des protocoles d’entrainement aux techniques chirurgicales de sutures nerveuses et vasculaires sont réalisés chez le rat car le diamètre des vaisseaux du rat correspond au plus petit calibre de vaisseaux que les chirurgiens auront à anastomoser chez l’homme. En parallèle, une formation sur l’éthique animale et une sensibilisation au respect du vivant sont dispensés dans le cadre du diplôme afin d’améliorer tant le savoir-faire que le savoir-être des chirurgiens en devenir.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont en termes de santé humaine : amélioration des résultats de réimplantations et de reconstructions par lambeau chez les patients se présentant avec des amputations de doigt ou de membre, ou des défects complexes mettant en cause le pronostic du membre atteint. Les compétences des internes, chirurgiens en devenir, seront améliorées et leur permettront une prise en charge optimale des patients de chirurgie plastique et de chirurgie de la main. Enfin, la réussite à ce diplome leur permettra de prétendre à la formation en chirurgie de la main et au titre de chirurgien de la main auprès de la SFCM (société française de chirurgie de la main).

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie générale, de type anastomose artérielle, veineuse ou suture nerveuse. Sur chaque animal 1 à 6 procédures chirurgicales seront réalisées, sur une durée de 4 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress lié à l'anesthésie et à la contention périanesthésique, réalisée par les personnels formés à ces gestes de l'animalerie ; douleur, qui sera gérée par le traitement analgésique peropératoire.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure, car il s'agit d'une procédure sans réveil.

Remplacement

Afin de remplacer au maximum l'utilisation de rats, les internes apprendront à travailler dans un premier temps sous microscope opératoire sur des modèles utilisant des nouilles Konyaku, pleines (suture simples) puis perforées (anastomoses vasculaires). Lorsque la phase d’apprentissage est acquise, ils travailleront ensuite sur des modèles artificiels de rat. La dernière phase sur rat vivant anesthésié aura lieu pour chaque étudiant lorsque les gestes techniques de base auront été maitrisés sur des modèles non vivants, permettant de diminuer le nombre d'animaux nécessaires.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au maximum, une procédure contenant un ou plusieurs gestes techniques étant prévue par animal dans la même journée. Pour des raisons de limitation des douleurs post-opératoires, notamment lors des gestes sur les nerfs sciatiques, les rats sont mis à mort en fin de journée. Il n'y a pas d'étude statistique permettant d'évaluer le nombre d'animaux nécessaires à cette formation.

Raffinement

Les procédures respectent le principe de raffinement, avec une gestion précise de l’analgésie pré-opératoire et per-opératoire (c'est à dire anesthésie générale et anesthésie locale), en limitant le nombre de gestes invasifs par animal, et en déterminant des points limites adaptés. Les animaux seront acclimatés pendant 4 à 7 jours avant d'être inclus dans la procédure (procédure classe sans réveil, durée 4 à 6h).

Choix des espèces

La taille des vaisseaux chez le rat est similaire à celle des artères et des veines devant être suturées chez l'être humain lors d'une réimplantation de doigt ou d'une reconstruction par lambeau libre. De même, la taille du nerf sciatique du rat est similaire à celle d'un nerf digital. Enfin, un modèle vivant permet le controle de la perméabilité des anastomoses, notamment l'identification de défauts qui entrainent la thrombose des vaisseaux mais ne sont pas identifiables sur modèle non vivant. Rats adultes Sprague Dawley de 300-350g Au delà de ce poids, l'anesthésie fixe estplus difficilement gérable et entraine des risques de sur- ou de sous-dosage. De plus, une masse graisseuse limitée facilite l'abord des vaisseaux et la réalisation des anastomoses.

61 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant maintenus endormis puis tués sans reprise de conscience. Chaque lapin reçoit un cathéter veineux, est intubé et ventilé mécaniquement pendant 48 heures, reçoit une injection de LPS puis une inoculation d'Enterobacter dans les poumons, pour tester des cellules souches contre une pneumonie acquise sous ventilation. Curarisés, les animaux sont tués par injection létale à la fin de l'expérience et leurs organes prélevés. Le porteur affirme que ce projet chez le lapin est un "prérequis indispensable" avant des essais chez les patients en réanimation.

Objectifs

Objectifs du projet : Objectif principal : Ce travail vise à évaluer l’effet d’une injection intraveineuse de cellules souches mésenchymateuses stromales (CSMs) sur la capacité du lapin à éliminer les bactéries au cours d’une infection du poumon à Enterobacter, acquise au cours de la ventilation mécanique (PAVM pour pneumonie acquise sous ventilation mécanique). Objectifs secondaires : - Evaluer l’effet d’une injection par les veines de CSMs au cours de la PAVM à Enterobacter aerogenes chez le lapin sur : o la capacité à éliminer la bactérie Enterobacter dans le sang, la rate ou le foie. o L’amélioration du fonctionnement immunitaire et des cellules o la correction des dysfonctions des différents organes - Evaluer l’effet d’une injection intraveineuse de CSMs, lorsque l’on associe ce traitement à un antibiotique, au cours de la PAVM à Enterobacter aerogenes chez le lapin sur : o la capacité à éliminer la bactérie Enterobacter dans le sang, la rate ou le foie. o L’amélioration du fonctionnement immunitaire et des cellules o la correction des dysfonctions des différents organes

Bénéfices attendus

Ce projet chez le lapin visant à évaluer l’effet de ce traitement à bases de cellules souches (CSMs), est un prérequis indispensable pour justifier l’évaluation des CSMs dans des essais chez les patients souffrant de pneumonie acquise sous ventilation mécanique en réanimation. De plus, nous pensons que ce travail permettra une meilleure compréhension des mécanismes d’action des CSMs.

Procédures

Les lapins seront soumis, par ordre chronologique durant l’expérimentation : - Pose d’un cathéter veineux central sous anesthésie générale (Kétamine et Xylazine administrées par voie intraveineuse) 72 heures avant le début de l’expérimentation (durée 60’). - Intubation orotrachéale par les voies naturelles sous anesthésie générale (Kétamine et Xylazine administrées par voie intraveineuse) pour mise en place d’une sonde d’intubation (20’). - Ventilation mécanique selon un schéma protecteur utilisant des paramètres ventilatoires similaires à ceux utilisés en pratique clinique (48h). - Injection de LPS (toxine Lipopolysaccharide) par voie intraveineuse via le cathéter central (2’) - Prélèvements sanguins veineux en utilisant le cathéter veineux (vigiles pour les animaux ventilés, sous anesthésie générale chez les animaux ventilés) (2’) - Inoculation intratrachéale bactérienne (inoculum calibré d’Enterobacter aerogenes), par la sonde d’intubation, chez l’animal en cours de ventilation mécanique sous anesthésie générale (2’) - Administration des CSMs et/ ou de l’antibiothérapie par le cathéter (2’) - Autopsie à 48 heures du début de l’expérimentation, après anesthésie par Kétamine et Xylazine puis injection létale d’Euthasol (30’)

Impact sur les animaux

Des études antérieures de notre équipe montrent qu’une ventilation mécanique (VM) prolongée (jusqu’à 48 heures) avec des paramètres de ventilation plus agressifs que ceux utilisés dans cette étude, n’entraine pas de risque vital pour le lapin. De plus, notre modèle de pneumopathie acquise sous ventilation (PAVM) à Enterobacter aerogenes chez l’animal ventilé et subissant une inoculation bactérienne, n’entrainait pas de risque vital pour le lapin dans un précédent travail de l’équipe. En revanche, l’injection de LPS au début de l’expérimentation n’a pas encore été évaluée dans notre modèle de PAVM à Enterobacter. La partie 1 du projet permettra d’évaluer l’effet de cette double agression (VM + LPS) et ainsi de valider notre modèle avant la réalisation des 2 essais thérapeutiques. Néanmoins : - L’ensemble des animaux ventilés sera sous anesthésie générale pendant l’ensemble de l’expérimentation (absence de réveil). - D’autre part, une injection de LPS à la même concentration que celle utilisée dans notre modèle n’entrainait pas de risque vital chez le lapin. Enfin, ce type d’expérimentation a été régulièrement réalisé chez des volontaires sains pour étudier le rôle de l’endotoxémie (effet du LPS), sans complication, en dehors de la fièvre produite par l’injection. Le cathéter veineux central préalablement posé sous anesthésie générale permet un contrôle précis de l’administration des thérapeutiques (afin d’assurer le bon déroulement de la VM) et la réalisation des prélèvements sanguins sans causer de douleur à l’animal. Les animaux seront présents à l’animalerie la veille du début de l’expérimentation. Les animaux resteront sous anesthésie générale pendant toute la durée de la manipulation sous Midazolam et Kétamine, en continu, afin d’éviter toute douleur et tout réveil intempestif. Les animaux sont aussi curarisés par Besilate de cisatracurium permettant une ventilation sans difficulté et sans aucun ressenti pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront tous mises à mort à la fin de la procédure sous anesthésie générale par une injection d’un mélange Kétamine + Xylazine suivi d’une injection létale d’Euthasol (0,5mg). Différents prélèvements seront effectués afin de réaliser les différentes mesures immunitaires, métaboliques, et afin d’évaluer les dysfonctions des organes. → Lavage broncho-alvéolaire : mesure de paramètres immunitaires et métaboliques (mitochondriaux) → Prélèvement de tissu pulmonaire : histologie pour apprécier les dommages tissulaires, bactériologie pour apprécier la clairance microbienne, extraction protéique pour mesures immunitaires, extraction d’ADN pour mesure du pool mitochondrial, extraction ARN pour mesures de paramètres mitochondriaux. → Prélèvement de foie et rate : bactériologie, extraction protéique Ainsi, ces différentes mesures permettront d’évaluer l’effet des agressions mécaniques et infectieuses, et l’effet des thérapies investiguées.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal est limité pour ce type d’expérimentation. L’utilisation de modèles d’étirements de cellules pulmonaires ne permet pas de reproduire l’infection, la réponse immunitaire et les conséquences sur le reste de l’organisme qui conduisent au décès. Le lapin est un modèle privilégié pour une VM prolongée par les voies naturelles. La VM de plus petits animaux nécessite en effet des procédures invasives telles que la trachéotomie, ne peut être conduite plus de 6 heures, et se complique fréquemment. Ceci est particulièrement vrai pour obtenir un modèle préclinique de PAVM, où le poumon doit être préalablement soumis à une agression mécanique (ventilation) +/- une première agression infectieuse pendant une durée suffisante (24h dans notre modèle). A cela s’ajoute la 2ème agression infectieuse (pneumopathie acquise sous VM), qui nécessite un temps d’évaluation suffisant (au moins 24 heures). L’ensemble de ces contraintes et la complexité du schéma chronologique ne peuvent être résumées avec l’utilisation de petits rongeurs, encore moins par des expérimentations in vitro. Enfin, lorsqu’injectées par voie intraveineuses, de précédents travaux montrent que les CSMs migrent dans l’organe atteint (poumon) et exercent leurs effets différemment selon l’environnement dans lequel elles se trouvent. Ce mode d’action des CSMs exige leur évaluation dans un modèle in vivo, reproduisant au mieux les conditions cliniques observées chez les patients (administration intraveineuse, au cours d’une pneumopathie sous VM).

Réduction

Pour la partie 1 du projet, l’objectif est de décrire l’effet des agressions (VM +/- LPS) en comparaison au groupe contrôle. Le nombre d’animaux choisi (5/groupe) est le nombre minimal permettant de réaliser des analyses statistiques, et basés sur nos précédents travaux. En revanche, les parties 2 et 3 correspondent à des essais thérapeutiques dont l’objectif principal est de démontrer un effet des CSMs sur la clairance bactérienne pulmonaire. Le nombre d’animaux choisi (10/groupe) a été calculé à partir des résultats obtenus dans un précédent essai thérapeutique chez le lapin évaluant l’effet des CSMs au cours de la pneumopathie à pneumocoque ventilée. Au total, le nombre maximal de lapins sera de 61 sur 24 mois - Partie 1 : n=5/groupe ; 3 groupes +/- 10% de perte attendue (17 lapins) - Partie 2 : n=10/groupe ; 2 groupes +/- 10% de perte attendue (22 lapins) - Partie 3 : n=10/groupe ; 2 groupes +/- 10% de perte attendue (22 lapins)

Raffinement

Chaque procédure (pose de cathéter, intubation, ventilation, inoculation, autopsie) est réalisée sous anesthésie générale. Un cathéter veineux central maintenu par un gilet permet de s’affranchir de ponctions veineuses itératives et assure une anesthésie constante. Les animaux sont hébergés à température réglée. L’intubation et l’inoculation se font sur un animal préalablement anesthésié par voie intra-veineuse par un mélange de Kétamine (27mg/kg) et Xylazine (2mg/kg). Un délai de 5 min est observé avant toute intervention. L’animal est pré-oxygéné. Un laryngoscope pédiatrique permet d’exposer les cordes vocales à la vue et d’insérer sous contrôle de la vue un guide semi rigide à bout mousse atraumatique entre les cordes vocales et par la suite la sonde d’intubation. En cas de mouvements moteur lors de la stimulation endobuccale au début de l’exposition de la filière respiratoire (mâchonnement), l’animal est reposé et une nouvelle dose de mélange anesthésique est administrée. Ainsi, l’intubation ne doit souffrir d’aucune résistance de la part de l‘animal. L’anesthésie est entretenue par administration intraveineuse d’un mélange de Kétamine (1mg/kg/h) et Midazolam (0.2mg/kg/h) ainsi qu’une curarisation Besilate de cisatracurium 0.8mg/Kg/h) à l’aide d’un pousse seringue électrique pendant toute l’expérimentation et jusqu’au décès. Le curare permet de maintenir l’animal immobile pendant toute la durée de l’expérimentation, évitant tout risque d’extubation. Les animaux sont positionnés sur un tapis chauffant (39°C), hydratés par perfusion continue de sérum physiologique (5ml/h) et les yeux hydratés puis occlus. Un scope permettra de dépister les variations de fréquence cardiaque et ainsi une possible dysfonction du système d’anesthésie pour y remédier rapidement. La mise à mort sera effectuée au terme de la durée d’expérimentation (24 ou 48h) par une injection létale d’Euthasol (0,5mg) administrée par le cathéter veineux central. Nous n’attendons pas de mortalité avec ce modèle d’après nos précédents travaux, et ceux d’autres équipes, mais si un décès survient, celui-ci surviendra sous anesthésie générale, sans réveil, jusqu’au décès spontané, ou lors de l’autopsie programmée à 48 heures. Une évaluation rétrospective sera effectuée à la fin du projet.

Choix des espèces

La ventilation prolongée est maitrisée sur de grands animaux (porc, singes). Les modèles sur petits rongeurs (souris, rat), ont de nombreuses limites qui rendent l’interprétation des résultats difficile : - Ventilation invasive par trachéotomie, source de complications (stress de l’animal, hémorragie, décès possible). - Contrôle difficile des volumes du fait de la taille de l’animal (une variation de volume peut entrainer des différences importantes en termes de lésions pulmonaires). - Durée de ventilation limitée (maximum 6h), l’information sera alors incomplète, car ne renseignant que sur les premières heures du processus. Le modèle du lapin permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, sans entrainer de répercussion vitale et sur les paramètres d’échange gazeux. La procédure expérimentale est envisagée sur des lapins de 2.8 à 3.3 kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont nécessaires. La filière respiratoire haute doit être suffisamment large pour permettre une intubation atraumatique (intubation plus difficile lorsque l’animal fait moins de 2,5kg). Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

860 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sans réveil. Ils subissent d'abord une chirurgie cérébrale d'injection de neuromodulateurs suivie d'au moins une semaine de récupération, puis un enregistrement électrophysiologique de trois à six heures sous anesthésie profonde, terminé par une mise à mort par perfusion transcardiaque, pour étudier le contrôle du circuit hippocampique de la mémoire. Le porteur range les nuisances parmi les conditions d'élevage "monotones", l'inconfort du réveil après la chirurgie et un risque infectieux. Il affirme que l'étude de circuits neuronaux intacts ne peut se faire ni in vitro ni in silico et retient le rat et la souris pour leur "équilibre" entre bénéfices et dommages.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de types neuronaux spécifiques dans l'organisation fonctionnelle des réseaux corticaux, et comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde (sans réveil), d'une durée de 3 à 6h, et enfin perfusion transcardiaque (sous anesthésie profonde), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

Les dommages suivants sont attendus : - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience

Devenir

Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem. A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation du rat et de la souris car ils présentent le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 15 à 25% de la moyenne. Conformément à la procédure décrite dans le document PHENOMIN, "Estimation du nombre d'animaux nécessaires", par Hugues Jacob du Com'Eth (Comité d'Ethique pour l'expérimentation animale), il faut un échantillon compris entre 5 et 20 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, 0.15µ

Raffinement

Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal. Afin de minimiser la douleur, les interventions chirurgicales sont effectuées sous traitement anesthésique local, général et analgésique. La température corporelle est maintenue pendant toute la chirurgie et lors du réveil grâce à une couverture chauffante. Un gel protecteur évite l'assèchement de l’œil. A l’issue de l’opération, l’évolution de la cicatrisation est suivie et l’animal est surveillé quotidiennement pendant plusieurs jours. Pendant toute la période expérimentale, des points limites sont fixés pour minimiser la souffrance et l'angoisse. Si l’animal présente des signes visibles de mauvaise santé ou d'inconfort (immobilité de l’animal, état de détérioration de sa fourrure (absence de toilettage par exemple), absence de la réaction comportementale aux stimuli externes, agressivité anormale lors de la manipulation, tremblements, attitude voutée ou poils hérissés, l'intervention du vétérinaire sera demandée, en plus de l'isolement de l’animal et d'un traitement immédiat par analgésique en cas de signes de douleur. En l'absence d’amélioration de l’état de l’animal dans les 24h après le traitement éventuel décidé par le vétérinaire au vu des symptomes, l'animal est euthanasié pour éviter toute souffrance supplémentaire. Tous les enregistrements électrophysiologiques sont effectués sur l'animal en état de sommeil narcotique (sans réveil puisque l'animal est mis à mort en fin d'expérimentation), donc en état d'inconscience totale, ce qui exclut toute possibilité de douleur, souffrance ou angoisse.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation du rat et de la souris car ces espèces présentent des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Le rat et la souris sont également des espèces de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec ces deux espèces, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les souris utilisées seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire. Le rôle fonctionnel de l'inhibition périsomatique est susceptible de varier fortement avec l'âge, au point que ces neurones ont été décrits comme essentiels dans l'expression des patrons d'activité qui modulent la maturité des circuits neuronaux du cortex et de l'hipocampe. Le projet inclut donc une étude selon le stade de développement, selon les 4 groupes d'age suivants, tels que définis dans la littérature chez le rat : P5-6 : stade immature, GABA excitateur P9-12 : stade immature, hétérogène P17-21 : stade adolescent, intermédiaire 4-8 semaines : stade adulte

75 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une craniotomie et l'implantation stéréotaxique d'une sonde de microdialyse couplée à un émetteur d'ultrasons, pour mesurer les effets de la neurostimulation par ultrasons de basse énergie sur trois structures du cerveau. Le porteur affirme que l'application des ultrasons et la microdialyse ne sont pas douloureuses, l'ensemble se déroulant sous anesthésie longue. Il indique avoir écarté la souris, dont le cerveau trop petit compliquerait le positionnement des sondes, et juge l'organisme entier nécessaire pour étudier la focalisation du faisceau.

Objectifs

La neurostimulation par ultrasons à basse énergie (Low-Energy Ultra-Sound ou LEUS pour l’abréviation anglaise) suscite un intérêt thérapeutique récent. Les LEUS focalisés offrent des possibilités de neurostimulation ciblée sur une région cérébrale spécifique avec une résolution spatiale de l’ordre du mm3. Dans le passé, il a été possible de déclencher des mouvements de membres, de vibrisses, d’yeux ou de faire dilater les pupilles par neurostimulation LEUS. Cependant, très peu d’équipes ont étudié les mécanismes des réponses induites par la neurostimulation LEUS. Une étude fondamentale est donc requise afin de comprendre les mécanismes de stimulation en vue d’applications cliniques de cette technologie. Il a été montré que les effets mécaniques des LEUS induisent une modification transitoire de la perméabilité membranaire des ions, ainsi qu’une modification des dynamiques calciques sur des modèles cellulaires, avec un processus similaire à une libération neuronale de transmetteurs. Il est également possible de reproduire in vivo des effets observés en cultures in vitro. Comme la modulation calcique est une approche thérapeutique intéressante dans le traitement de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, le projet a pour objectif : 1) D’intégrer le système LEUS à des outils utilisés en neurosciences (ici, à la microdialyse, technique d’échantillonnage extracellulaire utilisée chez l’animal ou chez l’homme) 2) De montrer que la stimulation LEUS peut moduler la libération de neurotransmetteurs. La présente demande inclut la partie du projet portant sur trois régions dopaminergiques : hippocampe, noyau accumbens et striatum, afin de caractériser les variations spatiotemporelles des taux de dopamine induites par LEUS.

Bénéfices attendus

La neurostimulation ou la neuromodulation fait partie des approches basées sur la transmission d’une énergie au cerveau pathologique qui ont pour but de modifier l’activité neuronale pour traiter des pathologies diverses comme la maladie de Parkinson, l’épilepsie, la dépression, la schizophrénie par exemple. Certaines techniques comme la “deep brain stimulation” (DBS), la « transcranial magnetic stimulation” (TMS), la « transcranial direct and analog current stimulation » (tDCS ou tACS) sont d’ailleurs connues et utilisées pour faire libérer la dopamine chez l’animal et chez l’homme et certaines sont mêmes utilisées en routine dans des protocoles bien définis et approuvés. Cependant, ces approches sont soit invasives et peuvent induire des complications post-opératoires (DBS), soit manquent d’une spécificité spatiale (TMS et tDCS ou tACS). La neurostimulation LEUS, basée sur la focalisation précise d’une onde à ultrasons de basse énergie, permettrait de s’affranchir de ces contraintes techniques. Comme les effets sont moins connus que les autres neurostimulations de par le développement plus récent de la technologie LEUS, le projet a pour objectif de montrer en termes de neuromodulation ce que peut apporter cette technologie sur des animaux sains puisque très peu de données sont disponibles. Les expériences réalisées dans le projet permettront une étude approfondie de la LEUS dans des zones cérébrales définies et les données obtenues sur la dopamine seront ensuite comparées à celles de la littérature scientifique portant sur d’autres techniques de neuromodulation. Elles permettront enfin de déterminer les nouvelles pistes thérapeutiques pour la poursuite de l’étude de la neurostimulation LEUS.

Procédures

Les 75 rats seront utilisés sous anesthésie générale, une seule fois sur une journée, dans le cadre de deux procédures sans réveil. Les 15 premiers animaux serviront pour optimiser les paramètes de stimulation LEUS (procédure n°1), les 60 autres animaux seront employées pour quantifier les effets neurochimiques de la stimulation LEUS dans trois structures cérébrales d’intérêt (procédure n°2). L’animal ressentira une légere douleur lors de l’induction de l’anesthésie mais ce geste sera réalisé par un expérimentateur formé afin de minimiser cette douleur. La bonne profondeur d’anesthésie vérifiée, une sonde de microdialyse couplé à un transducteur LEUS sera ensuite implantée dans le cerveau de manière stéréotaxique, après une fine craniotomie. La microdialyse est une technique d’échantillonage des composés cérébraux, mais sans aucun prélèvelement du liquide céphalo-rachidien. L’application des LEUS ne sera pas douloureuse non plus car elle n’est pas invasive. Aucune douleur ne sera ressentie par l’animal qui sera sous anesthésie générale durant cette procédure.

Impact sur les animaux

Les expériences seront réalisées sur des animaux sains anesthésiés et utilisés sans réveil. Les protocoles de stimulation cérébrale par ultra-sons n’entraîneront aucune douleur. L’anesthésique utilisé permettra une anesthésie longue (5h), ce qui sera au-delà de la durée maximale des expériences à réaliser.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet. Néanmoins, même si cela est très peu probable, si nous avions des animaux non utilisés (absence imprévue, prolongée et simultanée des deux expérimentateurs), les animaux seraient proposés aux autres expérimentateurs de notre animalerie.

Remplacement

Les premières données in vitro ont montré leurs limites à expliquer tous les effets LEUS, il est nécessaire de pouvoir comparer cette approche de stimulation à basse énergie aux données de la littérature obtenues avec d’autres types de stimulation (stimulation transcrânienne par exemple) qui ont montré des bénéfices thérapeutiques chez l’homme. De plus, pour faciliter l’étude de la focalisation d’un faisceau, nous devons disposer d’une structure cérébrale entière avec l’ensemble des afférences.

Réduction

75 animaux au maximum devraient être utilisés. Ce nombre est basé sur notre propre expérience et sur les statistiques appliquées à la microdialyse (ANOVA, mesures répétées, après consultation antérieure d’un biostatisticien). Nous prévoyons d’utiliser 15 animaux pour tester les paramètres de stimulation dans la procédure n°1 puis 60 animaux (10 animaux par groupe, 3 groupes de traitement LEUS + 3 groupes sham) avec les paramètres retenus pour la procédure n°2. Néanmoins, en nous basant sur une antérieure utilisant un autre type de neurotransmission par ultrasons, on espère pouvoir atteindre au moins 50% de libération de dopamine à la suite d’une stimulation LEUS, ce qui permettra de réduire le nombre des animaux à utiliser. Des analyses statistiques intermédiaires seront effectuées dès que les effectifs atteindront 5 puis 8 animaux par groupe afin de ne pas employer plus d’animaux que nécessaire. De plus, si une sonde de microdialyse était défectueuse pendant l’expérience et en fonction de l’étape d’implantation, nous implanterions la sonde de rechange soit dans la zone souhaitée, soit dans l’hémisphère opposé, ce qui aidera également à réduire le nombre d’animaux utilisés par groupe.

Raffinement

Nous effectuerons les expérimentations de mesures neurochimiques avant, pendant et après la neurostimulation de basse énergie sur des animaux anesthésiés, ce qui limitera la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux utilisés. En plus de notre démarche stricte de suivi quotidien du bien-être des animaux, nous ferons attention à n’ajouter aucun stress supplémentaire à l’expérimentation. Outre la douleur liée à l’injection de l’anesthésique général, nous réduirons les éventuels réflexes observés lors de l’incision de la peau par de la lidocaïne appliquée localement au niveau de la zone à inciser, nous injecterons du sérum physiologique à mi-parcours de l’expérimentation pour prévenir une éventuelle déshydratation. Nous utiliserons une procédure d’anesthésie qui associe un antidote prévenant les éventuels surdosages et qui respecte le bien-être animal tout en permettant à l’expérimentateur de faire face à une éventuelle complication anesthésique.

Choix des espèces

Notre choix s'est orienté vers le modèle rat qui est un modèle classique d'étude du fonctionnement du cerveau en lien avec des stimulations cérébrales. De plus, chez le rat adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer les fonctions neurochimiques dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle rat possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les rats ont une taille cérébrale qui permet d’étudier de nombreuses aires cérébrales retrouvées également chez l’homme : striatum dorsal, noyau accumbens et hippocampe dorsal ciblés dans notre projet. Vu la taille de son cerveau, une souris n’est pas un modèle retenu dans notre étude puisqu’il présenterait des difficultés expérimentales supplémentaires telles que l’encombrement des sondes de microdialyse vis-à-vis du positionnement du transducteur ultrasonore. Les rats utilisés seront des jeunes adultes sexuellement matures, de plus de 2 mois (entre 280 et 320 g)