Procédures sévères
Transfert de gènes par voie intraveineuse et intracérébrale chez la souris saine : screening des nouveaux vecteurs AAVs optimisés pour la transduction du CNS
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
194 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 104 d'entre elles et sévère pour 90. Elles reçoivent des injections stéréotaxiques dans le cerveau sous anesthésie et des injections intraveineuses de vecteurs AAV, pour comparer des voies d'administration en thérapie génique des maladies neurodégénératives. Le porteur évoque une possible perte de poids et prévoit l'euthanasie des animaux dont l'état ne s'améliore pas. Il affirme que le recours aux souris est "essentiel", aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau.
Objectifs
Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, une préoccupation croissante en santé publique. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouvent la thérapie génique. Les vecteurs adéno-associés (AAV) sont administrés dans le cerveau pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives. La modulation du métabolisme du cholestérol est une cible thérapeutique intéressante. Le bénéfice thérapeutique de la modulation du métabolisme du cholestérol par surexpression d'une enzyme clé du metabolisme du cholesterol cérebrale appelée CYP46A1, a été prouvé dans plusieurs études récentes. En effet, cette approche a été démontrée comme efficace dans les modèles murins de la maladie d’Alzheimer, de Huntington et enfin les Ataxies. Ces preuves de concepts ont été établies par injections intracérébrales de vecteurs AAV (AAV codant pour la protéine agissant sur le metablolisme du cholesterol, comme la proteine CYP46A1). Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. L’objectif de ce projet est donc de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration par voie intraveineuse de vecteurs AAV modifiés de façon à passer la barrière hématoencéphalique, étant ainsi capable d’amener une transduction plus homogène dans le cerveau. Ceci avec le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration intraveineuse de vecteurs AAV codant pour des protéines différentes : CYP46A1, et/ou aussi des gènes rapporteurs comme la GFP et/ou aussi la luciférase. Le but final est de trouver un traitement efficace et de le valider chez la souris, en utilisant un mode d’administration le moins invasif possible, afin de pouvoir l’appliquer chez l’Homme et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives
Procédures
deux procédures : 1. Injections stéréotaxiques sous anesthésie générale (durée 70min), animal endormi, avec une prise en charge analgésique afin d'eviter la douleur, par l'administration d'analgesique avant et après la chirurgie. 2. injections intraveineuses sous anesthésie générale (durée 5min), animal endormi.
Impact sur les animaux
Une perte de poids dû à l'injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% du poids totale), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d'éviter toute toxicité chez la souris. Si ces effets seront observés, des actions seront menées par les expérimentateurs. L’animal sera euthanasié si les actions menées ne permettent pas d'améliorer son état.
Devenir
- Procédure 1 et procédure 2 : mise à mort, Les souris seront euthanasiées 3-8 semaines après les injections de la procedure 1 ou 2 ( le temps d'expression des AAVs etudiés) - pour les differentes etudes biocellulaires et biomoleculaires
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, nous avons déjà utilisé des souris sauvages pour mettre au point des protocoles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Réduction: Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (194) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteurs à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Raffinement: Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et anti-inflammatoire, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes d’AAV modifiées et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un AAV exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire. Les animaux sont identifiés par tatouage après une semaine d’acclimatations.
Étude et manipulation du corépresseur transcriptionnel Sin3A dans les processus de la mémoire à long-terme chez la souris C57BL/6 adulte et âgée
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intracérébrales de virus AAV et de shRNA, puis passent une batterie de tests comportementaux (open-field, labyrinthe en croix surélevé, conditionnement à la peur) avant une perfusion intracardiaque, pour étudier le rôle de la protéine Sin3A dans la mémoire de la souris jeune et âgée. Le porteur reconnaît que les animaux peuvent développer prostration, perte de poids supérieure à 20 % et stress lié au conditionnement par la peur. Les retombées thérapeutiques contre le déclin cognitif lié à l'âge sont annoncées comme une perspective, tandis que le remplacement par des méthodes sans animaux est écarté au motif qu'il ne reproduirait pas la mémoire à l'échelle de l'animal entier.
Objectifs
Comprendre les événements biologiques conduisant à l’apparition des troubles cognitifs est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en neurosciences. Une dérégulation des mécanismes épigénétiques et de l’expression des gènes impliqués dans la mémoire semble être une des causes de déficit cognitif lié à l'âge. Nous faisons l'hypothèse que la protéine Sin3A, un répresseur de l'expression des gènes, joue un rôle majeur dans la cognition et dans ses troubles associés. Nous altérerons l’expression de la protéine Sin3A pour identifier, au niveau cellulaire et moléculaire, les mécanismes impliquées dans le fonctionnement cérébral et les capacités cognitives, ainsi que leurs altérations liées à l'âge. Ce projet a comme objectifs : 1. de créer un nouveau modèle murin pour l'étude du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les processus de mémoire ; 2. de comprendre le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans la mise en place de la mémoire à long-terme chez la souris adulte et âgée ; 3. d'étudier les conséquences d'une inactivation de ce corépresseur transcriptionel SIN3A sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire à long-terme ; 4. de proposer une nouvelle approche pour restaurer un décificit cognitif (apprentissage et mémoire) lié à l'âge. Ce travail éclaircira le rôle des modifications épigénétiques dans la mémorisation à long terme et fournira de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des troubles cognitifs liés à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet examinera et comparera systématiquement les mécanismes comportementaux, anatomiques, électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires des troubles cognitifs associés à l'âge chez la souris. De plus, ce projet fera progresser de façon spectaculaire les connaissances actuelles sur les troubles cognitifs dans le cerveau âgé. Outre sa contribution à la résolution des problèmes économiques et sociaux associés aux troubles cognitifs survenant au cours du vieillissement, ce projet fournira des informations importantes sur le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les fonctions cognitives. Ce point est très important au vu du nombre croissant de publications sur le dysfonctionnement de la mémoire dans le vieillissement. Nous sommes convaincus que les résultats de ce projet seront exploités par une large communauté de neuroscientifiques, de pharmacologues et d'industries pharmaceutiques intéressés par les aspects développementaux du cerveau et de ses troubles. En outre, l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le déficit de mémoire lié à l'âge, fournira de nouvelles perspectives dans la compréhension du déficit cognitif lié au vieillissement.
Procédures
1. Injection intracérébrale d'adenovirus associé (AAV5)-CamK2-mCherry (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 2. Injection intracérébrale de shRNAs (cette procédure concerne les 312 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 3. Injections de 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure moins de 5 secondes par animal). 4. Le test de l'open-field (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 30 min par animal). 5. Le labyrinthe en croix surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 5 min par animal). 6. Conditionnement à la peur surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 6 min par animal). 7. Perfusion intra-cardiaque surélevé (cette procédure concerne 96 animaux du projet et dure environ 20 min par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux de ce projet peuvent développer des signes de souffrance tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% (basée sur des pesées quotidiennes). Des douleurs post-chirurgies et post-injections peuvent également apparaitre. Enfin, les animaux soumis à des tests comportementaux peuvent développer un état de stress notamment ceux qui sont soumis au test de conditionnement par la peur.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 312 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations cellulaires et moléculaires.
Remplacement
De nombreux modèles animaux mimant les pathologies humaines ont été mise au point, grâce auxquels de nouvelles approches fondamentales et thérapeutiques de ces maladies ont été développées. La présence chez la souris de gènes équivalents à ceux de l’homme et la possibilité de manipuler simplement le génome de la souris ont conduit à une multiplication du nombre de modèles murins. Le modèle murin permet de comprendre la fonction d’un gène par la dysfonction en l’invalidant, ou de tester une hypothèse en vérifiant si une mutation observée conduit à la maladie ou s'il s'agit d'un simple polymorphisme du gène. De plus, les rongeurs sont capables de réaliser des apprentissages de différentes natures (simple et complexe) et nous pouvons analyser leur mémoire d’un point de vue comportemental (tests de mémoire), structural (études morphologiques), cellulaire (études des réseaux neuronaux) et moléculaire (études des gènes). Ainsi, l'utilisation d'un modèle animal dans ce projet ne peut être remplacé par des modèles in vitro ou in sillico.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien être en vigueur (4 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Le fond génétique C57BL6/JRj sera utilisé dans ce projet ; il est particulièrement bien adapté pour les analyses comportementales et métaboliques que nous comptons mener. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Les protocoles décrits ci-dessous, relativement classiques, sont aussi bien maitrisés par les personnes impliquées dans ce projet. Des jeunes adultes âgés de 3 mois ainsi que des souris âgées de 16-18 mois seront utilisés dans ce projet afin d’étudier les conséquences d’une inactivation de la protéine SIN3A dans un cerveau mature et vieillissant. L’utilisation de ces deux stades (adulte et âgé) nous permettra également d’étudier cette protéine SIN3A au cours du vieillissement cérébral.
Etude du rôle d’un récepteur au froid (« TRPM8 ») dans l’hypothermie thérapeutique sur un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent deux chirurgies, dont une thoracotomie avec intubation, pour provoquer un infarctus du myocarde et étudier le rôle d'un récepteur au froid dans l'effet de l'hypothermie thérapeutique. Le porteur décrit une couverture analgésique morphinique et un suivi post-opératoire par grille de score. Il affirme devoir prouver l'implication de ce récepteur "sur organisme vivant" après des années d'études in vitro.
Objectifs
L'infarctus du myocarde reste encore aujourd'hui l'une des principales causes de décès dans le monde. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux au cours de l'infarctus ou des stratégies validées de cardioprotection reste donc nécessaire. Plusieurs données de la littérature démontrent en particulier un effet bénéfice de l'hypothermie thérapeutique (HT) dans certains contextes d'ischémie-reperfusion (I/R). Ce bénéfice a notamment été mis en évidence chez un modèle murin d'arrêt cardiaque développé au sein du laboratoire (diminution de la mortalité notamment) Décrypter l’intégration complexe des mécanismes médiés par l’hypothermie dans le contexte de l’I/R est nécessaire pour améliorer rationnellement les protocoles d’hypothermie thérapeutique en clinique. Parmi les récepteurs sensibles aux variations de température, le principal récepteur au froid est le canal appelé « TRPM8 » (Transient receptor potential cation channel subfamily M (melastatin) member 8). L'objectif du projet est de décrypter le rôle de TRPM8 dans l'effet cardioprotecteur de l'hypothermie thérapeutique, dans le cadre de l'ischémie-reperfusion cardiaque. Ce mécanisme offre comme perspective le développement d’agents pharmacologiques régulant l’activité des récepteurs au froid pour potentialiser ou restaurer l’effet protecteur du froid sur les lésions de reperfusion dans le cas d’un syndrome métabolique. A terme, l'objectif sera de développer une stratégie thérapeutique mimant ou améliorant l'effet protecteur de l'hypothermie thérapeutique. En effet, la procédure d'hypothermie thérapeutique est compliquée à mettre en place chez l'Homme et ne peut être initiée que tardivement dans la prise en charge des patients (car réalisable uniquement en structure hospitalière) Le projet impliquera 204 animaux maximum
Bénéfices attendus
En conclusion de ce projet, nous espérons obtenir une température cible pour notre HT. Cette température servira pour nos futurs protocoles liés à l’étude de la HT. Nous devrions observer une diminution de la taille d’infarctus, et/ou une potentielle diminution de la mortalité. Ce projet nous permettra également de valider l’implication du canal TRPM8 dans le bénéfice de la procédure HT. Cette implication nous permettra de travailler sur des substituts pharmacologiques mimant l’effet de la HT, facilitant ainsi la prise en charge thérapeutique des patients (la procédure d'hypothermie thérapeutique est compliquée à mettre en place chez l'Homme et ne peut être initiée que tardivement dans la prise en charge des patients).
Procédures
Les souris seront soumises à deux procédures chirurgicales, d’une durée totale respective de 90min puis 15min (sous anesthésie générale), espacées de 24H.
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale d’ischémie-reperfusion cardiaque (modèle d’infarctus du myocarde), implique une thoracotomie sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée, avec intubation de l’animal. Il s’agit d’une technique maîtrisée au laboratoire depuis plusieurs années. Les soins (analgésie, enrichissement) et le suivi post-opératoires (surveillance post-opératoire, points limites) associés ont ainsi été optimisés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre l’analyse de la taille d’infarctus (prélèvement cardiaque).
Remplacement
Le canal TRPM8 a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années, notamment au laboratoire. Ces études ont permis d’établir le potentiel de TRPM8 comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver l’implication de ce canal dans l’hypothermie thérapeutique suite à un infarctus du myocarde, dans une étude physiologique sur organisme vivant.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats analysables statistiquement. Dans un objectif de réduction, seuls des animaux mâles seront utilisés pour la procédure 1 « pilote ». Le choix de recourir à des animaux C57bl/6J provenant d’un fournisseur (et non de notre élevage) permet ainsi de ne pas faire naître inutilement des animaux (femelle ou génotype inadapté) via notre élevage. Les résultats obtenus dans la procédure 1 (pilote) pour les températures sélectionnées seront directement intégrés à la procédure 2 afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire dans la procédure 2. Afin d’utiliser au mieux les animaux issus de l’élevage des lignées dans la procédure 2 (et éviter la mise à mort d’animaux non utilisables dans le projet), les expériences porteront sur les mâles et les femelles (pour un effectif total de 84 animaux). Ainsi, ce n’est que si un effet genre est observé sur ces premiers résultats, que les effectifs devront être adaptés (doublés) pour conserver une exploitation statistique fiable des résultats en séparant l’effet mesuré sur les mâles et celui mesuré sur les femelles. Le projet impliquera donc au maximum 204 animaux : 48 pour la procédure 1 puis 156 pour la procédure 2.
Raffinement
La chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde (fixe), et couverture analgésique (morphinique et anesthésique local pour les abords) maintenue si besoin jusqu’à la mise à mort de l’animal (morphinique administré toutes les 6-8h selon la fiche d’observation/score). Au réveil, les animaux sont hydratés (300μL de sérum physiologique en sous-cutané) et placés en couveuse chauffées, où ils bénéficient d’eau sous forme gélifiée, et de nourriture de consistance molle, directement dans la litière, en plus du biberon et de la nourriture standard. Des capsules d’eau gélifiée enrichie en glucose et vitamines sont également disponibles si besoin. Un suivi du réveil est assuré à l’aide d’un « scoring » de symptômes, principalement respiratoires, comportementaux et morphologique, établi à deux temps post-opératoires clefs, dans le but d’intervenir de manière rapide et efficace, le cas échéant en concertation avec le chef de projet et/ou le vétérinaire référent.
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, la souche C57Bl/6 est largement utilisée pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet sont sur fond C57bl/6J). De plus, le choix de ce modèle nous permet justement le recours à des modèles génétiquement modifié (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid TRPM8) Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 20 semaines. Des souris plus jeunes ne présentent pas d’intérêt thérapeutique associé. Les souris plus âgées augmentent le risque de décès et de complications post-opératoires.
Rôle des mastocytes MrgprB2 dans la physiologie et physiopathologie intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 140 relevant de la gravité sévère. Elles subissent l'insertion d'une bille de verre dans le côlon, des gavages, des injections de toxine diphtérique et l'induction d'une colite par le DSS, pour étudier le rôle de certains mastocytes dans la motilité intestinale. Le porteur indique que la colite provoque un stress et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des saignements abondants. Il qualifie le modèle murin d'"élément clé et incontournable" pour cette étude.
Objectifs
Des travaux ont récemement montré que l'intéraction entre les mastocytes MRGPRB2 de la peau et les neurones responsables de la douleur, les nocicepteurs, est à l'origine du dévelopemment d'une maladie allergique de la peau, la dermatite atopique . Une cartographie précise et exaustive des différentes niches dans lesquelles résident les mastocytes MRGPRB2 a également permis de mettre en évidence que ces mastocytes MRGPRB2 se retrouvent au niveau des muscles lisses du tube digestif, en contact étroit avec les neurones du plexus myentérique. De plus, il a été montré que ces mastocytes régulent les contractions intestinales ex vivo. Les objectifs du projet seront donc : 1) De déterminer l'impact de ces mastocytes sur le transit intestinal in vivo dans des conditions physiologiques. 2) De déterminer les acteurs cellulaires et moléculaires du dialogue avec le système nerveux entérique et 3) D'étudier la dérégulation de ces intéractions dans le cadre d'inflammations intestinales.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à 1) déterminer le rôle précis des mastocytes MRGPRB2 dans le phénomène de transit intestinal, 2) déterminer les acteurs moléculaires et cellulaires (autres que les mastocytes) impliqués dans la régulation du transit par les mastocytes MRGPRB2, et 3) déterminer si cet axe est impliqué dans le développement de maladies inflammatoires de l'intestin, qui sont souvent caractérisées par des troubles du transit. Sur un plan fondamental, ce projet permettra donc d'identifier un nouveaux rôle de "niche" des mastocytes MRGPRB2 associé au tube digestif en condition physiologique et physiopathologique. Sur un plan translationnel, il permettra d'établir si ces mastocytes MRGPRB2 peuvent représenter des cibles pharmacologiques intéresssantes pour moduler le transit intestinal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune procédure chirurgicale, ni prélèvement sur animal vigile. - Sous anesthésie, certains seront soumis à une injection intraveineuse (envrion 20s par animal) et à l'insertion d'une bille de verre dans le colon (environ 20s par animal) - Certains seront soumis à un gavage intragastrique necessitant une contention de l'animal classique qui sera effectuée par une personne ayant l'habitude de cette expérience (environ 10s par animal). -Certains seront soumis à des injections de toxine diphtériques par voie intraperitonéale qui seront effectuées par une personne ayant l'habitude de cette manipulation (environ 10s par animal). Ce projet regroupe donc 4 interventions différentes qui prendront chacune en moyenne 10 à 20s.
Impact sur les animaux
- Nous avons l'habitude de travailler avec les souris mutantes utilisées (MRGPRB2-cre; IDTR, MRGPRB2-cre; IDTA,Sash,TAC1 déficientes,MRGPRB2 mutantes,MRGPRB2 cre-TPH1 floxed) qui ne présentent pas de défaut de comportement, de déficiences immunitaire profondes ou de létalité à l'état basal. Nous pourrions révéler des défauts de motilité, mais c'est l'objet du présent projet. -L'injection des AAVs ne cause pas d'inflammation chez la souris. -Les protocoles utilisés pour évaluer les temps de transit sont peu invasifs (gavage ou introduction d'une bille de la taille d'un feces dans le colon) et seront conduits par des personnes expérimentées. La manipulation pouvant cependant générer un stress pour les souris, elles seront dès que possible anesthésiées à l'isoflurane pour minimiser leur stress pendant les procédures. -L'induction de l'inflammation par le DSS causera un stress chez l'animal. Celui ci sera cependant suivit quotidiennement pour évaluer son état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage), son poids, ainsi que la consistance de ses féces et la présence de sang dans les selles. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, abscence de toilettage, abscence d'intéractions), ou qu'il présente des saignements abondant dans les selles (nettement visible à l'oeil nu), il sera écarté de l'expérience et sacrifié pour minimiser ses souffrances.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à l'issue de chaque procédure pour analyser les intéractions entre les mastocytes et le système nerveux entérique. Une banque de tissus sera également constituée pour répondre aux questions scientifiques suivantes sans avoir à réutiliser des animaux, et sera mise à dispostion de la communauté scientifique sur demande aux porteurs du projet.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l'effet des mastocytes MRGPRB2 situés dans le muscle le long du tube digestif sur la motilité intestinale en conditions physiologiques et physiopathologiques. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendrent compte de la diversité des intéractions étudiées dans le contexte de ce projet. Devant la complexité de ces phénomènes, due notamment à l’implication de différents organes et types cellulaires, le recours aux modèles animaux est indispensable. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact des mastocytes MRGPRB2 sur la motilité intestinale dans des condtions normales et dans le développement des maladies inflammatoires de l'intestin mimant les maladies humaines. Les expériences qui seront réalisées in vivo ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombres déterminés sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet, pour des tests statistique de type Mann Whitney ou unpaired t-test pour la comparaison de deux moyennes, ou de type two-way ANOVA avec post test de type Bonferoni pour l'analyse de données à deux variables (suivi du poids au cours du temps pour le modèle de colite au DSS par exemple).
Réduction
Réduction du nombre d'animaux: L'expérience des porteurs du projet dans l'analyse de ces divers modèles et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous prévoyons d'utiliser 10 animaux contrôles versus 10 animaux malades . Ce nombre pourra éventuellement varier à la baisse en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. L'utilisation d'AAV nous permettra aussi de travailler sur des souris WT, et d'éviter la mise en place d'élevage de souris transgéniques ce qui réduira le nombre d'animaux produits. La première partie du projet nous permettra également de déterminer le test le plus robuste de transit intestinal dans nos conditions, et nous nous restreindrons à un seul test pour les deux parties suivantes du projet, ce qui diminuera le nombre d'animaux nécessaires. Enfin, le maximum de tissus d’intérêt sera récupéré sur chaque souris et stocké en vue de répondre à d’éventuelles questions scientifiques ultérieures, sans avoir à utiliser de nouvelles souris. De plus, une banque de tissus prélevés sur les différents modèles de souris utilisés au laboratoire sera constituée et mise à disposition de la communauté scientifique, dans le but d'éviter un emploi d'animaux redondant.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (au moins 2 fois par semaine) lors des pathologies, température (par thermomètre sonde rectale, à l'arrivée des souris et durant le développement des pathologies) , signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine ou bien une perte de température corporelle de - 8°C (un critère courant de morbidité utilisé dans plusieurs modèles), les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond C57BL/6 standardisé et bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Uniquement pour la procédure 1 (injection des AAV ), les animaux seront utilisés à 4 semaines, puis laissés au repos 4 autres semaines pour ensuite être utilisés dans les autres modèles expérimentaux entre 8 et 12 semaines.
Impact de l’absence d’une molécule dans la production d’anticorps chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 216 relevant de la gravité sévère. Elles reçoivent des immunisations, des prélèvements sanguins répétés et, pour une partie, une irradiation aux rayons X avant greffe de moelle osseuse, pour étudier une molécule des lymphocytes B producteurs d'anticorps. Le porteur indique qu'aucune analgésie n'est prévue, au motif que les analgésiques créeraient un "biais expérimental" sur le système immunitaire. Il affirme qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire pour reproduire les interactions de la réponse immunitaire.
Objectifs
Suite à une infection ou une vaccination, notre système immunitaire (ligne de défense de notre organisme contre les envahisseurs étrangers ou dangereux) met en place une réponse impliquant différentes cellules qui combattent l’infection et nous protègent contre une future exposition. Parmi ces acteurs cellulaires, les lymphocytes B jouent un rôle central dans cette réponse en reconnaissant les agents infectieux et en produisant des anticorps qui vont se fixer à ces agents et ainsi favoriser leur neutralisation et leur élimination. L’objectif de notre projet est d’étudier de façon précise le rôle d’une molécule particulière exprimée par les lymphocytes B à leur surface et décrite comme ayant un rôle dans la persistance de ces cellules productrices d’anticorps à longue terme.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la biologie des lymphocytes B producteurs d’anticorps. Cette caractérisation fondamentale nous permettra à plus long terme de mieux comprendre les mécanismes de la réponse vaccinale afin de pouvoir l’améliorer chez les individus à risque (patients immunodéprimés ou atteints de cancer, population âgée, nourrissons).
Procédures
Afin de comprendre comment la molécule d’intérêt agit sur la qualité de la réponse immune (production d’anticorps, localisation et prolifération des lymphocytes B, producteurs d’anticorps), nous allons étudier la réponse vaccinale dans un modèle de souris génétiquement modifiées n’exprimant pas cette molécule. Les connaissances actuelles sur ce modèle murin ne montrent pas d’altération de leur bien-être. Toutes les souris seront soumises à un protocole d’immunisation. Cela consistera à injecter dans l’abdomen de souris éveillées une substance qui mimera l’effet d’une infection bactérienne. Cette injection non douloureuse sera soit unique soit répétée une fois à 28 jours d’intervalle. Afin de suivre la production d’anticorps, des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées) seront effectués au maximum cinq fois sur toute la durée (49 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins 4 jours. La prolifération des lymphocytes B sera évaluée en administrant un produit permettant de quantifier ce phénomène (injection dans l’abdomen puis dans l’eau de boisson pendant 6 jours). Afin de déterminer si les défauts observés dans la réponse vaccinale sont dus à une anomalie des lymphocytes B producteurs d’anticorps, nous réaliserons des expériences consistant à créer des souris chimères. Pour cela des souris normales seront irradiées (étape non douloureuse permettant d’éliminer les cellules du système immunitaire réalisée par exposition à des rayonsX) avant de recevoir par injection intra-veineuse (injection sur souris éveillée dans la veine de la queue) des cellules obtenues à partir de la moelle osseuse de nos souris transgéniques. Les cellules injectées permettront de récréer un nouveau système immunitaire. La réponse vaccinale sera alors mesurée grâce à un protocole expérimental similaire à celui déjà décrit (injection intra-péritonéale suivi de prélèvements sanguins). La durée du protocole sera dans ce cas de 10 semaines (6 semaines pour la création des souris chimères et 4 semaines pour le protocole de vaccination). Enfin, nous injecterons par voie intra-veineuse (veine de la queue sur souris éveillée) des lymphocytes B producteurs d'anticorps, exprimant ou non la molécule d'intérêt afin de suivre leur devenir (prélèvement d'une goutte de sang 18, 36 et 48h après l'injection et dans les organes récupérés après l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cas du protocole d’immunisation (injection dans l’abdomen de la souris), la douleur maximale ressentie sera le jour de l’immunisation et ne dépassera pas la douleur induite par la piqure. Dans le cas des procédures impliquant une irradiation des animaux préalablement à l’injection de cellules par voie intra-veineuse, un risque d’infection et de déshydratation pourraient apparaître. Cependant, les conditions d’hébergement des souris ainsi que leur suivi quotidien permettront de prévenir ce risque et d’agir dans un délai très court (compensation de la perte en eau par ajout d’une gelose hydratée notamment).
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Les réponses du système immunitaire sont des processus complexes dépendants de nombreux types de cellules et de l’environnement dans lequel sont ces cellules. Aucune procédure de remplacement permettant d’éviter le recours à l’expérimentation animale n’est connue à ce jour. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude afin de reproduire in vivo toutes les interactions mises en place lors du processus de la réponse immunitaire suite à une infection.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.)
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Chaque semaine nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. L'analgésie des souris n’est pas prévue. En effet, ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour réaliser les expériences de ce projet. Ce modèle animal est pertinent dans notre étude, car il existe un modèle transgénique, n’exprimant pas la molécule dont nous souhaitons étudier le rôle, parfaitement décrit. La molécule murine présente une ressemblance très forte avec celle exprimée chez l’Homme, permettant de transposer facilement les résultats à l’espèce humaine. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes avec un système immunitaire totalement développé et fonctionnel.
Electrochimiothérapie vertébrale: évaluation de la toxicité médullaire sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
14 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, huit d'entre eux étant opérés sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une électrochimiothérapie de la colonne vertébrale d'une durée de trois heures, pour évaluer la toxicité du traitement sur la moelle épinière. Le porteur indique que six animaux sont réveillés après l'intervention et peuvent alors développer des lésions neurologiques, comme un déficit moteur des membres postérieurs. Il affirme qu'aucune méthode alternative, simulation ou modèle numérique, ne permet de modéliser cette toxicité.
Objectifs
Les patients souffrants de métastases osseuses vertébrales sont à risque de développer une compression médullaire lorsque les cellules tumorales envahissent le canal rachidien où se trouve la moelle épinière et les nerfs. On parle alors « d’épidurite métastatique ». C’est une complication grave puisqu’elle entraine d’importantes douleurs et un risque de handicap sévère et définitif : la paraplégie. La fréquence des compressions médullaires par épidurite métastatique est estimée à 5% des patients atteints de cancer. Elle est plus particulièrement fréquente chez les patients souffrants de cancer de la prostate, du sein ou du poumon.
Bénéfices attendus
La réalisation d’un traitement d’électrochimiothérapie en utilisant une chimiothérapie sans toxicité neurologique, telle que la bléomycine, permet d’espérer une destruction sélective des cellules tumorales sans séquelle neurologique. Le but du projet est donc de vérifier l’innocuité de l’électrochimiothérapie sur la moelle épinière en utilisant un modèle porcin. En l’absence de toxicité, ce traitement pourra être envisagé chez des patients souffrants d’épidurite métastatique pour évaluer l’efficacité anti-tumorale.
Procédures
L’ensemble des traitement d’électrochimiothérapie sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Deux animaux seront utilisés en phase préliminaire pour valider la faisabilité de l'étude et 12 autres pour le projet à proprement parlé. Si les résultats des deux animaux préliminaires le permettent, ceux-ci seront inclus dans le groupe expérimentation (groupe 1 - N=6). Les animaux du groupe test et du groupe 1 (procédures aigus) seront sous anesthésie générale pendant la durée de la procédure (3 heures) avant d'être euthanasiés. Les animaux du groupe 2 (N=6) subiront la même procédure que ceux du groupe 1 mais seront réveillés et euthanasiés à J+3 (N=3) et J+28 (N=3).
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Pour le groupe 3 (n=6) les animaux seront réveillés après le traitement d'électrochimiothérapie. Le risque, qui aura théoriquement été préalablement écarté lors des procédures du groupe 2 est l'apparition, après le réveil, de lésions neurologiques (déficit moteur des membres inférieurs ou sphincterien).
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de pouvoir réaliser l'étude anatomopatholgique des segments de moelles exposés à l’électrochimiothérapie.
Remplacement
Notre projet prévoit d’utiliser un modèle animal porcin car il n’existe actuellement pas de méthodes alternatives (simulation sur mannequin haute-fidélité́, simulation numérique) permettant de modéliser les éventuelles toxicités de l’électrochimiothérapie sur la moelle épinière : courant électrique et chimiothérapie.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire, chaque animal sera son propre témoin.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale balancée. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Les animaux du groupe 3 (N=6) seront évalués cliniquement, après leur reveil, à la recherche de signe de lésion neurologique (déficit moteur des membres inférieurs ou sphincterien) ou de tout autre signe de souffrance. Cette évaluation aura lieu deux fois par jours de J0 à J3 selon la grille d'évaluation (Annexe 1-2). Une attention particulière sera portée sur l'éventuelle altérration du comportement général (recherche de signe de passivité ou d'apathie) et de la locomotion (réticence à se déplacer, trouble de l'équilibre, paralysie...). L’atteinte d’un point limite est déterminée par un score basé sur des signes comportementaux, d’apparence générale permettant de quantifier la souffrance de l’animal (Annexe 1-2). En cas de doutes ou de constat d’un mal-être, l’information sera remontée au responsable du bien-être animal qui fera une contre-expertise du score. Selon le score obtenu, le responsable du bien-être animal prescrira des examens systématiques qui seront fait sous sédation et préviendra le vétérinaire désigné de la situation. La prise en charge de l’origine de la douleur devra entrainer la baisse du score. En cas de détérioration du score, le responsable du bien-être animal contactera le vétérinaire désigné pour effectuer des examens plus approfondis et définir la conduite à tenir. Pour améliorer le confort et le bien-être des animaux, les animaux seront hébergés en zone de réveil après l'intervention afin de s'assurer de leur parfaite récupération puis dès que cela sera possible, ils réintègreront la zone d'hébergement avec leurs congénères afin de réduire leur stress, à raison de deux par box. Du personnel animalier mettra quotidiennement à disposition un environnement stimulant (activité́ de fouissage, distributeur d’aliments, planche à gratter).
Choix des espèces
Le porc est l’animal le plus approprié pour notre étude à la fois du fait des caractéristiques physiologiques proches de l’homme, mais également en raison de son anatomie et la taille de ses vertèbre et de sa moelle épinière qui se prêtent aisément à la mise en place des aiguilles d’électrochimiothérapie.
Effets de différentes souches probiotiques productrices d’un métabolite d’intérêt sur l’hypersensibilité viscérale liée au stress chez le rat : approfondissement des mécanismes d’action mis en jeu.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 720 relevant de la gravité sévère. Des rates Wistar subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes, une distension colorectale douloureuse sous contention de 45 minutes et un stress d'immobilisation de deux heures, pour tester cinq souches probiotiques contre la douleur du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'un saignement anal peut survenir pendant la distension, auquel cas la procédure est arrêtée. Il affirme que la complexité du syndrome ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à évaluer l’efficacité de 5 souches probiotiques pour le traitement et/ou la prévention du syndrome de l’intestin irritable (SII). Nous évaluerons ainsi les effets d’un traitement de 5 ou 10 jours avec ces souches productrices d’un métabolite d’intérêt sur la douleur viscérale en condition de stress chez le rat et déterminerons la persistance de l’effet antidouleur de ces souches après un arrêt du traitement (période de « wash out ») de durée variable selon les souches testées. Nous comparerons les effets des souches à une souche non productrice ainsi qu’à un mutant de chacune de ces souches ne produisant plus le métabolite afin de démontrer l’importance de celui-ci et de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la modulation de la douleur. De manière complémentaire, l’effet de l’ensemble de ces souches sera évalué après un seul jour de traitement. Outre l’évaluation de la sensibilité viscérale chez les animaux traités, des prélèvements seront effectués 5 jours ou 10 jours après gavage des animaux en conditions basales ou de stress aigu et avec ou non période de « wash out », afin d’identifier les molécules potentiellement actives et ainsi décrypter les mécanismes d’action mis en jeu
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la durée de traitement nécessaire et suffisante ainsi que la persistance de l’effet antidouleur après arrêt du traitement des souches d’intérêt, apportant de nouvelles réponses sur les mécanismes impliqués dans les effets observés. A terme, ces explorations permettront de proposer de nouvelles pistes de traitement des symptômes douloureux des patients SII associés à un profil anxieux et/ou stressé développant des manifestations digestives douloureuses.
Procédures
Tous les animaux de ce projet reçoivent un traitement par gavage. Les animaux pour l’évaluation de la sensibilité viscérale sont soumis à une procédure chirurgicale durant 20 min sous anesthésie générale (implantation d’électrodes intramusculaires). Après une période de convalescence et de repos puis de traitement, les crampes abdominales vont être enregistrées pendant une phase de distension colorectale durant 20 minutes. Cet enregistrement se fait en condition basale puis le lendemain en condition de stress aigu (maintien des pattes avant le long du corps de l’animal pendant 2 heures). Pendant les phases d’enregistrement, les animaux sont placés dans des tunnels de contention (45 min ). Pour l’étude de l’effet « wash out », une période de repos/ arrêt du traitement est appliquée. Puis un deuxième enregistrement de crampes abdominales pendant la distension colorectale avant et après un stress aigu est réalisé. Pour l’étude des mécanismes d’action mis en jeu dans les effets anti-douleur des souches testées, une prise de sang est réalisée à la queue au milieu du traitement. Un stress de contrainte est réalisé à la fin du traitement et après la période de « wash out ». Les animaux sont ensuite anesthésiés et euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
La douleur liée au gavage est évitée en utilisant une sonde à bout arrondi adaptée à la taille de l’animal et en réalisant un geste rapide et bien maitrisé. Pour la mesure de viscérosensibilité, les douleurs liées à la chirurgie sont prises en charge (analgésie pré et post-opératoire /anesthésie). La déshydratation et l’hypothermie sont prévenue par une injection post opératoire de sérum physiologique à chaque animal et par un maintien au chaud pendant les phases chirurgicales, de réveil et de convalescence. Le stress lié à la manipulation des animaux est évité en prévoyant de phases d’habituation aux différentes manipulations et de repos. La douleur ressentie pendant les phases d’enregistrement des crampes abdominales (indice de douleur) due à la distension colorectale est progressive et dure 20 minutes. La douleur n’est plus ressentie après l’arrêt de la procédure car les enregistrements reviennent à un niveau équivalent à celui de départ. Il n’y a pas de dommages observés sur les animaux mais un effet indésirable possible pendant ou après la distension est un saignement au niveau anal. Dans ce cas la procédure est arrêtée immédiatement.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. La procédure 1 étant une procédure sévère, les animaux ne peuvent pas être gardés en vie à la fin de la procédure ou participer à une autre étude. Les animaux de la procédure 2 sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements
Remplacement
L’utilisation du modèle rat se justifie par le nombre important d’études bibliographiques et d’outils méthodologiques utilisant ce modèle pour étudier la pathologie du SII qui de par sa complexité ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre de souches bactériennes sélectionnées (5) a été fixé suite aux essais de criblage réalisés par les partenaires du projet sur un panel de 152 souches vis-à-vis de leur capacité de production de la molécule d’intérêt in vitro. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur les études précédentes utilisant le même modèle. Ces effectifs, n=12 pour les études de viscérosensibilité et n=8 pour les prélèvements de sang et d’organes, sont suffisants pour atteindre une validité statistique. La possibilité d’utiliser les mêmes animaux a été étudiée mais n’a pas été retenue. En effet, les deux procédures décrites ici doivent-être menées de façon distincte pour permettre d’obtenir des résultats pertinents et robustes.
Raffinement
Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation, récupération) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (anesthésie/ analgésie, soins post opératoire, détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.
Choix des espèces
Le modèle de stress aigu chez le rat est largement validé par la communauté scientifique pour étudier la physiopathologie du SII. Ce modèle permet de reproduire les caractéristiques décrites chez les patients SII : douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, micro-inflammation intestinale. Les animaux seront des rats Wistar femelles adultes de 200g à 220g. L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer les effets des souches probiotiques sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte.
Etude de la dynamique fonctionnelle du circuit CRF-locus coeruleus dans la résilience au stress chronique de défaite sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 635 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, injection stéréotaxique de virus et implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress chronique de défaite sociale de dix jours provoquant anhédonie, anxiété et apathie, pour étudier la résilience au stress. Le porteur reconnaît que cette gêne "ne peut être soulagée" puisqu'elle est l'objet même de l'étude, et signale des blessures possibles liées aux agressions entre souris. Il affirme que ces troubles psychiatriques ne peuvent être étudiés sans animaux vivants.
Objectifs
La depression touche plus de 350 millions de personnes dans le monde et représente la première cause d'invalidité dans le monde. La depression est precipitee par des evenements stressants. Cependant, certains individus ne developpent pas de profil pathologique apres exposition au stress, une qualite definie comme la resilience. Une région du cerveau appelée « locus coeruleus » a un role majeur dans le circuit de la resilience. Comment ce systeme est controle lors de la reponse au stress reste a definir. Les neurones exprimant l’hormone CRF ont des connexions directes avec le LC et pourraient être impliqués dans cette réponse. Selon leur structure d’origine, ces neurones ont des caractéristiques neurochimiques differentes. L’objectif de ce projet est d’etudier i) la regulation fonctionnelle du locus coeruleus par ces differents sous-circuits CRF et ii) les roles de ceux-ci dans la resilience au stress chronique.
Bénéfices attendus
Environ 30% des patients dépressifs ne répondent pas aux traitements antidépresseurs conventionelle. Ce projet a un interêt majeur puisqu'il permettra d'ameliorer la comprehension de la neurobiologie de depression et de la resilience afin de concevoir de nouvelles approches therapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales (Injection stereotaxique de virus AAV et implantation de fibres optique). Chaque procédure aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune. Les animaux seront également soumis à une protocole de stress chronique de défaite sociale pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée étant donné que l’objectif de ce projet est d’étudier les effets du stress et de la dépression sur le cerveau. Des blessures ou lésions induites par les agressions physique lors de la procédure de stress par défaite sociale chronique peuvent être observées. Les souris CD1 agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront mis à mort par décapitation ou par perfusion intracardique. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardique.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet necessite l’emploi de plusieurs techniques experimentales. Compte tenu de la litterature et de notre experience, nous utiliserons les tests statistiques [t-test, test ANOVA, sur mesures repetees ou non] pour analyser nos donnees. Ces tests necessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativite en fonction des experiences realisees.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance, alors, il sera euthanasié. Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitues a l’experimentateur, au dispositif et a la piece d’experimentation pour eviter un stress supplementaire. Les procedures chirurgicales seront realisees sous anesthesie generale et des protocoles analgesiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont ete etablis pour chaque procedure.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser une batterie de souris Génétiquement modifiées. La souris est donc le modèle le plus adapté étant donné également sa petite taille et sa reproduction rapide. Les études seront réalisées à l’âge adulte (8-12 semaines).
Etude pilote de l’efficacité d’une molécule en suspension sur les souris modèle de progéria G609G
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant la progéria, une maladie de vieillissement accéléré, et reçoivent des injections répétées d'une molécule candidate avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit un phénotype "dommageable", avec décrochage de poids et mortalité prématurée, qu'il ne cherche pas à soulager puisqu'il fait l'objet de l'étude. Il affirme que le modèle cellulaire ne permet pas d'explorer l'organisme entier et présente le passage in vivo comme une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition de signes cliniques assimilables à un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients. Cette pathologie est due à l’accumulation d’une protéine toxique dans le noyau des cellules. La quantité de cette protéine toxique présente chez les patients est directement corrélée avec la sévérité de la maladie. La réduction de la quantité de cette protéine toxique est donc une cible potentielle pour changer le cours de cette pathologie dévastatrice. Dans ce but, nous avons étudié in vitro, sur des cellules issues de patients HGPS, la toxicité ainsi que l’efficacité d’une famille de molécules innovantes ayant pour cibles des protéases cellulaires. Cette étude a permis d’identifier 11 molécules efficaces sur le critère sélectionné, à savoir la réduction significative de l’accumulation de la protéine toxique. La molécule ayant la meilleure efficacité thérapeutique sur le modèle d’étude a été sélectionnée pour poursuivre le développement. Elle a fait l’objet d’un développement de formulation compatible avec une exposition plasmatique satisfaisante et avec la voie d’administration envisagée par injection intrapéritonéale (la voie intraveineuse étant à proscrire chez ces souris ayant un arbre cardio-vasculaire fragilisé, comme chez les patients). Cette formulation a été testée chez la souris à différentes doses, avec une exposition plasmatique proportionnelle à la dose administrée, sans observer de signe clinique. Cette même formulation fait actuellement l’objet d’une étude de toxicité par injections unique ou répétées, à différentes doses, sur des souris du même fond génétique que celles utilisées dans ce projet, afin de déterminer le meilleur régime d’administration. L'étude d’efficacité sera ensuite réalisée en fonction des résultats de l'étude de toxicité, en appliquant le traitement optimal.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine ; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule-candidate. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’Homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.
Procédures
maintien d’une lignée à phénotype sévère, injections intrapéritonéales (2X/semaine, sur une durée de 4 semaines pour l'un des groupes, 10 semaines pour le 2è groupe), mise à mort par perfusion intracardiaque
Impact sur les animaux
Plusieurs inhibiteurs de protéases ont été étudiés chez la souris. Certains effets secondaires observés avec ces molécules seront pris en compte dans l’établissement des points limites (signes gastro-intestinaux non spécifiques, rares troubles neurologiques telles que l’ataxie ou la parésie), en plus des points limites bien connus du modèle murin de Progéria utilisé. Par ailleurs, l’étude de toxicité simple dose et doses multiples en cours nous permettra de mieux définir les organes cibles pour lesquels une toxicité est observée avec la molécule étudiée. Il est important de noter que dans ce but, cette étude de toxicité est menée sur des souris du même fond génétique que les souris utilisées pour cette étude d’efficacité. Enfin, le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.
Devenir
les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse du biomarqueur précoce comporte 7 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement (comparaison de moyennes, test t, bilatéral). Nous avons comme hypothèse une diminution de 40% du niveau de progérine après traitement avec PGL217 par rapport au véhicule, avec un écart type de 30%. Avec un risque de première espèce alpha-0.05 et une puissance de 90%, le nombre d’animaux nécessaires par groupe est n=7 (estimation réalisée avec le logiciel R). Une seconde cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Pour les deux cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gels, facile à ingérer par les souris. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités à partir de l'age de 5 semaines, avant que la pathologie ne se développe. La 1ère cohorte sera traitée jusqu'à l'age de 9 semaines afin d'analyser les biomarqueurs, précoces, la 2ème jusqu'à 15 semaines pour l'étude de l'efficacité tardive.
Effet des anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et anti-RAMP3 dirigés contre les récepteurs de l’adrénomédulline sur la croissance tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des tumeurs humaines leur sont greffées (glioblastome, prostate, rein, poumon) puis traitées par des anticorps monoclonaux, la charge tumorale pouvant atteindre 1 500 mm³ et provoquer nécroses et métastases entraînant la mise à mort. Le porteur revendique un dispositif "ON/OFF" arrêtant les étapes suivantes en cas d'échec, censé réduire les effectifs. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" pour prendre en compte le microenvironnement tumoral que le in vitro ne reproduit pas.
Objectifs
La croissance des tumeurs malignes nécessite un débit sanguin adapté, fourni par des vaisseaux néoformés, permettant l’apport d’éléments nutritifs et d’oxygène nécessaires à cette croissance pathologique. Ce phénomène est le résultat d’actions coordonnées entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement de la tumeur. Parmi les facteurs potentiels, une protéine fortement impliquée notamment dans le phénomène de vascularisation intra-tumorale a été mise en évidence : l’Adrénomédulline (AM). L’implication de l’AM dans le processus tumoral a fait l’objet de nombreux articles de recherche scientifique publiés dans des journaux internationaux. Son rôle a également été valorisé par plusieurs publications sur différents modèles tumoraux in vitro mais également in vivo. L’utilisation d’anticorps polyclonaux anti-système de l'AM, provoque une diminution de la croissance tumorale in vivo sur des modèles de xénogreffes tumorales. Cependant les anticorps polyclonaux ne peuvent être utilisés en thérapie humaine. Ainsi dans cette optique, des anticorps monoclonaux ont été développés. Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité des différents anticorps monoclonaux produits sur différents modèles tumoraux et de les valider comme potentiel outil thérapeutique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de démontrer que les anticorps monoclonaux bloquants anti-récepteurs de l’AM dirigés contre la région extracellulaire peuvent déstabiliser la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires endothéliales et promouvoir une régression tumorale faisant de ces anticorps un outil thérapeutique visant à améliorer le traitement des cancers et permettant de répondre à l’échappement de certains patients aux thérapeutiques actuellement utilisées.
Procédures
3 procédures expérimentales vont être menées: 1/Test d’angiogenèse sur souris C57BL6. Nous aurons différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP2 validés comme efficaces in vitro ; de même 5 groupes pour les 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP3 validés in vitro. Pour chaque groupe, 10 souris seront nécessaires. Nous aurons donc besoin pour une expérimentation de 12 groupesx10 souris soit 120 souris. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons donc besoin de 240 souris C57BL6. Les souris seront mises à mort au 21ème jours. 2/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Suite à l’angiogenèse in vivo, seuls les 3 meilleurs anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et les 3 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés. Il y aura toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif traité avec l'anticorps polyclonal. Pour les modèles du cancer de la prostate, du rein et du poumon, on a 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris par modèle soit pour 3 modèles = 240 souris. Pour le modèle du glioblastome (prise tumorale 100%), on a 8 groupes x 7 souris = 56 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un maximum de 592 souris athymiques. Le temps de traitement sera dépendant de la vitesse de croissance tumorale et du suivi clinique des animaux. 3/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Pour les anticorps monoclonaux, suite aux expériences hétérotopiques, seuls les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP2 et les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés, nous aurons toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif. Pour chaque modèle, on a donc 6 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 60 souris, soit pour l’ensemble des modèles 4x60 = 240 souris. Cette expérience sera dupliquée pour montrer sa reproductibilité ce qui montera le besoin en souris à 480. Le temps de traitement sera dépendant de la perte de poids de l'animal et du suivi clinique, sans modification le temps maximum de traitement sera de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostation, déshydratation, abcès, hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20 % de son poids et la charge tumorale ne devra pas excéder 10% du poids de l'animal ou un volume de 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (2 fois/semaine mais tous les jours si la perte de poids est supérieure ou égale à 10%) et par mesure de la masse tumorale avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique (3 fois/semaine). Si un des critères pré-établis selon la grille d'évaluation de la souffrance ou de détresse mise en place, il sera mis à mort immédiatement. Des phénomène de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître, les animaux seront alors immédiatement mis à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale et du microenvironnement en fonction des traitements appliqués.
Remplacement
Le processus de développement d'une substance originale comme médicament exige, après l'étude in vitro sur des cellules en culture, de valider son utilisation in vivo. En effet préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leur efficacité sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo ainsi parmi les 24 anticorps, seuls les 5 anticorps anti-RAMP2 et les 5 anticorps anti-RAMP3 les plus efficaces ont été retenus pour passer à l'étape in vivo. Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée car elle est indispensable pour prendre en compte le microenvironnement tumoral sachant de nombreuses études publiées au niveau internationnal montre que ce compartiment est un partenaire très actif avec la cellule maligne influançant le processus tumoral, celui-ci n'étant pas pris en compte in vitro. Il est également nécessaire de déterminer s'il existe des effets physiologiques de ces anticorps. Les retours d'expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l'étude clinique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de souris de 1312 cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre d'anticorps à tester. Préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leurs efficacités sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo à 5 anticorps et par conséquent le nombre de lots d'animaux à utiliser. Ainsi une première étude d'angiogénèse sera réalisée avec 5 anticorps anti-RAMP2 et 5 anticorps anti-RAMP3. Si l'expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l'étude sur xénogreffes hétérotopique (étape 2) sera lancée mais avec un maximum de 3 anticorps anti-RAMP2 et 3 anti-RAMP3 à tester. Pour l'étape 3 s'agissant de l'étude sur xénogreffes orthotopiques, seuls les modèles tumoraux positifs à l'étape 2 et un maximum de 2 anticorps ant-RAMP2 et 2 anti-RAMP3 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l'étape 2, l'étude sera arrêtée après les modèles hétérotopiques. Ce nombre de 1312 souris correspond aussi à un nombre de souris n=10 par groupe d'expérimentation sauf pour le modèle hétérotopique du glioblastome où n=7. Ce nombre de 10 souris (ou 7) par groupe d'expérimentation nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable au niveau de la réponse au traitement et de faire face aux problèmes de prises tumorales. Pour analyser les résultats obtenus nous utilisons le test de variance ou de Fischer PLSD, Statview 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées dans des cages de tailles adéquates. Un enrichissement du milieu par igloo teintés en polycarbonate qui réduit le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales sera utilisé. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement) d'air sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquées. Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction du suivi clinique des souris. Au moment de l'injection du Matrigel ou des cellules tumorales, une anesthésie gazeuse sera réalisée. Dans le cas du modèle orthotopique, une anesthésie fixe sera utilisée. Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par application d'une analgésie adaptée. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux et la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique. Si un des critères pré-établis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Pour les tests d’angiogénèse in vivo, nous utiliserons des souris C57BL6, modèle général polyvalent. L’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel, cellules pro-angiogéniques et cellules du système immunitaire. Certes il y a un risque d’immunisation active des souris contre l’anticorps injecté cependant le temps de traitement de maximum 15-20 jours va permettre de limiter au maximum ce biais potentiel. Ce modèle a été validé et publiés dans de nombreux articles internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, la souris athymique nude, laquelle a un système immunitaire déficient, a été choisi afin de pouvoir implanter des cellules cancéreuses (lignées cellulaires humaines établies) permettant la formation de tumeur. Les souris seront âgées de 7-8 semaines afin d'avoir un poids adulte stable. Pour les souris C57BL6, cet âge est également adapté à l’immunocompétence attendue dans le modèle d'étude de l'angiogénèse in vivo.