Procédures sans réveil
Mise en place d’un protocole d’ischémie rénale pour l’évaluation d’un dispositif de captage de métaux lors d’une dialyse chez le porc.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
120 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Après une chirurgie pouvant durer six heures, une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée, que le porteur décrit lui-même comme une maladie "grave, durable et irréversible" et douloureuse, avant de tester un dispositif d'épuration par dialyse. Les animaux sont réveillés une fois l'insuffisance installée puis tués pour analyse des reins. Le porteur juge le modèle porcin "indispensable" par sa taille et sa proximité anatomique avec l'humain, les cathéters et le générateur de dialyse humains pouvant lui être appliqués.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiue est une complication fréquente de diverses maladies, notamment de la déplétion volumique des lésions d'ischémie-reperfusion , du choc septique, des traumatismes et des molécules
Bénéfices attendus
Le bénéfice est double : - disposer d'un modèle animal qui sera utilisable pour d'autres études précliniques sur l'Insuffisance Rénale Aigue - tester des traitement en urgence, lors de l'apparition de l'IRA, à ses stades précoces.
Procédures
Les premières procédures de mise en place du modèle sont des procédures chirurgicales sans réveil qui peuvent durer jusqu'à 6h. En revanche le sprocédures suivantes qui constituent l'étude sont des procédures chirurgicales au cours desquelles on provoque une maladie grave et définitive : l'insuffisance rénale aigue. Il s'agit d'un dommage grave, durable et irréversible. Elles peuvent durer jusqu'à 2h
Impact sur les animaux
Les premières procédures de faisabilité ont lieu sans réveil, avec une sédation profonde. En revanche, les procédures suivantes, lorsque le modèle sera bien décrit, pourront présenter des effets indésirables pour les Porcs. En effet l'IRA est considérée comme une maladie doulouresue.
Devenir
Nous procédons à des analyses histologiques systématiques des reins des Porcs. Ils sont donc tous euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
Après des études de circulation extracorporelle menées in vitro en amont pour la mise au point des dispositifs, le modèle préclinique animal est indispensable afin de tester les dispositifs et stratégies d'épuration chez l'animal avant l'application à l'homme. Il permet également de répondre à des questionnements issus de centres de dialyse humains et des services de réanimation hospitaliers pour lesquelles les méthodes alternatives sont inadaptées. Par ailleurs, le modèle d'insuffisance rénale ainsi que les études d'épuration et leurs répercussions sur les fonctions physiologiques ne peuvent être testées que sur un être vivant du fait de la complexité des organismes.
Réduction
Dans un premier temps, les études de faisabilité portent sur des groupes de 3 animaux uniquement pour vérifier que la méthode de mise en place du modèle fonctionne. Si la méthode fonctionne sur 3 animaux consécutifs, avec la même méthode, on considère que c'est le bon modèle et on arrête l'essai. Par la suite, le projet prévoit des essais de traitement de l'IRA qui se feront sur des groupes réduits, de 3 animaux, en suivant les paramètres de biologie clinique du rein. Ces essais se font de petits effectifs avec un effort de réduction optimal et d'exploiration rapide des résultats pour passer directement aux applications à l'homme.
Raffinement
Les deux première procédures ont lieu sans réveil. Les porcs sont hébergés en groupe pendant la période d'acclimatation, et vivent dans un milieu adapté avec un enrichissement optimal. Les procédures suivantes visent à réveiller les animaux une fois l'insuffisance rénale en place. Un dispositif de suivi très fréquent des animaux (2 à 3 fois par jour) permettent de suivre l'évolution des signes cliniques et d'anticiper au mieux les effets d' l'insuffisance. Dans la situation la pire, l'animal sera anesthésié puis euthanasié.
Choix des espèces
S’il n'est pas possible de dialyser un animal trop petit du fait du volume mort dans le circuit de dialyse, la taille du porc permet de créer une circulation extracorporelle, d'équiper l'animal avec des cathéters destinés à l'homme, d'utiliser le générateur de dialyse humain et de prélever les échantillons sanguins nécessaires aux analyses sans spoliation sanguine délétère. En plus de sa taille, le choix du porc comme modèle animale est justifié car il est l’un des modèles animaux qui se rapproche le plus de l’homme du fait de son anatomie et de sa physiologie rénale et de son volume sanguin. Il s'agit de jeunes porcs en croissance. Leur poids est de 50 kg, ce qui correspondant à environ 3 mois. Travailler sur des porcs adultes est peu envisageable en raison du poids atteint par des animaux en fin de croissance.
Les néo-sarcomes secondaires post-radiothérapie : évaluer l’accumulation de cassures simple-brin de l’ADN dans les tissus situés en marge du territoire irradié.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue dont une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures déclarées de gravité légère. Placées sous anesthésie au contact d'un objet irradié cinq jours sur sept pendant sept semaines, tondues et privées de supplément en niacine, elles servent à mesurer l'accumulation de cassures de l'ADN dans les tissus voisins d'une zone irradiée. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable, les souris ne recevant que de très faibles doses. Il indique avoir d'abord travaillé sur cultures cellulaires et juge désormais l'étape animale nécessaire pour vérifier ces résultats dans un organisme entier.
Objectifs
Plus de la moitié des cancers sont traités par radiothérapie, seule ou en combinaison avec de la chimiothérapie ou de la chirurgie. Les radiations utilisées pour le traitement créent des cassures sur les deux brins de la double hélice d’ADN, qui sont létales pour les cellules cancéreuses. Bien que les techniques de radiothérapie soient de plus en plus précises, les rayonnements touchent toujours des cellules saines à proximité de la zone traitée, ce qui induit des effets secondaires. Certains sont immédiats, comme une réaction inflammatoire, d’autres sont beaucoup plus tardifs, avec un risque de développement d’un second cancer. Les seconds cancers sont extrêmement rares, mais souvent sévères, avec un taux de survie à 5 ans compris entre 10 et 40%. Comme ils se développent de nombreuses années après la radiothérapie initiale, ils concernent principalement des personnes ayant souffert d’un cancer durant leur enfance. Il est donc important et urgent de comprendre les mécanismes responsables du développement de ces cancers afin de pouvoir mieux prévenir leur formation. Lors d’études précédentes réalisées sur des cultures de cellules, nous avons montré que les cellules saines en bordure de zone traitée, recevant uniquement de très faibles doses de rayonnements, subissent aussi des cassures de l’ADN, mais seulement sur un brin, ce qui n’est pas létal pour les cellules, mais induit leur sénescence prématurément, ce qui se traduit entre autres par un arrêt de prolifération. Puis, quelques rares de ces cellules sénescentes évoluent vers un état pré-tumoral. L’objectif de ce projet est de vérifier une partie de ces résultats chez l’animal, notamment l’accumulation de cassures simple-brin de l’ADN, qui est l’étape cruciale pour l’induction de la sénescence puis l’acquisition de mutations nécessaires à l’évolution tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement des seconds cancers post-radiothérapie. Les résultats seront publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. La compréhension de ces mécanismes pourrait doter la clinique de marqueurs prédictifs de risque d’apparition des seconds cancers, que pourraient être les marqueurs de sénescence et de cassures simple-brin l’ADN. Des traitements préventifs ciblant les cellules sénescentes pourraient ensuite faire l’objet d’essais cliniques.
Procédures
Afin de n’étudier que l’effet des radiations sur les cellules saines en bordure d’une tumeur, nous n’irradierons pas les souris directement, mais nous les placerons en contact étroit avec un objet mimant la tumeur, appelé fantôme qui, lui, sera irradié. Les irradiations suivront un protocole similaire à celui appliqué aux patients, soit 2 Gy par séance quotidienne, sauf les week-ends, pendant maximum 7 semaines. De façon à bien assurer le contact entre la souris et le fantôme, les souris seront tondues et du gel d’échographie sera appliqué sur leur peau. Pendant la tonte et l’irradiation, les souris seront anesthésiées (anesthésie gazeuse). Les souris seront euthanasiées après une irradiation et à la fin de chaque semaine et des fragments de tissus seront prélevés. Ils feront ensuite l’objet d’analyse microscopique pour quantifier l’accumulation des cassures simple-brin de l’ADN au fur et à mesure des irradiations. Nous comparerons les résultats à des contrôles négatifs d’âge égal et manipulées comme les souris irradiées (anesthésie, tonte et application de gel d’échographie). Nous réaliserons également des contrôles positifs, c’est-à-dire des souris qui seront irradiées directement une fois et qui auront donc des cassures simple-brin de l’ADN. Deux jours avant le début du protocole d’irradiation, puis pendant tout le protocole jusqu’à l’euthanasie finale, l’alimentation des souris qui est très enrichie en vitamines passera à une alimentation sans supplémentation en niacine (= vitamine B3). En effet, la niacine est nécessaire à la réparation des cassures simple-brin de l’ADN. Un excès, bien supérieur à la quantité naturellement présente dans les céréales composant les granulés de l’alimentation des souris en animalerie et bien supérieur à la quantité moyenne présente dans l’alimentation humaine, pourrait minimiser les effets de la radiothérapie. Nombre de souris et nombre d’irradiations : - 5 souris placées en contact d’un fantôme irradié 1 fois - 5 souris contrôle négatif - 5 souris contrôle positif irradiées directement 1 fois - 5 souris placées en contact d’un fantôme irradié 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs (= 1 semaine) - 5 souris contrôle négatif - Même procédure que précédemment à 2, 3, 4, 5, 6, 7 semaines. Au total, nous aurons besoin de 85 souris. Nous prévoyons le double, pour pouvoir refaire tout ou en partie la procédure en cas de problème, soit 170 souris au maximum.
Impact sur les animaux
Pour les souris contrôle positif, aucun effet indésirable n’est prévu, car elles seront euthanasiées tout de suite après irradiation. Pour les souris contrôle négatif, elles ne subiront qu’un rasage une fois tous les 8 ou 15 jours, une anesthésie gazeuse et une application de gel d’échographie quotidiennes, ce qui ne devrait pas avoir d’effet indésirable. Pour les autres souris, aucun effet indésirable n’est prévu non plus car, en n’étant pas irradiées directement, elles ne recevront que des doses très faibles, ce qui ne devrait pas induire de réaction inflammatoire. Par ailleurs, elles ne devraient pas avoir le temps de développer de seconds cancers, car les cancers induits par irradiation chez la souris sont connus pour se développer après une période d’au moins 18 mois. Deux jours avant, puis pendant tout le protocole d’irradiation, le régime alimentaire des souris comprendra uniquement la niacine apportée par les céréales (soit 50mg/kg, à comparer aux 70mg/kg des régimes supplémentés), alors que le minimum recommandé est de 30mg/kg. Cette absence de supplémentation en niacine ne devrait donc pas changer la physiologie globale des souris, d’autant qu’elle ne sera pas réalisée pendant la croissance des souris.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les souris seront sacrifiées et des prélèvements de tissus seront réalisés pour des analyses microscopiques. Les analyses consisteront à quantifier les cassures simple-brin de l’ADN dans les cellules devenues sénescentes suite aux irradiations successives.
Remplacement
Nous avons déjà répondu à l’injonction de remplacement en réalisant des études préalables utilisant des cellules en culture. Nous avons ainsi pu montrer que les radiations touchant les cellules saines situées en bordure d’une zone irradiée induisent des dommages à l’ADN (des cassures simple-brin) qui s’accumulent et de la sénescence cellulaire. Ces résultats ont été publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. Mais nous ne pouvons affirmer que ces évènements (cassures simple-brin de l’ADN et sénescence) auront lieu dans des cellules incluses dans un organisme, avec notamment un système immunitaire qui pourrait éliminer les cellules sénescentes. C’est pourquoi, même si nous avons commencé par remplacer l’expérimentation animale par des études in vitro, nous devons maintenant procéder à des études chez l’animal.
Réduction
Notre stratégie expérimentale est composée de deux étapes. La 1ère étape déterminera l’avenir du projet qui ne sera poursuivi que si nous détectons bien une formation de cassures simple-brin de l’ADN dans les tissus à distance de la zone irradiée. Plusieurs échantillons de tissu à même distance de la zone d’irradiation seront pris par souris ce qui permet d’augmenter le nombre d’échantillons. Un calcul de puissance statistique en se basant sur nos résultats in vitro nous indique que 2 souris par lot seraient suffisantes. Néanmoins, étant donné que les résultats pourraient être plus variables in vivo qu’in vitro, nous monterons à 5 souris par lot. Trente souris seront donc nécessaires (5 par lot, 3 lots, multiplié par deux pour pouvoir refaire l’expérience en cas de problème). La 2ème étape permettra de déterminer si les cassures simple-brin de l’ADN s’accumulent au fur et à mesure des irradiations d’un protocole mimant un traitement de radiothérapie anti-cancéreuse standard et induisent la sénescence. Nous limiterons à 7 semaines d’irradiation, ce qui correspond au traitement maximal appliqué chez l’homme. Nous fixons a priori la taille des lots à 5 comme pour l’étape 1, mais si en fonction des résultats de l’étape 1, il est possible de diminuer le nombre de souris, nous le ferons. Nous prévoyons donc cent quarante souris (5 par lot, 14 lots, multiplié par deux en cas de problème).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages d’une animalerie thermiquement et hygrométriquement régulée, avec un éclairage alternant jour/nuit. Elles auront accès à de l’eau stérilisée et à une alimentation à volonté. Leurs cages seront équipées d’une litière enrichie de 2-3 nestlés. Pour chaque manipulation (rasage, irradiation), les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Les manipulations des animaux (mise en cage, anesthésie, irradiation, mise à mort) seront réalisées par un personnel qualifié. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur euthanasie. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole d’irradiation et mis à mort. Des échantillons de tissus seront alors prélevés et analysés comme prévu, pour ne pas perdre de données.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée en radiobiologie et cancérologie, dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. De plus, nous utiliserons une souche de souris transgénique (p16-tdTomato : insertion de tdTomato fluorescent dans le gène p16) qui permet d’analyser facilement les cellules sénescentes. Enfin, en lien avec notre problématique, la souris est connue pour développer des cancers lorsqu’elle est soumise à des irradiations. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 10 semaines. L’acquisition de la taille adulte permettra de placer toujours la souris de la même manière en contact avec le fantôme irradié. La sénescence cellulaire survient avec l’âge. C’est la raison pour laquelle nous utiliserons des souris jeunes pour être le moins possible parasité par la sénescence survenant spontanément avec l’âge.
Evaluation d’une méthode d’imagerie permettant de mesurer l’intégrité de nanovecteurs lipidiques après injection intramusculaire chez le rat
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
108 rats femelles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures mêlant gravité modérée et actes menés sous anesthésie sans réveil. Ils reçoivent une injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques et subissent des examens d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésies répétées, avant le prélèvement du muscle injecté, pour évaluer une méthode de suivi de nanomédicaments. Le porteur signale que les anesthésies répétées peuvent entraîner une déshydratation. Il indique que le remplacement reste difficile faute de reproduire in vitro l'environnement musculaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années, les nanoparticules thérapeutiques suscitent une grande attention dans le domaine pharmaceutique en raison de leur capacité à délivrer des traitements personnalisés et efficaces avec moins d'effets secondaires. Malgré la présence de nombreuses publications sur les avantages des nanoparticules thérapeutiques, seul un faible nombre de « nanomédicaments » sont actuellement mis sur le marché. La compréhension des mécanismes complexes d’interaction des nanoparticules avec les barrières biologiques et l’étude de leur intégrité post-administration sont actuellement des limites à dépasser pour accroitre le développement de nouveaux médicaments. Une connaissance approfondie de ces paramètres permettrait à terme d’optimiser les performances de ciblage, mais aussi d’améliorer la délivrance d’actifs thérapeutiques en comparaison aux traitements existants. Dans le cadre de futures études pré-cliniques visant à la validation de candidats médicaments nanovectorisés, il est actuellement essentiel de développer des outils permettant de caractériser leur devenir une fois administré in vivo. Au cours de la pandémie de COVID-19, l’usage thérapeutique des nanoparticules lipidiques s’est amplifié via le développement des vaccins Pfizer/BioNtech et Moderna. Depuis plusieurs années, la communauté scientifique a acquis une expertise dans le développement de nanoparticules lipidiques - notamment des nanocapsules lipidiques - utilisant des matériaux biocompatibles et biodégradables. Alors que l’innocuité in vitro des nanocapsules lipidiques a été montré au cours de multiples études, leur profil pharmacocinétique après injection intramusculaire in vivo demeure peu connu. Une méthode innovante de spectroscopie localisée de diffusion par résonance magnétique a été développée par notre plateforme technique. À ce jour, cette nouvelle méthode permet de caractériser in vitro les propriétés intrinsèques de chacun des composants qu’ils soient pris séparément ou associés sous forme de nanomédicaments. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la capacité de cette nouvelle méthode de caractérisation à suivre le devenir, et potentiellement l’intégrité, de thérapies in vivo. Les objets testés seront des nanocapsules lipidiques de tailles variables afin de solliciter différents mécanismes d’internalisation cellulaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus par ce projet seront de proposer une méthode de suivi des nanomédicaments, en particulier des nanocapsules lipidiques qui sont des nanoparticules analogues à celles actuellement largement utilisées dans le cadre de la lutte contre le COVID-19. La méthode proposée se base sur des appareillages largement rependus en clinique et pourra de ce fait être déployée dans les services de radiologie. Il est à noter que cette méthode d’imagerie fonctionne en l’absence de rayonnements ionisants et de part son caractère non invasif, permet des mesures répétées sur les mêmes individus et in fine permet d’obtenir l’information recherchée tout en limitant le nombre d’individus nécessaires. Dans le cadre de l’étude du devenir des nanocapsules lipidiques après injection intramusculaire, cette technique nous permettra de caractériser la cinétique de dégradation et ou d’internalisation de ces nanomédicaments en fonction du temps mais aussi d’étudier l’influence de la taille de ces nanomédicaments sur les cinétiques de dégradation et ou d’internalisation puisqu’il a été démontré qu’en fonction de la taille des objets, la voie d’internalisation préférentielle diffère. À plus long terme, nous pouvons espérer que cette technique pourra être déclinée pour l’étude d’autres nanomédicaments ou de vesicules endogènes.
Procédures
Trois procotoles sur des rats Sprague-Dawley femelles de 12 semaines permettront d’évaluer par imagerie par résonance magnétique (IRM) le devenir de nanocapsules lipidiques de différents diamètre (50 nm, 100 nm et 25 nm respectivement) après injection intramusculaire de 50 µL de suspension. Chacun de ces protocoles sera divisé en deux études. La première étude évaluera la dose permettant d’observer les nanocapsules lipidiques durant la phase précoce après l’injection. 3 lots de 5 rats recevront une injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques à différentes doses et suivront juste après un examen d’imagerie/spectroscopie par IRM. Tous les gestes de cette étude sont réalisés sous anesthésie générale en 40 à 50 minutes pour chaque animal avec un suivi permanent de la température et la respiration. La seconde étude évaluera l’impact du temps sur la mesure suivant l’injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques. 2 lots de 8 rats recevront une injection intramusculaire de suspension de nanocapsules lipidiques (dose déterminée selon les résultat de la première étude). Tous les animaux de cette étude suivront un examen d’imagerie/spectroscopie par IRM selon ces temps d’observation : Groupe 1 : 1h, 6h, 12h, 24h, 48h. Groupe 2 : 1h, 3h, 9h, 24h, 48h. Tous les gestes de cette étude sont réalisés sous anesthésie générale en 40 à 50 minutes pour chaque point d’étude pour chaque animal avec un suivi permanent de la température et la respiration.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’injection intramusculaire et aux anesthésies répétées. Dans des études antérieures (Nel, 2018 & 2019), l’injection IM de 40µL de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) ne s’est jamais accompagnée d’effets indésirables notoires. Toutefois, nous avons identifié cette phase du protocole comme point de vigilance. Il est à noter que nous aurons une information anatomique du point d’injection grace à la réalisation d’IRM. Les anesthésies répétées peuvent quant à elles s’accompagner de déshydratation. Une injection de 1 ml de serum physiologique sera réalisée au niveau de l’espace interscapulaire à la fin de chaque série de mesure. D’ordre général, une attention particulière sera portée à l’évaluation de l’inconfort des animaux durant les heures et les 2 jours suivant l’injection intramusculaire.
Devenir
Procédure 1 : Injection intramusculaire de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) et examen d’imagerie/spectroscopie par IRM : évaluation de la dose permettant d’observer les LNC durant la phase précoce après l’injection (étude 1). Cette procédure requierts la mise à mort de l’ensemble des animaux, car le prélevement du muscle injecté est prévu en fin d’étude (à T = 1h post-injection). Une analyse histologique de la zone prélevée sera ensuite faite par microscopie électronique à transmission pour localiser les nanocapsules lipidiques. Cette localisation visuelle permettra d’établir d’éventuels liens de corrélation entre les résultats obtenus par spectroscopie de diffusion et microscopie électronique à transmission. Procédure 2 : Injection intramusculaire de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) et examen d’imagerie/spectroscopie par IRM : évaluation de l’impact du temps suivant l’injection d’une suspension de LNC sur la mesure (étude 2). Cette procédure requierts la mise à mort de l’ensemble des animaux, car le prélevement du muscle injecté est prévu en fin d’étude (à T = 48h post-injection). Une analyse histologique de la zone prélevée sera ensuite faite par microscopie électronique à transmission pour localiser les nanocapsules lipidiques. Cette localisation visuelle permettra d’établir d’éventuels liens de corrélation entre les résultats obtenus par spectroscopie de diffusion et microscopie électronique à transmission.
Remplacement
Le remplacement a été évalué mais la complexité de l’environnement musculaire associé à la dynamique du flux sanguin, la réponse inflammatoire engendrée par l’injection intramusculaire ainsi que la contrainte mécanique du muscle sur le produit injecté (provoquée par le déplacement de l’animal post-anesthésie notamment) ne sont actuellement pas reproduite in vitro. Le remplacement est par conséquent difficilement envisageable.
Réduction
La méthode d’imagerie à évaluer permet un suivi non-invasif du site d’injection. Cette méthode permet ainsi d’effectuer des mesures de manière répétées sur un même animal. En conséquence, cette méthode d’analyse permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre a été estimé en fonction des protocoles précédemment réalisés par le laboratoire (pour des résultats statistiquement exploitables) en tenant compte des risques inhérent à chaque phase. L'évaluation du devenir des nanocapsules lipidiques se fera par mesure du coefficent de diffusion de chaque constituant. Nous étudierons sur chaque groupe de rat l’évolution statistique de ce coefficient de diffusion.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages normalisées et en groupes, en pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées et auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à leur disposition un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Avant toute expérimentation, une période minimale de 7 jours d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement sera observée. Lors des expérimentations, une attention particulière sera portée au maintien en normothermie des animaux à chaque phase, y compris lors de l’injection intra-musculaire et de l'examen en Imagerie par Résonance Magnétique par l'utilisation de tapis chauffant avec contrôle rectal de température. Toutes les expérimentations sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi en temps réel de la fréquence respiratoire de chaque animal sera effectué durant tout l’examen d’imagerie/spectroscopie. Une réhydratation par injection sous-cutanée de sérum physiologique est prévue en fin d’anesthésie pour chaque animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état évalué à partir d’une grille de scores comprenant des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance. L’examen d’imagerie a déjà été validé in vitro et est bien maitrisé. Cet examen permet d’observer la présence ou l’absence d’inflammation grâce à l’acquisition locale de données d’imagerie au niveau de la zone d’injection. En cas d’inflammation observée par IRM, un suivi renforcé de l’animal sera effectué au réveil. Cet examen est en mesure de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un modèle utilisé au laboratoire comme modèle préclinique. Des rats Sprague Dawley femelles de 12 semaines seront utilisés afin de pouvoir injecter en totalité le volume de suspensions de nanocapsules lipidiques nécessaire sans induire de souffrance pour l’animal ni de perte de produit, qui seraient conséquentes à un volume musculaire trop faible rencontré chez des rats plus jeunes.
Etude de faisabilité et de sécurité d’une procédure mitrale Valve-in-valve
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
12 porcs adultes vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale puis tués avant tout réveil. Chaque animal subit une intervention cardiaque d'environ trois heures reproduisant une pose de valve mitrale par voie mini-invasive, pour tester la faisabilité et la sécurité de la technique avant son usage chez l'humain. Le porteur indique qu'aucun calcul statistique n'est prévu et limite la démonstration à douze animaux. Il présente le porc comme le modèle dont l'anatomie cardiaque se rapproche le plus de celle de l'humain.
Objectifs
Les valvulopathies sont des maladies cardiaques fréquentes liées au vieillissement de la population. Le traitement consiste à réparer ou remplacer la valve par chirurgie cardiaque. Il s’agit d’une technique lourde. Pour les patients les plus fragiles, des techniques percutanées (techniques réalisées par des gestes opératoires faits par des mini-incisions) sont en cours de développement. Acutellement des sociétés pharmaceutiques proposent d’implanter une nouvelle valve à l’intérieur de l’ancienne (techniques de « Valve-in-valve »). Ces techniques mini-invasives présentent de nombreux intérêts. Il est à noter que la valve aortique est déjà ainsi traitée depuis plusieurs années. Ces techniques ont lieu sous guidage échographique et fluoroscopique. Cependant, ce n'est pas le cas pour la valve mitrale, et comme pour toute bioprothèse, une dégénérescence de cette valve est attendue dans quelques années. Il faudra alors être en mesure de proposer une technique de réparation efficace et mini-invasive aux patients. La faisabilité du traitement de la dégénérescence de la bioprothèse mitrale selon une technique mini-invasive n’a encore jamais été démontrée. L'équipe projet propose ici de faire la preuve de cette faisabilité sur l’animal avant de pouvoir la mettre en application chez l'Homme. L’expérimentation consistera à la réalisation sur un animal de la procédure opératoire de remplacement de la valve cardiaque selon la technique étudiée. Le modèle porc a été choisi car il est le plus proche de l'anatomie cardiaque humainre. Douze animaux seront inclus dans le projet.
Bénéfices attendus
Aucun médicament n’est efficace sur l’évolution de la maladie et le traitement consiste en général à mettre en place des prothèses valvulaires de substitution. Elles peuvent être implantées par voie chirurgicale conventionnelle mais les voies mini-invasives représentent assurément l’avenir de ces traitements. Les bioprothèses communément utilisées sont fabriquées avec du péricarde animal de porc ou de veau et ont une durée de vie d’environ 10 ans. Ensuite, on assiste à une dégénérescence de la prothèse de la valve avec réapparition des symptômes et de la maladie. Plus âgés, fragiles et déjà opérés, ces patients sont alors à coup sûr de mauvais candidats pour une chirurgie cardiaque, car il y aurait trop de risque pour la personne lors de l'intervention. Aussi, les techniques de « Valve-in-valve » aortiques ou mitrales faisant appel à des voies percutanées sont maintenant bien établies avec les valves implantées chirurgicalement. La première valve percutanée mitrale n’a obtenu le marquage CE qu’en 2020. D’ici quelques années, les équipes médicales devront donc être capables de prendre en charge les dégénérescences de ces dispositifs. Le bénéfice principal de ce projet est de montrer que cette technique est faisable et sûre est d’ores et déjà primordial pour éviter des impasses thérapeutiques.
Procédures
Les animaux sont soumis à une unique intervention, qui est une intervention similaire à celle réalisée chez l'Homme dans le cadre de la prise en charge d'une maladie de valve cardiaque, cette opération dure environ 3h, elle est réalisée sous anesthésie générale avec le suivi des paramètres vitaux en continu, cette procédure est sans réveil.
Impact sur les animaux
Dans les expérimentations proposées ici, l’animal est anesthésié dès le début de la procédure et maintenu sous anesthésie générale durant toute l’expérimentation. La procédure peut se compliquer par des troubles hémodynamiques ou rythmiques qui seraient pris en charge de manière adaptée par des molécules de réanimation conformément à ce qui est mis en place pour une intervention chez l'Homme. L’animal est sacrifié à la fin de l’expérimentation afin de pouvoir réaliser des analyses ex-vivo, il s’agit d’une intervention sans réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'opération chirugicale afin de réaliser des analyses ex-vivo (procédure sans réveil). Les animaux qui ne seraient pas inclus dans le projet seraient réutilisés dans d’autres projets du laboratoire.
Remplacement
Avant de pouvoir envisager ce traitement chez l’homme en toute sécurité, il est nécessaire de montrer la faisabilité et la sécurité de la technique chez l’animal vivant dans des conditions anatomiques aussi proches que possible de celles de l’homme. Cela permet d’acquérir les compétences techniques (guidage fluoroscopique, échocardiographique, déploiement de la valve) indispensables avant de procéder à une telle implantation chez l’homme.
Réduction
L’étude de la faisabilité sur l’animal est précédée de tests techniques sur modèles inertes. Cependant, il est indispensable de démontrer la faisabilité et la sécurité du procédé sur l’animal vivant avant de le considérer applicable chez l’humain. Nous proposons de limiter la démonstration à 4 animaux pour chacune des deux tailles de valve. Il n’y aura pas de calcul statistique réalisé. Douze animaux sont demandés dans le cadre du projet, huit animaux seront inclus dans le cadre des tests et quatre animaux seront éventuellement inclus en cas de décès prématuré d’un animal lors de l’expérimentation, ces animaux, s'ils ne sont pas inclus, entreront dans la démarche de ré-utilisation du laboratoire.
Raffinement
Le raffinement du projet et le bien-être animal sont pris en compte dès l’arrivée des animaux sur site. Les animaux sont hébergés dans des locaux agréés et bénéficient de soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal. Ils sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (jouets : balle, chaîne, grattoir). En amont de l’inclusion des animaux dans la procédure, si l’animal présente le moindre signe anormal, les mesures adaptées seront mises en place immédiatement en accord avec la vétérinaire, dans le cadre du soin (hors procédure) conformément aux procédures internes de l'animalerie. Les méthodes pour réduite la douleur, la souffrance et l’angoisse sont définies tout au long de la procédure chirurgicales et au niveau des différentes étapes. Le protocole expérimental est réalisé sous anesthésie générale. Les paramètres vitaux de l'animal, comme pour toute opération chirurgicale chez l'Homme seront suivis tout au long de l’anesthésie. Des molécules de réanimation (adrénaline, atropine, éphédrine, lidocaine : détermination et posologie selon observation des signes cliniques et du monitoring) et d’un défibrillateur seront utilisées si nécessaire. La procédure est sans réveil.
Choix des espèces
L'anatomie cardiaque du porc est proche de celle de l’homme en termes de taille notamment ce qui est primordial dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Porcs adulttes de 80 à 110 Kg afin de se rapprocher au plus près de l’anatomie cardiaque humaine.
Enseignement pratique de la chirurgie mini-invasive robot- assistée
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
300 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale puis tués avant tout réveil. Chaque animal subit deux à trois procédures chirurgicales au cours d'une anesthésie de six à huit heures, pour entraîner des chirurgiens à manipuler un robot opératoire. Le porteur prévoit de former 500 à 600 chirurgiens sur cinq ans. Il présente l'entraînement sur simulateur et modèles en plastique comme préalable, puis qualifie la formation sur tissus vivants d'"indispensable voire incontournable".
Objectifs
Le traitement de nombreuses pathologies cancéreuses ou bénignes nécessite, en complément d’un traitement médicamenteux, de la chirurgie. La chirurgie conventionnelle passant par une ouverture cutanée, et communément appelée chirurgie ouverte, présente des risques pour le patient. En effet un temps de récupération long, des douleurs post opératoires intenses et une augmentation du risque infectieux sont les inconvénients majeurs d’une telle intervention. Depuis de nombreuses années des techniques dites mini invasives, comme la cœlioscopie, se développent. Cette technique, permettant d'opérer à travers de petites incisions, devenue depuis un standard en chirurgie, présente un avantage majeur, celui de diminuer les contraintes rencontrées en chirurgie ouverte, mais présente certaines limites. Lors d’une intervention chirurgicale coelioscopique, les instruments utilisés sont totalement rigides dépourvus d’articulation, l’endoscope (caméra) qui permet la vision sera contrôlé, non pas par le chirurgien opérateur, mais par un tiers. Durant toute la totalité de l’intervention chirurgicale, le chirurgien sera debout au-dessus du patient dans une position inconfortable ce qui pourrait avoir un impact sur la concentration et l’état général de ce dernier. Voilà pourquoi une nouvelle forme de chirurgie mini invasive a vu le jour, la chirurgie mini invasive robotique assistée. Cette dernière approche va combiner les avantages des deux autres et en apporter de nouveaux. Le chirurgien va travailler assis à une console, avec une vue en trois dimensions, contrôlant des instruments complètement articulés et cela en toute autonomie. Aujourd’hui, les chirurgiens qui souhaitent accéder à la robotique doivent se former.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la maitrise de la manipulation des robots-chirurgicaux afin de réaliser les interventions en toute sécurité chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 ou 3 procédures chirurgicales au cours d'une même anesthésie générale durant 6 à 8h.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus seront réduits au minimum grâce à l'optimisation du protocole anesthésique et la prise en charge de la douleur en période per-opératoire (permettant, comme chez l’homme, de réaliser un acte chirurgical dans des conditions adaptées et non délétères pour l’animal) et du fait de la mise à mort des animaux en fin de chirurgie (protocole sans réveil). Des incidents chirurgicaux (hémorragies, lacérations digestives par exemple) sont toutefois toujours envisageable et peuvent conduire à une mise à mort anticipée des animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de formation.
Remplacement
Après des phases de formation en simulation virtuelle, sur modèles en plastique, l’enseignement comprend aussi des sessions sur sujet anatomique afin de compléter les objectifs de formation. Il reste cependant une étape indispensable pour que ces chirurgiens soient prêts à opérer des patients : afin de leur permettre de réaliser une intervention en toute sécurité sur l’Homme, une formation technique sur tissus vivants est nécessaire voire incontournable. En effet des applications comme l’utilisation d’énergie visant à coaguler un vaisseau (électrocoagulation), disséquer ou exposer un tissu n’a de sens que sur un modèle vivant.
Réduction
Les sessions de formation débutent par des séances de la simulation virtuelle dans les consoles, puis ces séances sont suivis par la manipulation des robots à partir de ces mêmes consoles sur des modèles en plastique, permettant aux apprenants de se familiariser avec le contrôle des robots et de maitriser les gestes avant de les effectuer sur animaux vivants. La formation s'adresse uniquement au chirurgien et à son aide (IBOD ou chirurgien). Le nombre de porcs sera réduit au minimum, à raison d’un animal par binôme avec une valorisation de chaque animal sur lequel plusieurs gestes chirurgicaux par temps opératoire pourront être effectués. Le nombre de formations dépend du nombre de robots mis sur le marché à l’échelle européenne voire internationale. Nous estimons cependant le nombre de chirurgiens à former entre 500 et 600 sur les 5 prochaines années (soit 300 porcs).
Raffinement
Les porcs sont préalablement hébergés en groupe sociaux selon la réglementation en vigueur (acclimatation), ils disposent d’enrichissements leur permettant d’exprimer leurs comportements naturels comme le fouissage, l’exploration d’objets à mâchouiller, le repos sur une aire dédiée. Une surveillance et des soins quotidiens sont apportés par une équipe qualifiée de techniciens et vétérinaires. Le protocole prévoit des procédures mini-invasives réalisées sous anesthésie générale par un chirurgien sous la supervision d’un formateur qualifié. Les animaux sont prémédiqués avant d’être transférés au bloc opératoire. Une voie veineuse est posée pour l’induction de l’anesthésie générale (propofol/rocuronium). Ils sont intubés et placés sous anesthésie gazeuse (isoflurane/oxygène) avec assistance respiratoire. L'analgésie est assurée par l'utilisation d'anti-inflammatoires voire d'opioïdes puissants. Le vétérinaire désigné et la structure chargée du bien-être animal accompagnent le responsable de la mise en œuvre du projet et proposeront la mise en place de mesures correctives en cas d’atteinte au bien-être animal.
Choix des espèces
Porc Large White La taille du cochon est adaptée à l’utilisation de notre système de robotique, des instruments de chirurgie, endoscope, conçus pour l’homme. Anatomie homologue (espèce monogastrique) pour modéliser les voies d’abords et les pratiques en chirurgie viscérale. Nous projetons l’emploi de porcs juvéniles, de 30 à 60 kilogrammes, en fonction des formations. Ces tailles de cochon sont adaptées à l’utilisation de notre système de robotique, des instruments de chirurgie, endoscope, conçus pour l’homme. La taille des organes des porcs à ce stade de croissance correspond déjà à ce qui peut être observé en clinique chez l’homme, il offre les repères anatomiques recherchés par le praticien et permet d’utiliser les mêmes équipements et matériels chirurgicaux que chez le patient.
Étude de pharmacocinétique, de bio-distribution et d’innocuité d’un transporteur d’oxygène par voie systémique dans un modèle de primate non humain.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles respiratoires
13 macaques à longue queue vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Repris d'un projet précédent, ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter fémoral, l'injection d'un transporteur d'oxygène issu d'un ver marin, une anesthésie maintenue huit heures et sept prélèvements sanguins, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur vise à évaluer la pharmacocinétique et l'innocuité de la molécule avant un essai chez l'humain. Il affirme que le macaque est l'espèce "de choix" et que cette évaluation "ne peut pas être remplacée" par des modèles in vitro.
Objectifs
L’infection à SARS-CoV2 (Covid19) se manifeste dans sa forme compliquée par un Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA). En l’absence de traitement étiologique validé, l’essentiel de la prise en charge des patients en SDRA est purement symptomatique et commune à l’ensemble des étiologies. Elle repose sur la ventilation protectrice, sur l’utilisation de myorelaxants en cas de désadaptation au respirateur, et sur le positionnement en décubitus ventral des patients les plus hypoxémiques afin de recruter du parenchyme pulmonaire atélectasié et d’améliorer les rapports ventilation/perfusion. En cas d’échec de la prise en charge classique, le recours à une ECMO (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation) est envisagé. Malgré cette prise en charge optimale, la mortalité reste élevée. L’hémoglobine de ver marin est un transporteur d’oxygène universel qui a la capacité de transporter une grande quantité d’oxygène et pourrait améliorer le contenu artériel en O2 dans une situation où l’échangeur pulmonaire est défaillant. Cette molécule est une hémoglobine extracellulaire dont la séquence est très proche de la forme humaine (HbA). Initialement développé comme un dispositif médical favorisant l’oxygénation des greffons en transplantation d’organes, le transporteur d'oxygène semble intéressant pour améliorer les hypoxémies réfractaires rencontrée dans le SDRA. Les expériences pré cliniques in vitro puis in vivo dans le modèle murin ont montré que ce composé a une capacité oxygénante 40 fois supérieure à l’hémoglobine des vertébrés. Les études in vitro ont démontré la biocompatilité de ce composé chez l’humain et les mammifères et les études de tolérance dans les modèles murin et canin n’ont pas montré d’effet indésirable notable. L’objectif principal de notre étude est d’évaluer la pharmacocinétique (PK) et la pharmacodynamique (PD) du transporteur d’oxygène et en particulier ses effets biologiques sur l’immunité, l’inflammation et la fonction plaquettaire, ainsi que sa biodistribution au niveau des organes. Les objectifs secondaires de notre étude sont d’évaluer l’innocuité de l’injection de la molécule d'intérêt chez le primate non humain, ainsi que d’évaluer son effet sur les fonctions d’organe dans les 6 premières heures suivant l’administration du produit en vue de premières expérimentations dans la clinique humaine.
Bénéfices attendus
L’obtention de données évaluant la pharmacocinétique et l’élimination de la molécule permettront de préciser les modalités d’injection en vue d’une première injection chez l’homme. Si notre étude montre l’innocuité de la molécule d'intérêt par voie systémique, une étude de toxicologie règlementaire sera développée puis une recherche interventionnelle de phase 1 impliquant la personne humaine sera soumise afin d’évaluer la sécurité du candidat médicament chez l’homme. Ces études seront suivies ensuite d’une étude comparative (phase 2) afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ce traitement. L’objectif attendu du traitement est une diminution de la morbi-mortalité des patients atteints de SDRA.
Procédures
Sous anesthésie générale : - Anesthésie à T-1H- Installation d’un cathéter central au niveau de la veine fémorale par voie chirurgicale (30-45 min) -Injection médicamenteuse d’un transporteur d’oxygène par voie veineuse centrale sur une durée d’une heure - Maintien de l’anesthésie durant 6h post-injection - 7 prélèvements de sang sur cathéter périphérique (5 min) sous anesthésie générale durant les 7h de suivis d’injection- Mesure des paramètres vitaux sous anesthésie durant les 7h de suivi (toutes les 5 minutes de T0 à H1 puis toutes les 20 minutes de H1 à H6) - Procédure sans réveil
Impact sur les animaux
Bien que toutes les procédures soient réalisées sous anesthésie générale (dès T-1H), la chirurgie (courte) ainsi que l’anesthésie longue de 8h avec injection de la molécule d’intérêt sur 1h et prélèvements sanguins fréquents (de faible volume) peuvent causer du stress, de l’inconfort et une certaine douleur. Aussi un traitement analgésique sera donné en amont du protocole et un suivi attentif de l’animal sera effectué tout au long de l’anesthésie. Cependant, l’injection de la molécule d’intérêt chez les rongeurs et chez le chien n’a pas montré d’effets secondaires particuliers.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde pour prélèvement d’organes post-mortem permettant l’analyse de la distribution tissulaire de la molécule d'intérêt.
Remplacement
L’évaluation de la pharmacocinétique et de l’innocuité d’une nouvelle molécule dans des conditions in vivo en vue d’une expérimentation chez l’homme ne peut pas être uniquement remplacée par des études in vitro. La littérature évaluant la molécule d'intérêt dans des conditions in vitro chez le rongeur est en faveur de sa tolérance systémique, rénale, hépatique, cardiaque, pulmonaire et immunologique. Le dépôt d’un projet de recherche évaluant une nouvelle molécule thérapeutique chez l’homme impose au préalable de justifier de son innocuité chez l’animal. Cette évaluation au niveau systématique ne peut pas être remplacée par des modèles in vitro.
Réduction
Les primates non humains intégrés dans ce protocole seront uniquement des animaux réutilisés d’un projet précédent et ce dans un cadre de procédure de classe sans réveil. Bien qu’aucune étude statistique ne soit possible et par homologie avec les évaluations de PK/PD-Innocuité en médecine humaine où le nombre de 3 sujets par palier est majoritairement admis comme suffisant, le nombre maximum de n= 4 animaux par palier de dose différente est apparu comme suffisant pour évaluer à la fois la pharmacocinétique et la bio-distribution de la molécule selon différentes posologies (objectif principal) ainsi que l’innocuité lors de l’injection systémique de la molécule (objectif secondaire). De manière à réduire, le nombre d’animaux, le groupe contrôle ne comptera qu’un animal. Il est à noter que si des évènements indésirables surviennent après l’injection des 50mg, le reste de la dose ne sera pas injecté et les autres groupes (paliers supérieurs) ne seront pas réalisés. De plus, après chaque palier, le recueil et l’analyse d’éventuels événements indésirables permettront de décider ou non de la poursuite de l’étude afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’innocuité d’une dose supérieure du transporteur d'oxygène. En cas d’évènement indésirable imputé à l’injection de la molécule, l’étude sera arrêtée au pallier étudié.
Raffinement
Les animaux en réutilisation ne seront introduits dans ce protocole, qu’après validation pas le vétérinaire référant. Pendant les procédures les animaux seront installés sur table chauffante. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et la douleur sera dans la mesure du possible gérée par injection d’analgésiques. Les paramètres vitaux seront surveillés très fréquemment pendant la procédure. Il est à noter que si les évènements indésirables apparaissent après l’injection des 50mg de la molécule d’intérêt, le reste de la dose ne sera pas injecté et en cas d’évènement indésirable imputable à l’injection de la molécule, l’étude sera arrêtée au palier étudié. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
L’évaluation de la pharmacocinétique/ bio-distribution et de l’innocuité du candidat médicament par voie systémique dans un modèle primate non humain est nécessaire afin de garantir une sécurité d’utilisation maximale avant utilisation en clinique humaine. Les primates non humains, particulièrement les macaques, représentent l’espèce animale de choix dans les modèles pré-cliniques de par leur taille, leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude physiologique et avec le système immunitaire de l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 8Kg) dont le système immunitaire est mature.
Etude des mécanismes d’apparition de la scoliose chez le poisson-zèbre Danio rerio, en particulier du rôle des cils du système nerveux dans ce processus.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
2500 poissons zèbres vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés ou menées sous anesthésie sans réveil. Des lignées mutantes développent une scoliose progressive pouvant réduire leur capacité à nager et à accéder à la nourriture, et des larves reçoivent des injections de colorant dans le cerveau sous anesthésie terminale. Un morceau de nageoire est prélevé pour le génotypage et vingt individus seulement sont gardés vivants pour reproduction. Le porteur indique utiliser des modèles cellulaires mais affirme que l'étude de la colonne vertébrale sur un vertébré reste essentielle.
Objectifs
Ce projet vise à identifier les mécanismes d'apparition de scolioses chez le poisson zèbre en lien avec les anomalies du fonctionnement des cils du système nerveux. Nous étudions des gènes qui causent des ciliopathies, des maladies humaines rares liées à des défauts de formation ou de fonction des cils, des organites cellulaires sensoriels et motiles présents sur la majorité des cellules. Le poisson zèbre a des intérêts scientifiques et techniques uniques pour l'étude des processus développementaux: transparence des embryons, développement externe, possibilité de produire et d'étudier des lignées mutantes. De plus, c'est un modèle reconnu de la scoliose idiopathique, une maladie très répandue (qui affecte 3% des adolescents dans le monde) dont l'étiologie est très mal comprise. Notre projet se subdivise en 3 objectifs: 1) Identifier les mécanismes d'apparition de la scoliose due à une dysfonction ciliaire, en prenant pour modèle un mutant de poisson-zèbre. Ce mutant ne présente pas de létalité embryonnaire à l'état homozygote et développe une scoliose progressive chez le poisson juvénile. 2) Tester les interactions fonctionnelles entre différents protéines ciliaires et avec des acteurs de la signalisation des neuropeptides en étudiants des doubles mutants. 3) Tenter de diminuer ou de retarder la scoliose par des traitements par des drogues. Pour l'ensemble du projet, nous utiliserons 2500 animaux sur 5 ans. Les animaux utilisés pour des expériences avant la fin du stade embryonnaire (5 jours) ne sont pas inclus dans ce décompte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à court et moyen terme, de mieux comprendre les événements qui conduisent à la scoliose chez le poisson-zèbre, en espérant à plus long terme que les mécanismes pathologiques identifiés pourront au moins en partie être validés chez l’homme. La scoliose idiopathique est une maladie d’origine inconnue qui touche environ 3% des adolescents dans le monde. Ceci est particulièrement important car il n’existe à ce jour pas de traitement médicamenteux pour la scoliose. Les seules interventions possibles sont le port d’un corset, traitement préventif, qui ne corrige pas la scoliose déjà existante, ou l’arthrodèse, une chirurgie lourde qui consiste à fixer les vertèbres les unes aux autres.
Procédures
Des animaux mutants ou double-mutants à phénotype dommageable de scoliose seront produits. La scoliose apparait entre 4 et 5 semaines après la ponte. Dans le cas où les animaux sont produits pour observation de l’évolution de la scoliose, les animaux seront maintenus jusqu’à l’âge de 6 mois. La durée de cette procédure est donc de 6 mois. Dans le cas où les animaux sont euthanasiés pour prélèvements, l’euthanasie interviendra à 3 stades différents : 5-21 jours, 3-9 semaines (2 stades différents) et 3-4 mois. Dans ces deux cas, entre 1 à 2 mois, un petit morceau de nageoire caudale sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant. L’anesthésie pour prélèvement de nageoire dure moins d'une minute. Une à deux semaines après le prélèvement, la nageoire caudale a complètement régénéré. Pour la procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central, les larves anesthésiées seront soumises à des injections sous loupe binoculaire de Dye fluorescent ou billes dans le ventricule cérébral ou canal: 90 larves âgées de 5 jours et 90 larves âgées de 15 jours seront injectées puis la diffusion du Dye sera observée sous microscope pendant 2h dans une atmosphère thermostatée et sous anesthésie. Les larves seront euthanasiées à la fin de l'expérience, donc au bout de 2 heures. Pour la procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose, un test de drogues sera réalisé sur 600 alevins âgés de 7 jours à 8 semaines. Observation de l'apparition de la scoliose pendant ces 7 semaines d'expériences. Vers 1-2 mois, un petit morceau de leurs nageoires caudales sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue vient de l’utilisation de lignées mutantes de poissons qui développent une scoliose à l’état homozygote chez l’adulte. Cette scoliose (torsion tridimensionnelle de la colonne vertébrale en absence de malformations vertébrales ou de fractures) peut, dans les cas les plus graves, induire une difficulté de nage donc une mobilité réduite et une compétition avec des poissons sains pour l’accès à la nourriture.
Devenir
La production de lignées double-mutantes pour l’observation de l’apparition de la scoliose est procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (adultes de 6 mois environ), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. 20 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. La production de lignées mutantes pour analyse phénotypique sur animaux euthanasiés est une procédure de sévérité modérée. Dans cette procédure les animaux seront euthanasiés eà différents stades larvaires, juvéniles et adultes pour prélever les organes et réaliser des analyses. La seule raison pour les euthanasier en dehors de ce protocole serait les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. La procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central est une procédure sans réveil. Toutes les larves seront sous anesthésie pendant toute la durée de la procédure et euthanasiées à la fin. En effet, l’injection d’un colorant fluorescent dans les ventricules du cerveau et l’observation de la larve vivante sous microscope pendant plusieurs heures compromettent la viabilité de l’animal et génèreraient potentiellement des souffrances en cas de réveil. La procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose est une procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (8 semaines ou 12 semaines en fonction du génotype), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring.
Remplacement
Dès que possible nous utilisons des modèles cellulaires pour remplacer l’expérimentation animale. Nous avons ainsi développé dans les dernières années des modèles de cellules souches embryonnaires de souris et de cellules pluripotentes induites humaines que nous différencions en différents types neuronaux, en deux dimensions et en culture de type organoïdes. Ceci nous permet de comprendre par exemple le rôle des cils dans la formation des neurones. Néanmoins, l’expérimentation sur le poisson reste essentielle, en complément des modèles cellulaires, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus de développement aussi complexes que la morphogenèse du système nerveux central ou de la colonne vertébrale.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans aucun dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Nous réutilisons aussi les animaux adultes produits dans certaines expériences (par exemple des animaux hétérozygotes pour certaines mutations) pour réaliser d’autres expériences. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des poissons dès l’âge de 1 mois (au lieu de 2 mois habituellement). Le nombre total d’animaux impliqués est de 2500.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28°C, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2-3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de transgenèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson-zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse. Nous analysons également l’impact d’un défaut des cils sur l’apparence de scoliose, pathologie pour laquelle le poisson-zèbre est un modèle de choix du fait des contraintes mécaniques subies par la colonne vertébrale pendant la nage. Ce modèle permet d’étudier les étapes précoces de la maladie, avant la survenue de la courbure, ce qui est difficile chez l’homme. Le poisson-zèbre permet également de tester des molécules chimiques pour retarder ou réduire l’apparition des scolioses. Les nageoires caudales sont coupées pour le génotypage sur des animaux âgés de plus de 2 mois. Pour certaines expériences, nous pourrons génotyper les poissons à un stade plus précoce (1 mois) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Afin d’étudier le développement de la scoliose, (phénotype dommageable modéré) nous réalisons des expériences sur des larves (5 jpf-21 jpf), des juvéniles (21 jpf-3 mois), et des adultes (> 3 mois).
TP de physiologie : étude des régulations de la fonction cardiaque sur cœur isolé de rats mâles ou femelles
- Enseignement supérieur
90 rats vont être utilisés sur cinq ans, tués sous anesthésie sans réveil, dans le cadre d'un travail pratique de physiologie. Chaque rat est mis à mort par surdose d'anesthésique pour prélever son cœur, ensuite monté sur un dispositif isolé permettant à des étudiants d'observer les effets de molécules sur la contraction cardiaque. Le porteur présente ce travail sur organe isolé comme une "méthode alternative à l'expérimentation animale" et une réduction par rapport aux travaux pratiques antérieurs. Il affirme qu'une formation de qualité ne permet pas de diminuer davantage le nombre d'animaux tués.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, qui prévoit la mise en évidence des régulations des grandes fonctions physiologiques ainsi que l'apprentissage de la prise de mesure de paramètres physiologiques . Dans la compétence concernée par ce TP, l’utilisation d’organes isolés en substitut d'études in vivo est souhaitée, afin de mettre en évidence les mécanismes de régulations physiologiques. Ce TP participera à l’apprentissage de la physiologie cardio-vasculaire, mais également à l'utilisation de méthodes alternatives à l'expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Ce TP permettra plusieurs apprentissages à nos étudiants : 1- fonctionnement de l’appareil de Langendorff et du logiciel associé; 2- suivi des contractions cardiaques du cœur isolé au cours du temps; 3- étude des effets de différentes molécules physiologiques (adrénaline, noradrénaline, acétylcholine) et pharmacologiques (isoprénaline, propranolol, atropine) sur le fonctionnement cardiaque; 4- travail sur organe isolé permettant une diminution du nombre d’animaux utilisés, notamment en comparaison avec les TP de physiologie réalisés en suivant le programme pédagogique des années antérieures.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure sans réveil, c'est à dire une mise à mort après anesthésie/analgésie générale sans reprise de conscience. C'est la seule intervention à laquelle ils seront soumis. La procédure durera environ 15 minutes entre l'injection d'anesthésique par voie IP et la fin du prélèvement cardiaque. Cette durée dépend principalement du temps nécessaire à l'animal pour atteindre une anesthésie/analgésie chirurgicale avant la surdose d'anesthésique par voie IV. Le prélèvement en lui-même durera 5 minutes environ.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un protocole induisant la mort de l’animal sous anesthésie générale sans réveil. Aucune douleur n’est attendue pour les animaux qui ne reprendront pas conscience après la mise en place de l’anesthésie/analgésie. Les réflexes des animaux seront évalués tout au long de la procédure et une nouvelle dose d’anesthésique sera administrée en cas de besoin avant la mise à mort de l'animal.
Devenir
Le but de ce projet est le travail sur organe isolé dans un cadre éducatif. Ainsi, la mise à mort des animaux inclus dans le projet est nécessaire afin de pouvoir prélever les organes d'intérêt (ici le coeur).
Remplacement
Le programme pédagogique national de notre formation prévoit l’utilisation de techniques de remplacement à l’expérimentation animale,notamment en physiologie animale. Pour cela, nous avons choisi de mettre en place ce TP sur le cœur isolé de rat, qui permet de remplacer l’utilisation d’animaux vivants pour l’étude des fonctions cardiovasculaires. Il n’est pas possible de remplacer ce système par des méthodes in vitro qui ne permettraient pas l’analyse de régulations physiologiques. Ce TP permettra détudier les régulations physiologiques de la fonction cardiaque, notamment par le système autonome, et de mettre en évidence les récepteurs impliqués en utilisant différentes molécules pharmacologiques, ce qui en enseignement ne pourrait pas être étudié dans un TP de suivi de la fonction cardiaque chez l'homme.
Réduction
Pour ce TP cœur isolé, nous utiliserons deux rats/groupe de 14 étudiants et 6 groupes d’étudiants seront concernés par ce TP soit 12 animaux/an pour 84 étudiants. A cela, nous souhaitons ajouter 2 rats par an en cas de soucis de prélèvement cardiaque et 10 rats permettant la mise au point de ce TP, soit un total de 14 animaux/an + 10 pour la mise au point, soit 90 rats/5ans. Bien entendu, ce nombre d’animaux sera revu à la baisse en fonction du nombre d’étudiants mais également en fonction des besoins pour la mise au point du protocole. Ce nombre permettra aux étudiants de travailler par groupe de 7 pour un cœur isolé, ce qui leur permettra de manipuler le matériel (ordinateur, appareil de Langendorff), de préparer les différentes solutions et d’analyser les résultats. Enfin, ces animaux pourront provenir d'un précédent protocole, tel que des TP de pharmacologie (procédures légères, administration de substances pharmacologiques par voie IP/VO et/ou étude comportementale) en 2e ou 3e année du BUT ou bien des TP servant à valider la formation de niveau praticien de nos étudiants (procédures légères, injection de sérum physiologique en IP/IM). Afin de fournir une formation de qualité à nos étudiants il n'est pas possible de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes socialement harmonieux durant toute la durée de leur vie à l’animalerie, en présence de deux éléments d’enrichissement (tunnel en plastique et noix ou batonnet à ronger). Tout animal stressé ou malade sera exclu de l’étude. L’unique procédure concerne la mise à mort de l’animal sous anesthésie profonde et après une surdose d’anesthésique / analgésique. Le personnel formé à cette procédure sera vigilant aux réflexes de l’animal et s’assurera de réaliser le prélèvement cardiaque le plus rapidement possible. Préalablement au TP, les animaux auront été manipulés régulièrement afin de diminuer leur stress lors de l’injection IP.
Choix des espèces
Les rats possèdent un cœur plus gros que les souris ce qui favorise d’une part le prélèvement de l’organe et d’autre part le suivi d’un seul cœur isolé par un groupe relativement important d’étudiants (n=7). De plus, les études de physiologie animale sur cœur isolé de rat sont très bien documentées dans littérature. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de pouvoir facilement prélever le cœur et d’avoir un cœur dont la taille permette le suivi par un groupe d’étudiants.
Caractérisation et sélection de composés ciblant un nouveau mécanisme d’action biologique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil, c'est-à-dire une mise à mort sous anesthésie sans reprise de conscience. Auparavant vigiles, elles subissent des contentions, des injections et une administration orale de composés, puis sont endormies et tuées pour prélever sang et organes, afin de caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution d'inhibiteurs enzymatiques. Le porteur affirme avoir mené de nombreux tests in vitro et sur embryon de poisson zèbre en amont pour limiter le recours aux souris. Il conclut que l'expérimentation animale est "obligatoirement requise" par les agences réglementaires avant tout essai clinique, sans autre alternative.
Objectifs
Le projet consiste à caractériser les propriétés de pharmacocinétique, de pharmacodynamique et de biodistribution de composés inhibiteurs d'une famille d'enzyme par voie systémique et orale. Au final, le but sera d'identifier et d'isoler les meilleurs composés. Les résultats constitueront un ensemble de données qui alimenteront le dossier préclinique réglementaire en vue d'obtenir les autorisations pour réaliser les essais cliniques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples et d’une très grande valeur pour le développement pharmaceutique envisagé. Cibler le mode d’action de l’enzyme d’intérêt n’a jamais été réalisé dans le panorama scientifique et pharmaceutique. A terme ces composés pourront servir à réaliser des essais cliniques humains dans des indications médicales comme certaines neuropathies, pour espérer apporter de nouveaux traitements dans des maladies présentant de forts besoins médicaux insatisfaits. Ainsi, les résultats du projet alimenteront la base de connaissances scientifiques et renseigneront sur les effets pharmacologiques et potentiellement toxiques de la voie de signalisation ciblée. L’ensemble des travaux proposés alimenteront le dossier à soumettre aux agences réglementaires en vue d’obtenir les autorisations d’essais cliniques. Ce projet permettra également de développer les compétences des équipes sur la recherche pharmaceutique qui pourront largement être mises à profit pour de futurs projets et pour la diffusion des connaissances.
Procédures
Les souris vigiles recevront des manipulations de "classe légère", comme des contentions (30 à 45 secondes, 3 à 4 fois maximum, sur une période de 24 heures) et des procédures équivalentes à une piqûre (15-30 secondes, un maximum de 3, sur une période de 24 heures). Pour les administrations en voie orale (une seule fois par animal), la contention et l'administration dureront au maximum 1minute par animal. Pour les manipulations classées sans réveil, les animaux recevront un analgésique, puis seront endormis par anesthésie générale (20 à 25 minutes, une seule et unique fois pour un animal). Nous veillerons à l’application des gestes corrects par le personnel qualifié pour limiter le stress des animaux et assister pendant toute la procédure à l'observation des animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Un de nos composés administré par voie systémique à des souris à des doses 4 fois supérieures à la dose efficace n’a présenté aucune toxicité apparente, ni à l’échelle macroscopique ni sur des paramètres anatomopathologiques. Ce résultat préliminaire important présage de l’absence ou du peu d'effets indésirables. De plus, nous savons que les données de la littérature entrevoient un profil de toxicité favorable pour nos inhibiteurs. Les animaux seront manipulés avec ou sans contention et seront soumis à des prélèvements de petits volumes sanguins, suffisants pour réaliser les analyses, mais n’entraînant pas de perturbations physiologiques. Ces manipulations représentent des douleurs de l’ordre d’une piqûre. Pour l'ensemble du projet, nous avons établi un score de suivi des animaux basé sur l'apparence physique, des signes cliniques et comportementaux pour contrôler nos procédures et limiter toute souffrance animale. Notamment, nous répertorierons toute anomalie liée au comportement (la tonicité et la réactivité), la posture (s’il y a isolement), l’alimentation, la température corporelle, les excrétions ; Et rapporterons le cas échéant, tout effet délétère au responsable du bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des mesures à prendre. En cas d'effet indésirable avéré, aucun animal ne sera laissé sans traitement palliatif, et si non applicable, sera immédiatement sorti du protocole.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’échantillons et d’organes afin de les analyser. Ces échantillons uniques et précieux permettront de réaliser les analyses microscopiques pour déterminer les effets de l’action des composés inhibiteurs et déterminer quels organes reçoivent ou non la molécule, ce qui permettra de réaliser la caractérisation à visée pharmacologique et réglementaire. L’euthanasie sera réalisée conformément aux méthodes recommandées par la réglementation et les comités d'éthique et de bien-être animal. Nous veillerons au contrôle des méthodes utilisées par le personnel formé et qualifié pour éviter toute souffrance animale.
Remplacement
Pour caractériser le devenir de nos composés inhibiteurs dans un organisme, le recours à l’expérimentation animale est obligatoirement requis par les agences réglementaires avant le passage à l’expérimentation clinique humaine. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris vivantes, sans aucune autre alternative. Toutefois, avant de proposer de tester nos composés inhibiteurs chez la souris, nous avons réalisé une multitude de tests in vitro, in cellulo et ex vivo pour traquer de potentiels effets toxiques et/ou indésirables. Jusqu’alors, nous avons analysé et confirmé que nos inhibiteurs n’engendrent aucun effet sur la prolifération et la survie cellulaire, le métabolisme énergétique, le métabolisme du calcium intracellulaire cardiaque. Nous avons également évalué la toxicité sur le développement de l’embryon de poisson zèbre par balnéation sans relever d’effet toxique notable. Avant de rédiger ce projet, nous avons veillé à mettre au point des méthodes robustes de détection et d’analyse sur des modèles non animaux. En somme, toutes ces préparations en amont permettent de drastiquement limiter les mises au point sur des échantillons issus de l’expérimentation animale.
Réduction
Nous avons déjà vérifié qu’un de nos composés ne provoque aucun dommage sur des neurones primaires de rétine jusqu’à dix fois la dose efficace. De plus, nous avons réalisé des expérimentations sur des lots très restreints d'animaux pour évaluer les potentiels effets délétères de nos composés sur le système nerveux ou plus généralement dans la circulation générale et n’avons relevé aucun effet dommageable. Le déroulé de ce projet, construit sur une séquentialité, permettra de bien choisir les doses minimales et maximales à utiliser et de révéler les organes cibles où les molécules s’accumulent : ces données sont prédictives des effets indésirables à anticiper et permettront de réduire de façon significative le nombre d’animaux. Nous avons défini des filtres décisionnels de sélection permettant d'étudier les composés inhibiteurs sur un faible nombre d’animaux de manière incrémentale et ainsi de rapidement réduire le nombre de composés à analyser et le nombre d'animaux. Ensuite, nous avons prévu d’arrêter chacune des procédures dès lors que les objectifs seraient atteints (par exemple, retenir 5 composés formulés ou non). Ceci permettra de facto de réduire le nombre d’animaux. Des tests statistiques sont prévus pour établir des corrélations clés, évaluer systématiquement la robustesse des résultats obtenus et interroger leur significativité. Ces tests permettront de contrôler la variabilité expérimentale, ce qui limitera drastiquement le nombre de répétition. En somme, ces analyses permettront de cerner des tendances ou valider des résultats sans recourir à un grand nombre d’animaux.
Raffinement
A réception, les souris seront stabulées une semaine dans leur habitat d’hébergement avant toute manipulation. Aucun animal ne sera jamais délaissé en isolement. De manière générale, pour pallier au manque de recul de l’effet de nos composés, les animaux traités seront suivis rigoureusement et quotidiennement pour traquer l’émergence d’effets indésirables potentiels. La méthodologie choisie permettra de détecter l’atteinte des « points limites » les plus précoces. Nous prévoyons de rapporter tout effet délétère au responsable de bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des orientations à suivre. Plus spécifiquement, notre stratégie de raffinement prévoit de rechercher l’émergence d’effets toxiques selon le suivi du comportement (agitation ou prostration), de l’apparence physique des animaux (clôture des yeux, aspect du pelage et du poil), et du suivi des signes cliniques (température corporelle, rythme respiratoire, poids corporel, état des fèces). De plus, nos travaux cadreront les fonctions rattachées aux organes à monitorer. Nous porterons alors une attention stricte aux fonctions biologiques liées à ces organes. Nous prévoyons qu’aucun animal présentant un signe de souffrance ne sera laissé sans traitement palliatif. Nous prévoyons une prise en charge des nuisances en apportant un complément à l’alimentation et à l’eau si nécessaire. Un animal recevant une injection sera désinfecté localement avec un antiseptique. Les manipulations plus invasives prévoient d’abord une analgésie, puis une anesthésie générale pour pallier à toute douleur potentielle.
Choix des espèces
La souris est un des modèles de petit animal de laboratoire utilisé pour étudier les caractéristiques pharmaceutiques in vivo pour des inhibiteurs de nature chimique. De plus, ce modèle est reconnu par les agences réglementaires de médicaments pour constituer les preuves pharmaceutiques et scientifiques en vue d'obtenir les autorisations d'essais cliniques. Puisque l’application de nos composés inhibiteurs est prévue pour des adultes, ce projet prévoit donc d’utiliser des souris mâles et femelles adultes, ce qui permet de réaliser l’étude alors que le contexte hormonal adulte est déclenché. Nous n'avons pas trouvé d'alternative de remplacement.
Analyses de l’infiltration immunitaire au sein de l’ovaire par des cellules issues de moëlle de souris invalidées ou non pour les récepteurs aux oxystérols LXR (Liver X Receptors) chez une souris hôte immunocompromise.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 15 sans réveil. Elles reçoivent une greffe de moelle par voie intraveineuse au sinus rétro-orbital, un prélèvement sanguin puis une stimulation hormonale provoquant une superovulation, avant mise à mort pour prélever ovaires et tissus lymphoïdes. Le porteur indique qu'une réaction du greffon contre l'hôte peut survenir et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera administré car il modifierait les paramètres de l'expérience, les animaux atteints étant alors tués. Il étudie le rôle de récepteurs dans l'hyperstimulation ovarienne liée à la procréation assistée et justifie la souris par la proximité de son cycle avec celui de l'humain.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans un démarche d’exploration de l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris NSG ayant subi une greffe de cellules de moelle issues de souris WT, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. Le but du projet est de visualiser in vivo, le comportement des cellules immunitaires issues des moelles greffées sur le profil d’infiltration du tissu ovarien. Ce test fonctionnel in vivo va nous permettre de mieux comprendre la place jouée par LXR au sein de ces cellules dans la genèse du phénotype. Après 1 mois post- greffes, les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation par Injection IP de PMSG, 7,5UI/souris. Les tissus prélevés seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs des différents sous types immuniaires afin de caractérisé l’infiltrat. Ces études seront conduites en utilisant 3 donneurs de moelle osseuse distinct : 1) La lignée sauvage (Wild-Type ou WT) servant de control, 2) la lignée LXRs invalidés (LXR DKO ou LXR-/-) correspondant à un knock-out total des récepteurs LXRalpha et LXRbeta et 3) la lignée rescue pour l'expression de LXRbeta spécifiquement dans les cellules de Granulosa (Tg-AMH LXRbeta). Nous anticipons que les lignées KLXR DKO et Tg-AMH LXRbeta devrait se comporter de manière identique puisque les cellules immunitaires issues de ces souris sont déficientes pour les récepeteurs LXR. Ainsi nous pourront évaluer l'étendue et les caractéristiques de l'ensemble des infiltrats au regard du génotype des moelles implantées. Ainsi nous espérons être en mesure de conclure quand au rôle des LXRs dans les cellules immunitaires au sein de l'ovaire lors de la stimulation hormonale par la PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin).
Bénéfices attendus
Cette étude, couplé au reste du projet de recherche, qui est de plus grande envergure, va ainsi permettre de connaitre le role intrinsèque joué par les récepteurs LXRs au sein du compartiment immunitaire qui compose le tissu ovarien. Plus précisement, la greffe de cellules issues des souris transgéniques sauvages ou invalidées pour les LXRs sera injecté dans des souris avec un fond génétique NSG. Ceci va permettre de faire un rescue du répertoire immunitaire des ces souris et les cellules de l'immunité spécifiqes devraient ainsi recolonisées l'ovaire permettant de mieux comprendre comment ce dernier réagit à la stimulation à la PMSG. En termes plue vulgariseés, cette étude va permettre de comprendre le role des récepteurs LXR qui se trouve dans les cellules immunitaires au cours de la réponse de l'ovaire à une stimulation hormonale chez des patientes inclus dans un programme de procréation assistée. In fine, ces travaux pourraient permettre de trouver des biomarqueurs prédictifs de la réponse ovarienne à cette stimulation hormonale et ainsi éviter l'apparition de situation pathologique telle que le syndrome d'hyperstimulation ovarienne.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire NOMBRE 1 DUREE 1 minute Procédures d'implantation de moelle : implantation sous anesthésie par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire NOMBRE 1 DUREE 3 minutes
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, en particulier dans le domaine de l'immunologie. Ainsi, il y a un recul très important sur les nuisances susceptibles d'être rencontrée au cours des différentes procédures. Certains animaux peuvent éventuellement développer une GVH. De fait, les souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) après la troisième semaine pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Aucun traitement antalgique ne pourra être réalisé car il conduira de facto à modifier les paramètres expérimentaux (en particulier les anti-inflammatoires). En cas de GVH, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Chaque animal sera implanté par une moelle d'un donneur sauvage ou transgénique puis inclus dans le protocole de stimulation par la PMSG. L'ensemble des animaux seront mise à mort en fin d'experimentation pour prélèvement des ovaires et tissus lymphoïdes secondaires en vue de la caractérisation du profil immunitaire.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules vis à vis de leur statut LXR. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype d’infiltration in vivo. Cette approche d'anticipation permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et limiter l'étude au strict nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 45 individus.
Raffinement
Deux points sont à prendre en compte : i) les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 40 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin. ii) l’implantation de cellules immunitaires dans les porteurs NSG peut dans certains cas induire une réponse de l’hôte contre le greffon (GVH-Graft Versus Host syndrome). Cette réponse apparaît dans les 3 semaines qui suivent l’implantation. A cette période, les souris seront mises en observation soutenues pour détecter toutes manifestations de ce syndrome. Toutefois, ce type de complication est rencontrer essentiellement lors du conditionnement des souris par irradiation, ce qui n’est pas le cas ici, ou lors de l’injection de cellules immunitaires « matures » (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells). Dans le cas présent les cellules injectées seront des cellules de moelle, qui présente un risque faible de GVH.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Enfin, le modèle NSG constitue un modèle de choix pour la transplantation de cellules de moelle. Nous utiliserons des femelles de 8 semaines concernant les donneurs de moëlles et des souris de 2 à 4 mois pour le modèle NSG. Les âges ont été determiné à partir des données de la littérature.
Modèles conditionels pour étudier la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Un modèle de dystrophie myotonique est induit par la doxycycline, y compris chez des souriceaux étudiés jusqu'à sept jours de vie pour leurs vocalises, leur respiration et leur alimentation, 160 animaux étant tués sans réveil par perfusion d'un fixateur. Le porteur indique que les effets attendus des souris induites sont neurologiques et présente les autres actes comme légers. Il cherche à créer un modèle "plus performant" de la forme congénitale de la maladie et qualifie ce développement d'étape "incontournable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) conditionnel de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du cerveau permettant de décortiquer les mécanismes physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) étudier les impacts physiopathologiques des ARN DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris nouveau-nés transgéniques: analyses phénotypiques, histologiques, moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle permettra de déterminer l'implication des motoneurones des nerfs craniaux et spinaux dans la pathologie notamment dans la forme grave néonatale. L'obtention et l'étude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 848 souris de ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modérée et sans réveil. De séverité légère, sont concernées 96 souris qui seront utilisées pour l'étude des vocalises à 7 jours avec 3 minutes comme durée d'acte . De sévérité modérée, sont concernéees 592 souris: - les souris meres (128 souris) qui recevront la doxycycline au stade E11et P1 jusqu’à 7 jours, - les 16 souris qui permettront la validation du modèle après injection de l'inducteur doxycycline en injection intra-péritonéale sur une durée de 4 jours. - les 96 souris utilisées pour optimisation de la concentration de doxycycline. Cet acte durera jusqu à 7 jours de vie. - les 96 souris utilisées pour l'étude de la respiration par pléthysmographie à 7 jours. Cet acte dure au maximum 1h - les 96 souris utilisées pour l'étude de l’alimentation sur une durée de 7 jours. - les 160 souris utilisées qui recevront la doxycycline pour les etudes moléculaires jusqu’à 7 jours de vie. De classe sans réveil, sont concernées les 160 souris utilisées pour les études histologiques , perfusées au PAF pendant une durée d environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement neurologiques compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique).
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements qui sont nécessaires pour les analyses post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (mâles et femelles) seront utilisés soient 848 animaux. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques finales seront réalisées avec des lots suffisants dont le nombre a été établi par un calcul mathématique lors d’études precedents. Nous avons ainsi déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Il sera ensuite nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30- 18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques que nous avons créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie, nous permettent d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau ADN, ARN et protéines dans différents tissus, chez l'embryon et la souris adulte. Ce projet vise à comprendre les mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle murin conditionnel de la forme congénitale de la dystophie myotonique de type 1. La forme congénitale est “reproduite” chez les souriceaux d’ou le choix des analyses à 7 jours de vie.
Travaux Pratiques de Physiologie Animale et expérimentation animale en BUT Génie Biologique, parcours BMB
- Enseignement supérieur
1500 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués sans réveil, dans le cadre de travaux pratiques universitaires. Chaque animal subit la pose de plusieurs cathéters, jusqu'à cinq, et des prélèvements de sang, de bile ou de suc pancréatique, gestes réalisés par des étudiants en binôme ou trinôme. Le porteur envisage parmi les risques une hémorragie massive si un étudiant sectionne la carotide et une détresse respiratoire, l'animal étant alors tué. Ces séances ne produisent pas de connaissances mais entraînent des étudiants, et il mentionne des méthodes in vitro et de simulation utilisées "en amont ou en parallèle".
Objectifs
Les travaux pratiques dispensés sur des rongeurs vivants (rats) sont en lien direct avec l'enseignement dispensé au sein du Bachelor Universitaire de Technologie (BUT) Génie Biologique, parcours Biologie Médicale et Biotechnologie (BMB). Conformément au programme national de la formation, ils permettent aux étudiants d'acquerir les gestes opératoires de base dans le respect de la reglementation en vigueur. Cela permet de mettre en application les protocoles opératoires permettant d'explorer les régulations des grandes fonctions physiologiques (motilité intestinale, pression arterielle, fonction de détoxification du foie, fonction pancréatique...).
Bénéfices attendus
Les manipulations évoquées permettent aux étudiants d'explorer in vivo les régulations de diverses grandes fonctions physiologiques décrites lors d'enseignements théoriques. Cette mise en pratique leur permet également d'acquerir des compétences professionnelles concrètes nécessaires à leur futur métier de technicien de laboratoire polyvalent. Enfin, l'expérimentation animale permet aux étudiants de mieux appréhender la complexité des interactions physiologiques réelles, d'évaluer la profondeur d'un protocole d'anesthésie-analgésie et de se familiariser aux travaux sur animaux vivants dans de meilleurs conditions.
Procédures
Les rats sont inclus dans une procédure expérimentale de classe sans réveil pour une durée maximale de 3H. Ils sont soumis à une antalgie au moins 30 minutes avant une anesthésie. Chaque animal sera soumis à une procédure chirurgicale consitant en la pose d'une ou plusieurs canulations (jusqu'à 5 cathéthers pourront être posés) puis à 1 ou 3 prélèvement de sang associés à des prélèvements en continu de bile ou de suc pancréatique. Au cours de la chirurgie, ils recevront une deuxième injection d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : a - Le stress généré par la contention et l'injection de l'anesthésique. Intensité faible, durée d'une minute. b - Réaction de l'animal en cas de dissipation de l'effet anesthésique. Intensité faible à moyenne, durant le temps de la prise d'effet de la prolongation d'anesthésie (quelques minutes). c - Hémmoragie massive si l'étudiant sectionne l'artère carotide durant l'opération. Intensité moyenne à forte durant le temps de la prise d'effet de l'euthanasiant (quelques secondes). d - Détresse respiratoire sévère malgré la trachéotomie. Intensité moyenne à forte durant le temps de la prise d'effet de l'euthanasiant (quelques secondes).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures de classe sans réveil, l'ensemble des gestes techniques réalisés sur les animaux ne permettent pas de les réutiliser.
Remplacement
Des méthodes alternatives sont mises en pratique en amont ou en parallèle des procédures, notamment par l'utilisation de techniques in vitro (en culture cellulaire) ainsi que techniques in silico par des appareils de monitoring modernes permettant des simulations d’expériences simples.
Réduction
Les étudiants travailleront en binôme ou trinôme (1 animal pour 2 à 3 étudiants) afin de réduire le nombre de rats utilisés. Nous estimons le nombre d'animaux à 1350 rats sur cinq ans. Aucune étude statistique n'est envisagée.
Raffinement
Les animaux reçoivent 30 minutes avant l'anesthésie, une analgésie pré-opératoire. Les animaux sont ensuite placés sur les plaques en bois éclairées par une lampe afin de maintenir la température corporelle de l'animal au cours de l'expérience. L'état d'anesthésie est contrôlé régulièrement (toutes les 10 minutes) par le pincement du pli de peau interdigité d'un membre postérieur, l'absence de mouvements des paupières et une respiration régulière. Une feuille de suivi de soins permet d'évaluer le bien-être de l'animal. En cas de réaction ou de réveil de l'animal, une anesthésie supplémentaire sera réalisée. En cas de difficultés respiratoires, une trachéotomie pourra être réalisée. Si les difficultés repiratoires persistaient ou si une hémorragie massive était observée ou en cas d'inaction de la seconde anesthésie l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La physiologie des rats est proche de la physiologie humaine de part leur proximité phylogénétique ce qui permet de bien illustrer les régulations des grandes fonctions. Les animaux sont des individus adultes ayant atteint le poids de 250g car les vaisseaux sanguins sont plus gros ce qui facilite le travail opératoire.