Procédures sévères

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une lésion chirurgicale de la moelle épinière suivie d'injections sous-cutanées répétées sur huit semaines, avec des animaux dont la vessie doit être vidée plusieurs fois par jour. La moelle épinière est prélevée après la mort pour les analyses histologiques. Il affirme que le tissu ex vivo ne reproduit pas les interactions physiologiques d'une lésion médullaire et que le recours à l'animal vivant est "l'unique façon" de tester l'hypothèse.

Objectifs

Les lésions spinales (SCI) sont parmi les affections les plus invalidantes et répandues dans le monde, avec une incidence de 15 à 52,5 cas par million (soit 12000 nouveaux cas par an aux Etats-Unis d’Amérique et 40000 patients en France), affectant des individus jeunes et en bonne santé (80% sont des hommes âgés entre 15 et 35 ans), avec un impact dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne. En plus des effets sur le système sensori-moteur bien connus et identifiés (paralysie, insensibilité), les sujets SCI présentent une détérioration importante de l’activité de leur système nerveux autonome. D’un point de vue clinique on observe de nombreux symptômes cardiovasculaires (hypotension chronique due à un manque d’activité du système sympathique), thermorégulation dysfonctionnelle (capacité réduite à frissonner quand il fait froid et à transpirer en cas de forte chaleur), dysréflexie autonome (épisodes soudains et brutaux d’hypertension, et de la bradycardie, déclenchés par des stimulinociceptifs). Parmi ces symptômes, les dysfonctions cardiovasculaires contribuent à 40% des décès. Comparé aux nombreuses investigations réalisées sur les problèmes moteurs et sensoriels, peu d’études ont été menées sur les conséquences cardiovasculaires des lésions médullaires. Le but de notre projet de recherche est d’élucider les mécanismes de dysfonction de ces pathologies cardiovasculaires chez l’animal lésé médullaire. Lors d’une lésion spinale, les commandes supraspinales sont déconnectées de leurs cibles et en conséquence ne peuvent plus remplir leur rôle de modulateur de l’activité sympathique altérant ainsi fortement l’expression des ondes de Mayer.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre d'espérer le rétablissement des ondes de Mayer

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales et des injections sous-cutanée répétées (n=72 pendant 8 semaines)

Impact sur les animaux

Les animaux tout comme les humains présentant des lésions de la moelles épinières présentent des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur.

Devenir

Il est primordial de compléter les données physiologiques enregistrées par des données histologiques obtenu en prélevant la meolle épinière des animaux.

Remplacement

Afin de remplacer des animaux des études préliminaires ont été faites sur du tissus ex-vivo de nouveaux nés. Toutefois, si il est possible de screener certaines molécules sur des molles épinières ex-vivo, nous ne pouvons pas reproduire l'ensemble des interférences entre les systèmes physiologiques qui sont impliqués dans une lésion médullaire. Le recours au modèle vivant est donc l'unique façon de tester notre hypothèse.

Réduction

Le raffinement des techniques et soins-opératoires devrait permettre la réduction d'animaux nécessaires en réduisant les risques de mortalité lié à la chirurgie. Nous avons aussi choisi une métode de suivi des animaux sur le long de l'étude (télémétrie) afin d'avoir à éviter l'euthanasie de lots d'animaux à des temps régulier. Sur la base de nos précédentes études, nous savons qu'en post-SCI, la variation de la pression artérielle est faible avec un écartype d'environ 9,5 mmHg (n=14) . Nous pouvons donc estimer qu'avec une différence de 35mmHg (environ 4 écartypes représentant 95% de la population), nous avons une différence significative entre les lots. C'est à partir de ces données que nous avons calculer le n de nos lots dans un but d'obtenir des données exploitables et fiables.

Raffinement

Afin de prevenir tous les problèmes liés à l'absence de rétro-contrôle sympatique, plusieurs points sont raffinées (alimentation semi-liquide pour pallier au ralentissement de la vidange gastrique), ajout de paraffine dans celle-ci (pour pallier au ralentissement de la motricité intestinale), cage sur tapis chauffant (pour pallier aux problèmes de thermorégulation), vidange de la vessie plusieurs fois par jour par des expérimentateurs expérimentés, alimentation et eau au fond de la cage (cage avec un biberon bas et des coupelles d'aliment posées au sol. Le tunnel est en plastique rouge rainuré pour permetre une meilleur mobilité dedans), tapis aggripant au fond de la cage (pour facilité la mobilité). De même, le protocole analgésique a été validé par 2 vétérinaires. Seul un nombre minimum de personne seront amenés à rentrer dans la pièce où se trouveront les animaux afin de s'assurer que les animaux soient manipulés par peu de personne (personnes habituées à leur conditions particulières, pouvant s'adapter aux problématiques éventuelles).

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain.Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et SCI). De plus il existe de nombreux points commun entre le rat etl'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un syndrome inflammatoire généralisé leur est provoqué par injection de TNF-alpha, entraînant une chute rapide de la température corporelle, les souris étant mises à mort au plus tard six heures après l'induction ou dès 33 degrés. Le porteur décrit une longue liste de points limites, hémorragie, détresse respiratoire, convulsions, avant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune donnée in vitro ne suffit à prédire l'efficacité des molécules et que le modèle vivant est requis.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS). Il s’agit d’un syndrome grave lié à une réponse inflammatoire généralisée secondaire à une septicémie, un traumatisme ou un état de choc. Il se caractérise par une hypo ou hyperthermie, une tachycardie, une tachypnée et une hyperleucocytose, et conduit rapidement à la défaillance de plusieurs organes vitaux (foie, cœur, poumons…), à un collapsus cardio-vasculaire, et à la mort du patient. A ce jour, les traitements de ce syndrome sont majoritairement symptomatiques (réanimation, remplissage vasculaire, gestion de l’infection le cas échéant) et de nombreux patients en décèdent. Il est donc critique de développer un modèle animal de ce syndrome afin de tester de nouvelles molécules utilisables en prévention (chez des patients présentant un haut risque de sepsis par exemple) ou en thérapeutique (une fois le syndrome installé).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur le SRIS. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ce syndrome hautement létal pour lequel les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Implantation de transpondeur mesurant la température en sous cutané, sous anesthésie générale (Isoflurane 3-5%) en conditions d’asepsie, réalisée une semaine avant l’induction par le TNFα. Induction de SRIS : - T-15 minutes : éventuellement administration de zVAD-fmk (0.25-0.4mg, IP) - T0 : Administration de TNF-α (5 à 30 µg, IV) Ces administrations s’effectuent si possible uniquement sous contention pour éviter une chute de température due à l’anesthésie. Les animaux seront euthanasiés au plus tard 6h après l’administration de TNF-α. Test de composés chimiques ou biologiques : - Administrations intra-nasales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%), maximum 25µL par narine. - Administrations intratrachéales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%). - Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%) si nécessaire, si possible sous contention. - Administrations PO sous contention Suivi de température 4 à 6 fois au cours de la procédure. Prélèvements : - Sang : o prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale à l’isoflurane (exemple non exhaustif : veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire). o prélèvement par piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention. o prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Ensuite, constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale. - Prélèvements de tissus (foie, cœur, poumons etc…) post mortem. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique, confirmée par une deuxième méthode physique. Le pentobarbital sera évité en cas de prélèvement des poumons du fait de son caractère irritant. - Mise à mort par le CO2, confirmée par une deuxième méthode physique. Cette méthode sera évitée en cas de prélèvement des poumons. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir : prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Nous nous attendons en cas d’induction d’un SRIS à observer une chute de température corporelle intervenant dans un délai très bref après l’administration intraveineuse de TNF-α (avec ou sans zVAD-fmk IP) : moins de 6 heures. L’atteinte de la température corporelle de 33°C constituera un point limite.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur le syndrome d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées, dans la mesure du possible, dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront aussi été sélectionnées, si possible, sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

D’après la littérature, nous avons estimé qu’un nombre minimum de 8-10 animaux adultes par groupe sera nécessaire si une réduction significative de la chute de température et/ou de l’inflammation dans les organes prélevés doit être observée suite à un traitement préventif ou curatif. Ce nombre sera réévalué après les résultats de l’étude pilote. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA.

Raffinement

La température corporelle des animaux sera suivie au moyen de transpondeurs mesurant la température, implantés stérilement en sous cutané, sous anesthésie générale. Ces transpondeurs sont en mesure de détecter précisément des températures comprises entre 33°C et 43°C, et placés au moins 1 semaine avant l’induction du SRIS. Des prises de température seront effectuées (4 à 6 mesures sur la période de 6 heures). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites ci-dessous concernent l’état général de l’animal. - Toute prise de température

Choix des espèces

- L’induction de SRIS par le TNF-α en intraveineuse en association éventuelle avec le zVAD-fmk en intrapéritonéal est bien décrite chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur le syndrome étudié et la dose toxique dans la même espèce. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés pour les procédures d’induction de SRIS, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une septicémie leur est provoquée par injection intrapéritonéale de matière fécale, puis un candidat médicament est testé, avec cinq batteries de tests comportementaux mesurant force musculaire, équilibre, résistance à l'effort, exploration, dépression et mémoire. Le porteur indique une perte de poids et une chute de température attendues, une variation de deux degrés ou de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Il affirme qu'aucun essai sur culture cellulaire ne peut remplacer ce modèle pour évaluer l'efficacité des molécules.

Objectifs

L'objectif scientifique de l'étude est d'évaluer l'amélioration (ou l'absence d'amélioration) des capacités de récupération physiques, mentales et comportementales des souris suite à une septicémie grâce à un traitement pharmaceutique. La septicémie sera induite par injection intra-péritonéale de matière fécale. Nous pourrons également étudier, à différents temps, l'infiltration des cellules (quantification et identification des sous-populations leucocytaires) dans le péritoine après lavage de la cavité. Le sang et d'autres organes seront également prélevés en fonction des demandes du sponsor pour quantifier la synthèse de médiateurs cytokiniques ou lipidiques, telles que les lipoxines ou les résolvines. Le poids, le comportement et les capacités physiques des animaux seront évalués en fonction de la demande du sponsor tout au long de l’étude. Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un composé pharmaceutique à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un médicament à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution en association avec les capacitées physiques, mentales et comportementales des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées sur animaux vigiles pour l'induction de la septicémie (1) et le traitement de celle-ci (1 injection intra-péritonéale à 24h, 48, 72h post-induction et 1 injection sous-cutanée à 24h, 48h, 72h post-induction). Les animaux pourront être soumis selon la demande du sponsor à une procédure de gavage journalière pour l'administration du composé si besoin lors de l'étude principale. L'évaluation physique, mentale et comportementale des animaux sera réalisée à l'aide de 5 procédures de tests comportementaux standardisées selon les recommandations de la plateforme partenaire. Ces tests permettront d'évaluer la récupération physique des souris grâce aux 3 tests comportementaux physiques mesurant respectivement la force musculaire des 4 pattes, l'équilibre des souris et la résistance à l'effort. Et la récupération mentale grâce aux tests cognitifs et comportementaux, mesurant respectivement, entre autre, la capacité d'exploration des souris, la dépression et la mémoire. L'ensemble de la procédure durera 14 semaines, 7 pour l'étude pilote et 7 pour l'étude principale.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont une perte de poids et une baisse de la température corporelle. C'est pourquoi les souris seront surveillées toutes les 2 heures pendant 8h post induction, puis 2 fois par jour les jours suivants. La température corporelle ainsi que le poids des souris seront évalués quotidiennement. Une variation de 2 degrés de la température initiale et de 15% du poids de la souris entrainera la mise à mort des animaux concernés. Durant la septisémie induite par injection de matière fécale, les animaux seront traités 24h, 48h et 72h après injection par un antibiotique injecté en intrapéritonéal et une réhydratation par voie sous cutanée sera réalisée. De plus, on reportera l'aspect général de l'animal sous la forme d’un score prédictif de la douleur.

Devenir

A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier les composés de l'inflammation et de la résolution de l'inflammation présent dans la plasma des animaux.

Remplacement

Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Au sein de cette étude, nous avons réduis le nombre d'animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 15 nécessaire à une étude statistique.

Raffinement

Des soins et une observation accrue aux animaux suite à l'induction des maladies seront apportés, ceux ci comprennent une aide à l'alimentation et à la réhydratation. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé dans le paragraphe 3.4. L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire par l'ajout surnuméraire d'enrichissment.

Choix des espèces

La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences seront réalisées chez la souris C57BL/6 fonction des souhaits des sponsors. Ce modèle a déjà été utilisé dans des publications similaires étudiant la récupération physique et le comportement des animaux suite à une septicémie. Ce modèle répond parfaitement au besoin scientifique du projet qui est d'évaluer l'effet de la molécule du sponsor sur la récupération physique et comportementale des animaux suite à une septicémie. Les animaux utilisés seront adultes (7-12 semaines) car il est nécessaire que leur système de défense immunitaire soit mature. Selon demande du sponsor, nous utiliserons des animaux plus agés (10-14 semaines).

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur nerf sciatique est sectionné puis suturé, avant l'application locale ou l'injection de tacrolimus pour tester la régénération nerveuse, avec un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Le porteur indique que la section du nerf peut entraîner l'automutilation de la patte et que le tacrolimus peut provoquer perte de poids, léthargie et diarrhée, les rats perdant 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut se substituer à ces travaux, les études ex vivo ne reproduisant pas les propriétés d'un "organe entier".

Objectifs

Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt du Tacrolimus (molécule immunosuppressive, avec de potentielles propriétés de régénération des nerfs) sur la régénération des nerfs périphériques après lésion. L'objectif est d'évaluer la réparation du nerf sciatique (après section transversale) chez le rat après suture et (a) application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) injection sous-cutanée d'une solution de Tacrolimus. Cette évaluation sera réalisée pendant une période maximale de 12 mois (période de suivi des animaux après chirurgie), et permettra de mettre en évidence l’intérêt d’une délivrance locale et prolongée du Tacrolimus sur la régénération des nerfs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider au niveau préclinique que la délivrance locale prolongée de Tacrolimus a un effet supérieur à son administration sous-cutanée répétée pour la régénération des nerfs périphériques. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement d’un traitement local pour la régénération des nerfs, dans un modèle rongeur de section et réparation du nerf adapté aux cas cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure : Après anesthésie et analgésie de l'animal, le nerf sciatique sera sectionné puis réparé par suture épineurale. Ensuite, chaque animal recevra soit (a) une application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) une injection sous-cutanée journalière d'une solution de Tacrolimus pendant un mois (injection sous-cutanée ou délivrance du Tacrolimus à l’aide d’une pompe osmotique). La durée de la procédure chirurgicale sera d’environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’automutilation de la patte lésée est un effet indésirable potentiel résultant de la section du nerf sciatique chez le rat. Néanmoins, l’automutilation apparait à court terme (dans un délai de quelques jours après chirurgie) ainsi que potentiellement à 1 mois après chirurgie (en cas d’absence de sensation de la patte, due à une absence de régénération de l’influx nerveux). Par la suite, l’arrêt de l’automutilation permet la bonne cicatrisation de la patte et donc de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude. Aussi, compte tenu de la forte activité du Tacrolimus, les animaux pourraient manifester des signes de perte de poids, malaise, léthargie et/ou perte de poils, typiquement associés à l'administration systémique de Tacrolimus. De plus, les animaux seront surveillés pour tout signe de diarrhée et de déshydratation. Toutefois, le suivi quotidien des animaux ainsi que la complémentation de leur alimentation permettront de prendre toute disposition afin de palier à de tels événements et de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L'absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la SBEA, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la DDPP.

Remplacement

Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité du Tacrolimus pour la régénération du nerf sciatique et permettra son développement optimal pour la clinique

Réduction

Le nombre d’animaux (200) a été rationnalisé au maximum en tenant compte des analyses statistiques qui seront effectuées. Aussi, le nombre d’animaux par groupe (10) a été défini en se basant sur les études faites en interne, pour lesquelles 10 animaux par groupe ont été/sont considérés. Ce nombre tient compte des mutilations engendrés par l’animal lui-même suite à la chirurgie (perte de sensation dans la patte ; effets secondaires documentés pour toute lignée de rats), ainsi que d’une éventuelle mortalité lors de la chirurgie

Raffinement

Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des boules et/ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. À la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systématique sera administré. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20% par rapport au poids maximum mesuré ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 200.

Choix des espèces

L'utilisation d'un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des nerfs périphériques. De plus, la composition de la matrice extracellulaire des humains et rongeurs est très similaire pour plusieurs organes. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l'étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Les animaux seront bagués sur l'oreille dès leur arrivée dans l'animalerie.

26 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimés et porteurs d'une tumeur cérébrale, ils reçoivent une canule implantée dans le cerveau puis des séances de microdialyse, avant une mise à mort au plus tard cinq jours après la pose, pour mettre au point un suivi de l'inflammation autour de la tumeur. Le porteur reconnaît que l'hébergement en cage individuelle et la contention peuvent stresser les animaux, plusieurs points limites déclenchant une mise à mort anticipée. Il présente la microdialyse comme réduisant le nombre d'animaux et affirme que le développement tumoral ne peut être appréhendé qu'in vivo.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. Le traitement de référence consiste, lorsque cela est possible, à retirer chirurgicalement la tumeur, puis à traiter par radiothérapie (traitement par les rayons X) et chimiothérapie. La radiothérapie occupe une place incontestée après la chirurgie. Malgré un traitement bien conduit, de nombreux patients développent une récidive tumorale locale. La Nanomédecine offre de remarquables perspectives de développement et d'innovation en matière de radiothérapie. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nanoparticule innovante (en cours de développement clinique), la compréhension approfondie des effets de ce traitement sur la réponse immunitaire et inflammatoire est une étape cruciale qui permettra de maitriser et potentialiser les effets du traitement. Pour cela, il est important de mettre en place une technique d’approche permettant de suivre en direct les marqueurs participant à la réponse immunitaire et inflammatoire. L’identification des marqueurs de l’inflammation se fait traditionnellement par technique d’immunohistochimie (méthode de localisation de marqueurs dans des coupes de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps) mais cette technique reste invasive puisqu’elle ne se fait que sous une approche « ex vivo » nécessitant la mise à mort de l’animal. Il est donc nécessaire d’utiliser une technique plus pertinente permettant de réduire le nombre d’animaux en effectuant un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation « in vivo » sans avoir à mettre à mort l’animal. a microdialyse intracérébrale constitue une technique adaptée puisqu’elle permet d’assurer un échantillonnage sur animal vivant. Elle nécessite l’introduction dans le cerveau d’une sonde (passant à travers un guide ou canule) contenant une membrane semi-perméable à l’eau et aux petites molécules. L'atout principal associé à cette technique est qu'elle permet la mesure répétée de molécules dnas l'environnement du cerveau et de la tumeur sans nécessité de biopsie.

Bénéfices attendus

La microdialyse est une technique largement employée en clinique, permettant la surveillance du métabolisme cérébral. Elle permet, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le cerveau, d' obtenir des échantillons du liquide prése,t dans le cerveau. La maitrise de cette technique d’échantillonnage permettra de mieux appréhender les mécanismes liés au développement de la tumeur et permettra par la suite de pouvoir caractériser les mécanismes d’action des différentes stratégies thérapeutiques menées au sein du laboratoire, notamment au niveau de la réaction inflammatoire. Dans le cas précis du projet européen, la mise en place de ce modèle permettra à terme d’apporter une compréhension approfondie des effets sur la réponse immunitaire qui constitue une étape cruciale pour maitriser et potentialiser les effets thérapeutique d’une nanoparticule innovante pour le traitement du glioblastome.

Procédures

- Implantation de la canule intra-cérébrale (suite à la réalisation de la procédure 1) : présence d'une canule (guide) qui émerge au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal pour une durée de 5 jours maximum. La chirurgie en elle-même est quant à elle estimée à 1h - Microdialyse intracérébrale (procédure 2) consiste en l'infusion d'un perfusat à travers des tubulures et à travers la sonde dans le but d'én récupérer un dialysat. Cette technique nécessite une équilibration préalable de la sonde antérieure à la récupération du diaysat. Pour la série 1, 5 microdialyses sont prévue de Jn+1 à Jn+5 avec 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats, ce qui correspond à une durée de 5h/jour soit 25h au total. Pour la série 2, 3 microdialyses sont prévues à J11, J13 et J15 avec de la même façon 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats correspondant à une durée de 5h/jour soit 15h au total.

Impact sur les animaux

Implantation de la canule : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 1). Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la canule (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements spéciales (30 cm *30 cm) et système de contention nécessaire à la protection des 2 tubulures (infusion du perfusat et récupération du dialysat)

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure sauf si un des points limites détaillés précédemment est atteint, conduisant alors à la mise à mort de l'animal. Pour réaliser un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation, les animaux sont gardés en vie après chaque séance de micro-dialyse(procédure 2), sauf atteinte d’un des points limites (volume tumoral, dysfonctionnement moteur, modification comportementale, altération de l’état physiologique de l’animal) ou critère de perte de poids décrit comme précédemment. Cependant, comme mentionné précédemment, tous les rats seront mis à mort maximum 5 jours après la pose de la canule suite à la dernière session de micro-dialyse (soit Jn+5) pour a série 1 ou de la même façon à J15 post-implantation tumorale pour la série 2. Une mise à mort plus précoce sera préconisée dans le cas de problèmes techniques liés à la micro-dialyse (interruption de l’infusion, sonde mal positionnée par rapport à la tumeur)

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation des cellules immunitaires, envahissement du tissu cérébral, processus inflammatoires...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules des caisseuw sanguins, tissu cérébral,...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Cependant une expérience préliminaire « in vitro » sera menée pour dans un premier temps estimer les rendements de micro-dialyse ainsi que les temps d’équilibration de la sonde.

Réduction

La technique de micro-dialyse intra-cérébrale est une méthode d’échantillonnage permettant le recueil de molécules produites par l'organisme sans avoir à mettre à mort les animaux pour récupérer l’organe d’étude afin d’en extraire les molécules à doser. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements de dialysats peuvent être réitérés au cours du temps : chaque animal sera donc utilisé à plusieurs temps cinétiques, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la canule (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment de la micro-dialyse, en effet les animaux connectés aux tubulures seront régulièrement observés, d’une part pour vérifier que le prélèvement se déroule correctement mais aussi pour s’assurer que le comportement des animaux n’est pas trop altéré par la contrainte des tubulures. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie (5 min de trajet à pieds), notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie sous gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la nécessité d’obtention de volumes de dialysats suffisamment importants pour les dosages ultérieurs mais aussi par les limitations de résolution offertes par l’imagerie anatomique. Les rats immunodéprimés sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Des rats âgés de 6 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.