Procédures sans réveil
DU microchirurgie avec mise au point d’un modèle expérimental d’anévrisme
- Enseignement supérieur
1 310 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, pour l'entraînement de chirurgiens à la microchirurgie, une partie des procédures étant menée sous anesthésie sans réveil. Jusqu'à 60 rats servent à mettre au point un modèle d'anévrisme de l'aorte, les autres à des séances de formation, dix chirurgiens réalisant chacun vingt-cinq séances par an sur cinq ans. Les animaux sont euthanasiés par surdosage anesthésique intracardiaque, et le porteur déclare n'attendre "aucune nuisance". Il affirme que la pratique sur le vivant est "indispensable" et qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, le calibre des vaisseaux du rat se rapprochant de celui des vaisseaux humains.
Objectifs
Le Diplôme d’Université (DU) de microchirurgie a pour objectif de former des chirurgiens et/ou internes voulant acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie nécessaires à certaines spécialités chirurgicales (en discipline humaine : chirurgie des lambeaux, chirurgie de la main, neurochirurgie, chirurgie de la face, chirurgie pédiatrique, notamment et aussi dans les disciplines vétérinaires). Dans le cadre de cette formation (DU de microchirurgie), nous souhaitons également mettre en place une procédure supplémentaire et nouvelle au DETERCA pour l’entrainement de nos apprenants : le modèle anévrisme. Il s’agit d’induire sur l’artère aorte du rat un anévrisme (malformation artérielle) dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’anévrisme des artères cérébrales chez l’Homme. Ce modèle est connu, déjà utilisé dans d’autres centres. Il permet d’entrainer un apprenant à la prise en charge microchirurgicale d’un anévrisme.
Bénéfices attendus
En effet, afin reproduire les techniques chirurgicales en conditions réelles et pouvoir vérifier ces dernières, il est nécessaire d’avoir un organisme entier et vivant. Le choix du modèle rat est dû au fait que le calibre des vaisseaux du rat correspond au calibre des vaisseaux humains nécessitant des techniques de microchirurgie pour être appréhendés. Ainsi les chirurgiens peuvent s’entrainer sur les artères fémorales, l’aorte ou encore la carotide du rat. Pour cette formation, nous aurons deux types de procédures, une première afin de mettre au point le modèle anévrisme et une seconde pour le DU microchirurgie en général. Le modèle anévrisme est une nouveauté que nous souhaitons intégrer aux techniques déjà existantes du DU microchirurgie.
Procédures
Pour la mise au point du modèle anévrisme, les rats subiront une intervention chirurgicale afin de créer l'anévrisme. Le tout sous anesthésie et analgésie adaptée afin de réduire au maximum la souffrance de l'animal. Ceci concerne au maximum 60rats (procédure 1). La durée maximale de l'intervention est de 3h.
Impact sur les animaux
Aucune nuisances ou effets indésirables sont attendus sur les animaux pour ces procédures.
Devenir
A la finalité des deux procédures, les animaux seront euthanasié par surdosage anesthésique en intracardiaque.
Remplacement
Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie, nécessaires dans de nombreuses spécialités chirurgicales pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain. L'anatomie vasculaire du rat est un critère important afin de rendre la procédure la plus réaliste possible. Ces animaux sont opérés sous anesthésie générale.
Réduction
: Pour la mise au point du modèle anévrisme, nous prévoyons un total de 60 rats sur 5 ans. Nous procéderons par série afin de mettre au point ce modèle en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, si un nombre de rats inférieur à ce qui est prévu nous permet d’obtenir ce modèle anévrisme, nous utiliserons les animaux restants pour la formation au DU microchirurgie. Le nombre total d’animaux prévu pour le Diplôme d’Université est calculé sur 5 ans avec au maximum de 10 chirurgiens inscrits par an. Cette formation est composée de 25 séances d’entrainement par chirurgien par an. Soit pour 5 ans : 10x25x5 = 1250 rats. Ainsi un nombre total de 1310 rats au maximum seront utilisé pour ces deux procédures. Ceci a été calculé de sorte à réduire au maximum l’effectif tout en ayant un nombre suffisant d’étudiants pour ouvrir cette formation. Ce nombre sera revu à la baisse et uniquement à la baisse en fonction du nombre de chirurgiens inscrits. De plus, n’ayant pas de critère génétique, d’espèce ou de sexe (l’anatomie reste la même), nous utilisons au maximum des animaux de réforme, ayant servis pour d’autres recherches. Toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les chirurgiens peuvent réaliser plusieurs techniques sur un même rat anesthésié.
Raffinement
Les rats utilisés pour cette formation proviennent d’un éleveur agrée et sont hébergés par groupe social de quatre. Chaque cage dispose à minima d'un tunnel comme enrichissement. Lors de la chirurgie, les rats sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique adaptée. Ceci, dans le but de proscrire la souffrance et douleur de l’animal. En effet, du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie durant toute l’intervention. De plus, des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal lors des chirurgies et au réveil. Pour la procédure de création de l’anévrisme, l’animal est réveillé avec un suivi analgésique post-opératoire (analgésie, réhydratation…). A la fin du TP de microchirurgie l’animal n’est pas réveillé.
Choix des espèces
Le calibre des veines et des artères du rat est proche de celui des vaisseaux de petite taille chez l'homme. La carotide du rat est, par exemple, proche de l'artère digitale de l'homme, indispensable pour la chirurgie reconstructrice de la main (réimplantation de doigts). Dans l’idéal, nous utilisons des jeunes adultes de 300gr environ. Mais l’anatomie vasculaire étant presque similaire d’un jeune rat à un rat plus âgé, cela dépend plus principalement des rats de réforme qui nous sont proposés (nous avons déjà utilisé des rats plus mature pesant environ 700gr).
Evaluation d’un nouveau type d’aiguille pour la technique d’ablation percutanée par micro-ondes permettant la destruction de lésions tumorales rénales et hépatiques sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
5 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués sans réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal subit huit ablations par micro-ondes, quatre au foie et quatre aux reins, avant d'être tué pour mesurer les volumes détruits. L'objectif est de vérifier les tables d'un fabricant d'aiguilles d'ablation, établies jusqu'ici sur des tissus cadavériques. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit la perfusion des tissus vivants et juge "nécessaire" de travailler sur animal vivant.
Objectifs
Les techniques d’ablation percutanée permettent la destruction de lésions tumorales par une approche mini-invasive. L’ablation par micro-ondes présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques aussi bien au niveau des effets indésirables pour les patients que pour la facilité d’utilisation pour le praticien. Le principe de l’ablation par micro-ondes est de déposer localement une énergie qui induit une agitation moléculaire et donc une élévation de température significative entrainant alors une destruction cellulaire, afin d’obtenir un volume d’ablation contenant l’intégralité de la lésion plus une marge de sécurité. Pour cela, deux paramètres, la puissance et la durée d’application, sont adaptés au volume d’ablation souhaité. Il est donc nécessaire de disposer de tables fiables permettant de prévoir le volume d’ablation selon les valeurs de ces deux paramètres. La plupart des fournisseurs ne proposent que des tables basées sur des études expérimentales cadavériques, or la perfusion tissulaire (processus qui alimente les organes en nutriments et oxygène nécessaires à son activité) peut entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés et de s’assurer de la conformité et de l’absence de variabilité entre les volumes d’ablation étalonnés par le constructeur et les volumes d’ablation réels. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est le 6ème cancer le plus fréquent au monde et de la 2ème cause de mortalité par cancer. Le cancer du rein est le troisième cancer des voies urinaires et génitales. La technique d’ablation percutanée par micro-onde permet de traiter avec efficacité ces deux cancers. Elle est particulièrement adaptée pour les patients fragiles chez qui la chirurgie est délicate. La précision du volume d’abblation obtenu est essentiel. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés. Cela permettra de s’assurer que les tables mises à disposition par le fabricant et établis à partir de modèles cadavériques sont conformes avec la réalité. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. A l’aide d’un guidage échographique , l’aiguille permettant de déposer localement l’énergie micro-ondes sera introduite en percutanée dans les zones à traiter : foie ou reins. Quatre ablations percutanées hépatiques et quatre ablations rénales (2 par rein) seront réalisées sur chaque animal avec différents paramètres (puissance et durée d’application). Une échographie de contraste sera réalisée à la fin du traitement pour évaluer la zone d’ablation. A la fin du traitement des 8 zones, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes traités pour les analyser.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet.
Devenir
Les 5 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs foie et reins pour les analyser (mesure du volume de l’ablation et degré de nécrose).
Remplacement
Des études préalables pour évaluer la technique ont été faites sur modèles animaux cadavériques. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter la perfusion tissulaire pouvant entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.
Réduction
Un minimum de cinq animaux sera nécessaire pour évaluer la reproductibilité des volumes par type d’application (puissance / temps de traitement). Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs applications (8 au total) seront réalisées sur le même animal car le foie et les reins du porc sont suffisamment grands pour le permettre.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et sous antalgiques pour éviter des souffrances à l’animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes (foie, reins) sont comparables à celles de l'homme. Les animaux auront un poids d'environ 70 kg et auront entre 4 et 5 mois pour avoir une taille d’organes comparable à ceux des humains.
Mécanismes immuno-régulateurs des pathologies cardiométaboliques et de leurs comorbidités: récepteurs nucléaires et membranaires (1/2 ET 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
25 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Elles servent à reproduire une dizaine de pathologies comme l'anaphylaxie, l'asthme, le psoriasis, la septicémie ou le diabète de type 2, au moyen d'injections répétées, de gavages, de nébulisations et de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la douleur, inhérente à certains de ces modèles inflammatoires, ne peut pas être prise en charge dans certaines procédures sans interférer avec les résultats. Il affirme que la complexité des interactions entre organes rend l'expérimentation in vivo "indispensable", les retombées thérapeutiques restant formulées comme de simples perspectives.
Objectifs
But : Ce projet a donc pour but d’étudier la contribution des cellules immunes dans les pathologies immuno-inflammatoires et métaboliques et dans l’aggravation des unes par les autres. Il s’agira notamment de déterminer comment certains facteurs régulent le développement et la fonction des cellules immunes dans le contexte des maladies métaboliques. Ces facteurs sont d’une part, certains récepteurs nucléaires, activateurs ou répresseurs transcriptionnels activés par un ligand (un lipide ou un dérivé d’acide gras) ou des récepteurs membranaires.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental: meilleure connaissance du rôle des récepteurs nucléaires dans les processus pathophysiologiques impliquant le système immuno-inflammatoire Sur le plan appliqué: les mécanismes mis en évidence pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les récepteurs nucélaires peuvent être ciblés pharmatologiquement par de petites molécules
Procédures
P1 Anaphylaxie. 1. Injection intraveineuse, intrapéritonéale et intradermique. 2. Prélèvement sanguin. 3. Injection intraveneuse ou intradermique. 4. Gavage. 5. Injection intraveineuse. 6 Prise de témpérature (2h). 7 Prélèvement sanguin. P2 Athme. 1. Prélèvement sanguin. 2. Sensibilisation (3-5 nébulisation, injection intransale, intrapéritonéale, ou intratrachélae). 3. Nébulisation (20min). 4. Pléthysmographie (30 min). 5. Prélèvement sanguin. P3 Dermatite atopique. 1. Prélèvment sanguin. 2. Rasage. 3. Application topique. 4. Pose de "" (5X 3-4 jours). 5. Nébulisation (20min) ou injection intranasale. 6. Pléthysmographie. 7. Prélèvement sanguin. P4 Psoriasis. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Rasage. 4. Application topique (5). 6 Prélvement sanguin. P5 Hypersensibilité. 1. Prélèvmeent sanguin. 2. Application topique (3). 4. Rasage. 5. Application topique (2). 6 Prélèvement sanguin. P6 Septicémie et P7 Endotoxémie. 1. Prélèvement sanguin. 2. Gavage. 3. Injection intrapéritonéale ou sous cutanée. 4. Prélèvement sanguin. P8 Inflammation stérile. 1.Prélèvement sanguin. 2. Injection intrrapéritonéale. 3. Gavage (3). 4. Injection sous-cutanée. 5. Prélèvement sanguin. P9 Athérosclérose et P10-13 Diabète de type 2 (DT2). 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Prélèvement sanguin (6). P10-11 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Gavage. 4. Gavage ou injection intrapéritonéale. 5 Prélèvement sanguin (9). P10-12 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Cathétérisation (30 min). 4. Clamp (2h). 5. Prélèvement sanguin. P14 Exercice. 1. Exercice sur tapis de course (4X1h) 2. Prélèvement sanguin. 3. Exercice sur tapis de course (80X1h) 4. Prélèvement sanguin. P15-11-18 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation biliaire (1h). 15-11-19 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation canal thoracique (1h). P16 Colite. 1. Prélèvement sanguin. 2. Injection Intrapéritonéale ou intrarectale. 3. Prélèvement sanguin. P17 Immunisation. 1. Prélevement sanguin. 2. Injection intrapéritonéale (3). 3. Gavage (8). 4. Prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La douleur faisant partie de certains processus patholgiques, notamment pour l'inflammation intestinale et les processus allergiques, celle-ci ne peut être prise en charge dans certaines procédures sauf à interférer avec les résultats
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la suite des procédures ou enchaînement de procédures
Remplacement
Les pathologies métaboliques et/ou immunes impliquent de nombreux organes du corps et de nombreux types cellulaires circulant entre ces organes. Comme il est impossible de reproduire la complexité de ces interactions in vitro, l’expérimentation animale in vivo est indispensable pour reproduire de manière aussi réaliste que possible ces pathologies.
Réduction
L’utilisation de conditions les plus standardisées possibles (conditions d’hébergement, âge et sexe des animaux, groupes contrôles appariés, horaires de réalisation des expériences…) et l’entraînement et la dextérité du personnel impliqué dans l’expérimentation permettent de diminuer la variabilité individuelle des réponses des animaux et par voie de conséquence le nombre d’animaux nécessaires par groupe pour obtenir des résultats significatifs. De
Raffinement
L’hébergement dans des conditions sanitaires optimales (exemptes d’organismes -opportunistes etpathogènes spécifiques), l’enrichissement de l’environnement dans les cages (abris et « jeux »), le maintien des interactions sociales, l’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress durant toute la vie des animaux y compris durant l’expérimentation. Une surveillance quotidienne est également pratiquée.
Choix des espèces
En raison du grand nombre de lignées génétiquement modifiées disponibles et de la facilité relative avec laquelle il est possible d’en créer de nouvelles, la souris a été choisie comme modèle d’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines), âge à partir duquel le système immunitaire est mature. De plus les pathologies cardiométaboliques sont des pathologies de l'adulte.
Formation du personnel et des nouveaux entrants au sein de notre établissement à la mise en œuvre des méthodes de prélèvements sanguins
- Formation professionnelle
Rats : 500
750 animaux non-humains, 250 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil. Chaque animal enchaîne plusieurs techniques de prélèvement sanguin apprises par le personnel, de la queue à la veine sous-maxillaire puis au sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal au cœur ou à l'aorte sous anesthésie. Ce projet ne produit pas de connaissances mais entraîne les expérimentateurs, avec des animaux surnuméraires d'élevages. Le porteur présente cette formation comme un moyen de "participer au bien-être animal" et affirme que le remplacement par un modèle in vitro n'est pas possible.
Objectifs
Ce projet porte sur la formation technique et la formation continue du personnel amené à utiliser les animaux dans les procédures expérimentales, sur l’apprentissage de nouvelles techniques et la mise à niveau des techniciens déjà formés. Les formations utilisant les animaux visent à améliorer les méthodes expérimentales, à assurer la qualité scientifique et à réduire les dommages subis par les animaux. Toutes les techniques réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis avec le vétérinaire seront respectés. Les conditions suivantes devront être respectées : - Les animaux seront en bon état général - Ce sont les animaux non-utilisés dans des procédures (animaux surnuméraires provenant d’élevages non génétiquement modifiés).
Bénéfices attendus
L’expérimentation animale nécessite une maitrise de différentes techniques de prélèvements. Il est important que les expérimentateurs connaissent parfaitement les techniques et puissent effectuer les prélèvements de façon précise et rapide afin d’éviter tout stress et douleur à l’animal. La formation de toutes les personnes concernées par ces processus est cruciale Cette demande de projet est faite pour fournir des informations correctes, complètes, à jour et pertinentes, accompagnée d’instructions adéquates afin de former de la meilleure façon le personnel et donc participer au bien-être animal. Dans cette demande de projet nous détaillerons les différents prélèvements effectués au sein de notre animalerie. Ces procédures seront appliquées lors des séances de formation et enseignées aux utilisateurs de l’animalerie afin de s’assurer de la bonne formation des personnes et donc de s’assurer que les prélèvements seront faits correctement et n’entraineront pas de douleur ou de stress chez l’animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang en respect avec la réglementation animale. Toutes les souris seront intégrées à la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , procédure légère sans anesthésie, 5 prélèvements à une semaine d'écart. Elles intégreront ensuite la procédure 2« prélèvement sanguin à la veine submandibulaire chez la souris » légère sans anesthésie, 2 prélèvements à une semaine d'intervalle, puis la procédure 3 " prélèvement sanguin au sinus rétro orbital chez la souris et le rat »modérée avec anesthésie, 4 prélèvements avec une semaine d'intervalle puis la procédure 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat » sans réveil sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Un premier lot de 250 rats intègreront la procédure 2 «prélèvement sanguin à veine submandibulaire chez la souris » , modérée sous anesthésie et ensuite la procédure sans réveil 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat »sous anesthésie, un deuxième lot de 250 rats intègreront la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , légère sans anesthésie puis la procédure sans réveil 5 « prélèvement sanguin à l’aorte abdominale chez le rat » sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Les prélèvements décrits dans les procédures 1,2 et 3 sont des prélèvements courts d'environ 30 secondes par prélèvement. Les prélèvements dans les procédures 4 et 5 sont des prélèvements terminaux d'environ 1 minutes.
Impact sur les animaux
Afin de diminuer au maximum tout stress à l’animal, toutes les procédures sans réveil seront faite sous anesthésie générale faite par un une personne formée et validée (enseignant)
Devenir
Les animaux seront utilisés dans une des autres procédures du projet en premier et seront ensuite utilisés dans une des procédures de classe sans réveil du projet.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de former les utilisateurs aux différentes techniques de prélèvements. Le remplacement des animaux par un model in vitro n’est pas possible
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a était réduit au maximum pour qu’un utilisateur puisse maitriser une technique
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ces formations. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (maximum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies. Toutes les manipulations sont effectuées dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Toutes les manipulations et anesthésies se font dans une pièce dédiée et non pas dans la pièce d’hébergement.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisés dans l’expérimentation animales et sont les deux seules espèces hébergés au sein des animalerie du CSGA Les animaux auront un âge différent selon les procédures effectuées. L’âges des animaux doit varier afin de former les utilisateurs aux manipulations et aux prélèvements sur des animaux de tailles, de poids et de morphologies différentes.
Etude de l’importance relative de Slc44a2 exprimé par les plaquettes et par les neutrophiles dans le processus de thrombose veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 225 d'entre elles et sans réveil pour 150. Les 225 premières subissent une chirurgie de la veine cave sous anesthésie pour provoquer la formation d'un caillot, les 150 autres un prélèvement de sang terminal, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la thrombose veineuse. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance grâce à l'analgésie maintenue tout au long des procédures. Sur le remplacement, il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne répond à l'objectif, sans autre précision.
Objectifs
Les thromboses veineuses représentent la 3ème cause de mort par maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Les thromboses veineuses, incluant les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires ont une incidence de 1/1000. Des stratégies thérapeutiques existent et sont en place afin également de contrôler le risque de récidive chez ces patients. Or, ces traitements ne suffisent pas car malgré ceux-là le taux de mortalité à 1 an est de 20%, et 25 à 50% des survivants auront des séquelles portant gravement atteinte à la mobilité et à la qualité de vie. Un polymorphisme affectant la protéine CTL-2 a été identifié par le laboratoire comme pouvant moduler le risque de thromboses veineuses de 30% chez l’homme. Cette protéine n’a été que peu étudiée, et aucune fonction dans la thrombose n’a été décrite à ce jour. Cette protéine est exprimée à la surface des cellules vasculaires notamment à la surface des neutrophiles et des plaquettes. Or les neutrophiles adhèrent aux sites inflammatoires des parois vasculaires lésées et interviennent dans les étapes précoces de la TV contribuant au recrutement plaquettaire conduisant à l’occlusion des vaisseaux. Les neutrophiles jouent un rôle majeur dans l’inflammation, cependant, les mécanismes par lesquels les neutrophiles exercent leurs fonctions pro-thrombotiques restent encore mal connus. Il semble ainsi essentiel de mieux caractériser les mécanismes impliquant le recrutement et l’activation des neutrophiles à la paroi vasculaire médiés par CTL-2 suite à une stase afin de pouvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les phénomènes inflammatoires et/ou thrombotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes impliqués dans la thrombose veineuse mais aussi dans les maladies thrombo-inflammatoires.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera effectuée sur 225 animaux destinés à la procédure 1 (durée=30 minutes de chirurgie initiale + 6h ou 48h de réveil en fonction des groupes + 10 minutes d'anesthésie pour récupérer le thrombus formé; soit un total de durée de 6 ou 48h +40 minutes). Les 150 animaux destinés à la procédure 2 seront soumis à un prélèvement terminal de sang sous anesthésie générale (durée=15 minutes).
Impact sur les animaux
Pas de souffrances attendue pour les animaux car l’analgésie sera maintenue tout le long des procédures. Nous veillerons au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux issus de la procédure 1 (225) seront sacrifiés après la procédure. Les autres animaux (150) seront soumis à la procédure 2 qui est sans réveil. Nous utiliserons un total de 375 animaux.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de satisfaire l'objectif de remplacement à notre connaissance.
Réduction
Concernant l'objectif de réduction nous avons limité nos travaux aux expériences indispensables pour répondre à notre question scientifique. (avec risque alpha de 5% et une puissance atteinte de 80%).
Raffinement
L’objectif de raffinement a été pris en compte : nous ferons notre possible afin de diminuer les contraintes imposées aux animaux en renforçant leur confort: hébergement avec milieu enrichi (igloo de cages, enrichissement foisonnant à base de frisure de papier, nid végétal à base de fibres courtes de coton), anesthésie et analgésie pour supprimer la douleur et le stress, diminution du stress en séparant animaux lors de l'hébergement et l'expérimentation. Nous avons établi des points-limites, et nous avons prévu de maximiser les données obtenues en mesurant un maximum de paramètres pour chaque animal (i.e: formation d’un thrombus, poids et taille du thrombus, étude
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille facile à manipuler et à reproduire. De plus, les souris sont des mammifères et les données obtenues à partir de cette espèce sont beaucoup plus extrapolables à l’homme et la pathologie humaine que celles obtenues à partir d’espèces évolutivement inférieures. La souche C57Bl/6 a été choisie car les lignées conditionnelles knock-out (KO), et totales KO ont été créées dans cette dernière. De plus les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés chez la souris principalement dans cette souche, par de nombreuses équipes dont la nôtre. Cette étude vient s'inscrire dans la continuité de notre travail sur CTL-2 déjà effectué chez la souris. Les animaux seront âgés de 9 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés car le diamètre de la veine cave doit être de taille similaire à ce qui est habituellement publié dans ce modèle pour pouvoir comparer nos résultats à ceux d’autres équipes. Une souris trop jeune aurait une veine cave inférieure trop petite et le ratio de rétrécissement du diamètre de la veine comparé à son diamètre initial s’y retrouverait ainsi plus important comparé à une souris plus vieille et avec une veine cave plus grosse.
Banque de tissus primates
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 microcèbes, des primates, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil pour prélever leur sang et leurs organes. Le projet récupère les tissus d'individus en fin de vie, âgés, blessés ou malades, dont les points limites sont déjà atteints, pour constituer une banque destinée à d'autres équipes. Le porteur présente cette collecte comme une mesure de "réduction" du nombre de primates utilisés par la communauté scientifique. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives.
Objectifs
Le projet consiste à récuperer le sang et les tissus de primates en fin de vie. L'objectif du projet permet une rationalisation et une réduction du nombre d'animaux (primates) utilisés par la communauté scientifique. Les tissus prélevés sont le coeur, les poumons, le foie, la rate, le pancréas, le tube digestif, les reins, l'utérus, les testicules, les muscles des pattes postérieures, le diaphragme, le cerveau, la moelle épinière, les yeux, les bulles tympaniques (en fonction des demandes des équipes). Les tissus disponibles non utilisés par notre équipe sont en général conservés à -80°C ou post-fixés au paraformaldéhyde (sur demande des équipes). Une fiche individuelle des organes prélevés sur l'animal est conservée avec la date , le mode de conservation et le nom des équipes qui ont reçu les échantillons.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de tissus précieux de primates à la communauté scientifique pour des études translationnelles vers l'humain. Un projet de dons d'organes primates est actuellement en cours par le GDR BIOSIMIA.
Procédures
En fin de vie, anesthésie des animaux par injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique et analgésique, puis injection intrapéritonéale d'héparine pour permettre l'exsanguination par prélèvement intracardiaque puis prélèvement du coeur et des autres organes. Une fois que l'animal est profondément endormi, la durée de l'intervention pour l'exsanguination et prélèvement du coeur est de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En fin de vie, les points limites étant atteints, les animaux sont anesthésiés par injection intrapéritonéale d'anesthésique, ce qui peut engendrer un stress.
Devenir
si les soins apportés par le vétérinaire sont inefficaces et que les points limites sont atteints, les animaux seront mis à mort pour prélèvement de sang et des tissus pour banque de tissus fixés ou congelés
Remplacement
Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. La variabilité individuelle chez les primates miment la variabilité chez l'homme.
Réduction
ce projet rentre totalement dans le cadre de la réduction puisqu'il s'agit de partager des tissus de primates en fin de vie à la communauté scientifique
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés par un mélange d'anesthésique et analgésique avant exsanguination intracardiaque
Choix des espèces
Le primate Microcebus murinus, phylogénétiquement plus proche de l’homme que les rongeurs, présente des caractéristiques physiologiques similaires à l'humain. Les animaux adultes en élevage qui présentent une altération forte de leur bien être (blessure, pathologie, âge avancé) et pour lesquels les points limites sont atteints seront utilisés
Etude de l’effet neuroréparateur de la stimulation du nerf vague dans un modèle d’AVC chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue puisque leur cerveau est prélevé, la plupart sous anesthésie sans réveil et 25 en gravité modérée. Une microchirurgie provoque une ischémie du cortex et pose une électrode autour du nerf vague, les animaux étant gardés jusqu'à 28 jours avec des tests sensori-moteurs quotidiens puis un enregistrement électrophysiologique sous anesthésie. Le porteur affirme que la stimulation du nerf vague est indolore et que le seuil des points limites n'a jamais été franchi lors de projets antérieurs. Il décrit les procédures comme d'une "stricte nécessité" ne pouvant être remplacées par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
A ce jour, il n’existe pas de solution thérapeutique capable de protéger ou réparer le système nerveux central après un accident vasculaire cérébral (AVC). Plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont démontré que la récupération fonctionnelle est freinée par un excès d’inhibition par le GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, au sein des territoires adjacents à la lésion cérébrale et que la réduction de cet excès d’inhibition favorise la plasticité cérébrale, c'est à dire la formation de nouvelles connexions neuronales, ainsi que la récupération sensori-motrice. La stimulation du nerf vague (SNV) favorise cette récupération, mais son mécanisme d’action reste à démontrer. Ce projet s’inscrit dans la thématique du laboratoire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de valider l'hypothèse que la SNV permet d'amplifier l'activité du cortex cérébral lors de la phase de réparation après un AVC expérimental, et ainsi d'améliorer la récupération des fonctions sensori-motrices perdues avec l'AVC.
Procédures
Quatre procédures sont prévues dans cette demande. Ces 4 procédures seront réalisées, (avec des modalités différentes, clairement explicitées dans les paragraphes concernés) pour tous les animaux. A savoir : 1. une microchirurgie permettant de réaliser une ischémie du cortex cérébral ainsi que d'équiper l'animal avec une électrode de stimulation du nerf vague. Les animaux seront maintenus en vie 28 jours au maximum. La chirurgie durera environ 1h. Les performances motrices de l’animal seront sensiblement diminuées pendant les 48h suivant l’intervention, après quoi son état s’amméliorera de jour en jour grâce à la récupération sensori-motice. 2. des tests d'évaluation des capacités sensori-motrices. L'animal sera soumis aux tests sensori-moteurs pendant une quinzaine de minutes par jour de tests. 3. La stimulation du nerf vague (SNV) indolore et sans effet inconfortable pour l'animal sera pratiquée pendant la tâche comportementale ou alors sous anesthésie générale (30 min). 4. L'enregistrement électrophysiologique (2 h) sera pratiqué exclusivement sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau à ce niveau entraînera une plaie sur 1 cm, qui sera traitée. - L'occlusion d'une branche de l'artère cérébrale induira une déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm qui sera traitée (résorption en quelques jours). Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Au total, notre expérience de plusieurs années sur ce modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effet inattendus.
Devenir
Le cerveau de tous les animaux utilisés dans ce projet sera prélevé pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).
Remplacement
Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (277 souris mâles adultes), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur. L’utilisation d'un modèle d'AVC modéré génère une lésion uniquement corticale de quelques millimètres cube (7 en moyenne) ce qui n’occasionne pas de handicap lourd chez les animaux ni de mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Concernant le critère de raffinement, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.
Etude en IRM de l’effet d’un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines sur la formation de l’œdème cérébral chez le rat en cas d’ischémie cérébrale transitoire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
31 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, 26 dans des procédures classées sévères et 5 tués sans réveil comme témoins. Chez les 26 premiers, un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivie de deux passages en IRM, pour étudier l'œdème cérébral et un candidat-médicament. Le porteur indique un taux d'échec de 30 %, dont 25 % de mortalité, et cite parmi les atteintes l'hypothermie, des difficultés à se nourrir et une douleur liée à l'œdème. Il revendique un modèle in vivo "indispensable", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui les mécanismes entre cerveau et sang.
Objectifs
La World Stroke Organization rapporte 13.7 millions d'Accidents Vasculaires Cérébraux chaque année, dont 5.5 millions sont fatales. 80% des AVC sont d’origine ischémique (AIC) et sont causés par l’obstruction d’un vaisseau sanguin cérébral. Cette interruption de la circulation sanguine bloque l’apport d’oxygène et de glucose nécessaire à l’activité cérébrale, endommageant progressivement les cellules et formant un œdème cérébral avec une composante cellulaire et une composante vasculaire. Les premières heures qui suivent un AIC sont déterminantes quant à ses conséquences, mais les approches thérapeutiques actuelles sont limitées dans le temps et ne peuvent contrer l’œdème qui ne peut être soulagé que par une chirurgie décompressive invasive : l’hémicrâniectomie. L’objectif aujourd’hui pour la recherche est de proposer un traitement neuroprotecteur permettant d’élargir cette fenêtre thérapeutique en protégeant les cellules et en limitant l’œdème cérébral. Notre équipe travaille sur un candidat médicament répondant à ces attentes. C'est un inhibiteur de kinases cyclines dépendantes dont les effets neuroprotecteurs et anti-œdémateux à 24 et 48h post-AVC ont été montrés dans différentes études indépendantes dans un modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez le rat. Nos résultats histologiques préliminaires indiquent un effet potentiel de notre molécule sur l'œdème cellulaire. D'autre part, les biomarqueurs de pathologie neurodégénératives constituent un axe de recherche aux enjeux majeurs, cependant ils ne sont pas encore appliqués aux AVC. De plus en plus de recherches suggèrent que certaines molécules anormalement présentes dans le sang en cas d'AVC pourraient être utilisées pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Parmi environ 150 candidats, nous avons sélectionné l'aquaporine-4, un canal perméable à l'eau situé à l'interface entre le sang et le cerveau particulièrement impliqué dans l'œdème cérébral et dont la présence dans le sang a récemment été rapportée dans une étude pilote chez l'homme. Cette étude a 2 objectifs : 1) évaluer l'effet de notre candidat médicament sur la formation de l’œdème cellulaire cérébral à un stade précoce de l’AVC en imagerie par IRM ; 2) identifier un potentiel marqueur sanguin de l’AVC chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra dans un premier temps d’étudier l'effet de notre candidat médicament sur l'œdème cérébral en cas d'AVC ischémique en IRM. L’impact de notre molécule sur l’œdème n’a jamais été mesurée par cette technique. Dans un second temps, la comparaison des taux d’aquaporine 4 dans le sang des différents groupes nous permettra d’identifier un potentiel marqueur de l’AVC et d’investiguer l’effet de notre traitement sur ce marqueur. A terme, ce projet pourrait mener au développement d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement des AVC.
Procédures
Au total, 31 rats mâles Sprague-Dawley adultes (6-8 semaines) seront utilisés dans cette étude, et inclus dans une procédure 1 intitulée « Etude de l’oedème cérébral en IRM après induction d’une ischémie cérébrale transitoire chez le rat ». Cette procédure comprend l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) permettant de reproduire un AVC ischémique (~30min), l’administration en aveugle du traitement ou de son placebo (~15min), deux passages à l’IRM (~30min chaque) à 6h et 24h post-AVC et la mise à mort des rats. Trois groupes de rats seront distingués au cours de cette procédure : un premier groupe de 13 rats recevra le traitement, un second groupe de 13 rats recevra le placebo, et un troisième groupe de 5 rats sera seulement mis à mort pour constituer un groupe contrôle sans AVC ni traitement. Ces rats contrôles ne passeront pas d’IRM. Par ailleurs, l’atteinte d’un point limite au cours du protocole entrainera la mise à mort immédiate de l’animal.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été conçues de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. La procédure a un taux d’échec de 30% : la chirurgie du modèle d’ischémie cérébrale par occlusion temporaire de l’artère cérébrale moyenne via l’insertion d’un filament dans l’artère carotide externe est un modèle complexe qui a un taux de mortalité de 25% et un risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique de 5%. Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) Une hypothermie : au cours de la chirurgie, le risque d’hypothermie est strictement monitoré à l’aide d’une sonde rectale et d’un tapis chauffant, cependant certains rats peuvent avoir du mal à réguler leur température corporelle après la chirurgie, c’est pourquoi des mesures seront prises pour prévenir tout risque d’hypothermie jusqu’à la mise à mort des animaux. (2) Une diminution de leur capacité à se nourrir et à s'abreuver : la zone d’opération se trouvant au niveau des muscles mandibulaires, les rats peuvent avoir du mal à mastiquer et à se redresser pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau. (3) Une douleur céphalée conséquente à l’œdème cérébral apparait dans les premières heures après la chirurgie. L’intensité de cette douleur dépend du degré de sévérité de l’AVC et est évaluée lors du test de suspension par la queue. Cette douleur peut également gêner le redressement pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau, malgré l’analgésie mise en place post-chirurgie. (4) Une gêne pour se déplacer : une paralysie de la patte avant droite apparait au cours des premières heures après la chirurgie. Cette atteinte est plus ou moins importante selon le degré de sévérité de l’AVC et est mesurée dans le neuroscore via le test de rotation. (5) Un stress au cours au transport : 5h et 24h après la chirurgie, les animaux seront transportés vigiles à l’aller et au retour dans une cage de transport entre l'animalerie et l'IRM. Ces quatre trajets de 10-15 minutes en voiture peuvent engendrer un stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente selon une méthode de mise à mort réglementaire et les informations sont conservés pour les contrôles de la SBEA, du vétérinaire référent de l'établissement ou des services vétérinaires départementaux.
Remplacement
S’il existe des modèles alternatifs in vitro recréant des conditions ischémiques sur des cultures de cellules cérébrales, ils ne permettent pas d’étudier les mécanismes inflammatoires complexes et coordonnés entre différents tissus (cerveau-sang), formés de multiples types cellulaires, ni le développement de l’oedème cérébral et sont donc inappropriés à notre étude. De plus, ce projet s’inscrivant dans la continuité de notre étude de l’effet du traitement test sur le cerveau du rat en cas d’AVC, il est indispensable d’utiliser le même modèle expérimental pour intégrer et comparer nos résultats. Cependant, en accord avec les exigences de remplacement et de réduction, des tests in vitro ont préalablement permis de sélectionner la molécule traitement parmi plusieurs candidats médicaments et de définir une gamme étroite de concentrations efficace in vivo.
Réduction
Un test sur un rat mort récupéré de notre précédent projet a été effectué au préalable pour vérifier la faisabilité de l’expérience et mettre au point les paramètres de l'IRM, évitant l'inclusion de rats supplémentaires dans l'étude pour le réglage de l'IRM. La procédure n°1 d’étude de l’effet du traitement sur l’oedème est réalisée sur le nombre d’animaux minimal tout en permettant d’accomplir son objectif. D’après nos précédentes études et en se basant sur la méthode statistique d'estimation développée par Noordzij et al. (2010), un effet sur l’oedème cérébral est observable et significatif à partir de 8 rats par groupes. L’induction de l’ischémie cérébrale a un taux d’échec d’environ 30%, comprenant la mortalité (25%) et le risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique (5%), c’est pourquoi nous prévoyons 13 rats par groupes. Nous estimons que 5 rats non ischémiés seront suffisants à l’acquisition de données de « contrôle » étant donné qu’il n’y a aucun risque de perte. Les tests statistiques utilisés par la suite seront Student ou ANOVA (données paramétriques), ou Mann Whitney ou Kruskal-Wallis (données non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter leur stress et selon les mesures de raffinement, une période d’acclimatation de 1-2 semaines sera respectée à leur arrivée. Les rats opérés seront gardés par 2 pour réduire leur stress avant et après chirurgie. Le transport en voiture entre l’animalerie et l’IRM pouvant engendrer un stress chez l’animal, un temps de calme de 20-30min sur tapis chauffant sera respecté avant toute manipulation de l'animal à l’aller et au retour. Au cours de la chirurgie, l’hypothermie est compensée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermostaté à 37°C relié à une sonde rectale et par une couverture de survie. Après la chirurgie, la cage des rats sera posée sur un tapis chauffant à l’animalerie et à l’IRM pendant les phases de calme et de réveil de l’anesthésie. Un pack de gel chauffé à 30-37°C sera placé dans le fond de leur cage pendant leur transport et sous leur ventre pendant les 30 minutes d’IRM. Pour contrer les difficultés à se nourrir et à s’abreuver après la chirurgie, des pipettes à tige longue seront mises à leur disposition et des croquettes humidifiées (pellets mélangés à de l’eau) seront placées dans le fond de leur cage. L’option des DietGels a été écartée puisqu’ils contiennent du glucose, composé influençant le volume de l’œdème ; les alternatives sans glucoses ont été testées mais les animaux ne s’y intéressent pas. En accord avec le vétérinaire référent, une stratégie d'analgésie par injection sous-cutanée de lurocaïne 0,5% (7mg/kg) préopératoire sur le site d’incision associée à la buprénorphine post-opératoire (0,03-0,05mg/kg 2x/jour) a été privilégiée. Du gel ophtalmique sera également appliqué avant la chirurgie afin de protéger les yeux des animaux. Ils bénéficieront d'un soin adapté par l'utilisation d'anesthésique et analgésique avant l’IRM et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 6-8 semaines, pesant 320g +/- 40g, notre étude principale portant sur des pathologies principalement observées chez l’adulte et visant à traiter les patients victimes d’un AVC. Nous avons choisi la même espèce de rat pour cette étude pilote que pour nos études sur l'AVC puisqu'il s'agit d'une mise au point propre à l'espèce. Nous travaillons sur un modèle d'ischémie focale transitoire chez le rat, espèce que nous avons sélectionnée pour son système vasculaire cérébral très similaire à celui de l’homme, en faisant un modèle de choix pour reproduire un AIC. De plus, ce type d’ischémie cérébrale est déjà bien décrit chez le rat et de nombreuses données sont disponibles, nous permettant d’anticiper et de comparer nos résultats. Le rat est également l’espèce de référence dans les études de pharmacologie et les études précliniques. L’utilisation du rat évite de mettre en place de nouvelles études préliminaires pour valider le modèle, et donc d’augmenter le nombre d’animaux nécessaire.
Evaluation de l’impact d’approches thérapeutiques sur la force musculaire de modèles murins de maladies neuromusculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
180 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles proviennent d'un autre projet où elles ont reçu par voie intramusculaire ou générale des molécules candidates ou une solution saline, puis subissent une mesure de la force musculaire de vingt à trente minutes avant d'être tuées pour prélever leurs muscles. Le projet vise à trier des candidats-médicaments contre la myopathie de Duchenne, un "réel bénéfice thérapeutique" pour les patients restant renvoyé au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet aujourd'hui de tester le bénéfice fonctionnel de ces traitements sur la fonction musculaire.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques pour des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement du corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le coeur et le système nerveux central (aspect cognitif) représentent aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques, les stratégies thérapeutiques et les outils moléculaires développés se doivent de répondre efficacement à ce défi. L’évaluation générale de ces différentes approches sur les modèles murins de maladies neuromusculaires fait l’objet d’une autre demande d’autorisation préalablement acceptée. Cette autorisation regroupe notamment la description des procédures d’administration des molécules thérapeutiques (par voie locale ou systémique).
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la DMD. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique permettant une amélioration significative de la fonction musculaire chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients DMD traités.
Procédures
Dans le présent projet, les animaux subiront une procédure unique (d’une durée de 20 à 30 minutes), classée sans reveil. Cependant, les animaux seront ré-utilisés d’un autre projet dans lequel les souris auront reçu les molecules thérapeutiques ou la solution saline contrôle par voie intramusculaire ou systemique (procédures modérées).
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une procédure sans réveil pratiquée depuis de nombreuses années dans l’établissement utilisateur (pour d’autres projets). Par expérience, les effets indésirables associés sont très limités. Lors de la procédure, les animaux seront sous profonde anesthésie gazeuse ainsi que sous analgésie. Les risques ou nuisances possibles liés à cette procédure sans réveil sont des risques anesthésiques et incluent un possible réveil ou une détresse respiratoire. »
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet (notmament muscualire) et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos outils thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro des modèles cellulaires afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses et qui permettent d’envisager un reel beenfice thérapeutique chez les futurs patients traités. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro permettant de tester le bénéfice fonctionnel (notamment sur la fonction musculaire) de ce type de traitement.
Réduction
Seules les molécules ayant démontré une efficacité à la fois in vitro dans des modèles cellulaires et dans des analyses préliminaires in vivo (études pilotes sur un nombre d’animaux réduits (n=3-4) afin de valider la restauration de protéine dystrophine dans les muscles traités (projet « Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies neuromusculaires »), seront utilisées dans le présent projet visant à mesurer la fonction musculaire. Les évaluations fonctionnelles réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=10 par groupe, soit un nombre total de 180 animaux au maximum).
Raffinement
Le personnel expérimental vérifiera que les animaux se portent bien dès leur arrivée dans l’Etablissement utilisateur et ce jusqu’au début de la procédure sans réveil (à la suite de laquelle les animaux seront directement euthanasiés). Si jamais un point limite était atteint, l’animal serait immédiatement euthanasié. Lors de la procédure, les animaux seront sous analgésie et profonde anesthésie gazeuse. Si l'animal se réveille ou est mal endormi, l'expérimentateur procèdera une nouvelle fois à une induction mais plus importante (3% par exemple). Il vérifiera qu'il n'y ait aucune réponse à stimulation tactile avant de procéder à la chirurgie. En cas de détresse respiratoire due à l'anesthésie, le flux d'isoflurane sera coupé 15 secondes. Lorsque la respiration redevient normale, l'isoflurane sera relancé et baissé à 2%. Après quelques minutes, les réponses à la stimulation tactile seront vérifiées à nouveau. En cas de réveil survenant lors de l'opération, l'animal sera euthanasié immédiatement.
Choix des espèces
Seuls des modèles murins sont utilisés dans ce projet de recherche. Les modèles murins mdx, mdx52 et mdx5CV sont les modèles les plus couramment utilisés pour l’évaluation préclinique de molécules thérapeutiques pour la DMD car ils reproduisent le défaut génétique observé chez les patients, à savoir une mutation dans le gène DMD invalidant la production de protéine fonctionnelle. Ces modèles permettent une évaluation de l’efficacité de nos outils au niveau moléculaire comme fonctionnel. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent.
Apport de la thérapie génique pour traiter les déficits visuels, auditifs et d’équilibre dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
5 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 954 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 620 un niveau léger et 120 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans la cochlée ou sous la rétine sous anesthésie, puis des tests auditifs, des tests d'équilibre (rotarod, suspension par la queue, nage) et des électrorétinogrammes, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Usher. Le porteur indique que les souris déficientes présentent surdité et troubles de l'équilibre et n'attend aucune aggravation. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit le fonctionnement de la rétine et de l'oreille interne.
Objectifs
Le syndrome de Usher de type 1B (USH1B), causé par une mutation dans le gène MYO7A, représente plus de la moitié des formes héréditaires de surdicécité. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B (USH1B). Nous testerons deux stratégies de transfert de gènes (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (déjà créées ou à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome de Usher de type 1B et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation de souris humanisées nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - L’injection des formes courtes de la Myosine 7A (mini-MYO7A) nous permettra de mieux comprendre le rôle des différents domaines constituant la Myosine 7A et leur implication dans le syndrome de Usher de type 1B. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de la thérapie génique dans la correction des troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez des souris porteuses de mutations dans le gène Myo7A. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques et qui permettront de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome de Usher de type 1B. Ceci inclut : - la découverte d’un mini gène fonctionnel et prêt pour de potentiels essais cliniques, - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques, Les méthodes que nous allons développer pourraient permettre de traiter d’autres maladies affectant des gènes de grande taille.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections intracochléaires ou à des injections sous-rétiniennes. Ces injections se feront sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées par voie intrapéritonéale puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Les potentiels auditifs évoqués seront enregistrés à l’aide d’électrodes sous-cutanées placées à proximité du nerf facial. Les produits de distorsion des oto-émissions acoustiques seront enregistrés à l’aide d’une sonde placées à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux destinés à évaluer leur fonctions vestibulaires. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système de vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifié à l’aide d’un système rotarod (31 minutes) et d’un test de maintien sur une plateforme surélevée (2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à un test de suspension par la queue (15 secondes) et par un test de retournement (15 secondes). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des électrorétinogrammes (ERG) entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie par voie intrapéritonéale, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées par les photorécepteurs et neurones rétiniens seront enregistrés à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des ERG seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition de 3 minutes à une intensité lumineuse déterminée). Prélèvement d’organes : Les tissus seront récupérés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en myosine VIIa (souris shaker-1) sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces nouvelles lignées de souris déficientes en Myosine-7a. Les injections intracochléaires et sous-rétiniennes seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté Myo7a contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car ne pouvant être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par les photorécepteurs ou les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux cellules ganglionnaires de la rétine ou aux neurones spiraux de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimum d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests paramétriques ou non paramétriques. Pour certaines procédures, les mêmes animaux seront utilisés pour nos tests comportementaux et auditifs, puis mis à mort pour collecte des tissus.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes en carton et de bâtonnets en bois. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles, complétés de ceux que nous souhaitons créer, vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. Les injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Travaux Pratiques d’introduction à l’expérimentation animale et de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Rats : 140
70 souris et 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, les souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et les rats dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Les souris servent à des étudiants pour apprendre la contention et une injection de sérum physiologique, les rats sont opérés sous anesthésie avec pose d'une canule dans la trachée et de cathéters dans la jugulaire et la vessie, pour des mesures de ventilation et de diurèse. Le porteur indique que le règlement de l'animalerie interdit toute réintroduction et que les corps sont congelés pour des travaux pratiques de dissection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive satisfaisante ne remplace ces séances.
Objectifs
Dans le cadre de notre formation universitaire, régi par un programme pédagogique national, nos étudiants sont amenés à "mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour mieux comprendre le fonctionnement, la physiologie des systèmes/appareils des organismes animaux. Ils doivent ainsi acquérir les compétences suivantes: 1) Manipuler les animaux de laboratoire; 2) Respecter la réglementation, les règles de la bioéthique; 3) Maîtriser les techniques liées à l’expérimentation animale utilisées en physiologie animale. Ces compétences de base doivent leur permettre ensuite de mettre en œuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmaco-cinétique, ou encore des études du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ces TP sont extrêmement importants dans le cursus de ces étudiants. La formation doit les amener à être directement opérationnels en laboratoire de recherche. Cette première approche permet ainsi de les confronter à la réalité de l’expérimentation animale, et de les sensibiliser au respect absolu de la réglementation, en particulier aux procédures de raffinement. Ils permettent de lever l’appréhension d’un certain nombre d’étudiants et de les conforter ou non dans leur désir de travailler sur l’animal et de s’engager dans cette démarche. Le 1er TP d'introduction au semestre 1 (sur la souris) leur permet d’aborder plus sereinement les TP de physiologie (sur le rat) qui ont lieu au semestre 2. Le résultat pédagogique est extrêmement satisfaisant, car les étudiants sont extrêmement impliqués et se montrent transformés (positivement) entre le début et la fin des TP. Les TP du semestre 2 représentent une réelle "plus value" pour nos étudiants qui peuvent être amenés à manipuler des animaux dans leurs fonctions ultérieures. Le retour des étudiants est unanime.
Procédures
Dans le cadre du TP d'introduction à l'expérimentation animale, les souris seront manipulées par les étudiants dans un premier temps pour se familiariser avec l'animal de laboratoire (30 minutes à 1 heure), puis pour apprendre la contention de base (1 heure à 1h30), mais également pour réaliser une injection sous cutannée ou intrapéritonéale de sérum physiologique (30 minutes). Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront manipulés selon une procédure d'anesthésie sans réveil. Différentes procédures seront menées sur ces animaux : pose d'une canule dans la trachée (30 minutes), pose d'un cathéter dans la veine jugulaire (1 heure), et pose d'un cathéter dans la vessie (30 minutes). Concernant le TP sur la ventilation, le protocole de mesure de la ventilation est ensuite estimé à environ 20 minutes maximum. Concernant le TP sur la diurèse et la pression artérielle, le protocole de mesure est ensuite estimé à environ 1 heure maximum. Dans tous les cas, aucun prélèvement ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Concernant le TP d'introduction, hormis un stress lié à la manipulation des souris pour l'apprentissage de la contention, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu. Concernant les TP de physiologie, la buprénorphine peut entrainer une faible dépression cardio-vasculaire.
Devenir
Le règlement de l’animalerie interdisant la ré-introduction d’animaux après expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés (dose létale de pentobarbital) à l'issue des TP. Une fois euthanasiés, les animaux sont congelés et utilisés ultérieurement pour des TP d’anatomie/dissection.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode substitutive satisfaisante qui permettrait le remplacement de ces séances telles qu’elles ont été conçues pour préparer les étudiants à la réalité des procédures en laboratoire de recherche et au respect de la règle des 3R.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernés pour l’ensemble des cinq années et 28 étudiants pas promotion (partagés en 2 groupes de 14 étudiants) est de 210, dont 70 souris et 140 rats. En effet, dans le cadre du TP d’introduction, chaque année, 14 souris seront utilisées (une souris par étudiant), les souris du groupe du matin étant ré-utilisées pour le groupe de l’après-midi. Afin de réduire le nombre de rats (28/an contre 42/an précédemment), nous avons décidé de supprimer une séance de TP par rapport aux années précédentes. La saisine actuelle ne comprend par conséquent que 2 protocoles expérimentaux sur les rats, contre 3 les années précédentes. Ainsi, sur 5 ans, 70 rats de moins seront utilisés dans le cadre de cette formation. Par ailleurs, les animaux euthanasiés seront congelés et utilisés pour des TP d’anatomie/dissection.
Raffinement
La formation ne dispose pas d’animalerie. Nous utilisons donc l’animalerie de l’UFR dédiée à la recherche qui existe sur le site. Les animaux sont réceptionnés au minimum 5 jours avant chaque TP. Les animaux sont stabulés dans des cages ayant une surface de 410 cm2 et une hauteur de 12cm (souris) ou ayant une surface de 820 cm2 et une hauteur de 15cm (rats) contenant de la litière mélangée à du coton. Des "maisons dômes" en carton et des tunnels en plexiglass rouge sont ajoutés aux cages des souris et des rats, respectivement. Une surveillance quotidienne est effectuée par le personnel de l'animalerie. Il y a 4 souris ou 2 rats par cage, la température de l'animalerie est de 21°C +/- 2, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Une alternance jour/nuit de 12h est respectée. Dans le cadre des TP d’introduction/contention, chaque étudiant est invité à faire une démonstration de contention à l’enseignant. Si l’enseignant estime la contention réalisée correctement, il invite ensuite l'étudiant (uniquement dans le cadre du volontariat) à pratiquer une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale sous le contrôle exclusif de l’enseignant habilité et formé aux gestes garantissant le bien-être des animaux. Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront anesthésiés avant l'arrivée des étudiants selon un protocole mis au point avec l'aide d'un vétérinaire. Une prémédication permet de réduire la dose du mélange anesthésique administré, mais aussi de rendre l’anesthésie plus facile et surtout permet une analgésie plus efficace, plus profonde, et plus longue. Au cours de la séance, si le rat montre des signes de réveil, l'injection d'une dose supplémentaire d'anesthésiant sera pratiquée par les enseignants.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront utilisés lors des séances de travaux pratiques. Ces deux espèces mammifères ont une physiologie assez proche de l’homme. La souris sera utilisée pour les travaux pratiques sur l’apprentissage de la contention car c’est un petit animal facile à appréhender pour des étudiants n’ayant pas l’habitude de manipuler les animaux. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser ce TP avec des souris de souche OF1 ou Swiss réputées calmes et non agressives. Pour les autres TP le rat sera utilisé car il y aura nécessité de réaliser des procédures au niveau des abords veineux et la taille du rat est mieux adaptée. Les animaux ne sont pas identifiés. Ils seront utilisés à maturité sexuelle afin de ne pas avoir des animaux trop petits et faciliter les expériences. Les rats utilisés ne proviennent pas de notre animalerie qui n'est pas une animalerie d'élevage. Il s'agit d'anciens mâles reproducteurs (animaux de réforme). Concernant les souris, nous ne sommes pas en mesure d'utiliser des souris de réforme de notre animalerie pour plusieurs raisons. En premier lieu, l'animalerie n'est pas une animalerie d'élevage et n'est donc pas en mesure de fournir 14 souris de réforme à une date précise. Le responsable de l'animalerie pourra le confirmer. Par ailleurs, la quasi totalité des souris de l'animalerie sont de la souche B6, connue pour être nerveuse et agressive, ce qui n'est pas idéal pour un TP d'initiation à l'expérimentation animale, à la contention.
Développement d’un pancréas bioartificiel : validation de matrices d’encapsulation d’îlots pancréatiques de rats et humains.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 791 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 008 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 783 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection de streptozotocine, suivi de chirurgies abdominales pour prélever le pancréas ou implanter des modules d'encapsulation d'îlots, avec un suivi de 91 jours et des tests répétés de tolérance au glucose. Le porteur indique qu'une dégradation rapide de l'état des rats diabétiques peut survenir malgré l'insuline, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme le recours aux animaux "indispensable" pour évaluer le biomatériau.
Objectifs
La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline.
Bénéfices attendus
La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus, au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans l’omentum permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.
Procédures
- Procédure 1 : L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par une seule injection et l’intervention (et la contention) durera quelques secondes. Chez les rats devenus diabétiques, mise d’implants à insuline afin de permettre un maintien à l’équilibre de la quantité de sucre dans le sang (glycémie) et de prendre du poids (nécessaire à la transplantation des îlots). Procédure réalisée sous anesthésie générale d’environ 10 minute. Une mesure de glycémie quotidienne avec un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier l’efficacité de notre insulino-thérapie. - Procédure 2 : Isolement d’îlots de rat qui seront inclus dans nos hydrogels. Pour le prélèvement du pancréas, une laparotomie abdominale et une cathétérisation du canal cholédoque seront réalisé sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). - Procédure 3 : L’implantation des modules d’encapsulation dans l’omentum des rats se fera après incision de l’abdomen (2 cm). Chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (marqueurs de fonction de la greffe, marqueurs de l'inflammation...). Une fois par mois un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capilaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL(incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intraéritonéale du glucose.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure d’induction du diabète et/ou la perte progressive de la fonction du greffon, une dégradation rapide de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir malgré l’administration d’insuline et la transplantation des îlots. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. Néanmoins, l’insulino-thérapie et la greffe d’îlots devraient empécher cela. Si aucune
Devenir
- Procédure 1 : « Induction du diabète par injection intra-péritonéale de Streptozotocine et mise de pompe à insuline en sous-cutanée. » Les rats devenus diabétiques poursuivent l’étude et seront utilisés dans la procédure 3. Les rats non devenus diabétiques seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) »). - Procédure 2 : « Isolement d’îlots pancréatiques de Rat. » L’ensemble des animaux de la procédure seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« Prélèvement pancréas »). - Procédure 3 : « Implantation intra-omental des hydrogels + îlots et suivi métabolique des rats par mesure glycémique, par évaluation de la prise de poids, par tests de tolérance au glucose (IPGTT) et dosage plasmatique de biomarqueurs. » A la fin de cette procédure tous les rats seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) ») car il s’agira de la fin de l’étude. Nous pourrons ainsi prélever le sang total pour réaliser des dosages plasmiques de marqueurs de survie et de fonction du greffon, de paramètre statuant sur la régulation de la glycémie, sur l’état inflammatoire etc… Nous prélèverons les modules d’encapsulation pour analyse (histologique ...). Enfin, nous prélèverons également les organes impliqués dans la régulation de la glycémie et impactés par le diabète afin de faire des analyses histologiqsues, de protéomique et de génomique.
Remplacement
L'étude consiste à déterminer l’efficacité de biomatériaux sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique, ainsi, le recours à des animaux est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Cette étude nécessitera 1791 rats.
Raffinement
Le respect du principe de raffinement intervient en premier lieu au niveau des conditions d’hébergement : les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions de température et d’hygrométrie régulées et conformes aux règles en vigueur, ainsi que de cages enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges. Les rats sont placés dans des cages de 1500cm², en fonction de leur poids (jusqu’à 200 g ils sont 6 par cage), entre 200 et 300 g ils sont 5 et ensuite un rat est enlevé par tranche de 100g). Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de préanesthésie, d’anesthésie et de prise en charge post-opératoire. Enfin, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses d’études sur le diabète. En effet, lors de l’induction ou l’apparition du diabète, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme, notamment une glycémie à jeun supérieur à 1,26 g/L et des taux d’HbA1c (reflet de l’équilibre glycémique sur les semaines antérieures) comparables. Les rats employés pour ces études sont de souche Lewis, souche consanguine provenant d'un élevage agréé. Ils ont été préférés aux souris à cause de leur taille qui permet une aisance de manipulations, facilite les interventions chirurgicales, et permet une étude à plus long terme (environ deux mois dans de bonnes conditions par rapport à leur état diabétique). Les rats pour cette étude seront uniquement utilisés à un stade jeune adulte (Age : 8 semaines) possédant un système immunitaire. De plus, à ce stade de développement, les animaux présentent un poids idéal pour réaliser les isolements. En effet, c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal.