Procédures sans réveil

16 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, anesthésiées puis tuées avant tout réveil. Leur cœur est exposé pour prélever le sang par ponction intracardiaque et isoler les plaquettes, afin d'étudier la mobilisation du calcium en lien avec l'activité plaquettaire. Le porteur indique que les plaquettes se conservent mal et que leur production in vitro reste limitée, ce qui l'amène à conclure que l'accès à ces animaux mutants est "la seule approche" possible. Les retombées thérapeutiques annoncées, des antithrombotiques sans risque de saignement, restent formulées comme une perspective.

Objectifs

Le calcium fonctionne comme un messager dans les cellules. Il contrôle ainsi de nombreux mécanismes d'activation cellulaire et nous cherchons à comprendre comment se construisent ces messages afin de mettre au point de nouvelles thérapies. L'objectif de ce projet est d'évaluer si l'absence d'un lipide précis chez une souris modifiée génétiquement, se traduit par un défaut de mobilisation de calcium dans les plaquettes sanguines, calcium qui est impliqué dans l'activation de ces cellules qui jouent un rôle majeur dans l'arrêt du saignement.

Bénéfices attendus

Le blocage de la mobilisation du calcium semble réduire l'activité des plaquettes sanguines, ce qui pourrait réduire les accidents ischémiques (AVC, Infarctus). L'identification des mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité des plaquettes ouvre une nouvelle voie thérapeutique permettant des traitements anti-thrombotiques sans risque de saignement.

Procédures

Les souris sont sous anesthésie générale profonde pour ne ressentir aucune douleur. Un prélèvement sanguin est réalisé par ponction intracardiaque et les plaquettes sanguines sont isolées. L'intervention ne dure que quelques minutes (moins de 5 min).

Impact sur les animaux

contention et injections d'anesthésie/analgésie

Devenir

Les souris sont euthanasiées à la fin de la procédure car pour optimiser la qualité du prélèvement de sang, le cœur est exposé afin de permettre l'insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche.

Remplacement

Les plaquettes sont des éléments cellulaires très fragiles dont la conservation est d’une durée très faible (quelques heures) et dont la production in vitro est encore très limitée. Pour caractériser le signal calcique des plaquettes, il faut utiliser des plaquettes isolées à partir du sang. Les mécanismes que nous étudions ont été observés dans les plaquettes de souris génétiquement modifiées. La possibilité d'avoir accès à ces animaux est aujourd'hui la seule approche pour la concrétisation de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons calculé le nombre d'animaux de façon à obtenir des résultats reproductibles et de prendre en compte la possibilité d'une différence de résultats entre les mâles et les femelles. Les plaquettes issues de chaque animaux seront étudié en utilisant à chaque fois deux des activateurs principaux des plaquettes à plusieurs doses pour être sûr de pouvoir utiliser les données obtenues avec chacun des animaux utilisés.

Raffinement

Au cours de sa captivité en animalerie, le bien-être de l’animal est contrôlé tous les jours et nous avons établi un score concernant les conditions générales de façon à pouvoir définir les points limites pour permettre d'éviter la douleur à son minimum. A leur arrivée, les animaux pourront s’acclimater pendant au moins une semaine. La nourriture sera renouvelée toutes les semaines et nous nous assurerons que les animaux aient une consommation régulière. Pour la procédure, les souris sont anesthésiées. Après l'anesthésie, l'animal est surveillé (respiration, réflexe) pour s’assurer que l’animal ne se réveille pas et reste insensible à la douleur. Si l’animale montre de signe de réveil, mouvement de la patte, une nouvelle dose d’anesthésiant lui sera immédiatement administrée.

Choix des espèces

L’espèce animale sélectionnée pour ce projet est la souris. Nous utilisons cette espèce car elle partage de nombreuses voies de signalisation plaquettaire avec l'homme. Et c'est en utilisant ce modèle animal que nous venons de mettre en évidence cette nouvelle signalisation. De plus le modèle murin permet l'utilisation d'animaux transgéniques qui fournissent des plaquettes sanguines portant ces mutations et qui sont impossible à produire in vitro. La possibilité de disposer d’une lignée génétiquement modifiée est un atout essentiel pour montrer ces effets protecteurs et permettre de développer une approche thérapeutique par la suite. Les souris seront utilisées à taille adulte permettant de récupérer un volume de sang suffisant pour purifier suffisamment de plaquettes de bonne qualité.

300 souris vont être utilisées, anesthésiées puis tuées avant tout réveil par une perfusion intracardiaque. Elles sont mises à mort pour prélever leurs cellules cérébrales et les mettre en culture, afin d'y tester dix petites molécules censées agir sur la neuroinflammation. Une fois les cellules prélevées le projet reste entièrement in vitro, l'animal ne servant qu'à fournir la matière première. Le porteur affirme avoir déjà réduit la sélection des molécules par un travail in silico et décrit la souris comme un modèle "pertinent et reconnu".

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact de nutriments lipidiques et métabolites sur la régulation des cellules cérébrales et leurs intéractions in vitro. Il s’inscrit dans le cadre du projet global d’étude de la neuroinflammation, composante primaire de pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Les paradigmes expérimentaux in vitro permettront de mettre en avant l’importance de petites molécules d’intérêt (nutriments, lipides et métabolites) sur les intéractions entre cellules murines cérébrales in vitro et leurs fonctionnements. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances et de découvrir de nouvelles stratégies pharmacologiques prometteuses dans le cadre des pathologies que nous étudions (neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives). Nous avons 5 molécules d’intérêt en lien avec les pathologies neurodéveloppementales et 5 en lien avec les pathologies psychiatriques et neurodégénératives.

Procédures

Une perfusion intracardiaque sera effectuée sur les animaux avec prise en charge de la douleur.

Impact sur les animaux

Les animaux en cours de protocole sont surveillés quotiediennelement par les animaliers. Il n’y a pas d’induction de stress majeur sur ces animaux entrainant une alteration de l’état général des animaux. La procédure de perfusion implique une injection intrapéritonéale.

Devenir

L’ensemble des souris sera mise à mort à des fins de culture cellulaire et d’étudier l’impact de petites molécules sur les interactions entre les cellules cérébrales in vitro

Remplacement

La sélection des molécules à tester a été drastiquement réduite par un travail in silico visant à ne sélectionner que les molécules (nutriments, lipides et métabolites) avec un fort pouvoir interventionnel sur les interactions entre les cellules cérébrales. Notamment, l’expression spécifique de récepteurs à ces petites molécules par les sous-types cérébraux a été vérifiée et validée ou encore l’implication des molécules dans des voies de signalisation dans les pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives étaient des pré-requis à la sélection des molécules. Nous remplaçons le test de ces molécules in vivo par notre approche in vitro afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces travaux vont nous permettre de définir plus finement et de sélectionner les molécules d’intérêt pharmacologique.

Réduction

Nous avons calculé au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour réaliser les isolements de cellules cérébrales à des fins de culture. En se basant sur notre expérience et sur l’optimisation des protocoles de culture cellulaire, nous avons calculé la quantité de cellules nécessaires à l’évaluation de chaque molécule et donc nous pouvons retranscrire ce nombre en nombre de souris. Nous devons répliquer l’expérience 3 fois par molécule d’intérêt, soit 30 animaux pour une analyse complète par molécule. Nous testerons 10 molécules d’intérêt, soit un total de 30 animaux X 10 molécules = 300 souris. De manière importante et optimisée, le nombre d’animaux demandé va permettre de réaliser les cultures de cellules en neuroinflammation ET des cultures des autres cellules cérébrales.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (maison en carton + baton de bois). Les animaux seront observés quotidiennement par les animaliers. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera sacrifié dans les 24h. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des aanalgésiques (décrite dans la procédure) afin de limiter la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris males et femelles seront utilisées à l’âge adulte entre 6 semaines et 12 mois. Cela permettra d’étudier les impacts des différentes molécules au niveau des cellules cérébrales adultes in vitro.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées sans réveil alors que le suivi décrit s'étend sur six à douze semaines après l'opération. Une arthrose est induite chirurgicalement par déstabilisation du ménisque du genou, puis trois composés sont administrés dans l'eau de boisson avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur décrit une gêne à la marche postopératoire disparaissant en 48 heures et ne rapporte pas d'autre effet notable. Il affirme que l'arthrose met en jeu l'articulation entière et le système digestif, ce qui rendrait le recours à la souris nécessaire faute d'alternative in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'impact de la prise orale via l'eau de boisson du Thiamet-G (TG), de la triéthylènetrétramine (TETA) et de la glucosamine (GlcN) sur l'évolution de l'arthrose post-traumatique chez la souris

Bénéfices attendus

L'OA est la maladie articulaire la plus répandue avec une prévalence mondiale de 303 millions de patient dans le monde. Elle touche aussi bien les articulations périphériques que rachidiennes. Au sein des articulations tous les composants de l'articulation sont impactés. L'OA se caractérise par une érosion du cartilage, la formation d'ostéophyte, une sclérose osseuse et une inflammation synoviale. Les composés que nous nous proposons de tester sont des molécules capables de jouer sur la régulation de voies métaboliques dérégulées dans l'OA. Le TG est un composé augmentant la O-GlcNacylation des protéines processus agissant sur l'autophagie. La GLcN composé connu pour ses effets anti-inflammatoires et enfin la molécule TETA mimant la restriction calorique et stimulant l'autophagie. Nous espérons que les composés testés présenteront des effets bénéfiques sur l'apparition et l'évolution de l'OA post-traumatique chez la souris et permettront ainsi l'identification de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de l'OA chez l'Homme.

Procédures

A l’âge de 9 semaines les souris des groupes 2, 3, 4 et 5 subiront une induction chirurgicale d’arthrose unilatérale par déstabilisation du ménisque médial droit alors que les souris du groupe 1 subiront une procédure Sham, c’est-à-dire qu’elles subiront l’intervention chirurgicale sans l’étape de déstabilisation du ménisque médial.Le geste chirurgical par souris est d'environ 5 min. Les souris seront suivies et traitées via l'eau de boisson pendant 6 et 12 semaine après la procédure chirurgicale. 6 et 12 semaines après la chirurgie, la moitié des souris de chaque groupe aura une ponction intracardiaque terminale puis sera euthanasiée comme décrit dans la procédure expérimentale n°1 et les différents organes nécessaires à l'évaluation des traitements et du niveau d'OA seront prélevés.

Impact sur les animaux

En post opératoire une légère gêne à la marche peut être observée chez certaine souris. Cette gêne disparait dans les 48h post chirurgie et est prise en charge comme décrite dans la section 4. Pas d'effet notable de la procédure sur le poids des animaux, sur leur mobilité ou sur leur comportement n'a été reporté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’OA est une maladie de l’ensemble de l’articulation : os sous-chondral, membrane synoviale, ménisques et appareil musculo-ligamentaire. Il s’agit aussi d’une pathologie multifactorielle (métabolique, génétique, endocrinienne, mécanique, traumatique) complexe difficilement reproduite par des systèmes cellulaires simplifiés. D’autre part ce projet évalue des principes actifs par prise orale, ce qui implique leur passage par le système digestif, ce qui ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Je réduis en utilisant le nombre minimal d'animaux par groupe requis pour chaque type de test afin d'atteindre une significativité statistique. Les études statistiques comparatives seront réalisées en utilisant le test de kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaison multiple de Dunn. Cette saisine nécessitera donc 180 souris C57BL/6 âgées de 9 semaines

Raffinement

Je raffine en réduisant la douleur lors de cette expérimentation afin d'améliorer la reproductibilité et la qualité de l'expérimentation. Ainsi, une analgésie péri-opératoire immédiate est prévue par administration de buprénorphine et meloxican en pré et post-chirurgie. Les souris seront hébergées à raison de 4 souris par cage avec de l'enrichissement type frisottis. Elles seront observées quotidiennement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Elles seront également pesées quotidiennement pendant les 3 premiers jours après la chirurgie puis 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérimentation. Par ailleurs des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en place lors de l'atteinte de ces points limites ont été décrites. Malheureusement, je ne peux pas remplacer cette expérimentation animale par un modèle in vitro, car cette étude visant à déterminer l'effet de nos molécules sur l'apparition et l'évolution de l'OA nécessite l'intervention du système digestif et de l'articulation dans son ensemble ce qui ne peut pas être reproduit in vitro. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives à l'utilisation d'animaux pour ce projet.

Choix des espèces

Le choix des souris est fondé sur plusieurs critères : - Le besoin de travailler sur des animaux adultes et à maturité squelettique ; - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie ; - Ces animaux sont faciles à gérer en stabulation ; - Le modèle murin d’OA est le plus décrit dans la littérature internationale. De plus, il représente une référence dans l’étude de cette pathologie. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 9 semaines lors du début de la procédure n°1 car c’est à cet âge qu’est classiquement induit l’OA par déstabilisation du ménisque médial « DMM ».

20 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur coeur est prélevé puis perfusé sur machine, pour entraîner des équipes chirurgicales et médicales à la conservation d'un greffon cardiaque ex vivo, non pour produire des connaissances. Le porteur décrit cette formation comme "indispensable" avant de lancer un programme clinique chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les conditions d'un coeur humain et justifie le choix du porc par sa physiologie circulatoire proche.

Objectifs

La perfusion cardiaque ex-vivo requiert une formation spécifique, à la fois chirurgicale et de réanimation, cette discipline étant innovante et actuellement non enseignée par des formations académiques diplômantes. Seule l’expérimentation sur modèle animal permet de reproduire les conditions anatomiques et physiologiques proches de l’homme afin de former les équipes médicales à la technologie de préservation du cœur sur machine de perfusion ex vivo. La formation à la perfusion ex-vivo cardiaque sous la direction de la société fabricant ce dispositif comporte une formation théorique au principe de cette technologie, et une formation pratique sur modèle de cœur porcin perfusé ex vivo. Il s’agit d’une formation indispensable avant de débuter un programme clinique de perfusion cardiaque ex vivo chez l’homme, à la fois pour appréhender les contraintes techniques chirurgicales, et pour s’initier à la surveillance et à l’entretien de la perfusion normothermique au sang d’un organe isolé.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la formation des équipes chirurgicales et médicales à la perfusion cardiaque ex-vivo. Il s’agit d’une formation indispensable avant de débuter un programme clinique de perfusion cardiaque ex vivo chez l’homme, à la fois pour appréhender les contraintes techniques chirurgicales, et pour s’initier à la surveillance et à l’entretien de la perfusion normothermique au sang d’un organe isolé.

Procédures

Préservation du greffon cardiaque sur machine de perfusion ex vivo : prélèvement cardiaque, instrumentation et perfusion ex vivo au sang

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur.

Devenir

L'ensemble des procédures impliquent l'explantation du coeur ce qui rend la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux inenvisageable.

Remplacement

La technologie de perfusion cradiaque ex-vivo en vue d'une transplantation est une perfusion normothermique au sang qui fait reprendre une activité cardiaque avec des battements. Il est donc nécessaire pour l’apprentissage de cette technique d’utiliser des organes prélevés sur modèle animal. Il n’existe en effet aucun autre modèle alternatif capable de reproduire les conditions biologiques, anatomiques et physiologiques d’un cœur humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet à visée éducative, cette formation est réalisée dans un centre ayant à la fois une expertise en expérimentation animale et en perfusion d’organe ex vivo. Ainsi depuis 2019 nous réalisé plus de 50 procédures de perfusion ex vivo de cœur porcin sur machine et 8 procédures en pratique clinique. Cette double expertise permet de réduire le risque d’échec de la procédure à visée éducative. Les chirurgiens de notre équipe réaliseront les procédures sur l’animal et la mise en place du cœur sur le dispositif de perfusion ex-vivo, à la fois pour raison règlementaire et pour éviter tout échec en lien avec l’inexpérience de l’équipe en formation.

Raffinement

Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement enrichi avec : promenade régulière, planche à gratter, distributeur de nourriture. Evaluation quotidienne du bien être animal selon plusieurs grilles d'avaluations. Ce protocole ne comprend aucune procédure ou acte invasif sur un animal conscient (anesthésie générale sans réveil).

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme (Fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg). Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée ex vivo. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce à la formation et limitera au minimum le nombre d’animaux tests (échec techniques). Les animaux utilisés dans le protocole expérimental sont des porcs de 60 kg. A ce stade de développement les porcs ont un système circulatoire très proche de l’homme et leur gabarit permet une modélisation chirurgicale optimale

120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est sédaté, intubé et ventilé, puis reçoit une injection intraveineuse de LPS provoquant un choc endotoxinique et une défaillance cardiaque, avant une échographie du coeur puis la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun traitement de cette cardiomyopathie en médecine humaine et renvoie l'intérêt thérapeutique à une validation ultérieure sur un "gros animal" puis chez l'humain. Il décrit le modèle rat comme "incontournable" et juge les cultures cellulaires non pertinentes.

Objectifs

L'objectif du projet est d'identifier des molécules qui pourraient traiter la cardiomyopathie induite par le sepsis (CMIS) qui est la dysfonction cardiaque causée par une infection sévère. Plusieurs études chez l'animal ont permis de mettre en avant l'implication des voies de l'inflammation, de modifications redox et des troubles de l'homéostasie calcique. Des travaux précédents ont mis en évidence l'existence de dysrégulations des RyR dans la CMIS. Notre objectif est de montrer que certaines molécules pourraient protéger de la CMIS par leur impact sur une régulation des RyR. On s'intéressera particulièrement aux molécules connues pour avoir un impact sur l'homéostasie calcique (notamment via les récepteurs de la ryanodine, RyR) en les évaluant sur un modèle de rat après induction d'un choc septique (ou plus précisément endotoxinique) par injection d'un fragment de bactérie (le LPS d'Escherichia coli).

Bénéfices attendus

Dans nos précédents travaux nous avons mis en évidence l'implication des RyR parmi les mécanismes physiopathologiques de la CMIS. Ceci laisse entrevoir de nouvelles possibilités thérapeutiques qui doivent être validées chez l'animal avant de pouvoir envisager leur utilisation en médecine humaine. La mise en évidence d'une potentielle efficacité sur l'atténuation de la CMIS par une ou plusieurs molécules, en monothéréapie ou en association, permettra son ou leur évaluation sur un modèle de gros animal puis en médecine humaine. Le bénéfice attendu in fine est la mise à disposition de thérapeutique active contre la CMIS, alors qu'il n'en existe aucune disponible en médecine humaine aujourd'hui.

Procédures

Chaque journée d’expérimentation est dédiée à un seul animal. L’individu est sédaté (hypnotique et morphinique), intubé, ventilé, et monitoré en continue (ecg, pression artérielle, échelle de sédation). Un choc endotoxinique (LPS) est ensuite réalisé par injection intraveineuse de LPS afin de générer une CMIS. Une échographie cardiaque est réalisée à la phase initiale puis après 4 heures. L’individu est ensuite euthanasié et les tissus et le matériel biologique destinés aux analyses sont prélevés pour réalisation des analyses biochimiques (immunoprécipitation et Western blot) et analyses fonctionnelles avec la mesure des propriétés biophysiques (bilayer) des canaux calciques, issus de microsomes des tissus. On appliquera cette procédure à 10 groupes de 12 rats, soit 120 animaux au total.

Impact sur les animaux

Décés (les animaux sont euthanasiés en fin d'expérimentation)

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le coeur, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.

Remplacement

Le développement et la caractérisation d'un modèle de rat est incontournable pour l'analyse physiopathologique de la CMIS. Il est important de souligner que les cultures cellulaires de cardiomyocyte, déjà réalisées dans d'autres laboratoires, ne permettent pas d'appréhender l'impact des interactions entre le cœur et les différents organes, le cœur et la ventilation, et les effets des variations de volémie. L'utilisation de méthodes alternatives ou substitutives n'est donc pas pertinente. Le modèle rat après sédation, intubation et ventilation devrait permettre d'obtenir des résultats extrapolables au patient de réanimation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement significatif. Nous avons défini une stratégie d'expérimentation que nous espérons la plus optimale possible. Nous réaliserons dans la mesure du possible les exploration electrophysiologique, la mesure de pression, les mesures échographiques et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement avant l'expérimentation et de façon rapprochée, toutes les heures durant l'expérimentation. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche le rat wistar est l'espèce retenue. Cette espèce a déjà été utilisée dans la litérature pour étudier la CMIS. D'après d'autres études sur des modèles animaux variés, les mécanismes physiopathologiques de la CMIS semblent être généralisables entre les espèces de mammifères. De plus, un certain nombre d'études réalisées chez l'homme confirment les similitudes physiopathologiques avec les autres espèces de mammifère et notamment les rats. Ainsi, les résultats du modèle rat devraient permettre une extrapolation chez le gros animal et chez l'homme. Afin d'obtenir des résultats représentatifs de notre cohorte clinique et comparable à la littérature existante, les rats seront utilisés à un stade adulte (8-10 semaines).

516 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les souris étant tuées avant tout réveil. 66 subissent une coupure de l'extrémité de la queue pour mesurer le temps de saignement, 66 une thrombo-embolie pulmonaire provoquée par injection, et 384 une exsanguination, pour étudier le rôle d'un canal ionique dans la coagulation. Le porteur indique que toutes les souris meurent pendant l'expérience ou sont mises à mort juste après, sous anesthésie et analgésie, car elles perdent trop de sang ou développent des thromboses. Il affirme que le modèle transgénique est plus spécifique qu'un activateur chimique et juge le recours à la souris "indispensable" pour reproduire l'activation du canal par le flux sanguin.

Objectifs

Les plaquettes sanguines sont des éléments essentiels de l’hémostase qui conduit à la formation du caillot et arrête le saignement. Elles sont également impliquées dans plusieurs pathologies. Ce projet concerne la caractérisation du rôle d’un canal ionique. A ce jour, cette protéine est très peu étudiée en hémostase et en particulier dans les plaquettes, bien que les mutations observées chez des patients pourraient être à l’origine d’événements thrombotiques. Nos travaux préliminaires effectués in vitro sur du sang humain, sont en faveur d’un rôle important de cette protéine dans l’activation plaquettaire. Cependant, ces travaux sont basés sur l’utilisation d’un activateur chimique, plus ou moins spécifique. Or physiologiquement la protéine que nous étudions est activée par un mécanisme complexe qui fait intervenir les forces mécaniques qui accompagnent le flux sanguin. C’est pourquoi, il est important de valider ces résultats en étudiant in vivo et ex vivo l’activité fonctionnelle des plaquettes de souris génétiquement modifiées exprimant sur cette protéine une des mutations fréquemment retrouvées chez les patients. Ainsi, la comparaison des réponses des plaquettes de souris témoins à celles des souris transgéniques nous permettra de caractériser les mécanismes à l’origine des thromboses observées chez les patients.

Bénéfices attendus

Identifier de manière plus précise la physiopathologie associée aux mutations de ce canal ionique, permettra une avancée majeure dans la connaissance de la pathologie et du rôle de ce canal ionique dans l'hémostase et l'apparition d'événements thrombotiques. Notre étude devrait également permettre d'ouvrir éventuellement la voie vers de nouvelles recherches comme le développement de nouvelles molécules antiplaquettaires.

Procédures

66 souris auront une coupure de l'extrémité de la queue (temps de saignement) ; 66 souris seront utilisées pour le modèle de thrombo-embolie pulmonaire induit par l’injection d’activateurs plaquettaires et - une exsanguination sera effectuée sur 384 souris. Toutes ces expériences sont de courtes durées (moins de 10 min) et sont réalisées sur des souris prémédicalisées afin de diminuer leur stress et améliorer l'efficacité de l'anesthésie effectuée avec un mélange d’anesthésique - analgésique.

Impact sur les animaux

Toutes les souris utilisées dans les expériences décèderont : soit pendant l'expérience , soit seront mises à mort immédiatement à la fin de l'expérience (toujours sous anesthésie-analgésie)

Devenir

Toutes les souris qui seront utilisées pour les expériences seront mises à mort sous anesthésie-analgésique, directement suite à l'expérience, car en fonction des expériences, les souris perdent trop de sang, ou présentent des thrombo-embolis entrainant des phénotypes dommageables (incompatibles avec la réutilisation de ces souris), ou le décès de l'animal. De plus, à la fin des expériences des prélèvements d'organes (poumon, moelle osseuse, ...), sur les souris mises à mort, seront également effectués afin d'étudier les thombo-embolies, et mettre en culture les cellules de la moelle osseuse pour étudier l'erythropoïèse et la mégacaryopoïèse.

Remplacement

Suite à l’étude de l’impact d’un activateur chimique du canal ionique sur les plaquettes humaines, il est crucial de confirmer le rôle du gain de fonction de ce canal dans l’hémostase grâce au modèle de souris transgénique qui est plus spécifique. Par ailleurs, les mécanismes impliqués dans l’hémostase mettent en jeu différentes cellules et molécules ainsi que diverses interactions (cellule-cellule et cellule-matrice), il est donc indispensable d’associer aux études in vitro des études in vivo chez l'animal. Enfin, le canal étudié étant activé par le flux sanguin, le modèle in vivo nous permet de nous affranchir de l’utilisation d’activateurs chimiques plus ou moins spécifiques.

Réduction

Si aucune différence dans les réponses plaquettaires n’est observée entre les mâles et les femelles, pour l’étude de la caractérisation de la signalisation, métabolome... (études moléculaires) un seul groupe sera alors étudié incluant mâles et femelles (au lieu de 2 groupes séparés). Ainsi, l’approche par étapes nous permettra peut être selon les résultats obtenus de ne pas atteindre le nombre d’animaux estimés pour l’ensemble de ce projet. En s’appuyant sur notre expérience dans ces modèles et ce qui est habituellement réalisé dans la littérature et en utilisant des tests statistiques à l’aide du logiciel invivostat, ceci nous permettra d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en atteignant la significativité, importante pour assurer la robustesse de notre étude. Ainsi, afin d'avoir une puissance suffisante, nous estimons le besoin de 11 animaux par groupe pour les études in vivo et 6 à 8 animaux par groupe pour les études ex vivo et les études de signalisation. De plus, nous développons régulièrement des méthodes d’études de l’hémostase nécessitant moins de sang. Ces tests, appliqués au modèle murin, nous permettent de diminuer le nombre de souris pour effectuer l’ensemble des études nécessaires à la caractérisation de l’activité des plaquettes des souris.

Raffinement

Bien que nous ne nous attendions pas à ce que ce modèle de souris transgénique en soi soit associé à la douleur et à la souffrance, dans un premier temps nous vérifierons, à l'aide d'une fiche d’observation, que ce modèle n’est pas dommageable et si nécessaire, la mise en place de points limites nous permettra de prendre en charge et/ou mettre à mort, tout animal présentant des signes de souffrance. Toutes les expériences effectuées sur les souris sont de courte durée (maximum 10 min) et sans réveil. Elles seront réalisées sur des souris prémédicalisées par une injection d'analgésique (Buprénorphine 0.1 mg/kg par voie SC) ce qui permet de diminuer leur stress et d'augmenter l'efficacité de l'anesthésie (isoflurane 2,5% ou mélange de kétamine (125 mg/kg)- xylazine (12,5mg/kg). La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée par la laxité de la queue, l’absence de mouvement au niveau des vibrisses, l’absence de réflexe oculaire, de retrait de la patte à la stimulation et/ou de réaction au pincement de la queue. La qualité de l’anesthésie sera contrôlée régulièrement au cours de l'expérience Tout signe de douleur (petits mouvements des vibrisses, agitations, augmentation de la fréquence respiratoire) entrainera un renouvellement de l’injection par voie intra-péritonéale.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des expériences d’hémostase in vivo (thrombose et saignement sur les vaisseaux artériels) et d’obtenir suffisamment de sang et de progéniteurs hématopoïétiques nécessaires à l’étude ex vivo de l’hémostase, de la mégacaryopoïèse, et l’érythropoïèse. Par ailleurs, le modèle murin permet la construction de modèle transgénique utilisée dans notre étude . Cette étude doit se faire sur des souris adultes âgées d’au moins 10 semaines. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.

13 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Sur chaque animal, plusieurs saignements sont provoqués par incisions et sections d'artères pour tester des scellants hémostatiques, l'intervention durant de trois à quatre heures pour le premier animal. Le porteur vise le choix d'une solution destinée au marquage CE et énumère des complications possibles comme hémorragie, arythmie ou nécrose des tissus. Il affirme que "seule l'expérimentation animale permet d'évaluer" l'arrêt d'un saignement et retient le cochon pour sa proximité anatomique avec l'humain.

Objectifs

Avec la normalisation de la pratique chirurgicale et l’accroissement de la prise en charge des opérations en France et dans le monde, le nombre d’interventions chirurgicales est en constante augmentation. Ceci accroît considérablement les risques hémorragiques liés à la pratique chirurgicale (notamment section de tissus et de vaisseaux). Ainsi, le développement de solutions hémostatiques permettant l'arrêt du saignement est primordial afin de permettre au chirurgien de stopper les hémorragies per- et éventuellement post-opératoires. Bien qu'il existe de nombreuses solutions sur le marché, aucune aujourd'hui n'est réellement satisfaisante. L'arrêt d'un saignement est un mécanisme complexe dont seule l'expérimentation animale permet d'évaluer l'efficacité. Ainsi ,après avoir développé un panel de cinq solutions pouvant répondre à cette problématique et effectué des tests in vitro permettant d'en éloigner deux, nous sommes forts de trois scellants pouvant potentiellement permettre l'arrêt d'un saignement. Ainsi, l'objectif de cette étude est l'évaluation préliminaires de nos composés par leur capacité à créer l'hémostase, et leur comparaison à des produits déjà présents sur le marché. Le tout afin de situer leur efficacité vis-à-vis des solutions existantes, mais également de diriger un choix vers un scellant final qui sera ensuite amené jusqu'au marquage CE.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de finaliser le choix d'une solution parmi les trois scellants développés, ainsi que de comprendre leur positionnement en termes d'efficacité et de temps d'arrêt du saignement par rapport à des hémostatiques, scellants et colles déjà présents sur le marché. Sans cette évaluation, il ne sera pas possible de choisir avec certitude une solution et continuer avec celle-ci jusqu'au marquage CE.

Procédures

Sous anesthésie générale, quatre types de saignements (S1, S2, S3, S4 soit 4 sites différents) seront créés sur un même animal. Pour les saignements S1 et S2, 5 incisions distinctes et équivalentes seront réalisées par sites, à des distances raisonnables pour appliquer les 3 solutions (H1; H2; H3) et les 2 références pour un temps d'intervention d'environ 10min par site. Pour les saignements S3 et S4, un site par produit (solution ou référence) sera sélectionné pour un temps d'intervention d'environ 10min par site. Les quatre types de saignements créés sont les suivants : -S1: saignement sous cutané - S2 : saignement musculaire diffus - S3 : saignement actif - S4 : application des produits en complément de sutures. Dans ce cas précis, les 3 soutions et 1 seule référence seront testés, sur 4 différentes artères. Le temps d’arrêt du saignement sera mesuré pour chaque saignement et chaque produit. Il sera défini par la durée entre l’application du produit et l’obtention de l’arrêt du saignement (en sec). Une fois les solutions appliquées, une évaluation macroscopique sera réalisée et l'hémostase sera confirmée visuellement. L'homogénéité des films obtenus sur les tissus sera notée ainsi que l'apparition de fuite. Les inflammations et éventuelles nécroses seront notées. Pour S3 et S4, et principalement S4, une échographie sera réalisée afin de mettre en évidence la présence de thrombose ou de fuite de produit dans les vaisseaux. Le temps d’intervention par saignement crée est évalué au maximum à 10 minutes. La durée totale d'intervention sur ce porc est estimée de 3H à 4H. Pour les douze porcs suivants, le cas échéant: un site, un type de saignement et une solution seront utilisés par animal. La procédure reste identique avec un temps d’intervention par site estimé à 10min, mais des coupes histologiques seront prélevées afin d'être étudiées.

Impact sur les animaux

Potentielles complications per-opératoires: Bradycardie, Hypotension, Arythmie, Hémorragie non contrôlée, Hypothermie, Défaut d'adhérence aux tissus, réaction inflammatoire, réaction allergique et nécrose des tissus.

Devenir

Concernant la phase de faisabilité, c’est çà dire le premier porc sur lequel plusieurs sites d’intervention pour plusieurs produits seront étudiés avec prélèvement de coupes histologiques , à la fin de la procédure on procèdera à la Mise à mort de l’animal. Concernant la phase sélective, sur les 12 animaux au maximum utilisés, on procèdera également à la mise à mort à la fin de la procédure afin de prélever les coupes Histologiques. La mise à mort est réalisé sous anesthésie générale par injection d'un agent euthanasiant, puis les animaux sont mis au congélateur avant d'être enlèver par un écariseur agréé

Remplacement

Des essais préliminaires in vitro sur l'effet hémostatique de ces solutions en utilisant des animaux morts (souris) ont été réalisés au préalable de ce projet. Les résultats de ces tests ont permi de faire un premier choix parmi les 5 solutions hémostatiques et n'en retenir que 3 à tester. Ainsi 2 solutions ont été éliminées afin de minimiser le nombre d'animal et les essais à réaliser sur le même animal. De plus, en parallèle de ce projet, des tests in vitro sur du sang total de donneurs humains sont prévus afin d'éviter l'utilisation de nombreux animaux.

Réduction

Après des essais in vitro permettant de sélection 3 solutions, l’objectif est ici de vérifier le comportement hémostatique de ces 3 solutions retenues dans ce projet, afin d’en sélectionner 1 ou 2 comme DM appartenant à la catégorie de gel hémostatique non spécifique sur la cascade de coagulation. Pour cela, 2 produits commercialisés comme agent hémostatique, 1 spécifique sur la coagulation et 1 non spécifique, seront utilisés comme témoins. Ces 5 produits devront être testés sur 4 types de saignement représentatifs (sous cutané, musculaire diffus, actif, en complément d’anastomose). Pour le premier lot correspondant à une étude de faisabilité, les 2 variables étudiées étant de nature dichotomique (succès ou échec), la non nécessité de répétabilité et la taille de l’animal, nous permettront d’utiliser un nombre minimum de porc soit un premier lot de 1 seul animal. Pour le deuxième lot correspondant à une étude sélective, 1 porc par site et par produit, le nombre minimum d’animal de 12 porcs a été défini selon des tests statistiques à variable dichotomique. Nous avons défini que pour l’analyse statistique, nous prendrions en compte que 2 solutions (solutions « succès ») au maximum parmi les 3 et qu’un seul produit témoin était suffisant pour comparaison. De plus, nous avons considéré que les 4 types de saignement au maximum suffisaient à démontrer le pouvoir hémostatique de notre ou nos solutions et que l’analyse de la répétabilité pourra être réalisée sur le même animal qui sera ensuite euthanasié

Raffinement

Ceci passe par la gestion des principales complications per-opératoires par la réduction ou l'ajout en perfusion ou directement par voie intraveineuse de solutions médicamenteuses. Seront traîtées des complications telles que la bradycardie, l'hypotension, l'arythmie ou encore une hémorrhagie (contrôlée ou non). En plus de ces gestions des complications, le bien être des animaux avant opération est supervisé par une acclimatation au laboratoire d'environ 4 jours, des contrôles vétérinaire avant le départ de l'éleveur puis au laboratoire,et les porcs seront stabulés seuls pour éviter tout stress. Enfin, l'intervention se fera sous anesthésie générale afin de limiter la douleur.

Choix des espèces

Le porc est un animal de choix car le porc possède certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est en particulier le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales, qui sont bien plus proches des nôtres que ne le sont celles de la souris. Les chirurgiens l’utilisent notamment depuis longtemps pour s’entraîner à la pose de cathéters, s’exercer aux procédures endoscopiques ou à soigner des traumatismes complexes. Le développement de ces techniques a conduit à utiliser le porc comme modèle préclinique, pour tester notamment les dispositifs implantables tels que les pacemakers. La taille des organes du porc, similaire à celle des organes humains, ou le fait que la distribution du sang par son artère coronaire soit très similaire à celle de l’Homme, rendent aussi son utilisation très pertinente dans le cadre de la transplantation d’organes. Utilisation d'animaux adultes (45-50kg, âge: 16 semaines) afin de se rapprocher au plus de l'utilisation finale du dispositif médical (DM), soit principalement chez l'humain adulte.

128 souris vont être utilisées, dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe sous la peau de cellules de glioblastome, puis des séances de chimiothérapie et de radiothérapie avec des anesthésies répétées. Le porteur teste une molécule censée bloquer la croissance tumorale en ciblant un récepteur aux œstrogènes, dans une preuve de concept avant un éventuel modèle dans le cerveau. Il affirme que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est pas possible pour ce cancer lié au statut hormonal.

Objectifs

Les gliomes sont des tumeurs astrocytaires (cellules gliales du cerveau) qui constituent l'un des groupes les plus fréquents de tumeurs cérébrales chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome (GBM, grade IV) dont la récidive est systématique et la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle neuroprotecteur des hormones féminines (oestrogènes). Des études sur des modèles murins indiquent que les oestrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur le rôle des voies de réponses aux oestrogènes dans les cellules tumorales, notamment celles initiées par le récepteur GPER (récepteur membranaire des oestrgènes couplé à la protéine "G"). Ceci apparait donc comme un axe de recherche pertinent. Dans une étude préliminaire pluridisciplinaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de GBM et identifié que ce récepteur GPER était jutement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons pu montrer pour la première fois que l'activation de GPER par la molécule "G1" est capable de bloquer la multiplication des cellules tumorales. La combinaison du G1 avec le traitement de radio et chiomiothérapie standard conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, le ciblage de GPER par le G1 pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante, ce que nous voulons démontrer via une étude préliminaire "in vivo".

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet initial constitueront une base pour proposer l'utilisation du G1 et/ou l'invalidation de GPER pour le traitement des GBM. Cette étape est indispensable pour soutenir la valorisation clinique de nos travaux. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature scientifique) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences de survie entre les hommes et les femmes atteints de GBM. En cas de résultats probants, cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant l'utilisation de médicaments ciblant des récepteurs des oestrogènes comme GPER, dans le cas du traitement de certaines tumeurs marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).

Procédures

injection sous-cutanée de cellules tumorales (procédure 1) : 1 seule itération durée 5 min - administration des traitements (procédure 2 ) : schéma de traitement étalé sur 3 semaines pour l'administration des traitements - (chimiothérapie et radiothérapie) : 3 jours de traitement x 3 semaines = 9 itérations pour chaque groupe. La durée des traitements est de 3 min maximum (quelques secondes pour l'administration par voie intra-veineuse et quelques minutes pour la radiothérapie).

Impact sur les animaux

La nuisance associée à ces procédures est surtout à liée à la fréquence des anesthésies et des traitements (3 par semaine sur 3 semaines soit 9 au total).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures 1, 2 et 3. Tous les animaux seront ensuite mis à mort à l'issue de la procédure 4.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris males ou femelles ...) En l'occurence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Dans le cadre de notre étude, 2 lignées tumorales sont utilisées: une exprimant normalement le récepteur aux oestrogènes GPER (wt) et l'autre non (GPER-KO) sur un modèle de greffe de cellules tumorales sous-cutanée. Cette étude préliminaire fait office de preuve de concept et permet de valider/invalider l'efficicacité des traitements testés sur un modèle de première ligne (injection de cellules tumorales en sous-cutanée) en utilisant un effectif d'animaux assez réduit (8 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus à partir de cette étude pilote, une étude avec un nombre plus grand d'animaux sera envisagée sur un modèle de greffe intra-cérébrale plus proche de la pathologie clinique.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique), puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois par semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale 3 fois par semaine). Une vigilance accrue sera également exercée pendant le temps d'admiministration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'évolution de la tumeur). Un suivi quotidien garantissant le bien-être des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau boisson et croquettes ad libitium, enrichissement sous forme de feuilles de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera mis en mort.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins, (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées athymiques sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris Nude (mâles ou femelles) seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.