Procédures sans réveil
Mise au point d’un système de conservation statique actif des greffons pulmonaires : création d’une glacière perfusante connectée
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
12 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit un prélèvement du bloc cœur-poumon pour évaluer un nouveau dispositif de conservation des greffons pulmonaires par perfusion à froid. Le porteur présente le porc comme l'animal de référence pour l'étude du poumon isolé, ses organes étant proches de ceux de l'humain. Il justifie la mise à mort par la nécessité d'évaluer la fonction pulmonaire et d'éviter une transplantation tant que le bénéfice du dispositif n'est pas prouvé.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de créer un nouveau dispositif médical de transport d’organe, capable de perfuser du liquide de conservation, avec une température contrôlée, afin de diminuer le risque de défaillance primaire du greffon. Il comprendra un monitorage continu des paramètres de perfusion transmis aux chirurgiens via une application Bluetooth, offrant un outil de première évaluation de la qualité de l’organe. L’application intégrera un GPS permettant aux différents intervenants (chirurgiens du prélèvement et de l’implantation, anesthésistes) de connaitre la position de greffon en temps réel afin de mieux coordonner les équipes et donc de réduire le temps d’ischémie. Avant de chercher un investissement industriel, nous souhaitons faire une étude de faisabilité pour vérifier que la perfusion hypothermique n’est pas nocive pour le poumon.
Bénéfices attendus
Les avantages attendus de la glacière perfusante connectée sont nombreux: monitorage continu des constantes du greffon ce qui permettra de l’évaluer et d'anticiper ses performances chez le receveur; alarmes paramétrables: en cas de détection d’une anomalie, la perfusion s’arrêtera pour éviter toute lésion d’hyperpression mais la température cible restera maintenue afin de protéger le greffon; perfusion par un soluté dédié permettant un lavage des débris intravasculaires pulmonaire, une diminution de la charge immunologique du greffon du donneur vers le receveur et un effet anti-oedémateux et anti-inflammatoire. De plus cette glacière permettra un refroidissement homogène de l’organe à la température optimale de +10°C (la température n’est pas surveillée dans les glacières et une importante hétérogénéité de température des greffons est constatée) et ce pour tous les greffons.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 20 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant au prélèvement du bloc coeur-poumon à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure. En cas d’échec de l’anesthésie/analgésie au cours de l’expérimentation, l’animal sera euthanasié. La mort de l’animal sera confirmée par l’arrêt permanent de la circulation (arrêt d’activité cardiaque suivie par ECG).
Devenir
La finalité de l'étude est d'évaluer la fonction pulmonaire et les lésions du greffon pulmonaire après perfusion hypothermique. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour évaluer la fonction pulmonaire lors de notre protocole (durée 6h). Il n'existe pas d'autre modèle pour étudier ce système de conservation. Le sort prévu à ces animaux permet d'éviter une transplantation des organes prélevés tant qu'il n'existe pas de preuve du bénéfice de ce système de préservation pulmonaire.
Remplacement
Du fait de son anatomie et sa physiologie respiratoire, le porc est l’animal de référence pour l’étude de la perfusion de poumon isolé. Le matériel dont nous nous servons (glacière et machine de perfusion, avec sa connectique) est celui utilisé chez l’homme afin d’assurer une bonne applicabilité future. Ils imposent d’utiliser des poumons similaires anatomiquement et physiologiquement à ceux d’un humain.
Réduction
Nous avons choisi de réaliser une évaluation physiologique, biologique et scannographique des organes isolés seulement pour comparer les deux méthodes de conservation. Nous évitons ainsi le recours à un modèle de transplantation pulmonaire qui aurait nécessité le double du nombre d’animaux (un donneur et un receveur). Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est évalué à 12, soit 6 par groupe, afin de pouvoir réaliser des comparaisons entre les groupes via des tests statistiques.
Raffinement
Période d’acclimatation de 7 jours entre l’arrivée dans le service et l’inclusion dans le protocole. Arrivée et hébergement en groupe pour vivre entre congénères. Environnement enrichi avec : promenade régulière, planche à gratter, distributeur de nourriture. Evaluation quotidienne du bien être animal seon plusieurs grilles d'avaluations. Ce protocole ne comprend aucune expérimentation ou acte invasif sur un animal conscient (anesthésie générale sans réveil).
Choix des espèces
La machine de perfusion que nous utilisons est faite pour des organes humains et impose donc d’utiliser des organes similaires, tant sur le plan des paramètres de perfusion que de la connectique. Le porc charcutier a des poumons proches de ceux d’un humain sur le plan anatomique et physiologique (fréquence cardiaque 100 battement/mn, débit cardiaque 3-5 L/mn, pression artérielle pulmonaire moyenne < 15mmHg). Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une physiologie cardio-pulmonaire semblable à l’homme et des poumons du même ordre de grandeur.
Suivi de l’abondance du rat brun (Rattus norvegicus) dans l’Eurométropole de Strasbourg et évaluation du risque zoonotique
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2120 rats bruns vont être utilisés, dont environ 2000 relâchés et 120 tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est piégé pendant moins de dix heures puis manipulé sous sédation, l'échantillon tué servant à évaluer l'état sanitaire et le risque de maladies transmissibles à l'humain. Le porteur présente le rat brun comme l'espèce invasive causant le plus de dommages à l'humain et vise à orienter la gestion urbaine de ces populations. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer l'espèce par un modèle mathématique ou in vitro.
Objectifs
Le rat brun est aujourd’hui considéré comme l’espèce invasive causant le plus de dommages à l’espèce humaine. En effet, le rat peut être le réservoir et le vecteur de maladies zoonotiques, c’est-à-dire transmissibles à l’humain, dont certaines sont mortelles. Les pathogènes transmissibles à l’humain sont des bactéries (Leptospira interrogans, Yersina pestis, Rickettsia typhi, Bartonella elizabethae, Streptobacillus moniliformis, Salmonella enteritidis, etc.), des virus (hantavirus, arénavirus, cow-pox, etc.), des parasites (Angiostrongylus cantonensis, Capillaria hepatica, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, etc.) et la teigne (Trichophyton mentagrophytes). De plus, le rat brun dégrade l’habitat et les ressources alimentaires de l’humain, ce qui engendre un coût économique significatif. En conséquence, cette espèce fait l’objet de plans de destruction dans plusieurs métropoles. Or la plupart des études souligne l’inefficacité des campagnes d’éradication qui entraînent la concentration des rats sur certains sites, favorisant ainsi même la propagation des pathogènes et accroissant le risque pour l’humain. Une meilleure connaissance de la biologie et de l’écologie de ces animaux en fonction de l’habitat urbain et des usages des citadins, devrait permettre d’améliorer le succès de ces mesures, voire de s’en affranchir en proposant des solutions de cohabitation sans risque pour la santé humaine ni conséquences économiques. Dans cet objectif, notre projet propose d’estimer le niveau de populations de rat brun au sein de l’Eurométropole de Strasbourg, d’évaluer l’état sanitaire des animaux et de mesurer s’il existe un risque zoonotique.
Bénéfices attendus
Les objectifs de notre étude sont 1/ de connaître l’état des populations de rats à Strasbourg et 2/ le risque zoonotique qu’elles représentent, afin 3/ de fournir des mesures de préconisations aux gestionnaires et citadins en matière de gestion de l’espèce et de son environnement. Nous escomptons donc des effets positifs de notre étude sur l’environnement en réduisant la présence de l’espèce à Strasbourg par une amélioration des usages, et par conséquent sur les activités économiques, de loisir, et la santé animale et humaine. Un autre objectif est bien sûr scientifique au travers de la valorisation des résultats obtenus dans des journaux scientifiques et conférences, notamment au sein de la Zone Atelier Environnementale Urbaine de Strasbourg et en lien avec les mots clés de la section 52 du CNRS à laquelle appartient le porteur du projet.
Procédures
Les animaux seront capturés ce qui va induire un stress, puis anesthésiés par injection sous-cutanée. Ils ne subiront pas d'intervention à l'état vigile et aucune procédure chirurgicale. La durée de capture est inférieure à 10 heures dans un piège. La durée de la manipulation de l'animal vigile est inférieure à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable sur les animaux est un stress lié à la capture et à l'injection de l'anesthésique. Les animaux seront manipulés sous sédation.
Devenir
Les animaux seront relâchés dans leur habitat. Un échantillon de la population sera euthanasié (60 à 120 rats).
Remplacement
L'étude porte sur l'abondance de rattus norvegicus en ville et le risque zoonotique lié à cette espèce, il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ni par des modèles mathématiques ou in vitro.
Réduction
La souffrance infligée aux animaux sera réduite au maximum : - grâce à des contrôles fréquents des pièges (plusieurs fois par jour), afin de limiter le temps de captivité - en réalisant toutes les manipulations sous anesthésie
Raffinement
Les animaux auront de la nourriture hydratée à disposition dans les pièges. Le temps de captivité sera réduit au maximum. Ils seront relâchés immédiatement après les mesures à leur point de capture.
Choix des espèces
Il s'agit d'étudier l'abondance de cette espèce à Strasbourg au regard de sa pullulation récente et du risque zoonotique qu'elle représente. Au stade adulte uniquement, pour avoir un état sanitaire complet des populations adultes
Etude de la conséquence d’un défaut d’une protéine des jonctions serrées sur la formation de l’émail chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une chirurgie de trente minutes pour implanter des germes dentaires sous la capsule rénale de souris receveuses, les donneurs étant des souriceaux nouveau-nés d'une lignée qui ne survit que quelques heures. Il affirme que seul un modèle animal intégré permet la formation d'une dent, sans méthode de remplacement possible. Il indique par ailleurs qu'un test statistique justifierait douze souris, quand le projet en prévoit quarante-huit.
Objectifs
L'amélogenèse imparfaite constitue un groupe de maladies génétiques rares du développement affectant la structure de l'émail de toutes les dents (temporaires et permanentes). Ces troubles de structure ont un impact important sur l’esthétique et la fonction des dents du patient et affectent de manière importante sa qualité de vie. L’amélogenèse imparfaite peut s’exprimer de façon isolée ou syndromique. Les formes isolées sont principalement liées à des mutations dans les gènes qui codent pour les composants de la matrice extracellulaire de l'émail, ou des protéines impliquées dans la maturation de l'émail, ou encore dans l’attachement cellule-cellule et cellule-matrice. L'amélogenèse imparfaite est aussi fréquemment diagnostiquée chez les patients présentant des troubles génétiques associés aux reins, à la peau et à de nombreux autres organes/systèmes ; on parle alors de formes syndromiques. L’objectif de notre recherche est d’étudier les consquences dune mutation d'un gène codant une protéine clée des jonction intercellulaires, dans l'amélogenèse . Nous disposons au laboratoire de la lignée de souris invalidée pour ce gène. Ce modèle, déjà bien établi dans la littérature, permet la formation complète d’une dent. Ceci nous permettra d’étudier tous les stades de l’amélogenèse dans un environnement nourricier contrôlé et idéal.
Bénéfices attendus
La mort des souriceaux de la lignée de souris invalidée pour ce gène survenant quelques heures après la naissance empêche l’étude des différents stades de l’amélogenèse (formation de l’émail). Quand bien même la souris serait viable au-delà de quelques heures, elle présenterait, comme chez les patients avec le syndrome, une homéostasie minérale perturbée, ce qui impacterait indirectement la formation de l’émail. Pour évaluer le rôle direct de l’absence de cette protéine sur la formation de l’émail, nous allons implanter les germes dentaires issues des souris de cette lignée invalidée pour le gène dans la capsule rénale de souris sauvages afin d’étudier tous les stades de l’amélogenèse, les germes continuant à se développer après implantation dans le rein. La capsule rénale est en effet un modèle d’implantation bien établi, qui constitue un environnement nourricier contrôlé et idéal. La capsule rénale est un compartiment bien isolé, accessible, richement vascularisé qui permet donc un afflux de nutriments et de minéraux qui va donc favoriser le développement et la minéralisation des germes inclus. Cette étude pionnière apportera des données essentielles sur la compréhension du rôle de ce gène dans l’amélogenèse. Les retombées de cette étude seront à la fois scientifiques mais aussi de manière plus générale apporteront des données nouvelles sur l’amélogenèse et ses dysfonctionnements. Il est à savoir qu’un nombre considérable de patients avec des maladies rares mais aussi des maladies chroniques comme la carie dentaire présentent des perturbations au niveau de l’émail. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’amélogenèse devrait apporter un bénéfice réel à la fois pour la connaissance scientifique et pour la population car cela pourrait ouvrir des pistes vers de nouvelles thérapies à la fois préventives et interventionnelles pour ce type de pathologies.
Procédures
Chirurgie : durée d’environ 30 minutes par animal réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
Notre expérience avec les procédures mises en place pour ce projet a montré qu’il y a peu d’effets indésirables observés moyennant un traitement antidouleur systématique en pré et post chirurgie (Buprénorphine 0.05mg/kg 2X/jour pendant 48h). D’après la littérature, aucun changement de comportement ne devrait être observé et la perte de poids resterait inférieur à 5%.
Devenir
À l'issue de la procédure, les souris sont mises à mort pour collecter des germes formés dans la capsule rénale puis pour différentes types d'analyses.
Remplacement
La formation d’une dent est un processus physiologique complexe qui fait intervenir différents types cellulaires et de nombreux facteurs de croissance qui n’ont pas tous été identifiés. Par conséquent seul un modèle animal intégré permet à l’heure actuelle ce développement et il n’y a pas de méthode alternative de remplacement.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette étude mais de disposer d’un nombre minimal d’animaux pour obtenir la puissance statistique requise, nous utiliserons le test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student. Ces tests permettent de déterminer qu’un nombre de 12 souris sera nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Afin de limiter au maximum la souffrance des animaux, les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les analyses se feront sous anesthésie générale avec une médication antidouleur systématique en pré et également post-opératoire. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la chirurgie et en phase de réveil. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites ont été définis au-delà desquels les animaux seront mis à mort. Les souris seront maintenues dans des cages bénéficiant d’un enrichissement composé d’un igloo rouge et de coton.
Choix des espèces
La souris est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’amélogenèse. Il permet une faisabilité technique et la biologie car l’émail murin est proche de celui de l’homme. Afin de limiter toute réaction immunitaire chez la souris receveuse, nous utiliserons la même souche. Pour les donneurs, seules les souriceaux nouveaux nés seront utilisés puisque les souris invalidées pour le gène ne vivent que quelques heures après la naissance. Pour les receveurs, des souris de 3 mois seront utilisées car à cet âge, leurs reins sont assez développés pour pouvoir réaliser les implantations de germe.
La lactation comme période de reprogrammation du système métabolique et endocrine de la descendance exposée in utero à une hyperglycémie maternelle.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 748 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères subissent une manipulation nutritionnelle, des traites manuelles de lait et des tests de tolérance au glucose, tandis que leur descendance est soumise à des tests comportementaux, des prélèvements sanguins et une chirurgie avec pose d'un cathéter à la jugulaire pouvant durer trois heures. Le porteur indique que les petits sont tués à différents stades, de huit à deux cent soixante jours, pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance.
Objectifs
Le diabète gestationnel (DG), (8% des naissances en France), serait à l’origine du diabète de type 2 (DT2) chez 47% des patients âgés de 10-22 ans. Cette intolérance au glucose, transmise de génération en génération, contribuerait à l’explosion épidémique de la prévalence du DT2 dans le monde. Quelques études récentes montrent que, chez des enfants de 7 ans, exposés à une hyperglycémie maternelle in utero, la durée d’allaitement exclusif est inversement corrélée aux teneurs circulantes en hémoglobine glyquée (marqueur du DT2). Cependant, ces données épidémiologiques, parfois contradictoires, ne prouvent pas que la composition du lait maternel impacte le risque métabolique de la descendance. Nous émettons l’hypothèse que la lactation pourrait avoir un impact sur le devenir métabolique de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie maternelle qui pourrait s’expliquer en partie par des adaptations du métabolisme maternel et de la composition du lait. Nous avons préalablement montré dans des modèles rongeurs de programmation métabolique avec adoptions croisées, que la descendance mâle présentait des changements différents dans leur sensibilité à l’insuline à l’âge adulte selon que la descendance avait été allaitée par des rates maintenues en sous- ou sur-nutrition calorique durant la période périnatale. Ces changements étaient associés à des compositions spécifiques des laits maternels. Ce projet vise donc à caractériser : 1) la composition du lait maternel dans un modèle rongeur d’hyperglycémie maternelle durant la gestation suite à une manipulation nutritionnelle (mimant le DG chez la femme avec un retour post-partum à la glycémie pré-gravide), en lien avec les adaptations métaboliques des 3 organes clés du contrôle hormonal de la lactation que sont le placenta, le pancréas et la glande mammaire, 2) le devenir métabolique (insulino-sensibilité) de la descendance mâle et femelle jeune et adulte en réponse à des compositions de lait de mères DG ou normo-glycémiques (adoptions croisées) ou encore à des supplémentations postnatales en composés bioactifs du lait maternel identifiés dans le lait humain DG. La contribution du DG dans la prévalence des pathologies cardio-vasculaires à l’âge adulte, et neurodéveloppementales pendant l’enfance sera également explorée dans ce projet.
Bénéfices attendus
L’enjeu global de ce projet est d’évaluer l’impact de l’allaitement maternel sur le devenir métabolique de l’enfant soumis in utero à un DG. Le modèle expérimental nutritionnel de DG avec adoptions croisées va permettre d’étudier le rôle de la composition du lait maternel dans la programmation endocrino-métabolique de la descendance. L’objectif in fine est de tester la capacité de composants bioactifs du lait humain à (re)programmer la sensibilité à l’insuline de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie. Cette étude permettrait de prendre en compte ces biomarqueurs dans l’élaboration des formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, dans un contexte de diabète.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation et la lactation, à 4 prélèvements manuels de lait (30 minutes) et/ou 4 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes) selon les lots de rates (procédures expérimentales 1 ou 2). Leur descendance sera soumise à 4 tests de comportement (3 tests avec séquence de 10-15 minutes et 1 test avec une séquence de 1 heure), des prélèvements sanguins, une mesure de masse grasse par ostéodensitométrie (1 heure), 2 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes), une intervention chirurgicale (un clamp euglycémique/hyperinsulinémique avec pose d’un cathéter à la jugulaire et des prélèvements de sang à la veine caudale, durée 180 minutes) sur 260 jours de vie.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang répétés à la queue peuvent occasionner une douleur de classe légère due l'apparition d'une croûte. La cicatrisation qui fait suite à la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire peut être gênante pour l'animal. La traite régulière de lait chez les mères peut engendrer une irritation des mamelles. Le gavage oral peut induire très exceptionnellement une fausse route.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie d'une procédure à l'autre ou sont mis à mort à différents stades de développement (de J8 à J260) afin de prélèver les organes d'intérêt.
Remplacement
Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance en lien avec un diabète gestationnel (DG) et ceci, d’autant plus, que ce projet requiert un modèle d’étude de supplémentation nutritionnelle postnatale avec adoptions croisées pour mieux comprendre l’impact de la fenêtre de lactation sur cette programmation.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction sans compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, nous utiliserons autant que possible le même animal (suivi longitudinal de la glycémie et l’insulinémie). L’effectif retenu de n=8 mâles et 8 femelles par groupe d’adoption représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement une intervention nutritionnelle, prenant en compte le facteur sexe, avec une variabilité interindividuelle importante. Ce projet prévoit donc l’utilisation au maximum de 1332 individus sur une durée de 5 ans avec 372 rates Sprague-Dawley gestantes et allaitantes, 960 petits, mâles et femelles. Selon les résultats obtenus dans la première procédure expérimentale, le nombre de mères gestantes pourra être réduit dans la suivante. De même, si une différence d'effets selon le sexe est observée dans le suivi des descendants, la supplémenation postnatale ne sera mise en œuvre que sur la moitié des effectifs de ratons prévus.
Raffinement
Dans un souci de raffinement les animaux seront hébergés au moins 2 par cage pour le suivi de la descendance DG (sauf pour les périodes de gestation et de lactation des mères, où les mères seront seules avec leur portée après la mise-bas jusqu’au sevrage). Leur milieu de vie sera enrichi avec un tunnel et des frisottis leur permettant de faire leur nid, et de jouer. Aucune souffrance n’est attendue lors des manipulations nutritionnelles prévues : les rates en régime hypercalorique 1 semaine avant la conception et jusqu’à la fin de la gestation (4 semaines) ou jusqu’à la fin de la lactation (7 semaines) ne présentent pas d’obésité. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et manipulés quotidiennement (jeux, manipulations, caresses…) afin de réduire au maximum douleur et détresse et leur assurer un bien-être, en particulier après les chirurgies pour s’assurer de leur parfaite récupération. Les prélèvements de sang seront réalisés avec l’usage d’analgésiques afin de contrôler la douleur et dans des conditions d’asepsie nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Lors des prélèvements de lait, les rates seront anesthésiées et disposées sur un tapis chauffant. Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront anesthésiés après avoir reçu un antalgique qui agira pendant et après l’opération. Jusqu’au réveil et au-delà, les animaux seront surveillés et une grille comportementale pour chaque animal sera complétée avec des points limites à partir desquels les animaux seront pris en charges pour supprimer leur souffrance avec des injections d’antalgiques ou seront mis à mort si cette souffrance est trop importante.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle d’étude de la nutrition périnatale en raison de sa petite taille (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures), et de sa rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Contrairement à l’espèce souris, l’espèce rat (en particulier la souche Sprague Dawley choisie) présente des grandes qualités maternelles, permettant de mener à bien cette stratégie expérimentale avec des adoptions croisées en limitant notamment les risques de cannibalisme et d’abandon lors des adoptions, et limite sa prise de poids sous régime calorique, permettant de s’affranchir du paramètre obésité dans cette étude. Enfin, le volume de lait collecté par rate fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses individuelles de phénotypage du lait maternel de rate contrairement à la souris. Des femelles gestantes âgés de 8 semaines et de souche Sprague Dawley seront commandées. Ces femelles auront été soumises à un régime chow (CTL) ou HFHS, 1 semaine avant l’accouplement, chez le fournisseur d’animaux à qui nous aurons fourni l’aliment. A leur arrivée, les femelles seront en cage individuelle pendant la gestation et la lactation. Les rates utilisées pour les prélèvements de lait seront mises à mort en fin de procédure expérimentale N°1. Dans la procédure expérimentale N°2, 96 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles par mère adoptive, issus de mères biologiques différentes) seront constituées afin d’avoir au final 16 ratons (8 mâles et 8 femelles) par groupe d’adoption et par âge (6 temps). Ces groupes seront suivies durant la lactation (J8, J14), au sevrage à J21), au stade jeune (2 mois) et à long terme (âge adulte, 4 mois, sous régime standard et sous challenge hyper-énergétique durant 20 semaines).
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Evaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux dispositifs innovants pour la thrombectomie chez un modèle porcin d’ischémie cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
12 cochons vont être utilisés dans une procédure unique d'environ quatre heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un modèle d'ischémie cérébrale est provoqué pour évaluer deux dispositifs de thrombectomie destinés à retirer un caillot dans une artère du cerveau, deux dispositifs testés sur le même animal. Le porteur indique qu'aucune nuisance supplémentaire n'est prévue au-delà du stress de la prémédication, puisque la procédure est sans réveil. Il affirme que la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et que seul l'essai in vivo permet de la confirmer.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral ischémique (AVC) est la première cause de handicap et la troisième de décès dans le monde occidental. L’AVC résulte de l'occlusion d'une artère cérébrale par un caillot sanguin appelé thrombus. Le traitement de l'AVC consiste à retirer mécaniquement le thrombus par voie endovasculaire, c'est à dire en passant par les veines et les artères. C'est ce qu'on appelle la thrombectomie mécanique. Pour cette intervention l'opérateur utilise différents outils endovasculaires, et des techniques pour extraire le thrombus de l'artère bouchée. Ce traitement est efficace dans 80 à 90% des cas. Cependant, le temps nécessaire au rétablissement de la circulation sanguine dans l’artère est parfois excessivement long, ce qui influence négativement l'évolution clinique des patients. Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ils sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils habituels et permettront d’améliorer la procédure en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en optimisant le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs, qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro, à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone qui ont démontré leur efficacité mais n’ont pas permis d'évaluer leur sécurité d’utilisation. En effet, ils pourraient engendrer des dommages au niveau de la paroi d’une artère réelle (dissection ou rupture). Par conséquent, l'objectif de notre projet est d’étudier l’impact de l’utilisation de ces dispositifs à visée clinique sur les parois artérielles réelles, étape indispensable pour leur développement futur. Nous envisageons de reproduire des procédures de thrombectomies chez l'animal (sous anesthésie générale) en utilisant les dispositifs en cours d'évaluation et de prélever les vaisseaux pour réaliser une analyse histopathologique des différentes couches de la paroi en accord avec d'autres études animales similaires de références.
Bénéfices attendus
L'expérience proposée est essentielle pour prouver l'efficacité et la sécurité de deux nouveaux dispositifs d’aide à la thrombectomie (action de déboucher une artère) pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC). En effet, les deux dispositifs que nous avons mis au point, associés avec les outils endovasculaires utilisés pour réaliser des thrombectomies standards, ont montré une bonne efficacité et même une amélioration de la procédure. Néanmoins la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et l’efficacité reste à confirmer in vivo. Notre étude comparera directement une procédure nouvelle d’un côté et la procédure standard de l’autre côté sur le même animal. Le gain de connaissances attendu par cette expérience permettra d’envisager une application future chez l’homme. L’apport de ce développement est significatif car le traitement des AVC aigüs représente un nombre important d’interventions dont les résultats cliniques à moyen terme sont directement liés aux aspects techniques de la procédure. Toute amélioration bénéficiera donc à ce domaine de recherche qui est très important en termes de santé publique. L’optimisation de ces dispositifs permettra in-fine d’améliorer le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et par conséquent les résultats cliniques pour les patients.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure expérimentale d'environ 4h00 et classée sans réveil. L’animal restera sous anesthésie générale et tous les prélèvements tissulaires seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure alors qu'ils sont sous anesthésie générale.
Remplacement
Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ces dispositifs sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils couramment utilisés pour la thrombectomie, en particulier les fils guides, les cathéters et les stentrievers. Ces deux dispositifs permettront d’améliorer la procédure de thrombectomie en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en permettant d’optimiser le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone. Bien que tous les tests appropriés aient été réalisés pour évaluer l’efficacité des dispositifs, il est impossible d’estimer, dans un environnement in vitro ou in silico, si les dispositifs provoqueront une lésion de la paroi de l’artère traitée (dissection, rupture de la couche musculaire). Ainsi, la seule alternative restante pour évaluer l’impact sur la paroi artérielle est d’utiliser les dispositifs dans un organisme vivant et d'évaluer ses conséquences.
Réduction
Nous évaluerons sur les animaux l’efficacité des deux dispositifs dans les conditions les plus défavorables (caillots durs) car nous avons déjà évalué in vitro l’efficacité des deux dispositifs dans les cas favorables (caillots mous). Ceci permet de réduire le nombre de tests in vivo. Le nombre d'animaux sélectionné est aussi faible que possible pour évaluer la sécurité des dispositifs comme reporté dans des études similaires. Par conséquent, nous prévoyons 24 gestes de thrombectomie par dispositifs testés ce qui représente un total de 12 cochons répartis en 6 sessions de test. Le fait d’évaluer deux dispositifs sur le même animal réduit le nombre nécessaire.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront prises pour éviter les nuisances pour les animaux. Concernant l'hébergement de ces animaux, les mesures de raffinement seront mise place en amont : période d'acclimatation d'une semaine, hébergement en groupe afin de limiter leur stress. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés profondément, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés pour toute la durée des expériences. L’animal sera placé sous anesthésie générale avant de procéder à l’accès artériel fémoral et durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal pendant les expériences.
Choix des espèces
Le porc convient à ce type d'étude car sa taille, son anatomie vasculaire et le diamètre de ses artères sont proches de celle de l’homme et permettent d’utiliser les mêmes cathéters et dispositifs interventionnels, dans les mêmes conditions de diagnostic et de surveillance (radiologie). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois. A ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions.
Evaluation de l’autotransfusion par le système i-SEP dans un modèle de saignements massifs répétés d’origine cardiaque chez le cochon : comparaison avec un appareil de référence et effet sur le comptage plaquettaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une thoracotomie avec pose d'une canule dans l'oreillette droite du cœur, puis trois cycles de saignement massif et d'autotransfusion sous une anesthésie de dix heures, pour tester un dispositif d'autotransfusion avant une étude clinique. Le porteur décrit un choc hémorragique prolongé qu'il juge incompatible avec le réveil de l'animal. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle grand format proche de l'humain est "indispensable" et "sans méthode alternative".
Objectifs
L’autotransfusion consiste à collecter le sang du patient épanché lors de la chirurgie associé à un anticoagulant, à le traiter pour pouvoir réinfuser une grande partie de la portion cellulaire du sang (globules rouges en premier). Le sang collecté est transféré dans le module de traitement, concentré et épuré des molécules contaminantes (héparine, hémoglobine libre), pour obtenir un concentré de globules rouges et de plaquettes avant transfusion peropératoire. Le projet présenté développe un nouveau dispositif d’autotransfusion basé sur la filtration, autour d’un modèle chirurgical d’hémorragie massive chez le miniporc pour évaluer la sécurité et la performance du dispositif lors de nombreux cycles consécutifs. En particulier, il est indispensable d’étudier les paramètres suivants avant une nouvelle étude clinique : performances de l’aspiration (intégrée dans le dispositif) afin de libérer le champ opératoire du sang écoulé, les vitesses de traitement du sang après de nombreux cycles permettant de rendre rapidement le sang au patient limitant la transfusion homologue, l’effet sur la physiologie du patient de la transfusion de grands volumes de sang traité. Il est particulièrement indispensable d’éprouver cette nouvelle technologie par filtration lors de nombreux cycle en conditions chirurgicales pour vérifier la durabilité de la performance de filtration.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de s’assurer d’une utilisation optimale du dispositif d’autotransfusion chez l’humain. En effet, il s’agit de garantir les performances et la sécurité du dispositif dans les cas de multiples cycles consécutifs, et de les comparer avec un dispositif de référence déjà sur le marché. Les hémorrhagies massives sont des cas rares mais particulièrement exigeants. En effet, la perte d’un important volume sanguin peut très rapidement dégrader l’état d’un patient et engager sa vie. Dans ces cas, il est indispensable que les performances du dispositif d’autotransfusion soient maintenues afin de rapidement rendre le sang au patient. De plus, la comparaison avec un dispositif de référence actuellement déjà sur le marché permettra de s’assurer de performances au moins égales ou supérieures du dispositif testé. Il a été montré que le dispositif testé permet de récupérer les globules rouges mais aussi les plaquettes. La récupération des plaquettes est significativement supérieure pour le dispositif testé par rapport au dispositif référence. Les échantillons sanguins prévus au cours des cycles de saignement et pendant le suivi post-opératoire permettront de tester la supériorité du dispositif testé sur la numération plaquettaire de l’animal lors du saignement de 80% du volume sanguin de l’animal.
Procédures
Une injection intra-musuclaire initiale sur animal vigile Sous anesthésie générale, procédure chirurgicale (thoracotomie avec pose d'une canule de prélèvement dans l'oreillette droite du coeur), cycle de saignement massif et d'autotranfusion: Une anesthésie de 10 heures, 4 heures d'instrumentation et procédures chirurgicales incluant les saignements répétés (3 cycles saignement/autotransfusion) Prélèvements sanguins dans un cathéter en place pendant toute la procédure sur animal anesthésié Euthanasie sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
L’objectif du modèle étant d’étudier la performance de la machine et la qualité diu sang retransfusé sur un saignement massif et prolongé dans des conditions extrêmes. Pour se faire, il est nécessaire de mettre en place une réanimation minimale évitant le développement d’une coagulopathie dilutionnelle et sans transfusion de plasma ni de concentré plaquettaire pour ne pas modifier les caractéristiques du sang auto-transfusé. Pour ces raisons, les animaux seront gardés sous anesthésie générale pendant la procédure puis sédation profonde/anesthésie légère pendant l’observation des effets post-transfusionnels avant d’être euthanasié. Ainsi la douleur sera prise en charge et le potentiel état de choc hémorragique sera pris en charge alors que l’animal restera inconscient.
Devenir
Euthanasie En raison de l’induction d’un choc hémorragique prolongé et de la nécessité d’une réanimation minimale (sans transfusion d’alloproduits sanguins de type plaquettes et plasma), il est jugé que ce modèle mis au point pour tester l’appareil dans des conditions extrêmes n’est pas compatible avec le réveil de l’animal.
Remplacement
La stratégie d’évaluation du dispositif développé doit conduire à la démonstration de sa sécurité et de ses performances en vue de l’obtention des autorisations réglementaires pour sa mise sur le marché. Cette stratégie a été discutée avec les autorités réglementaires et notamment l’ANSM. Les évaluations prévues ici consistent à reproduire des situations cliniques extrêmes grâce à un modèle d’hémorrhagie. L’utilisation d’un modèle animal grand format, proche de la situation chirurgicale et conditions d’analyses rencontrées chez l’Homme est indispensable, sans méthode alternative. En effet, l’anticoagulant contenu dans les poches de sang de donneurs utilisé pour les tests in vitro (citrate) est différent de celui utilisé en clinique lors des interventions chirurgicales (héparine). De plus, le sang épanché aspiré lors d’une chirurgie rentre brièvement en contact avec le milieu extravasculaire, ce qui est suffisant pour déclencher la cascade de coagulation ainsi que des méchanismes d’inflammation, dont l’origine est impossible à reproduire in vitro avec du sang anticoagulé au citrate.
Réduction
D’importantes étapes de mise au point in vitro et ex vivo d’échantillons sanguins fournis par EFS et Oniris respectivement ont permis de lever d’importants verrous technologiques et de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. Le nombre d’animaux est fixé au minimum, tout en assurant l’analyse statistique des résultats obtenus et la pertinence clinique du projet. Un calcul statistique de l’effectif nécessaire a été effectué en prévision de l’étude : L’effectif necessaire pour démontrer la supériorité du dispositif test par rapport au dispositif référence pour la numération plaquettaire de l’animal est calculé d’après la formule suivante : n = f(α/2, β) × 2 × σ² / (μ1 − μ2)² où μ1 et μ2 sont les moyennes attendues pour le dispositif testé et le dispositif référence, σ est l’écart-type et f(α, β) = [Φ-1(α) + Φ-1(β)]², avec Φ-1 est la fonction de distribution cumulative d’un écart normal standardisé. Considérant un niveau de signification (alpha) à 5% et une puissance (1- β) de 90%, l’effectif total nécessaire est de 16, c’est-à-dire 8 pour le groupe du dispositif testé et 8 pour le groupe du dispositif référence. Références : Pocock SJ. Clinical Trials: A Practical Approach. Wiley; 1983. Julious SA. Sample sizes for clinical trials with Normal data. Statist. Med. 2004; 23:1921-1986. Sealed Envelope Ltd. 2012. Power calculator for continuous outcome superiority trial. [Online] Available from: https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/
Raffinement
En plus du raffinement des conditions d’hébergement, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données sur la numération plaquettaire, l’évaluation de l’hémostase et la biochimie de l’animal. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. De plus, les études préliminaires in vitro ainsi que la première étude comparative ont permis de raffiner les procédures réalisées et le protocole d’échantillonnage et d’analyse.
Choix des espèces
Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Animaux de grande taille, aspect anatomique proche de l’homme ; paramètres hémato- biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50 kg) ce qui représente un avantage lors des manipulations comparativement au porc charcutier qui peut doubler de poids sur la même période et à âge égal. Animaux adultes
Etude préliminaire du système ocytocine dans le cervelet chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et l'autre en gravité modérée. Chaque souris subit une ou plusieurs chirurgies stéréotaxiques du cerveau de deux à six heures pour l'injection d'un virus, d'un traceur ou une stimulation optogénétique, le réveil s'accompagnant de stress, d'hypothermie et de difficultés à se déplacer et se nourrir dans les premières heures. Les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative satisfaisante et mentionne une collaboration avec des théoriciens développant des modélisations à partir de ses travaux.
Objectifs
Le système ocytocinergique n’a jamais été étudié dans le cervelet. Ce projet pilote vise à établir la présence d’ocytocine et de ses récepteurs dans le cervelet de souris, ainsi qu’à en déterminer l’origine. Il pose les bases d’un projet global, qui décrit et caractérise la physiologie et le rôle du système ocytocinergique cérébelleux dans le fonctionnement cérébral L’ocytocine est une hormone dont la fonction principale, au niveau cérébral, est de contrôler les liens sociaux. Ainsi, on a recherché les voies ocytocinergiques principalement dans les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales, le système de récompense et de gestion des émotions, mais pas dans les régions comme le cervelet. En réalité, les fonctions de l’ocytocine sont plus complexes et les travaux récents indiquent qu’elle aurait plutôt pour rôle d’adapter finement les comportements et réactions physiologiques à l’environnement social. Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système ocytocinergique dans le cervelet de souris. A l’aide de techniques d’immunohistochimie et de traçage des voies neuronales, nous mettrons en évidence et caractérisons la présence de récepteurs à l’ocytocine. Nous testerons également la présence et l’origine de l’ocytocine dans le cervelet de souris adulte
Bénéfices attendus
Des recherches récentes ont étendu les fonctions de l'ocytocine (OXT) et du cervelet bien au-delà de leurs rôles traditionnels attendus. Le neuropeptide OXT est devenu une molécule de grand intérêt en neurosciences en raison de ses effets pro-sociaux et de son potentiel prometteur en tant que nouvelle cible thérapeutique. Les données les plus récentes ont étendu le rôle de l'OXT au-delà de ses effets positifs célèbres. L’OXT régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, tout au long de la vie et chez les deux sexes. Pour donner une cohérence à ces effets génétique multi-caractériel, on peut proposer que l’OXT permet aux individus d'adapter leurs interactions avec leur groupe de manière flexible et dépendante du contexte. Une conséquence de ces travaux est que le système OXT a été largement étudié dans les régions cérébrales des réseaux sociaux et émotionnels ; mais pas dans le cervelet, ce dernier n’étant pas considéré comme faisant partie de ces réseaux. Pourtant, les recherches des quinze dernières années ont révélé le rôle du cervelet ne se limite pas au contrôle moteur. Il contribue aux systèmes cognitifs et émotionnels, ainsi qu'aux comportements addictifs et sociaux. En effet, en raison de sa large connectivité au cortex cérébral, le cervelet pourrait amorcer ou biaiser le traitement cortical des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions contextuellement pertinentes. Cette fonction pourrait expliquer la contribution du cervelet à certains troubles cognitifs et émotionnels (dyslexie, syndrome cérébelleux cognitif-affectif) ainsi qu’à des troubles neurodéveloppementaux (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention). Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système oxyctocinergique dans le cervelet de souris et son rôle. Plusieurs articles indiquent la présence d’ocytocine et de ces récepteurs dans le cervelet humain et de rongeur (rat et souris). Cependant, aucune donnée ne le démontre, et surtout, il n’est pas prouvé que ce système soit fonctionnel. Nous devons donc récolter, via ce projet préliminaire, les preuves qu’un système ocytocinergique fonctionnel existe bel et bien dans le cervelet de souris afin de proposer son étude et sa caractérisation détaillée dans la suite de nos travaux.
Procédures
- 44 Souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 2 et 4h pour une injection de virus rAAV, 22 jours plus tard le même groupe de 22 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique pour la stimulation optogénétique pour une durée totale entre 2 et 4h - 16 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 1et 2h pour une injection de traceur anatomique - 60 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 3 et 6h pour l'enregistrement neuronal après injection d'ocytocine
Impact sur les animaux
-Stress du au réveil de l’animal pendant quelques minutes -Hypothermie du au réveil de l’animal après l’anesthésie -Difficulté pour se déplacer se nourrir et s’abreuver dans les 2 premières heures suivant le reveil
Devenir
Procédure n°1, Injections stéréotaxiques de virus AAV ou d’une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel avec stimulation optogénétique : Les 44 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 2 Injection stéréotaxique d’un traceur neuroanatomique Les 16 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 3 Chirurgie stéréotaxique pour enregistrement neuronal avec injection d’ocytocine (voie intrapéritonéale, Intra cérébrale et élacridar IV) Les 60 souris de la procédure seront mises à mort par surdosage d’anesthésie chimique à la fin de la procédure chirurgicale, ces animaux ne pourront pas être ré utilisés par la suite pour d’autres études, cette procédure fait partie d’une étude préliminaire et les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal), car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu, de ce fait et pour répondre aux nombreuses questions de l'effet de l'oxycitocine par la communautée scientifique des lignées de souris transgénique ont été crées, nous utiliserons l'une d'elle, dont la modification transgénique entraîne la suppression de la séquence flanquée dans les neurones exprimant l'oxytocine. Néanmoins, nous avons une collaboration avec des chercheurs théoriciens qui vont développer des modélisations sur la base de notre travail
Réduction
Ce projet est une étude pilote utilisant un petit nombre d’animaux, les données preliminaires vont nous permetre d’affiner, d’arrêter ou de continuer les études dans le furur pour un projet plus global Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures, chaque fois que possible. Par exemple, les animaux utilisés pour le traçage seront également étudiés par immunohistochimie. Grâce à des rAAV vecteurs simultanés de la ChR2 et de marqueurs fluorescents, les animaux utilisés en procédure N°1 serviront également à des études de traçage avec des techniques d’immnuhistochime Les différentes procédures expérimentales ont été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Nous utiliserons des tests de puissances statistiques paramétriques (Mann-Whitney, Wilcoxon, t-test, ANOVA), avec indices de confiance fixés à 5%. Comme il s'agit d’expériences pilotes, nous ne connaissons pas les paramètres statistiques des populations testées. Nous ne pouvons donc pas déterminer a priori le nombre exact d’animaux nécessaires pour une puissance statistique cible. Nos estimations sont donc basées sur nos connaissances approfondies de la physiologie du cervelet et sur la littérature. Afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux nécessaires, la puissance statistique de nos tests sera évaluée régulièrement. Nous cesserons les expériences dès que les données collectées permettront d’atteindre une puissance de 80% et obtenir un resultat significatif, cela dépendra de l’amplitude, de la fréquence et de la variance des effets testés, ainsi que du nombre d’éléments (n). Afin de réduire n (et donc, le nombre d’animaux), nous utiliserons des méthodes et outils déjà caractérisés, des conditions réduisant au maximum la variabilité des données, et des effets aussi facilement détectables que possible (bonne sensibilité).
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé quotidiennement et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin Dans la mesure du possible les procédures n’auront pas lieu le vendredi ou veille de vacances/ jour férié pour éviter toute défaillance de surveillance, et si besoin une personé qualifier sera désignée pour la surveillance Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant /anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des reseaux et échanges neuronaux et de la mémoire dans le cerveau des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau des rongeurs sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur la physiologie du cervelet de souris, les comportements, l'apprentissage et la mémoire. La souris constitue un modèle animal les plus classiques pour les études en laboratoire, et plus particulièrement chez la souris génétiquement modifiée Du fait de la disponibilité de souches connues. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Par ailleurs, les techniques de génétique, de marquage anatomique et d'immunohistochimie sont rendues possible du fait de la disponibilité de nombreux produits utilisables chez la souris Dans le cadre de ce projet pilote, nous utiliserons de jeunes adultes (40 à 50 jours) en raison de l’abondance des données disponibles sur cette gamme d’âge dans la littérature (tant ocytocine que cervelet) et de la plus grande facilité d’expérimenter à ces âges. Les protocoles d’anesthésie sont plus efficaces et plus sûrs, et les techniques d'électrophysiologie in vivo produisent plus rapidement des données en utilisant des animaux ayant atteint leur taille adulte et de jeune âge. Ceci permettra d’accélérer la collecte des données préliminaires et d’affiner nos stratégies ultérieures pour étudier des animaux plus jeunes
S-nitrosylation des myofilaments cardiaques : conséquences sur l’adaptation du cœur au stress mécanique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
110 rats vont être utilisés, tués à l'issue, la plupart sous anesthésie sans réveil et vingt en gravité modérée. Une partie court sur un tapis roulant motorisé, une autre reçoit un bêta-bloquant pendant vingt-quatre heures, puis les animaux sont tués pour prélever leur cœur et l'étudier en montage isolé perfusé ou en biochimie. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'effet d'un étirement sur la fonction cardiaque et conclut que le recours à l'animal est "indispensable". Il retient le rat au motif que la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l'humain.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle du monoxyde d'azote et de la s-nitrosylation des protéines mitochondriales et myofilamentaires dans la régulation de la réponse du coeur à un stress mécanique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress mécanique. En effet, il est bien connu qu'un stress mécanique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfiques du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jours, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 seront traités avec un Beta-bloquant afin de réduire le stress adrénergique cardiaque au moment de leurs manipulations. Les animaux de la procédure 2 seront soumis à un protocole d'exercice physique sur tapis roulant motorisé.
Impact sur les animaux
Certaines expérimentations necessiteront de faire courir des animaux sur tapis roulant motorisé. Le laboratoire possède une grande expérience de ce type d'expérimentation. Par ailleurs, les animaux sont surveillés tout au long de leur course par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. Certains animaux seront traités avec un beta-bloquant pendant 24h00 avant leur euthanasie. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.
Devenir
A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur. Celui sera utilisé soit dans un protocole de coeur isolé perfusé de Langendorff soit pour réaliser des analyses biochimiques.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer d'un stress d'étirement (stretch) sur la fonction cardiaque et sur la réponse contractile du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations seront réalisées sur des organes ou des cellules isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres (facteurs circulants, conditions de charge cardiaque, fréquence cardiaque) et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (microscopie électronique et biochimie à partir d'un même prélèvement cardiaque).
Raffinement
Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites (pièce jointe).
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications.
Imagerie de l’inflammation par IRM via l’activité des protéases (2/2).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
855 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit une injection d'agent de contraste avant un passage à l'IRM, puis est tuée sans réveil pour prélever ses organes et corréler le signal aux sites inflammatoires, une partie développant au préalable des modèles inflammatoires pulmonaires, rénaux ou pancréatiques. Le porteur affirme que l'examen IRM n'entraîne aucun effet indésirable et que le recours aux animaux vivants est "indispensable" faute de pouvoir simuler la physiologie d'un organe inflammatoire. Il justifie l'espèce par la taille des souris, adaptée à l'antenne IRM existante.
Objectifs
Les inflammations pulmonaires sont responsables de 2,5 millions de morts par an dans le monde. Une détection précoce permettrait de protéger les poumons avant que leur dégradation ne soit irréversible. Dans ce projet il s'agit de détecter une inflammation pulmo-naire à ses débuts avant tout changement anatomique et physiologique visible par les méthodes actuelles. De plus dans les maladies inflammatoires, il a été décrit un syndrome pneumo-renal c’est à dire que si les poumons sont touchés par l'inflammation, le rein le sera aussi ou l'est déjà (mais sans symptôme). En parallèle, le diagnostic des pancréatites chroniques échappent à toutes les méthodes d’imagerie et dont la détection biochimique est peu fiable. Divers facteurs déclenchant les pancréatites sont caractérisées par une activation prématurée des protéases digestives dans le pancréas (en particulier l’élastase pancréatique). La conséquence est une destruction progressive du pancréas et une inflammation chronique pouvant conduire à un cancer de très mauvais pronostic. Le point commun de ces pathologies est l’enzyme élastase. Soit elle provient de la présence de neutrophiles (cellules du système immunitaire) qui libèrent ces enzymes, lors d’un processus appelé dégranulation. Soit elle provient du pancréas. Afin de détecter précocement ces pathologies, l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique de choix du fait de son innocuité. Nous voulons donc développer un agent de contraste (donnant un signal en IRM) qui détecte l'activité de l’élastase. Pour cela, nous développons des agents de contraste (substrats détectables par IRM) capables d’être clivés par l’élastase et dont le produit de la réaction enzymatique pourrait être détectable par IRM via un signal différent de celui du substrat. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de détection de l’activité des élastases afin de mettre au point un diagnostic fiable et précoce de trois modèles d’inflammation (pulmonaires, rénales et pancréatite) qui seront développés chez des souris.
Bénéfices attendus
1- Notre projet devrait permettre de détecter très précocement des maladies inflammatoires : actuellement les pathologies chroniques pulmonaires sont détectées trop tardivement, uniquement lorsque les destructions du tissu pulmonaire sont irréversibles (COPD, mucoviscidose). De plus, notre projet permettra de détecter l’inflammation rénale induite par l’inflammation pulmonaire et ainsi débuter un traitement plus précocement. Finalement, notre projet devrait permettre de détecter les pancréatites chroniques avant qu’elles ne se développent en cancer. 2- Notre projet vise à développer des agents de contraste qui possèdent une forte spécificité de contraste. Ainsi soit le substrat soit le produit de la réaction enzymatique pourront être détectés. Ceci permettra de non seulement détecter où se trouve l’inflammation, mais aussi de quantifier l’activité enzymatique présente et donc le stade inflammatoire. 3- Notre projet vise à détecter toute inflammation protéasique présente dans le corps, afin de développer un outil « universel » de détection
Procédures
La procédure décrite dans ce document sera réalisée sous anesthésie générale. Les animaux recevront une seule injection d’un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Du fait de la haute spécificité des agents de contraste, ceux-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à la présence des nitroxydes. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. L’examen IRM n'entraîne aucun effet indésirable.
Devenir
L'euthanasie des animaux est nécessaire pour extraire les organes et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence des neutrophiles dans les sites inflammatoires et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car il n'existe pas de moyens de simuler l'anatomie et la physiologie complexes d'un organe sain ou inflammatoire en raison d'un nombre de paramètres physiques, physico-chimiques, biochimiques et pharmacologiques trop important pour être modélisé. En effet, nous souhaitons détecter une activité enzymatique, liée à une inflammation. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent soit un système immunitaire complet soit un organe fonctionnel dans lequel une situation pathologique doit être provoquée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées en amont, pour étudier l'effet des agents de contraste sur des cellules en culture. Le nombre d'animaux a été évalué à 15 souris par agent de contraste, afin d'avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques adaptés seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Nous utiliserons une anesthésie gazeuse, un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les sessions IRM. Pour limiter la souffrance des animaux développant les modèles inflammatoires, ils seront euthanasiés dès que l’examen IRM sera terminé, sans réveil préalable. Entre la mise en place des modèles inflammatoires et l’examen IRM, des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si ces points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement imagés sous anesthésie générale puis euthanasiés sans réveil préalable après la session d’imagerie. Les animaux seront surveillés au minimum 1 fois par jour par le zootechnicien et/ou le porteur du projet et/ou l’étudiant en charge des expérimentations (post-doctorant ou doctorant ayant suivi la formation en expérimentation animale).
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car leur taille permet une imagerie IRM sur le système existant où seulement une antenne dédiée à la souris est installée. De plus, de nombreuses pathologies inflammatoires peuvent y être développées. Les souris seront utilisées à 8 semaines donc au stade adulte, car nous visons des pathologies survenant principalement chez l’adulte.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.
EDU PORC Formation pratique à l’anesthésie et à la chirurgie expérimentale sur modèle porcin
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
80 cochons vont être utilisés pour la formation de personnels à l'anesthésie et à la chirurgie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Une moitié, employée aux travaux pratiques d'anesthésie, est réveillée puis réutilisable, l'autre subit des gestes chirurgicaux lourds comme une trachéostomie, une hépatectomie ou une splénectomie et est mise à mort sous anesthésie sans réveil. Un même animal sert à deux ou trois stagiaires. Le porteur affirme que la mise en condition réelle sur grands animaux reste "essentielle" et "fondamentale" pour l'apprentissage.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de proposer des formations pratiques pour les personnels travaillant spécifiquement sur les gros animaux, avec un enseignement des principes de l’anesthésie et de la chirurgie sur le porc comme modèle. Les instruments et équipements utilisés sur les grandes espèces sont en effets différents de ceux utilisés chez les rongeurs et des formations adaptées aux grandes espèces sont nécessaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices apportés par l’utilisation d’animaux en TP sont liés la mise en situation réelle des apprenants pour la gestion de l’anesthésie, démonstrations de l’intérêt de l’oxygénation par exemple pour limiter les effets depresseurs d’une apnée, réanimation, gestes chirurgicaux dans un organisme vascularisé, rapports anatomiques spécifiques. Ceci permet d’apprendre et de mémoriser les bases et réflexes adaptés. Les techniques de chirurgie mini-invasive enseignées sont transposables à d’autres espèces de grande taille. Ce TP permet donc aussi de former les utilisateurs de gros animaux autres que le porc.
Procédures
Des procédures sur animaux anesthésiés sont enseignées sous la supervision de moniteurs qualifiés, dans le cadre de 2 TP (impliquant des animaux différents) : - Un TP anesthésie qui dure 2 à 3 heures, avec les gestes suivants : sédation par injection intramusculaire, pose de catheter sur veine périphérique, perfusion, intubation, monitoring per opératoire, oxygénation et apnée, prise de sang. Les animaux sont ensuite réveillés sous surveillance vétérinaire et réintègrent leur groupe social en animalerie. - Un TP chirurgie qui dure 4 heures durant lesquelles plusieurs gestes chirurgicaux sous anesthésie générale sont enseignés sur un même sujet (afin d’utiliser moins d’animaux) : pose de catheter central sous guidage échographique, trachéostomie, drain thoracique, chirurgie laparoscopique (coelioscopie) et sutures intra-abdominales, laparotomie, hépatectomie, gastrectomie ou splénectomie. A la fin du TP chirurgie, les animaux sont euthanasiés par injection de barbituriques, sans réveil de l’anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les animaux sont utilisés à but d’apprentissage de gestes, sous anesthésie avec analgésie, et avec euthanasie en fin d’intervention pour ceux soumis à des procédures chirurgicales. Les nuisances éventuelles sont liées à des incidents à l’anesthesie (difficultés à l’intubation, hématome lors de la pose de cathéter sur veine périphérique, réveil plus long) ou en cas de geste chirurgical mal maitrisé (saignement, atteinte d’organe vital…).
Devenir
Les animaux inclus dans la première procédure (TP anesthésie) ne subissent pas de dommages, ils sont réveillés et peuvent réintégrer l’animalerie avec leurs congénères. Après un temps de repos et sur avis vétérinaire, ils peuvent être réutilisés dans un autre projet. Les animaux inclus dans la deuxième procédure (TP chirurgie) ne sont pas réveillés, ils sont mis à mort sous anesthésie générale à la fin de l’intervention.
Remplacement
La plupart des apprentissages sont dispensés sans l’utilisation d’animaux vivants, en particulier pour l’initiation aux gestes techniques de base qui peuvent être expliqués sur video et enseignés sur organes isolés ou simulateurs. Tous les efforts sont faits pour remplacer l’animal par d’autres méthodes pédagogiques dès lors qu’elles permettent la même courbe d’apprentissage. La mise en condition réelle reste néanmoins encore essentielle pour l’apprentissage de l’anesthésie (contention, prémédication, pose de voie veineuse, intubation,perfusion, monitoring et réanimation) et de certains gestes de base en chirurgie (gestion per opératoire de l’animal, gestion intra corporelle des mouvements et saignements). La mise en condition sur grands animaux est une aide fondamentale dans l’apprentissage des conditions réelles de travail pour les personnels concernés.
Réduction
Un seul animal est utilisé pour 2 à 3 stagiaires, ils réalisent plusieurs gestes chirurgicaux sur un même sujet (mis à mort en fin de TP), ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire à l’atteinte de nos objectifs pédagogiques.
Raffinement
Les porcs utilisés pour les TP sont hébergés en groupe social dans de larges box, avec des conditions environnementales contrôlées en termes de température et d’hygrométrie. Ils disposent d’un abreuvement à volonté et de jeux à pousser, mâchouiller (balles, étoiles). Ils ont une période d’acclimatation avant d’être anesthésiés : ils sont lavés à l’eau tiède, contrôlés et nourris quotidiennement, ils reçoivent des récompenses pour être familiarisés à la présence humaine et aux manipulations (pesée, prise de température, palpation des toutes les parties du corps…). Toutes les interventions chirurgicales se feront sous anesthésie générale et analgésie, des points-limites ont été établis, en fin de TP chirurgie les animaux anesthésiés profondément ne sont pas réveillés, ils sont mis à mort par injection de barbituriques
Choix des espèces
Le choix de l’espèce porc répond à un besoin de formation spécifique émanant des personnels travaillant sur les grands animaux de laboratoire. L’adaptation des techniques et la réalisation d’interventions sur de grandes espèces (taille des instruments de chirurgie, matériel d’anesthésie…) nécessitent d’entrainer spécifiquement les manipulateurs. Les animaux utilisés en TP sont des porcs charcutiers de 3 à 5 mois, soit de 25 à 50 kg. Ils doivent être assez âgés pour supporter une anesthésie, de taille suffisante pour répondre aux objectifs pédagogiques et démontrer les gestes chirurgicaux dans de bonnes conditions.