Procédures sans réveil
Lipiodol et Hystérosalpingographie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 300
Lapins : 500
1 000 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures couvrant tous les niveaux de souffrance, du plus léger au plus sévère, la plupart tués à l'issue et 120 réutilisés dans d'autres procédures. Ils subissent des accouplements, une synchronisation hormonale, des frottis vaginaux répétés, l'administration intra-utérine d'un produit de contraste par voie basse ou chirurgicale et une induction d'endométriose. L'objectif est de comprendre comment le Lipiodol, un produit de contraste iodé, améliore la fertilité féminine. Le porteur affirme que ce mécanisme ne peut s'étudier in vitro et conclut à une "nécessité" du recours à l'animal.
Objectifs
L'hystérosalpingographie est un examen radiographique (aux rayons X) de l’utérus et des trompes utérines généralement indiqué dans les bilans de d’infertilité féminine afin de vérifier la perméabilité des trompes de Fallope et la normalité de la cavité utérine. Elle consiste en une instillation de produit de contraste iodé (radio opaque) dans l’utérus et les trompes via une canule accolée au col de l'utérus. L'absence de passage du produit de contraste depuis les trompes de Fallope dans la cavité péritonéale signe une obstruction tubaire. Cette obstruction tubaire rend compte d’une infertilité féminine dans environ 35% des cas. Des travaux cliniques ont montré que l’hystérosalpingographie, quand elle est réalisée au moyen de l’injection d’une huile iodée, le Lipiodol, se traduit par une augmentation de la fertilité par rapport à la même technique réalisée au moyen de produits de contraste iodés hydrosolubles. Le mécanisme de cet effet n’est pas connu. Il existe quelques hypothèses dans la littérature. L’objet de ce projet est l’élucidation de ce mécanisme et des éventuelles conséquences endocrinologues (thyroïdiennes notamment) de l'administration d'un produit iodé ou huileux.
Bénéfices attendus
Les différentes études de ce projet seront réalisées dans le but de comprendre le rôle du Lipiodol dans l’amélioration de la fertilité et son mode d’action. Plusieurs hypothèses seront isolées et testées afin de connaître précisément le mécanisme du Lipiodol. Si un mécanisme est identifié, des essais cliniques pourront être lancés afin de confirmer l’effet en clinique. L’utilisation du Lipiodol pourra alors être revue et adaptée au mieux, pour les patientes chez lesquelles un effet pourrait être observé. En effet selon le mécanisme, il est possible que la totalité des causes d’infertilité féminines ne soit compatible avec une amélioration de la fertilité par l’administration du Lipiodol. Les patientes présentant un trouble de la fertilité pourraient donc par la suite bénéficier d’une meilleure prise en charge aboutissant à une augmentation des taux de grossesses, et évitant le recours aux procédures les plus invasives (fécondation in vitro ou autre).
Procédures
Imagerie RX, IRM ou échographie (15 minutes environ), accouplement, synchronisation du cycle œstral par supplémentation hormonale (une injection en vigile), frottis vaginal (2 minutes, en vigile): pourra être répété au cours de l’étude, avec un temps de récupération adapté entre chaque procédure. Administration intra-utérine d’un produit de contraste par voies basses ou chirurgie : une fois (1 heure au plus) puis suivi de quelques semaines par imagerie (15 minutes environ), sauf en cas de mise au point ou d’intérêt scientifique de répéter l’administration Induction d’endométriose : une chirurgie (1 heure environ), puis suivi clinique de quelques semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie RX, IRM ou échographie, d’accouplement, de synchronisation ou d’identification par frottis vaginal du cycle oestral sont légères. Les nuisances attendues sur les animaux suite à ces procédures sont un potentiel inconfort au réveil dû à la durée de l’anesthésie ou lors de l’injection pour les procédures le nécessitant, ou du stress lors des contentions. La mise sous lampe chauffante ou sur tapis chauffant pendant les procédures d’anesthésie sera mis en place afin de maintenir la température corporelle, ainsi qu’au réveil. La procédure d’administration d’un produit par instillation intra-utérine, peut induire un inconfort gynécologique de l’animal, une irritation ou inflammation locale suite à l’insertion des cathéters, à la dilatation des trompes par l’injection du produit, ou à son écoulement. La procédure d’administration intra-utérine d'un produit par une procédure chirurgicale, et la procédure d’induction d’un modèle d’endométriose impliquent une chirurgie sous conditions stériles suivie d’une suture. Malgré la prise en charge analgésique post-opératoire, une démangeaison et/ou une douleur peuvent se manifester au niveau de la suture à cause de la tension des tissus et la cicatrisation. Une moindre activité et prise de nourriture peuvent être observées pendant quelques jours, suite à la chirurgie et l’anesthésie. Une collerette pourra être placée sur l’animal s’il touche trop leur plaie, et une hydratation pourra être envisagée au cas par cas si besoin. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une prise en charge adaptée à chaque observation sera mise en place.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie. A l’issue d’une étude (succession de plusieurs procédures), une mise à mort peut être réalisée sous anesthésie profonde à des fins d’analyse histologique ou de dosage, afin par exemple de caractériser la biodistribution et le mode d’action des produits testés.
Remplacement
La fertilité est le résultat de multiple processus complexes et interconnectés. Le mécanisme d’action du Lipiodol sur la fertilité est inconnu. L’étude de son effet est alors difficilement réalisable sur des modèles simplifiés in vitro. De plus, le Lipiodol n'est pas soluble dans les milieux de culture. Il semble donc nécessaire d'effectuer des études in vivo plus proche de la pratique clinique afin de mieux comprendre les effets induits par la présence de Lipiodol. Le recours au modèle animal apparaît donc comme une nécessité, au moins pour une partie des études. L’une des hypothèses mécanistiques de l’effet pro-fertilisant du Lipiodol est l’effet mécanique, par un meilleur débouchage des trompes, un effet viscosité du produit ou autre. Afin de remplacer le recours à des animaux, l’étude de cette hypothèse sera faite uniquement in vitro. Des études de cultures cellulaires in vitro pourront aussi être effectuées en complément afin d'étudier par exemple plus en détails la réponse immunologique sur un certain type cellulaire.
Réduction
Analyse bibliographique préclinique en amont pour ne pas refaire ce qui a déjà été fait, identifier les pistes à suivre, les erreurs à éviter, et faciliter les phases de mise au point. Macro-analyse de la littérature clinique pour en tirer les produits et donc paramètres qui semblent corréler avec les résultats de fertilité (guide vers une hypothèse mécanistique plutôt qu’une autre), et les pathologies répondant le mieux à l’amélioration de la fertilité après HSG (modèle le plus adapté). Recherche et contact d’équipes à contacter spécialistes dans les différents domaines (HSG clinique et préclinique, endométriose, fertilité et PMA) pour nous guider dans nos recherches (aide technique, pertinence des études, modèles, paramètres à suivre). Réutilisation des animaux pour les mises au point : - Lorsque cela est possible, premiers essais sur animaux post-mortem ou sans réveil d’animaux qui doivent être euthanasiés dans d’autres projets - Lors des étapes suivantes de mise au point, avec réveil, réutilisation d’un animal plusieurs fois si pertinent (échec précédent, non interférence avec les paramètres évalués) et procédure légère ou modérée - Un délai de 14 jours sera respecté avant réutilisation afin de permettre à l’animal de récupérer pour les HSG Lapins. Pour les souris, l’essai du passage du col et éventuellement l’injection vigile intra-utérine et contrôle par imagerie pourra être réalisé jusqu’à 3 fois par semaine, suivi d’un repos de 7 jours si une réutilisation pour le même usage est envisagée. Pour le protocole de synchronisation oestral des souris, un délai de 2 semaines sera respecté entre 2 administrations hormonales. Réutilisation des animaux au sein des études : - un échec de procédure légère ou modérée (par exemple échec d’administration intra-utérine d’un produit par voie naturelle) mènera à la réutilisation de l’animal pour un second essai, après temps de récupération nécessaire, à condition que les points limites ne soient pas atteints et si le protocole d’étude le permet. - suivi longitudinal de la distribution du produit en imagerie sur un même animal plutôt que par dosage sur prélèvement, pour réduire le nombre d’animaux en étude. - Les animaux dont l’euthanasie n’est pas nécessaire pour la finalité de l’étude pourront être réutilisés pour des mises au point de techniques/modèles, dans un autre projet, pour la formation, le prélèvement de matrices pour mises au point de techniques d'analyses.
Raffinement
Surveillance et relevé quotidien de l’état clinique, pesée régulière et scoring adapté à chaque protocole afin de quantifier l’état clinique, envisager un traitement et déterminer un score « point limite ». Enrichissement des cages d’hébergement : • Balle et bâtons en bois à ronger (lapins) • Bâtons à ronger, tubes en plexiglass pour l’abri, frisures de papier kraft pour le nid (rongeurs en groupes sociaux). Système de maintien de la température et monitoring de paramètres physiologiques lors des anesthésies. Anesthésie et analgésie : •Chez la Souris, l’administration intrautérine sera idéalement vigile en simple contention, comme cela est fait dans le cadre de l’insémination artificielle. La mise au point sera réalisée en premier lieu sous anesthésie gazeuse. Une habituation des animaux à la contention sera réalisée avant le début de la procédure afin de réduire le stress. •Chez la Ratte, si l’administration par voies naturelles est possible, elle se fera sous anesthésie gazeuse. •Dans les deux cas, si des signes de gêne ou de douleur apparaissent, une administration d’antispasmodique ou d'analgésique sera mise en place en curatif et/ou en préventif selon la fréquence d’observation de ces symptômes et la durée d’action de ces médicaments. •Chez la Lapine, la procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse de préférence, après administration d’un mélange d'un analgésique, d'un myorelaxant et sédatif, et d'un tranquillisant et sédatif. Une fois endormie, un antispasmodique sera administré afin de faciliter l’accès aux trompes en réduisant les spasmes tubaires. L’ensemble de cette médication devrait assurer le bon déroulement de la procédure et limiter les lésions éventuelles du tissu. Pour l’administration du produit par voie chirurgicale, ou chirurgie en vue de l’induction d’un modèle d’endométriose, une analgésie sera réalisée en pré-opératoire ainsi qu’en post-opératoire. Une nouvelle administration sera effectuée ultérieurement en cas de signe de souffrance les jours qui suivent. Mise en place d’une alimentation adaptée post chirurgie : •chez la Lapine, gel hydratant, quartiers de pommes, foin •chez le Rongeur, pellets placés dans la sciure plutôt qu’en hauteur, gels hydratants, friandises.
Choix des espèces
Notre espèce de choix est le Rat car c’est l’animal qui est classiquement utilisé dans les études de fertilité (réglementaires). De plus, des études de biodistribution et de toxicité à visée réglementaire seront effectuées sur cette espèce. Cela nous permettra de comparer certains résultats et d’être complémentaire à ces travaux destinés aux Autorités de Santé. Si la mise au point du modèle n’est techniquement pas possible chez le Rat, nous pourrons effectuer des études chez la Souris ou le Lapin, comme cela a aussi pu être fait dans la littérature. Ce sont également des espèces utilisées dans le domaine de l’étude de la reproduction. Les animaux seront des jeunes adultes, idéalement sexuellement matures. Pour les rats : 8-16 semaines. Pour les souris : 7-14 semaines. Pour les lapins : 3-8 mois. Pour la génération F1 : de la naissance jusqu’au sevrage.
Evaluation d’un nouveau type d’aiguille pour la technique d’ablation percutanée par micro-ondes permettant la destruction de lésions tumorales rénales et hépatiques sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
5 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque cochon d'environ 70 kilos subit huit ablations par micro-ondes, quatre dans le foie et quatre dans les reins, sous guidage échographique pour tester un nouveau type d'aiguille, avant d'être tué pour analyser les organes. Le porteur indique n'attendre aucune nuisance puisque tout se déroule sous anesthésie et analgésie. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique n'imite la perfusion des tissus et qu'il est donc "nécessaire" de travailler sur animal vivant.
Objectifs
Les techniques d’ablation percutanée permettent la destruction de lésions tumorales par une approche miniinvasive. L’ablation par micro-ondes présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques aussi bien au niveau des effets indésirables pour les patients que pour la facilité d’utilisation pour le praticien. Le principe de l’ablation par micro-ondes est de déposer localement une énergie qui induit une agitation moléculaire et donc une élévation de température significative entrainant alors une destruction cellulaire, afin d’obtenir un volume d’ablation contenant l’intégralité de la lésion plus une marge de sécurité. Pour cela, deux paramètres, la puissance et la durée d’application, sont adaptés au volume d’ablation souhaité. Il est donc nécessaire de disposer de tables fiables permettant de prévoir le volume d’ablation selon les valeurs de ces deux paramètres. La plupart des fournisseurs ne proposent que des tables basées sur des études expérimentales cadavériques, or la perfusion tissulaire (processus qui alimente les organes en nutriments et oxygène nécessaires à son activité) peut entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés et de s’assurer de la conformité et de l’absence de variabilité entre les volumes d’ablation étalonnés par le constructeur et les volumes d’ablation réels. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est le 6ème cancer le plus fréquent au monde et de la 2ème cause de mortalité par cancer. Le cancer du rein est le troisième cancer des voies urinaires et génitales. La technique d’ablation percutanée par microonde permet de traiter avec efficacité ces deux cancers. Elle est particulièrement adaptée pour les patients fragiles chez qui la chirurgie est délicate. La précision du volume d’abblation obtenu est essentiel. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés. Cela permettra de s’assurer que les tables mises à disposition par le fabricant et établis à partir de modèles cadavériques sont conformes avec la réalité. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. Une perfusion sera posée sur l'animal pour permettre l'administration des médicaments, un cathéter artériel pour mesurer la tension tout au long de l'intervention, ainsi qu'une sonde urinaire. A l’aide d’un guidage échographique , l’aiguille permettant de déposer localement l’énergie micro-ondes sera introduite en percutanée dans les zones à traiter : foie ou reins. Quatre ablations percutanées hépatiques et quatre ablations rénales (2 par rein) seront réalisées sur chaque animal avec différents paramètres (puissance et durée d’application). Une échographie de contraste sera réalisée à la fin du traitement pour évaluer la zone d’ablation. A la fin du traitement des 8 zones, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes traités pour les analyser.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet.
Devenir
Les 5 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs foie et reins pour les analyser (mesure du volume de l’ablation et degré de nécrose).
Remplacement
Des études préalables pour évaluer la technique ont été faites sur modèles animaux cadavériques. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter la perfusion tissulaire pouvant entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.
Réduction
Un minimum de cinq animaux sera nécessaire pour évaluer la reproductibilité des volumes par type d’application (puissance / temps de traitement). Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs applications (8 au total) seront réalisées sur le même animal car le foie et les reins du porc sont suffisamment grands pour le permettre.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et sous antalgiques pour éviter des souffrances à l’animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes (foie, reins) sont comparables à celles de l'homme. Les animaux auront un poids d'environ 70 kg et auront entre 4 et 5 mois pour avoir une taille d’organes comparable à ceux des humains.
Exsanguination par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
104 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur décrit un prélèvement de 150 microlitres de sang à la queue sous anesthésie, sur des souris porteuses du génotype Apc qu'il qualifie de dommageable, avec une surmortalité et une demi-vie de 23 semaines, suivies jusqu'à 15 semaines pour étudier la fonte musculaire liée au cancer. Il indique que la mise à mort passe par une exsanguination lors d'une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde, aucun animal n'étant maintenu en vie. Sur le remplacement, il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité multi-tissulaire du phénomène et que seul un modèle murin le permet.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez la souris Apc, un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en evidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoides dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez les souris Apc.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associe au cancer.
Procédures
Un prélèvement sanguin (150 µl) au niveau de l'extrémité de la queue sera réalisé sous anesthésie (kétamine 100 mg/kg + xylazine 10 mg/kg).
Impact sur les animaux
Il s'agit d'une étude non interventionnelle de suivi du développement naturel des animaux jusqu'à l'âge de 15 semaines. Toutefois, la gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Concernant les souris contrôles, aucune nuisance ou effet indésirable n'est donc attendu à l'exception du prélèvement rétro-orbital sous anesthésie gazeuse la veille de l’expérimentation. Concernant les souris Apc, il s'agit d'un génotype dommageable qui entraine une surmortalité des animaux avec une demi-vie de 23 semaines (le suivi et l'entretien de la lignée Apc est décrit dans la Procédure 1). D'une façon générale et afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons également particulièrement vigilants à tout signe évocateur de souffrance animale (se reporter à 4.2 pour une description des critères d'évaluation de souffrance animale et d'atteinte des points limites). Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Devenir
S'agissant d'une procédure classe sans réveil, aucun animal ne sera maintenu en vie au terme de la procédure.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, surface de section transversale ds fibres musculaires, à l'aide de l'outil https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority. Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour les souris Apc, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe pour les souris Apc. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives par l’utilisation de tests ANOVA 2 facteurs (time x genotype) pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Le déconditionnement musculaire associé au cancer met en jeu un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu. Des analyses immunohistologiques seront réalisées et ne peuvent donc être menés à bien qu’en ayant recours à l’expérimentation in vivo chez la souris. Par ailleurs, la littérature, ainsi que notre expertise dans ce domaine scientifique et technique, nous permettront de réaliser chez la souris ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope chez des souris mâles et femelles lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l'age de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris Apc seront utilisées comme animaux contrôles. Un dimorphisme sexuel pouvant être à l'origine d'une meilleure résistance à la cachexie des souris femelles, des souris mâles et femelles seront utilisées.
Suivi longitudinal du vieillissement d’un modèle de souris atteint de troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles subissent jusqu'à trois tests comportementaux de vingt minutes dont la nature n'est pas précisée, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau, afin d'étudier le vieillissement du modèle. Le porteur indique que ces souris développent au-delà de 53 semaines des stéréotypies et s'arrachent les poils jusqu'à se blesser, mais précise qu'il ne les utilisera pas au-delà de 40 semaines. Il affirme que les symptômes comportementaux de la maladie ne peuvent être reproduits ni en culture ni par modèle informatique.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des troubles neurodéveloppementaux envahissants qui sont associés à des perturbations dans la communication, les interactions sociales associées à des stéréotypies. Une stéréotypie est une ensemble de comportements sans signification apparente reproduits inlassablement. Les TSA sont des pathologies non mortelles avec des symptômes tout au long de la vie. De plus, la plupart des recherches sur cette pathologie ont été effectuées pendant la période de développement. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet vise à éclaircir le mécanisme des TSA et à identifier des déterminants moléculaires et cellulaires impliqués dans cette pathologie au cours du processus de vieillissement afin d'identifier des cibles moléculaires médicamenteuses qui pourraient être utilisées ultérieurement en thérapeutique pour améliorer le soutien thérapeutique tout au long de la vie du patient adulte.
Bénéfices attendus
La plupart des recherches sur l’autisme ont été effectuées pendant la période de développement. Ce projet se concentrera sur la période de vieillissement. Il a pour but de caractériser le vieillissement aux niveaux fonctionnel, moléculaire et morphologique sur un modèle souris autiste. Il vise à trouver et valider des cibles médicamenteuses potentielles qui pourraient améliorer cette pathologie et qui pourraient plus tard, potentiellement être utilisées dans les soins de santé. De plus, l'évaluation de l'implication de structures cérébrales interconnectées spécifiques impliquées dans la programmation et l’exécution des mouvements dans l’autisme constitue une percée dans notre compréhension de la maladie.
Procédures
Un test de comportement de 20 minutes sera réalisé sur des souris au maximum 3 fois durant le projet (360 animaux).
Impact sur les animaux
Au-delà de 53 semaines les souris présentent de nombreuses stéréotypies (gestes répétitifs, rythmés sans but apparent) au niveau du toilettage et elles s’enlèvent les poils et peuvent également présenter des plaies. Cependant nous n'utiliserons pas les animaux au-delà de 40 semaines. Lors du test de comportement, les animaux ont une phase exploratoire de leur nouvel environnement puis effectue leurs toilettages.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux pour l’analyse électrophysiologique, morphologique et moléculaire.
Remplacement
Nous étudions les bases cellulaires et moléculaires de l’autisme dans ce projet. Les symptômes cliniques de cette pathologie sont de nature comportementale qu’il est impossible de reproduire en culture cellulaire ou en modèle informatique dans l’état des connaissances actuelles. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Un calcul de puissance statistique a été utilisé pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Pour satisfaire à ces critères, ceci implique d'utiliser des groupes expérimentaux composés de 15 souris pour les groupes électrophysiologiques et de 8 souris pour les groupes moléculaires.
Raffinement
Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance quotidienne des animaux, une pesée deux fois par semaine ainsi que l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu. Des critères de points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal …). Un animal atteignant un des points limites définis sera euthanasié sans délais. Les animaux sont hébergés en groupe de quatre avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté et à un enrichissement (papier de nidification) leur permettant de se cacher. Les expérimentateurs sont formés à la chirurgie expérimentale et mettent à jour leurs compétences tous les ans.
Choix des espèces
La souris porteuse d’une mutation spécifique est l’espèce la plus pertinente pour les études menées sur l’autisme car cette mutation est connue chez l’Homme pour être responsable de l’autisme. Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles de petite taille ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. Les souris mâles et femelles seront utilisées à partir de la naissance jusqu'à l’âge de 40 semaines. Le but du projet étant de faire un suivi longitudinal du vieillissement : à 10 semaines les souris sont considérées comme jeunes adultes à 20 semaines comme adultes et à 40 semaines comme sénior.
Mise au point d’un protocole destiné à analyser le contenu de l’intestin grêle en réponse à des stress infectieux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. Après une mise à jeun de quatre heures, chaque souris subit une chirurgie viscérale d'une trentaine de minutes avec injection de microbilles fluorescentes ou d'une substance imitant un virus dans l'intestin grêle, puis reçoit un surdosage d'anesthésique. L'objectif affiché est de mettre au point une procédure d'analyse des molécules sécrétées dans l'intestin lors d'une infection, dans un projet pilote destiné à finaliser un article. Le porteur indique s'être appuyé sur des cultures d'organoïdes mais affirme qu'aucune méthode ne remplace l'expérimentation in vivo pour ces questions.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à mettre au point et optimiser une procédure permettant d’étudier les conséquences de l’exposition à certains agents d’origine parasitaire, microbienne ou viral sur la muqueuse intestinale. Plus précisément, nous souhaitons savoir quelles sont les molécules et substances sécrétées dans la lumière intestinale en réponse à des stress infectieux. Cette procédure consistera à réaliser une injection et un prélèvement de liquide intestinal, sur des souris anesthésiées. Dans ce projet, nous réaliserons deux types d’expériences, nous permettant d’optimiser la procédure : le suivi de microbilles fluorescentes, afin d’observer les interactions entre particules et cellules, ainsi qu’une substance capable de mimer la présence d’un virus, qui nous servira de contrôle positif. Cette procédure sera appliquée à deux lignées de souris, nous permettant, par comparaison des données obtenues dans ces dernières, de définir la contribution respective de certains sous types de cellules intestinales. Ce projet est un projet pilote, dans lequel nous validerons et optimiserons cette procédure
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires à la finalisation d’un article, visant à démontrer le rôle de certaines cellules intestinales dans la production de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de lutte contre les parasites. Au-delà de la finalisation de cette étude, cette procédure nous permettra de tester, simplement, d’autres hypothèses de travail, ayant notamment rapport avec l’immunité antivirale.
Procédures
Après une mise à jeun de 4 heures, les 60 animaux inclus dans cette saisine seront soumis à une procédure de chirurgie viscérale et injection de substances dans l’intestin grêle, procédure dite sans réveil, réalisée sous anesthésie générale, incluant l’ajout d'anti-douleur, durant une trentaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à une mise à jeun de 4 heures, des étapes de contention, une anesthésie générale, ainsi qu'un injection/ponction intraluminale.
Devenir
Les individus seront tous mis à mort pour récupération des tissus digestifs et du contenus de l'intestin grêle.
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains agents / substances pathogènes. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu consolider nos données à l’aide de modèles alternatifs (culture d’organoïdes), légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet.
Réduction
Il est difficile de présumer, par analyse de puissance rigoureuse, du nombre total d’animaux requis pour cette procédure, sachant que les paramètres que nous souhaitons étudiés n'ont jamais été monitorés jusqu'à présent. Sur la base des données publiées d'études relativement similaires, des lots de 4 à 6 souris sont typiquement analysés lors des expériences. Compte-tenu du nombre de génotypes et de substances à tester, et prenant en compte d’éventuelles étapes de mise au point, nous estimons qu’une quinzaine de souris sera nécessaire pour chaque type d’agents/composés à tester, par génotype, incluant les contrôles. Ainsi, ce projet impliquera 60 souris au total. Les méthodes d’interprétation des résultats seront basées sur des analyses statistiques.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière lors des phases d’élevage, et ne présentent pas de phénotype dommageable. Ces derniers ne seront en phase expérimentale que durant 30-40 minutes, sous anesthésie générale contrôlée, à la suite de quoi ils seront soumis à un surdosage d’anesthésique, dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée dans les conditions suivantes: contrôle des substances anesthésiques et analgésique locaux, maintien de la température corporelle de l'animal sur tapis chauffant.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature.
Etude de l’efficacité d’une technique de ciblage coeur-spécifique pour la délivrance d’anticorps par ultrason chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Issues d'animaux surnuméraires d'élevage, elles reçoivent une incision cutanée pour un accès veineux, une injection intraveineuse de molécules puis des ultrasons dirigés vers le cœur, pour établir la preuve de concept d'une délivrance ciblée de médicament par éclatement de microbulles. Le porteur décrit une chirurgie légère et des molécules et ultrasons présentés comme non délétères, l'ensemble se terminant par le prélèvement du cœur. Il affirme qu'une fois les validations in vitro faites, le recours à un "organisme entier" est "indispensable" avant tout transfert en clinique.
Objectifs
Les arythmies cardiaques ventriculaires sont la principale cause de mort subite cardiaque. Chaque année, environ 300 000 patients sont victimes de mort subite en Europe. Parmi les arythmies ventriculaires, les tachycardies ventriculaires peuvent être éligibles au traitement par radiofréquence lorsque les médicaments classiques ne fonctionnent pas. Ce traitement permet, grâce à un cathéter introduit dans les vaisseaux sanguins, d’atteindre le cœur et de détruire le foyer à l’origine de l’arythmie. La diffusion d’énergie radiofréquence au sein du muscle ventriculaire est donc limitée par l’épaisseur du muscle et sa composition, qui peuvent restreindre la diffusion et donc la destruction du foyer de l’arythmie. De manière générale, les résultats sont mauvais. Environ 50% des patients voient leur arythmie récidiver. Un des axes de recherche est d’améliorer l’efficacité de la suppression du foyer de l’arythmie. Alors que l’ensemble des projets sur ce sujet s’intéresse à changer l’énergie utilisée, nous souhaitons développer une méthode permettant de réaliser un traitement physique et chimique. Pour cela, il est envisagé une délivrance de médicaments encapsulées dans des microbules qui reconnaîtront le foyer de l’arythmie. Les ultrasons permettent ensuite de faire éclater les microbulles et délivrer le médicament au bon endroit. L’objectif de ce projet est d’établir la preuve de concept en évaluant l’efficience de cette approche de délivrance ciblée de molécules dans le tissu cardiaque in vivo. Ce projet pourra ouvrir des perspectives d'application au-delà du traitement des arythmies cardiaques ventriculaires.
Bénéfices attendus
L’intérêt de la démarche résiderait dans l’amélioration du pronostic de traitement des patients souffrant de tachycardie ventriculaire. De manière plus large, l’adressage spécifique d’une molécule à une zone cardiaques spécifique serait une première et ouvrirait des perspectives thérapeutiques plus larges pour le traitement d’autre maladie.
Procédures
Les animaux subiront une injection intrapéritonéale pour l’injection de l’anesthésie et du traitement antidouleur. Ensuite, ils seront sous soumis à une incision de peau de quelques millimètres pour permettre un accès veineux. Toujours sous anesthésie, ils recevront le traitement médicamenteux par injection intraveineuse et les ultrasons au niveau du coeur. La durée totale de l’anesthésie (couvrant le geste chirurgical, l’injection intraveineuse de molécules non toxiques et l’application localisée d’ultrasons) sera de 20 à 30 minutes et s’achèvera avec la mise à mort de l’animal pour le prélèvement de tissus.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une approche impliquant une chirurgie légère (pour accéder à la veine jugulaire), une administration intraveineuse de molécules non toxiques et l’application ciblé (thorax) d’ultrasons non délétères. Ces gestes et traitements seront en outre entièrement réalisés sous anesthésie et couverture analgésique adaptée. Il s’agit en outre de procédures sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis à mot en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur et l’analyse (histologie) des tissus.
Remplacement
La mise au point de l’approche, notamment la validation des molécules d’intérêt aura préalablement été validé in vitro. Néanmoins, une fois ces validations effectuées, il est nécessaire de recourir à un organisme entier pour intégrer également la réaction du corps face aux molécules injectées, leur biodisponibilité ou encore l’impact des structures tissulaires et cellulaires sur le ciblage de nos molécules. Cette étape est indispensable avant d’envisager des études plus approfondies ou un transfert à la clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Le projet sera réalisé par étape (la réalisation d’une étape étant conditionnée à la réussite de la précédente) Les animaux intégrés à ce projet proviendront de nos sélections d’élevage (animaux surnuméraires d’élevage : pas de naissance d’animaux déclenchées spécifiquement pour ce projet).
Raffinement
Le geste chirurgical permettant l’accès à la veine jugulaire ainsi que les traitements (injection intraveineuse et traitement par ultrasons) seront intégralement réalisés sous anesthésie gazeuse profonde et couverture analgésique adaptée. En outre, il s’agit de procédures sans réveil (les tissus cardiaques doivent être prélevés pour analyse) et les gestes les plus invasifs (laparotomie, injection intra-aortique) seront réalisés post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle murin est adapté aux études de pharmacocinétique dont il est question dans ce projet. De plus, il est parfaitement compatible à l’approche par ultrasons cardiaque envisagée ici. Enfin, le recours à un modèle murin permet l’utilisation des animaux déjà présents dans le laboratoire (souris surnuméraires d’élevage), évitant de faire naître des animaux (via un fournisseur agréé) spécifiquement pour ce projet. Les animaux auront entre 8 et 12 semaines (= jeunes adultes). Il est important d’avoir recours à des animaux plutôt jeunes, dont la densité osseuse gênera peu le passage des ultrasons. En effet, les résultats obtenus dans le cadre de projets impliquant les ultrasons dans un contexte d’échographie indiquent que chez les souris adultes plus âgées, les os font barrière de manière non négligeable aux ondes ultrasonores.
Identification de la fonction de la protéine SELENON dans la régulation glycémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 192 opérées du pancréas sous anesthésie et tuées avant tout réveil et 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement invalidées pour le gène SELENON, une partie reçoit une alimentation enrichie pendant six semaines pour induire un syndrome métabolique, avec mesures répétées de la glycémie et prises de sang, pour étudier le rôle de cette protéine dans la régulation du sucre. Le porteur indique que les souris peuvent développer un diabète avec perte de poids supérieure à 20 %, polyurie et hypo ou hyperglycémies, une insulinothérapie devant limiter ces atteintes. Il affirme qu'aucun autre modèle n'existe et qu'il est "impératif" d'étudier la protéine dans un organisme complet où tous les acteurs de la glycémie sont présents.
Objectifs
Le projet de recherche porte sur l’identification de la fonction de la protéine à sélénium SELENON, dans les mécanismes de la régulation glycémique en conditions physiologique et physiopathologique. La mutation de SELENON est responsable de dystrophies musculaires chez l’homme. Néanmoins, la fonction de SELENON et les mécanismes impliqués dans ces dystrophies musculaires restent inconnus et aucun traitement n’est actuellement proposé. Curieusement, l'expression de SELENON n'est pas limitée au tissu musculaire. En effet, plusieurs données de la littérature décrivent la présence du gène SELENON dans le pancréas. Le pancréas est un acteur central de la régulation de la glycémie. Par ailleurs, il a été démontré l’importance du dialogue muscle-pancréas dans le contrôle de ce système de régulation de la glycémie. De plus, dans certaines études réalisées sur une cohorte de patients atteints de myopathie liée à SELENON, il a été démontré que des index de masse corporel faibles sont associés à des niveaux d'insuline à jeun et post-prandial élevés, suggérant un risque élevé de résistance à l'insuline. L'objectif du projet est d'étudier le rôle de SELENON dans le pancréas dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, sa fonction dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie.
Bénéfices attendus
Les différentes analyses qui seront réalisée lors des études in vitro et in vivo de ce projet, nous permettront d’identifier les facteurs contrôlant l'expression de SELENON et fourniront des informations précieuses sur le contexte de son activité. Elles nous aideront également à évaluer la contribution d’un dysfonctionnement pancréatique au développement de la maladie musculaire. Enfin, les découvertes qui seront obtenus lors de ce projet nous permettrons d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du diabète mais également des maladies musculaires.
Procédures
Procédure1 : Pour le prélèvement du pancréas, une incision de l’abdomen et la mise en place d’un tube très fin en plastique dans le pancréas seront réalisés sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). Procédure2 : Les souris seront soumises soit à de l’alimentation standard appelée normal diet soit à une alimentation enrichie, appelé High Fat Diet pendant 6 semaine afin d’induire un syndrôme métabolique (durée classiquement décrite dans la littérature). Quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosages. Une fois par mois la fonction réelle du pancréas sera évaluée. Le test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie (0,6 µL de sang par mesure) toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL (incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose et 200 µL en postprandial. L’injection de glucose est réalisée sur animal vigile soumis à une contention manuelle. En fin d’étude, les animaux seront mis à mort et les organes prélevé (pancréas, muscles…) pour réalisation d’études histologique, protéomique et génomique.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, il pourrait être envisagé le dévelopement d'un phénotype diabétique chez les souris KO. Ainsi, une dégradation de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. etc... Néanmoins, l’insulino-thérapie qui sera mise en place pour traiter l'hyperglycémie devrait empêcher ces nuisances.
Devenir
L'objectif du projet est d'aborder l'expression de SELENON dans les tissus pancréatiques dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, son activité dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie. Ainsi, les devenir des animaux après chaque procédure se justifie par : - Procédure 1 : Cette procédure permet d’obtenir des îlots pancréatiques, source de cellules indispensable pour les études menées sur le diabète (mécanismes moléculaires de l'insulino-sécrétion physiologique et physiopathologique...). - Procédure 2 : L’euthanasie des animaux nous permettra de réaliser des études histologiques, de protéomique et de génomique sur les différents organes impliqués dans la régulation de la glycémie et sur les organes impactés par le diabète. Ceci nous apportera de cruciales informations sur le rôle de SELENON dans le développement du diabète afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutique de cette maladie. Enfin, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement.
Remplacement
En dehors de notre lignée de souris transgénique, il n’existe pas d’autre modèle permettant d’étudier le rôle du gène SELENON dans la fonction musculaire et la régulation glycémique. Des études menées in vitro sur des cultures cellulaires de muscle nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires et voies cellulaires auxquels participe SELENON. Toutefois, ces études ne permettent pas de comprendre l’importance physiologique de ces processus dans la formation et la maintenance du tissu musculaire. Par ailleurs, un îlot pancréatique est un ensemble complexe composé de différents types cellulaires interconnectés les uns avec les autres pour réguler de façon adapté la fonction régulatrice de la glycémie par la sécrétion de différentes hormones telles que l’insuline, le glucagon etc… Les lignées cellulaires n’ont pas réussi à l’heure actuelle de reproduire efficacement ce fonctionnement. Ainsi, la culture primaire d’îlots pancréatiques est indispensable pour une telle étude in vitro. Enfin, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’évaluer le rôle de SELENON dans un environnement physiologique et physiopathologique, il est également impératif de l’étudier dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés.
Raffinement
Les cages ventillées des souris seront enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges et de carrés de nidification. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et de prise en charge des animaux tout au long de leur séjour dans notre animalerie. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle. De plus, concernant l’isolement d’îlots pancréatiques, la cathétérisation du canal cholédoque à ce stade de développement est bien maîtrisée au laboratoire et permet une bonne reproductibilité des rendements en îlots pancréatiques. Enfin, pour ce projet, les mâles et les femelles seront utilisés car nous souhaitons caractériser le rôle de SELENON dans la régulation glycémique quel que soit le sexe.
Etude des effets neuromodulateurs de la pregnénolone en réponse aux ligands endogènes et exogènes du récepteur aux cannabinoïdes de type-1 : Analyses comportementales et moleculaires chez des souris mutantes CB1-E134G.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, trente-deux étant opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une injection de THC ou d'autres composés, puis 912 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'effet neuromodulateur de la prégnénolone chez des souris mutantes. Le porteur indique que la mise en cage individuelle peut provoquer un stress d'isolement et que les mises à mort se font par inhalation de CO2. Les souris ne sont pas réutilisées pour éviter tout effet cumulatif des traitements.
Objectifs
Le cannabis est une des drogues d’abus la plus utilisée dans le monde (166 millions d’utilisateurs dont 15 millions de personnes dépendantes). Le ∆9-tétrahydrocannabinol (THC) est le composant principal du cannabis et est responsable des effets toxiques et addictifs observés lors de la prise de cannabis chez l’homme. Le THC fait partie de la famille des cannabinoïdes et agit au niveau du cerveau via les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (CB1). Ces récepteurs CB1 participent à la régulation de nombreuses fonctions biologiques, comme la régulation de comportements liés à la cognition, à la régulation de l’équilibre énergétique, ou encore des réponses liés au stress et à l’anxiété. Une dérégulation de l’activité de ces récepteurs CB1 en réponse à la prise de cannabis (ou de THC), peut donc être à l’origine de désordres psychiatriques et comportementaux importants. Le développement de thérapies pouvant atténuer les effets neurologiques d’une sur-activation CB1 est donc un enjeu de santé publique majeur. Il a été montré, chez le rongeur de laboratoire, un nouveau mécanisme de régulation endogène qui se met en place dans le cerveau et permet de diminuer fortement les effets toxiques d’une telle sur-activation par le THC. De fortes concentrations de THC vont activer le récepteur CB1 de façon excessive et un stéroïde, la pregnénolone, va alors être libérée dans le cerveau et agir directement sur le récepteur CB1 pour réduire son activité et bloquer les effets toxiques du THC. Notre projet de recherche consiste à mettre en évidence le rôle physiologique de la pregnénolone dans la régulation des récepteurs CB1. Pour cela, notre stratégie a été de développer une souris mutante, chez laquelle la pregnénolone ne peut pas se lier au récepteur CB1. Cette souris ne comporte pas de phénotype dommageable. Nous envisageons d’étudier des comportements non invasifs, et les mécanimes moléculaires qui y sont liés, chez ces souris à l’âge adulte en comparaison à des souris ayant un récepteur CB1 intact.
Bénéfices attendus
Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, la depression, ou encore les troubles du comportement alimentaire. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1 par la pregnenolone. Cela sera rendu possible par l’utilisation d’un nouveau modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, chez lesquelles le site de fixation allostérique de la pregnenolone est invalidé.
Procédures
1) Traitement: Un total de 1264 animaux recevra un traitement par injection dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux (10ml/kg pour la souris). L’ensemble des animaux ne recevra qu’une seule injection. 2) Tests d’étude des comportements : L’ensemble des tests prévus dans cette étude concernera 912 animaux. Les tests seront réalisés sur des animaux vigiles après administration aigüe d’un traitement (délai allant de 30 minutes jusqu’à 24h). 3) Procédure chirurgicale: La procédure sera réalisée chez 32 souris sous anesthésie générale sans réveil. 4) Mise à mort : elle sera réalisée chez l’ensemble des souris, soit pour faire des prélèvements de tissus pour des analyses ultérieures (chez 320 animaux), soit à la fin des expérimentations (chez 912 animaux), car les animaux ne pourront pas être réutilisés.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux pourraient survenir à leur mise en cage individuelle, qui pourrait entraîner un « stress » lié à l’isolement. Cependant, cet isolement sera fait sur un temps court et sera compensé par un enrichissement des cages et des contacts visuels et sonores entre chaque cage. Des effets indésirables pourraient survenir lors de l’induction de l’anesthésie. Les méthodes de mise à mort peuvent également entraîner des effets indésirables, cependant elles seront réalisées dans des conditions expérimentales appropriées afin de limiter toute souffrance ou angoisse pour l’animal.
Devenir
Procédures I à V et VIII : Les animaux des procédures ayant recours à l’injection de THC et l’analyse des effets comportementaux du traitement seront mis à mort par inhalation progressive d’un mélange air/CO2. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ultérieurement afin d’éviter tout effet cummulatif des traitements sur le comportement des animaux. En outre, les effets cummulatifs de l’administration de THC chez les souris mutantes CB1-E134G n’est pas connu, en particulier sur les niveaux d’expression du récepteur CB1 et sur la synthèse de pregnénolone. Afin de pallier à ces éventuels biais expérimentaux, des groupes indépendants de souris seront utilisés. Procédure VII : Les animaux de la procédure VII seront mis à mort par injection d'euthanasiant couplé à une perfusion intracardiaque d’un mélange de paraformaldhéhyde (formaline 4%). La mise à mort des animaux et la fixation des tissus est ici nécéssaire pour l’analyse de l’expression du récepteur CB1 par des approches immunohistochimiques. Procédures VI et IX : Les animaux des procédures VI et IX seront mis à mort par décapitation rapide. La méthode de mise à mort par décapitation est nécessaire dans notre projet pour pouvoir prélever rapidement du sang afin de faire des analyses ultérieures. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres méthodes, comme la dislocation cervicale, car la récupération ultérieure du sang serait difficile due à sa coagulation et ceci entraînerait un biais expérimental. Les études des voies de signalisations ainsi que la quantifications des endocannabinoïdes et neurostéroïdes ne pouvant être réalisées que sur des échantillons ex vivo. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés et induire ainsi des biais expérimentaux.
Remplacement
Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches subsitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier au préalable le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1, ainsi que la probabilité d’invalider ce site de fixation par une mutation ponctuelle du gène codant pour le CB1. Cette mutation a ensuite été validée in vitro, nous permettant de vérifier que la pregnénolone ne pouvait pas se lier au récepteur muté. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. Nous utiliserons ici un modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, ce qui nous permet de connaitre la faisabilité et les conditions appropriées des procédures expérimentales.
Réduction
Un nombre de 8 à 10 souris par groupe expérimental sera nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets génotype. Les tests statistiques consisteront au préalable en un test de normalité, puis en un test d’analyse de variance à deux facteurs, suivi si besoin de tests post-hoc. Dans le cas où les données ne suivraient pas une distribution normale, des alternatives non-paramètriques aux tests cités ci-avant seront realisées. Enfin, les études réalisées en amont ainsi qu’une connaissance accrue de la bilbiographie sur le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques, en particulier pour les expériences ayant recours à l’utilisation de THC. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites (Voir Annexe 1 ; tableaux 3 A, B, C et Annexe 2, Tableau 1). De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuissances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des animaux (Varholick et al., ScientIfic Reports, 2019), et afin de reproduire les conditions d’hébergement des projets précédents. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation (Gouvela & Hurst, Plos one, 2013). Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 1h avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des mutations génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’homme. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de l’homme, ce qui permettra une possibilité de translation chez l'homme dans des études de recherche & développement des résultats obtenus dans le projet de recherche. De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Enfin, des études préliminaires réalisées in vitro ont démontré la conservation du site de fixation de la pregnenolone sur le récepteur aux cannabinoïdes CB1 chez le récepteur murin et humain; ce qui encourage l’utilisation de ce modèle dans notre étude. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie). Ce projet se fera dans la continuité de projets précédents chez ces souris au même âge et permettra de mieux appréhender les mécansimes de régulation endogène du récepteur aux cannbinoïdes CB1 par la pregnénolone.
Implication du recepteur TREM-1 au cours du syndrome des anticorps antiphospholipides (SAPL)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
138 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une thrombose est provoquée par sténose chirurgicale de la veine cave, suivie d'injections d'anticorps de patients, pour étudier le syndrome des anticorps antiphospholipides. Le porteur indique que la thrombose peut provoquer douleur, œdème des membres et une possible insuffisance rénale. La mise à mort se fait par ponction cardiaque pour prélever le sang et la veine cave.
Objectifs
Ce protocole in vivo se justifie par la nécessité d’améliorer la compréhension des mécanismes de l’immunité impliqués dans la thrombose liée aux anticorps antiphospholipides : dans le syndrome des anticorps antiphospholipides (SAPL) et dans la COVID-19. Le syndrome des anticorps antiphospholipides est une maladie autoimmune définie par la présence d’anticorps dirigés contre des composants cellulaires de son propre organisme et de thrombose (occlusion) veineuse, artérielle et/ou de la microcirculation. Cette maladie, actuellement non guérissable, favorise la survenue de thrombose telle que l’embolie pulmonaire, la phlébite ou les accidents vasculaires cérébraux. Elle touche environ 0.5% de la population d’une moyenne d’âge de 40 ans au diagnostic. Le traitement anticoagulant habituellement prescrit ne permet pas toujours un bon contrôle de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d’une thrombose due à ces anticorps afin de disposer de thérapeutiques nouvelles. Des travaux ont permis de montrer qu’une partie des globules blancs, les neutrophiles participent à la défense de l’organisme en s’activant et en libérant des pièges cellulaires qui jouent un rôle dans la survenue de la thrombose. Ces anticorps ont la capacité d’activer la production des pièges cellulaires. Au cours d’une infection, ils semblent en partis produits après activation des neutrophiles par le triggering receptor on myeloïd cells 1 (TREM-1). Ce récepteur (protéine capable d’activer les cellules et de transmettre un message après fixation par un composé biologique) semble impliqué dans le SAPL. Notre hypothèse est que TREM-1 joue un rôle dans la formation de la thrombose au cours du SAPL, par l’intermédiaire de l’activation des neutrophiles. Par ailleurs, dans la COVID-19, l’activation très importante de la coagulation contribue à la gravité de la maladie. Chez les patients COVID-19 hospitalisés, la présence d’anticorps antiphospholipides est inhabituellement importante suggérant leur implication dans l'activation de la coagulation. Plus ce taux est élevé, plus les thromboses sont importantes et corrélées à l’activation des neutrophiles, eux même corrélés à la sévérité de l’atteinte respiratoire. De plus, plus la maladie est sévère, plus TREM-1 est activé. Notre hypothèse est ainsi que les anticorps antiphospholipides seraient impliqués dans la COVID-19 de la même manière qu’au cours du SAPL, en activant TREM-1 et les neutrophiles
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus devraient permettre de confirmer le rôle de TREM-1 dans l’inflammation générée par la présence d’anticorps antiphospholipides dans le syndrome des anticorps antiphospholipides et dans la COVID-19 si les anticorps antiphospholipides sont pathogènes dans cette maladie virale et permettre d’envisager une nouvelle cible thérapeutique puisqu’un inhibiteur de TREM-1 est développé.
Procédures
Une thrombose veineuse sera induite chez tous les animaux en réalisant une sténose (rétrécissement du diamètre de la veine favorisant la stagnation du sang et donc la formation d’une thrombose) de la veine cave. Cette procédure chirurgicale réalisée sur des animaux anesthésiés dure environ 1h. Les souris recevront des anticorps (anticorps antiphospholipides, contrôle ou de patients avec COVID-19 avec ou sans antiphospholipides) en injection intrapéritonéale dont le nombre d'injection (1 ou 2) sera determinée lors d'une 1ère phase préliminaire. Les animaux seront ensuite anesthésiés de nouveau pour réalisation d'une échographie de veine cave, prélèvement sanguin par ponction intracardiaque puis mis à mort. Cette échographie d'une durée de 5 minutes environ sera réalisée à 24h ou 48h de l'intervention chirurgicale (délai determinée lors d'une 1ère phase préliminaire). 10 souris réutilisées d'un projet antérieur permettra l'optimisation de la chirurgie et seront mises à mort à l'issue de celle ci. 40 souris permettront l'optimisation du modèle en determinant le nombre d'injection intrapéritonéale d'anticorps et le délai de réalisation de l'échographie. Si les résultats de cette 1ère phase sont satisfaisants, la 2ème phase correspondant à l'étude proprement dite sera réalisées en utilisant 88 souris sauvage ou invalidées pour le recepteur TREM-1.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un thrombose de veine cave. Cela peut engendrer de la douleur (prise en charge par un médicament antalgique dérivé de la morphine : la buprénorphine) ainsi que de l'oedème des membres inférieurs. Le risque infectieux lié à la chirurgie est peu probable puisqu'elle sera réalisée de façon aseptique et par le porteur de projet qui se sera ré-entrainé grâce aux souris de la phase 1 groupe 1. Il existe également un risque d'insuffisance rénale car la veine rénale droite sera thrombosée. Ce risque est limité car la sténose sera réalisée en dessous de la veine rénale gauche qui sera donc épargnée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur bien être sera évalué à l'aide d'un score.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour récupération d'un volume sanguin important par ponction intra-cardiaque et récupération de la veine cave inférieure.
Remplacement
Les tests in vitro sont de réalisation difficile pour plusieurs points : premièrement l’activité des anticorps antiphospholipides est différente in vitro et in vivo. Un des anticorps possède une activité anticoagulante in vitro (d’où son nom) et une activité pro coagulante in vivo. D’autre part, un des acteurs clés du SAPL est la béta2GPI. Il s’agit d’une abondante protéine du plasma se trouvant habituellement en conformation circulaire, qui sous l’effet de certains stimuli va se déplier en « J » permettant alors la liaison aux anticorps. La survenue d’une thrombose fait intervenir de nombreux composants cellulaires : cellules endothéliales (cellules constituants la parois des vaisseaux en contact avec le sang), globules blancs (dont les neutrophiles), plaquettes (cellules du sang intervenant également dans la formation d’une thrombose) donc il est difficile d’être proche de la physiopathologie humaine avec un modèle in vitro.
Réduction
Réduction : Le calcul du nombre de souris nécessaire a été effectué via le logiciel G-Power (Université de Düsseldorf). Le risque de première espèce (alpha) a été fixé à 0.05 pour une puissance statistique minimum requise de 80%. Il a été escompté une diminution du thrombus par 3 dans le groupe étudié TREM-1 ko. Ainsi l’effectif minimum pour obtenir une puissance statistique suffisamment fiable était calculé à 11 souris par groupe. Par ailleurs la Phase 2 ne sera débutée que si les souris de la phase 1 ne montrent pas de signes de souffrance que l’on ne peut soulager, ce qui n'est pas attendu.
Raffinement
Les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris seront hébergées à 2 par cages individuellement ventilées. Cet hébergement par deux permettra de limiter le sentiment d’isolement tout en réduisant les conflits de dominance au sein des cages et le risque de blessure au niveau des points de suture suite à la chirurgie. Elles seront opérées toutes les 2 le même jours et remises ensemble une fois parfaitement réveillées. Elles seront nourries ad libitum avec les croquettes. Le milieu sera enrichi (buchettes en peuplier, tunnels, matériel de nidification). Les souris seront surveillées quotidiennement par l’utilisation d’une grille de score individuelle. A visée antalgique, les souris recevront une heure avant la chirurgie puis en post-opératoire à 6h de la première injection, un médicament antalgique dérivé de la morphine (buprénorphine) en injection sous-cutanée. Ce même médicament sera administrée dans l’eau de boisson pendant la 1ère nuit. Nous ne pouvons pas utiliser d’anti-inflammatoire puis que nous étudions la voie TREM-1 impliquée dans la réaction inflammatoire générée par l’organisme. La Phase 1, Groupe 1 permettra un ré-entrainement du porteur aux gestes chirurgical sur 10 souris sans réveil, pour optimiser la récupération des suivantes. La phase 2 ne sera pas lancée si la phase 1 est jugée néfaste ou trop sévère sur le bien être animal ce qui n'est pas attendu.
Choix des espèces
Il s’agit du seul modèle animal transgénique KO TREM-1 disponible. D’autre part, la souris est l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour l’étude du SAPL. L’induction d’une thrombose veineuse par sténose de veine cave chez la souris est bien décrite dans la littérature et est celui qui se rapproche le plus de la physiologie humaine (absence de discontinuité endothéliale). Notre équipe maitrise l’utilisation de ce modèle chirurgical et l’utilisation d’animaux transgéniques particulièrement ceux déplétés de TREM-1. Les animaux seront des souris adultes C57BL/6, reçues à 6-7 semaines d’âges et inclues dans l’étude à 10 semaines. Le SAPL est une pathologie se développant à l’âge adulte motivant l’âge des souris utilisées.
Evaluation de la fonction contractile cardiaque par échographie de stress
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une échographie de stress cardiaque après pose d'un cathéter, pour tester des candidats médicaments sur la fonction du cœur. Le porteur décrit une procédure sans douleur du fait de l'anesthésie générale continue. Il indique que le rat possède un système cardiaque proche de l'humain et sert de modèle courant pour ces études précliniques.
Objectifs
L’échographie cardiaque est un examen permettant une analyse précise de la fonction cardiaque et des dimensions des différentes cavités du cœur. Elle est indiquée dans la majorité des maladies cardiaques, pour le diagnostic lors d’apparition de douleurs thoraciques par exemple, mais aussi pour le suivi d’une maladie cardiaque suite à un infarctus ou pour l’évaluation de la fonction cardiaque lors d’une insuffisance cardiaque. La meilleure compréhension des maladies cardiaques a permis de développer de nouvelles classes de médicaments qui ont pour but de diminuer la réponse du cœur à un stress aigu, tel que l’infarctus, et qui vont ainsi le préserver de l’apparition de lésions futures conduisant à l’insuffisance cardiaque. Ces médicaments vont notamment limiter la contractilité du cœur (effet inotrope) ou l’accélération de la fréquence cardiaque (effet chronotrope). L’examen de référence pour étudier ces effets est appelé échographie de stress. Elle a pour but d’évaluer la fonction contractile du ventricule gauche et la fréquence cardiaque en situation de repos et durant une stimulation artificielle du cœur. Un composé induisant un stress cardiaque, l’isoprotérénol, la dobutamine ou la norépinéphrine, est administré dans une veine par perfusion et va donc stimuler les effets inotropes et chronotropes du cœur. Le médicament à tester est alors administré en amont ou conjointement au composé stressant et l’échographie va permettre d’évaluer la capacité de ce médicament à limiter le stress induit. Ainsi, le recours à cette échographie de stress va permettre de tester les effets cardiaques bénéfiques des candidats médicaments. Elle permettra également de valider les doses présentant la meilleure efficacité pour limiter le stress cardiaque. Ultimement, ces validations permettent d’améliorer la connaissance des candidats médicaments avant de les tester sur les modèles d’études plus complexes (infarctus) et chroniques (insuffisance cardiaque).
Bénéfices attendus
Les intérêts d’avoir recours à l’échographie de stress sont multiples : dans un premier temps, c’est un acte simple qui permet de valider l’efficacité d’un candidat médicament sur la contractilité du ventricule gauche et la fréquence cardiaque avant l’utilisation de modèles plus complexes tels que des modèles d’infarctus ou d’insuffisance cardiaque. En cas d’absence d’efficacité, cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés dans ces modèles. Ensuite, le recours à l’échographie permet d’améliorer de manière significative le raffinement. En effet, l’échographie est une technique d’imagerie non invasive, de courte durée (environ 30 min dans le cadre de ce projet). Enfin, l’utilisation de l’échographie de stress permet de tester l’effet dose-réponse d’un candidat médicament et donc de déterminer la dose présentant la plus grande efficacité. Cela permet ainsi de maximiser les tests d’efficacités sur des modèles chroniques et/ou des modèles plus complexes. Ainsi, bien que les modèles d’infarctus ou d’insuffisances cardiaques demeurent les modèles de références pour étudier l’évolution des pathologies ischémiques cardiaques, l’échographie de stress représente une alternative fiable aux stades précoces des tests d’efficacités de candidats médicaments sur la fonction cardiaque.
Procédures
Lors de ce projet, l'induction du stress et les traitements avec les candidats médicaments se feront par des voies d’administrations uniques nécessitant une anesthésie générale gazeuse et l’usage dans certains cas d’aiguilles (sous-cutanée, intra-veineuse). L’évaluation de l’efficacité des nouveaux traitements se fera lors d’une procédure effectuée sous anesthésie générale gazeuse à l’issue de laquelle l’animal inconscient sera mis à mort. La préparation de l'animal, qui comprend l'anesthésie gazeuse (isoflurane) + l'administration de lidocaïne (SC)+ la tonte de l'animal + la mise en place de la sonde rectale de température durera 10 min. Ensuite, la mise en place du cathéter durera 10 min. L'échographie basale 1 min et la perfusion du composé stressant 5 min, durant lesquelles seront réalisées des échographies toutes les minutes. Enfin, les animaux anesthésiés seront mis à mort par un administration intracardiaque (1 min). Ainsi la procédure dans sa totalité durera environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure, les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse (isoflurane) qui peut être génératrice de stress lors de l'induction. La procédure expérimentale n’entraine pas d’effets indésirables chez les animaux, du fait du déroulement sous anesthésie générale. De plus, la procédure étant classée sans réveil, les animaux seront mis à mort sans réveil préalable. Le stress cardiaque sert à reproduire une épreuve d’effort chez l’animal et n’entraine pas de douleurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à l'issue de la procédure
Remplacement
De nombreuses études expérimentales sur les maladies cardiaques, tels que l’infarctus et l’insuffisance cardiaque, utilisent les rats. En effet, cette espèce possède un système cardiaque similaire à celui de l'Homme et l'ensemble des paramètres étudiés est identique à celui mesuré chez le patient humain. Néanmoins, malgré leurs efficacités prouvées pour le développement de nouvelles thérapeutiques, ces études sont complexes et chroniques. L’utilisation de l’échographie de stress permet de développer et de tester de nombreux candidats médicaments en amont de ce type de modèles. En effet, cette procédure va permettre de tester l’effet de nombreux candidats médicaments sur la fonction cardiaque. L'utilisation du modèle animal in-vivo est nécessaire dans ce projet car le but recherché est d'étudier l'effet spécifique d'une molécule au niveau cardiaque suite à une administration dans le système sanguin, tel que classiquement décrit lors de la prise en charge des maladies cardiovasculaires comme l'infarctus. La souche de rat choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques. Elle correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. L'objectif du projet étant d'obtenir une preuve de concept d'efficacité de ces nouveaux composés in vivo, l'utilisation de rats est nécessaire afin d'évaluer l'effet sur un organe entier et les conséquences fonctionnelles (fonction cardiaque, fréquence cardiaque).
Réduction
Les données préalables obtenues sur ce modèle ont permis d'établir les effectifs d'une série expérimentale à 40 animaux répartis en 5 groupes de 8 animaux. Le nombre d'animaux par groupe a pu être fixé à 8 sur la base de notre expérience passée et de nos données antérieures sur ce modèle ainsi que sur le retour d'expérience des responsables de projet. En effet, chaque animal étant son propre contrôle grâce à l’échographie basale (avant la perfusion du composé stressant), nombre d’animaux utilisé pour chaque série expérimentale est considérablement réduit. L'étude d’efficacité d’un composé constitue une série expérimentale. A raison de 15 séries expérimentales réparties sur 5 ans, le nombre total d'animaux pour ce projet est de 600. L'analyse des données, sera effectuée en aveugle (sans connaissance des groupes) par une seule personne pour éviter tout biais dans l'évaluation de la fonction cardiaque. Les données obtenues seront soumises à des tests statistiques adéquats (non paramétriques). Des t-tests et/ou des ANOVA une voie seront réalisés entre les différents groupes afin d'évaluer l'efficacité du composé testé aux différents temps de l’infusion.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant leur durée d'acclimatation dans des cages aux dimensions conformes aux recommandations en vigueur et ceci jusqu'au protocole sans réveil. Des enrichissements multiples sont placés dans les cages. À réception, les animaux sont collectivement hébergés (3 ou 2 rats par cage selon le poids). L'eau et la nourriture sont données ad libitum et les animaux ont accès à différents types d’enrichissements (cubes de bois, rouleaux de carton). Lors de la procédure, les animaux sont profondément anesthésiés par anesthésie gazeuse (isoflurane) et ventilés à l’aide d’air enrichi en oxygène afin de prévenir une désaturation artérielle en oxygène. La température corporelle est également finement contrôlée à l’aide d’une sonde rectale reliée à un tapis chauffant. Une analgésie locale est réalisée avant la pose des cathéters veineux. La procédure expérimentale n’entraine pas d’effets indésirables chez les animaux, du fait du déroulement sous anesthésie générale profonde. Le stress cardiaque induit pour l’échographie de stress sert à reproduire une épreuve d’effort chez l’animal et n’entraine pas de douleurs.
Choix des espèces
Un grand nombre d'études expérimentales portant sur l’étude des pathologies cardiaques sont menées sur le rat. En effet, le rat possède un système cardiovasculaire proche de l’Homme et développe des lésions cardiaques reproductibles ce qui en font un modèles de choix dans les études d'efficacités précliniques. Des rats mâles ou femelles en croissance (à partir de 6 semaines) au moment de leur arrivée en acclimatation sont utilisés. Le choix du stade de développement est basé sur l'usage couramment référencé dans la bibliographie, le retour d'expérience et une sensibilité accrue des animaux trop âgés à l’échographie de stress, qui pourrait entrainer une réponse au stress trop intense et risquerait de masquer les effets du candidat médicament. En tant que prestataire, le choix de la souche pour chaque série expérimentale se fera en accord avec le sponsor.
L’IKEJIME : Etat des lieux et apports de cette méthode d’abattage pour l’acceptabilité de la mise à mort des poissons
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
60 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes mises à mort, réparties en quatre groupes de quinze selon la méthode d'abattage testée. Le projet compare l'asphyxie sur glace, la percussion crânienne, l'électronarcose et la méthode Ikejime, pour mesurer le stress et la qualité du filet. Le porteur indique que certains groupes seront tués par des méthodes qui ne respectent pas les recommandations de la directive 2010/63/UE, l'asphyxie sur glace durant plus de dix minutes avec un stress accru. L'objet déclaré porte en partie sur l'acceptabilité de la mise à mort et la qualité organoleptique de la chair.
Objectifs
L'objectif est d'évaluer le stress et la qualité du filet de poisson mis à mort par différentes méthodes chez la truite Arc en Ciel : l'asphyxie sur glace, méthode classiquement utilisée sur les bateaux de pêche, la percussion crânienne, méthode classiquement utilisée sur les parcours de pêche, l'électronarcose, méthode utilisée en élevage et la méthode Ikejime, méthode traditionnelle japonaise de plus en plus utilisée actuellement.
Bénéfices attendus
La méthode Ikejime est en développement actuellement chez certains pécheurs car elle est considérée comme préservant mieux les qualités organoleptiques du poisson car moins stressante et douloureuse au moment de l'abattage. Le projet permettra d'évaluer scientifiquement ces données et de comparer cette méthode de mise à mort aux autres méthodes beaucoup plus utilisées actuellement sur les bateaux de pêche (asphyxie sur glace et percussion de la boite cranienne) et en élevage (electronarcose).
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes méthodes d'euthanasie. Les procédures seront réalisées par des personnes expérimentées et durera de l'ordre de quelques minutes ainsi la percussion crabienne et la méthode ikejime sont d'une durée de la minute maximum, la technique electronarcose à une durée de 3 minutes. La méthode de mise a mort par asphyxie sur glace est la méthode la plus longue, 45 minutes, mais la glace ralentie la physiologie de l'animal. 15 poissons sont concernés par cette méthode.
Impact sur les animaux
Du fait des objectifs du projet, certains groupes de poissons seront mis à mort avec des méthodes qui ne respectent pas les recommandations de mise à mort (annexe IV) de la directive 2010/63/UE mais qui sont utilisés en pratique par les pécheurs. Les méthodes testées dans ce projet et non décrites dans la directice 2010/63/UE sont la mise à mort par asphyxie sur glace et la méthode Ikéjimé. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les poissons sont associés à la méthode de mise à mort par asphyxie sur glace. La durée de mise à mort sera plus longue que celle obtenue avec les autres méthodes, électronarcose de l’ordre de 3 minutes, percussion/commotion cérébrale et Ikejime de l’ordre de la minute tandis que pour l’asphyxie sur glace le temps estimé est plus de 10 minutes. Le stress induit sera plus important.
Devenir
Procédure sans réveil (mise a mort) pour tous les animaux
Remplacement
L'objectif du projet étant de comparer différentes méthodes de mises à mort chez le poisson, cela ne peut se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
En faisant l'hypothèse que la libération de cortisol est identique entre la méthode Ikejime et la percussion cranienne, et une liberation multipliée par 2 pour les méthodes asphyxie et électronarcose, le test de comparaison de 2 moyennes avec un risque alpha de 0.05 et une puissance à 0,9 ,15 poissons par lot sont nécessaires, ce qui correspond donc à 60 poissons au total (https://biostatgv.sentiweb.fr/), 15 par méthodes de mise a mort testées (asphyxie, percussion/commotion de la boîte cranienne, electronarcose et ikejime). Cette hypothèse est basée sur des premières données non publiées sur les méthodes de mise à mort de type électronarcose, commotion et surdosage d’anesthésique nous permettant d’avoir une idée des ordres des grandeur de niveau de cortisol attendu. Et surtout sur les différences de durée pour obtenir la mise à mort des animaux, très rapide et proche en durée pour la méthode percussion/commotion cérébrale et Ikejimé et plus longue pour les méthodes électronarcose et asphyxie sur glace.
Raffinement
Durant la période d'acclimation et d'élevage des animaux, les points limites sont les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 6 mg/ml) et ne peuvent pas être rectifiés, par exemple en raison d’une coupure de courant longue durée ou du défaut d’un appareil, l'expérimentation sera arrêtée. D'autre part, en cas de nage erratique, d'anorexie, les poissons seront euthanasiés. La densité sera de 16 kg/m3, ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher.
Choix des espèces
La Truite est l'espèce de poisson la plus élevée en France. Elle est de plus très utilisée dans les parcours de pêche. Ce n'est pas un modèle au niveau des poissons de pêche mais c'est également un modèle scientifique en expérimentation animale avec des publications sur le stress et la physiologie de l'espèce. La truite est donc un modèle intéressant car bien décrit scientifiquement et les résultats pourraient être comparer avec le milieu marin car la truite peut également s’élever en eau de mer. D’une façon générale, il n’y a pas de raison pour penser qu’une réponse en fonction de la méthode de mise à mort utilisée soit différente selon les espèces de poissons. Ce seront des truites adultes de type portion, vendue entière pour une personne, soit 250g environ. C'est une taille interessante pour appliquer les différentes méthodes de mise à mort.
Étude de la plasticité neuromusculaire et cardiaque dans un modèle murin de laminopathie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié tuée sous anesthésie avant tout réveil. Elles portent une mutation qui reproduit une laminopathie humaine et les fait décliner jusqu'à la mort par atteinte cardiaque vers huit mois. Trente-six subissent des électroneuromyographies avec aiguilles intramusculaires et des mesures de force, trente-six une perfusion intracardiaque, pour mieux comprendre la maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico n'existe et décrit un modèle qui ne peut pas être remplacé.
Objectifs
Les laminopathies constituent un ensemble très hétérogène de maladies génétiques caractérisées par des mutations dans des gènes codant des protéines nucléaires appelées lamine A et C. Parmi elles, plusieurs sont des maladies à expression préférentiellement neuromusculaire dont l’une d’entre elle se caractérise par une apparition précoce des symptômes souvent associés à une atteinte cardiaque appelée cardiomyopathies. Ce projet a pour but l’exploration des modifications fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et cardiaque permettant une meilleure compréhension de ces maladies et une prise en charge adaptée des patients dans un modèle murin de la pathologie. Le modèle murin de référence utilisé dans ce projet est porteur d’une mutation décrite chez l’homme et récapitulant, à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques musculaire et cardiaques décrites chez l’homme et détectable dès 3 mois allant jusqu’au décès des animaux à 8 mois.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats obtenus permettront de progresser sur les connaissances physiopathologiques synaptiques et cardiaques dans le cadre de défauts de protéine de l’architecture nucléaire, permettant ainsi une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les laminopathies.
Procédures
Dans ce projet, 36 animaux subiront une étude Electroneuromyographiques (ENMG) sur la patte gauche des souris (gastrocnemius) mutantes et contrôles (d’une durée de 8 minutes/animal) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois) et une semaine après des mesures de la force musculaire directe et indirecte (d’une durée de 20 à 30 minutes) sur la patte droite des souris mutantes et contrôles à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Les 36 autres animaux subiront un acte de perfusion intracardiaque permettant une analyse macroscopique du cœur des souris mutantes et contrôles (d’une durée de 15 minutes) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Tous les actes du projet sont effectués sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Dans chaque acte du projet des risques anésthesiques incluant un possible réveil ainsi qu’une détresse respiratoire peuvent survenir. Pour l'acte d'électromyographie, des nuisances post opératoire dû aux aiguilles intra-musculaire peuvent apparaître tel que une infection, inflammation et une douleur ou incorfort. Le modèle utilisé dans ce projet présente des atteintes cardiaques qui pourraient accentuer le risque d'anesthésie lors de chaque acte.
Devenir
Le protocole compte un lot 72 animaux (souris). Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des 2 procédures du projet. Des prélèvements de nombreux tissus et organes seron prélevés par la suite pour procéder à des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet nous anticipons l’utilisation d’un nombre total de 72 animaux respectant ainsi les règles des trois R de remplacement, de réduction et de raffinement. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque. Selon les connaissances actuelles, il n’existe aucune alternative in vitro, ex vivo ou in silico pour répondre à la question scientifique à la fois pour l’analyse fonctionnelle et structurelle des jonctions neuromusculaires mais également l’étude macroscopique du coeur.
Réduction
Les souris modèles et contrôles seront étudiées à différents stades allant de 3 mois (stade précoce de la pathologie, 6 mois (forme installée de la maladie) et 8 mois (stade tardif de la pathologie avec mort des animaux causé par une atteinte cardiaque) permettant une analyse aux différents stades de la pathologie. Il y aura 3 groupes de 12 souris selon l’âge des animaux. Les évaluations réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=3 groupes de 12 souris suivant l’âge des souris, soit un nombre total de 72 animaux au maximum).
Raffinement
Les souris seront stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Le milieu est enrichi avec des igloos (maisonnettes) en polypropylène sont disposés dans les cages permettant les jeux et le repos des souris. Au cours des procédures, seuls les animaux sur lesquels il y a une intervention seront amenés dans la pièce d’expérimentation. Les animaux seront anesthésiés avec un mélange d’analgésique et d’anesthésique en intrapéritonéal ou bien par anesthésique gazeux. Pour les deux procédures, une injection d’analgésique sera administrée pour le bien-être de l'animal. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres) et des points limites ont été définis. Cependant, l'expérimentateur référent de l'électroneuromyographie assure une reprise totale de l'animal et n'a observé aucun état de mal-être à la suite de cette acte.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet de recherche récapitule à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque étudiée. Les premiers symptômes sont détectés dès 3 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux vers 8 mois provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Ce modèle permettra d’étudier les modifications fonctionnelles et structurelles des jonctions neuromusculaires et cardiaques, conséquences des défauts de l’enveloppe nucléaire dans ce modèle murin qui ne peut pas être remplacé.