Procédures sévères
Mise au point d’un nouveau modèle préclinique mimant la maladie d’Alzheimer chez le rat diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique implantant une pompe qui diffuse des oligomères amyloïdes dans le cerveau, puis des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins, pour créer un modèle croisant maladie d'Alzheimer et diabète. Le porteur indique qu'une perte de poids de plus de 20 % entraîne le retrait de l'animal et son observation avant toute décision de mise à mort. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer ces rats par des systèmes in vitro ou in silico, la valeur du modèle tenant selon lui à un diabète spontané proche de l'humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) et la maladie d’Alzheimer (MA) sont deux pathologies dégénératives, liées à l’âge, et dont la prévalence mondiale suit une progression alarmante à cause du vieillissement de la population. Leur fardeau socio-économique est destiné à s’alourdir surtout en l’absence d’un traitement curatif. De nombreuses études épidémiologiques ont montré que le DT2 est associé à un doublement du risque de développer une démence ou la MA. Réciproquement, l’intolérance au glucose et le DT2 sont fréquents chez les patients atteints de la MA. Néanmoins, malgré les progrès de la recherche dans ce domaine, la relation entre le DT2 et la MA reste encore mal comprise. De ce fait, comprendre les mécanismes moléculaires associant le DT2 et la MA est un enjeu majeur de la recherche, afin d’identifier des cibles thérapeutiques communes permettant de modifier le déclenchement et la progression de ces deux pathologies.Pour élucider le lien entre ces deux maladies, nous allons créer deux modèles précliniques de MA en injectant dans le cerveau du rat Goto-Kakizaki (GK), un modèle spontané du DT2, et du rat Wistar (WT) non diabétique des oligomères du peptide β-amyloïde (Aβ). Nous appellerons ces modèles « GK-Alz » et « WT-Alz ». Pour chacun de ces deux modèles un groupe contrôle, qui ne recevra pas les oligomères , sera rajouté. En effet dans la pathologie humaine, l'une des caractéristiques majeure est l'agréagation des oligomères Aβ pour former des plaques entre les neurones. Nous étudierons si un DT2 préexistant va éventuellement accélérer la formation de ces plaques et aggraver la neurotoxicité des oligomères Aβ grâce à des analyses histologiques et biochimiques sur le cerveau et le pancréas. Réciproquement, nous étudierons si l’induction de la MA va impacter négativement l' homéostasie glucidique de nos modèles animaux, en effectuant des tests métaboliques in vivo . Ce projet nécessitera l'utilisation de 80 rats et sera mené sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en place de la MA, de mettre en évidence les impacts du diabète sur la MA et d'offrir de nouvelles perspectives dans la prévention de son développement . Ce projet nous aidera à étudier la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) .
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirurgicale ,par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Les 80 rats de l'étude seront implantés. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur les 48 animaux restants dans le cadre de tests métaboliques IPGTT et IPITT( à l'âge de 7.5 mois soit 1.5 mois aprés l'implantation des pompes Alzet.) et lors du suivi de la glycémie (entre 6 et 7.5 mois). Chacun de ces tests dure 2h. Pour l'IPGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour IPITT une goutte de sang (5 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps T0 T15 T30 T60 T90 et T120. Entre le test IPITT et IPGTT se déroule une semaine pour la récupération.
Impact sur les animaux
Les animaux sont isolés en cage individuelle suite à l'implantation en sous curtanée d’une minipompe osmotique Alzet® reliée à une canule implantée en ICV. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des IPGTT et ITT est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqure. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre de l'ITT, mais cela est trés rare chez le rat. Les anomalies cérébrales entrainées par le peptide Aβ pourraient induire une intolérance au glucose chez les rats wistar et aggraver le diabète des GK.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de chirurgie, réalisée à l'âge de 6 mois, les 80 rats sont maintenus en vie. A la fin des 2 semaines de perfusion 8 rats de chaque groupes seront mis à mort pour valider le modèle. A l'âge de 7.5 mois les autres animaux( 48 rats) subissent les tests métaboliques, à l'issue desquels ils sont mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) ne peut être réalisée que sur animaux vivants, et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes.
Raffinement
Afin de raffiner toutes les procédures et réduire au mieux l’apparition, d'une éventuelle douleur, d’angoisse et de stress chez les animaux, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Des points limites d’évaluation de la douleur seront déterminés portant sur l'apparence physique( manque de toilettage, poils ebouriffés, dos arrondi) le comportement (modification de la prise alimentaire, prostatration) les modifications de poids. Une perte de poids de plus de 20% entrainera le retrait de l’animal de la procédure et son observation avant toute décision de mise à mort. Le choix du protocole expérimental impliquant les 4 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que du point de vue comportement, le rat est un apprenant rapide et intelligent, et les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète est le rat.
NEUROPEPTIDES : Etude des rôles des neuropeptides URP1 et URP2 au cours du développement larvaire du poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
1 480 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les traitements par balnéation, destinés à faire surproduire deux hormones ou à détruire les neurones qui les fabriquent, provoquent des déformations de la colonne vertébrale, cyphose puis scoliose, le porteur signalant aussi un risque de mortalité lié au metronidazole. Les animaux expérimentaux sont élevés jusqu'à six mois puis tués pour analyse des tissus, tandis que les lignées génétiquement modifiées sont gardées comme reproducteurs jusqu'à deux ans. Le bénéfice avancé, réduire les malformations de la colonne chez les poissons d'élevage, est renvoyé au long terme, et le porteur affirme que la morphogenèse d'un organe complexe "nécessite" un modèle animal.
Objectifs
Notre projet est d’étudier les fonctions de deux hormones peptidiques (nommées URP1 et URP2) dans la mise en place et le maintien de la colonne vertébrale chez les poissons. Ces hormones sont produites par des neurones de la moelle épinière et agissent sur les muscles dorsaux du tronc. Chez le poisson-zèbre, notre modèle d’étude, en l’absence de ces deux hormones ou de leur récepteur, chez des poisons porteurs de mutations des gènes qui les codent, les animaux présentent une malformation de la colonne vertébrale. Ce défaut apparait chez la jeune larve. A ce stade, l’animal présente alors une simple courbure de l’axe avec la queue vers le bas (cyphose). La déformation évolue sensiblement au cours de la vie larvaire. Chez le juvénile, la colonne présente une double courbure en forme de S évoquant une scoliose. Ce phénotype ne semble pas s’aggraver pendant la croissance du juvénile ni plus tard chez l’adulte. En dehors de cette malformation, les animaux grandissent et vivent normalement. L’objectif de notre projet est de déterminer si ces hormones sont nécessaires uniquement chez la larve pour la mise en place de la colonne vertébrale ou si elles sont requises tout au long de la vie pour le maintien de la colonne.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer les fonctions des neuropeptides URP1 et URP2 dans la formation de l’axe vertébrale des poissons. A long terme, ces travaux devraient apporter de nouvelles pistes d’études pour réduire la fréquence des malformations de la colonne chez les poissons d’élevage
Procédures
3 types d’interventions sont utilisées dans ce projet : - 1 : Transgénèse : production d’animaux génétiquement modifiés. - 2 : Traitement par balnéation au tamoxifen 3 nuits consécutives pour induire une surproduction des hormones URP1 ou URP2. - 3 : Traitement par balnéation au metronidazole 3 nuits consécutives au metronidazole (balnéation) pour éliminer spécifiquement une population de neurones produisant les peptides URP1 et URP2 et ainsi supprimer la source de ces hormones.
Impact sur les animaux
La transgénèse est généralement sans effet mais est susceptible d’entrainer des malformations non souhaitées. La surproduction des hormones URP1 ou URP2 (induite par traitement au tamoxifen) et l’ablation des cellules sources d’URP1 et URP2 (induite par traitement au metronidazole) devraient entrainer des déformations de la colonne vertébrale. Le traitement au tamoxifen en lui-même est sans effet. Le traitement au metronidazole pourrait être toxique pour les animaux à la dose utilisée avec un risque de mortalité. Dans ce cas, la dose utilisée serait revue à la baisse.
Devenir
Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs jusqu’à l’âge de 2 ans. Dans le cadre des expériences de surproduction des hormones URP1 ou URP2 ou d’ablation cellulaire, les animaux sont élevés jusqu'à 6 mois (âge adulte) puis sont utilisés pour réaliser des analyses des différents tissus pouvant être affectés.
Remplacement
L’étude dynamique des processus de morphogenèse (croissance et acquisition de la forme des tissus, organes et animaux) est essentielle pour comprendre de nombreuses étapes du développement embryonnaire et larvaire normal et pathologique. La morphogenèse de tissus et d’organes complexes, comme la colonne vertébrale, ne peut être reproduite totalement in vitro et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux.
Réduction
Dans le cadre des traitements au tamoxifen ou au metronidazole, les expériences seront conduites par lots successifs de façon à pouvoir être arrêtées dès que les résultats obtenus seront concluants. Les phénotypes obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées, l'utilisation d'un marqueur de transgénèse permet de sélectionner les embryons porteurs des transgènes d'intérêt sans avoir recours à des biopsies.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire et larvaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Dans le cadre des expériences de surproduction des hormones URP1 ou URP2 ou d’ablation cellulaire, les traitements sont réalisés entre 2 semaines (jeune larve) et 12 semaines (juvénile) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux. Les animaux sont ensuite élevés jusqu'à 6 mois (âge adulte) puis sont utilisés pour réaliser des analyses des différents tissus pouvant être affectés
Evaluation de l’intérêt thérapeutique du surnageant des HuMoSC (cellules humaines suppressives d’origine monocytaire) dans un modèle de sclérodermie systémique induite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq injections hebdomadaires d'un agent chimique, l'HOCl, provoquant une fibrose de la peau et des poumons, ainsi que des injections d'un traitement testé, avant prélèvement du sang, de la peau, des poumons et de la rate. Le porteur décrit des effets possibles de gêne respiratoire et de rigidification cutanée, tout en affirmant n'attendre "aucun signe clinique majeur". Le modèle induit une sclérodermie systémique pour évaluer un candidat thérapeutique.
Objectifs
Les résultats obtenus sur un modèle de fibrose de peau ex vivo montrent qu’en plus de son action anti-inflammatoire, le surnageant de HuMoSC serait efficace dans le traitement de la fibrose. L’objectif de ce projet est de compléter et de confirmer l’intérêt thérapeutique du surnageant de HuMoSC, dans un modèle de fibrose induite par l’injection d’HOCl chez la souris.
Bénéfices attendus
En s’appuyant sur les résultats de nos précédentes études et après avoir identifié la meilleure posologie concernant l’administration du surnageant de HuMoSC, nous pouvons nous attendre à une diminution de l’inflammation ainsi qu’une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire induite par l’HOCl. Aucun traitement curatif n’existe aujourd’hui pour les patients atteints de ScS et la réduction de la fibrose reste un enjeu thérapeutique majeur puisqu’elle représente la principale cause de décès des patients.
Procédures
Les animaux recevront 5 injections d’HOCl en intradermique par semaine durant toute la durée de l’étude, ainsi que 3 injections de surnageant de HuMoSC en sous cutané, par semaine, durant 3 semaines. La fréquence des injections de surnageant de HuMoSC pourra être augmentée jusqu’à 5 fois par semaine, selon les résultats obtenus lors de la première phase de mise au point. L’épaisseur de la peau des souris pourra être mesurée 2 fois par semaine maximum, à l’aide d’un pied à coulisse. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ni aucune procédure chirurgicale ne sont prévus dans cette étude.
Impact sur les animaux
Les éventuels effets indésirables sont les suivants : - Risque de lésions au niveau du site d’injection de l’HOCl - Légère difficulté respiratoire possible dû à la fibrose pulmonaire - Légère fatigue possible en lien avec l’inflammation - Inconfort lié à la rigidification de la peau en bas du dos (localisé) - Stress induit par les injections répétées Aucun effet indésirable n’est décrit dans la littérature, il n’y a donc pas de signe clinique majeur attendu.
Devenir
A l’issue de la procédure, c’est-à-dire au bout des 6 semaines d’expérimentation, les animaux seront sacrifiés. Leur sang, la peau, les poumons ainsi que la rate seront prélevés. La régression de la fibrose sera évaluée en comparant les souris traitées avec du surnageant de HuMoSC et celles avec du sérum physiologique.
Remplacement
Nous avons en amont étudié l’effet du surnageant de HuMoSC sur un modèle in vitro de fibrose. Ces résultats préliminaires sont prometteurs et nous incitent à passer dans un modèle plus complet. De nombreux articles scientifiques ont démontré que les injections d’HOCl permettent de mimer chez la souris ce qu’il se passe chez les patients atteints de ScS. Les modèles in vitro disponibles ne permettent pas de reproduire fidèlement la physiopathologie complexe de cette maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en diminuant au maximum la taille des groupes sans négliger quelques étapes de mise au point pour adapter la meilleure posologie du traitement.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe afin de pouvoir exprimer leur comportement social naturel. Pour leur bien-être les cages comprennent des éléments d’enrichissements (tunnels, nids). Une période d’acclimatation est prévue pour réduire le stress des animaux (arrivée dans les locaux, manipulations régulières…) ainsi qu’un suivi quotidien de l’état général des animaux. La douleur sera anticipée au maximum par l’application d’un gel anesthésiant sur la peau avant les injections. Néanmoins, si l’animal manifeste de la douleur, celle-ci sera immédiatement prise en charge par un traitement médicamenteux.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris BALB/c. Nous utiliserons de jeunes souris femelles adultes, âgées de 6 semaines. Dans ce modèle, les injections d’HOCl permettent d’obtenir des effets similaires (inflammation et fibrose) à ceux que l’on retrouve chez les patients atteints de sclérodermie systémique. Ce modèle est largement documenté dans la littérature
Imagerie spécifique des propriétés de la myéline par IRM de transfert d’aimantation inhomogène quantitatif (qihMT)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 250 en gravité sévère. Ils servent de modèles de démyélinisation, génétiques ou induits par la cuprizone, passent des examens d'IRM, puis leur système nerveux central est prélevé par perfusion intracardiaque de fixateur suivie de décapitation. Le porteur met au point une technique d'IRM censée être spécifique de la myéline, à valider par comparaison histologique. Les retombées cliniques annoncées restent conditionnées à la réussite du projet.
Objectifs
Introduction : La myélinisation des axones est une composante fondamentale du fonctionnement du système nerveux central (SNC), puisque qu’elle assure d’une part l’isolation axonale et permet d’autre part la propagation efficace du signal électrique le long des fibres nerveuses. Ainsi, pouvoir accéder in vivo à l’intégrité de la myéline permettrait une meilleure compréhension du développement du SNC chez le sujet sain, ainsi qu’une meilleure caractérisation des pathologies neurologiques de la substance blanche (e.g. Sclérose en Plaques). Aucune technique IRM actuelle n’est réellement spécifique de la myéline et plusieurs facteurs confondants limitent ou empêchent les diagnostics précis. Les techniques basées sur le transfert d’aimantation offrent pourtant des potentialités très intéressantes. Récemment, nous avons développé une nouvelle technique dérivée du transfert d’aimantation, le transfert d’aimantation inhomogène (ihMT), dont la sélectivité du signal pour la myéline s'avère remarquable. Les objectifs majeurs de ce projet sont de développer une technique ihMT quantitative (qihMT) et de valider ses métriques quantitatives comme marqueurs spécifiques des différentes propriétés de la myéline (organisation, composition, structure, dynamique) dans des modèles pathologiques (e.g. modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle de démyélinisation cuprizone, modèles de dysmyélinisation) et dans le suivi de la maturation cérébrale.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet aura pour vocation de fournir un outil non-invasif quantitatif dont les métriques seront spécifiques des différentes propriétés de la myéline (structure, composition, fonction). Cet outil permettra un diagnostic in vivo plus précis ainsi qu’une levée des limitations des techniques actuelles. De plus, grâce à la transversalité de l’IRM, le protocole validé sur petit animal pourra être appliqué à l’homme sur la base des résultats obtenus en préclinique.
Procédures
A la fin des analyses IRM, le système nerveux central des animaux controles/modèles (nombre total de 440) sera être prélevé pour analyses histologiques par des techniques de référence d'imagerie de la myéline afin de valider les données qihMT. Le système nerveux central des animaux sera prélevé selon le protocole de perfusion intracardiaque suivant (durée 30 minutes): Administration analgésique Buprénorphine (buprecare, 0.3mg/ml) à la dose de 0.1mg/kg. La buprénorphine aura été préalablement dilué (X20) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 160 microlitre. Injection d’euthasol en ip à la dose de 140mg/kg. L’euthasol aura été préalablement dilué (X40) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 350 microl (seringue de 0,3 ou 0,5 ml, aiguille de 29 G) L'animal aura sa cage thoracique ouverte en vue d'effectuer une perfusion intracardiaque de 20 ml de PBS - Héparine 100U/ml puis de 50 ml de PFA 4%. A la fin de la perfusion, l'animal sera décapité et son cerveau sera prélevé puis post-fixé dans du PFA 4% à 4°C pendant 24 h.
Impact sur les animaux
Des nuisances temporaires de stress, liées à l'environnement relativement bruyant des IRM est attendu pour tous les animaux lorsqu'ils seront sortis de l'armoire de stabulation pour l'examen IRM (2heures). Une perte de poids temporaire (-5% pendant 1 semaine) due au changement de régime alimentaire est attendu pour les souris du modèle cuprizone.
Devenir
L'issue de chacune des procédures 1-6 cloturera un point particulier du projet global sur l'imagerie quantitative de la myéline. Les 440 animaux nécessaires à l'ensemble des procédures seront donc euthanasiés par perfusion intracardiaque (mise à mort décrite en 3.3.3 et demande de dérogation en 3.3.4) permettant le prélèvement de leur système nerveux central.
Remplacement
La spécificité des métriques quantitatives de la technique qihMT pour la myéline doit être démontrée in vivo afin de valider l'IRM ihMT comme marqueur spécifique utilisable dans des protocoles cliniques. Cette démonstration ne pourra être effectuée que sur la base de mesures réalisées à différents points temporels sur des animaux contrôles et modèles caractérisés d’altération/développement de la myéline. Ces mesures seront ensuite corrélées à des analyses histologiques. Ces aspects ne peuvent être conduits chez le patient du fait de l’impossibilité de réaliser une étude histologique sur un même échantillon préalablement exploré in vivo par IRM. Néanmoins, une stratégie de remplacement sera effectuée. Ainsi, à chaque fois que cela sera possible, notamment lors des ajustements de premier niveau (debuggage des séquences IRM, optimisation, tests...), des fantômes (composés chimiques ayant des caractéristiques similaires à la myéline, e.g. systemes de lipides lamellaires synthétiques) seront utilisés en lieu et place des animaux.
Réduction
Les examens IRM seront réalisés de sorte que plusieurs paramètres IRM puissent être ajustés au cours d’une même session et sur des mêmes animaux. La durée des examens n’excèdera néanmoins pas 2h par animal (durée standard d’investigation multimodale IRM sur petit animal). Un suivi longitudinal par exploration IRM non invasive sera effectué sur tous les modèles investigués, réduisant ainsi de manière drastique le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par les animaliers. La stabulation des animaux sera réalisée au sein de notre unité, dans des armoires dédiées à raison de 5 souris / cage et 2 rats / cage pour les animaux contrôles. Après un examen IRM, chaque animal sera placé dans une cage individuelle avec accès facilité à la nourriture/boisson puis replacé dans sa cage une heure après. Les cages de stabulation souris du CRMBM sont dotées d’un environnement enrichi (roues, tunnels... pour la stimulation des animaux). Les procédures expérimentales de chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile Isoflurane 3% dans l’oxygene pur et ventilation assistée ou mélange kétamine (100mg/kg de poids)/xylazine (10mg/kg de poids)) et des analgésiques sont administrés (injection intramusculaire de Buprenorphine, 0.1mg/kg).
Choix des espèces
Justification de l’utilisation de souris : Existence de différents modèles génétiques caractérisés de pathologies affectant la myéline chez la souris : modèles Shiverer et Twitcher (modèles génétiques des leucodystrophies, caractérisées par une dysmyélinisation du SNC résultant d’un déficit en galactocérébrosides pour Twitcher ou en Myelin Base Protein (MBP) pour Shiverer), modèle cuprizone et EAE (miment certains effets de la sclérose en plaques par une démyélinisation locale et par des lésions axonales entrainant un déficit cognitif et une incapacité progressive, et effets inflammatoires). Justification de l’utilisation des rats : L’interêt du rat est de disposer de structures de système nerveux central plus grosses que celles de la souris et donc d’un signal IRM plus conséquent. Investigation possible grace au diamètre plus grand du scanner 7T. L’IRM étant une technique très peu sensible, le critère de rapport signal sur bruit élevé est primordial afin de limiter le temps d’examen. Pour toutes les études (hors maturation cérébrale), les animaux seront âgés de >10 semaines correspondant au début de l’âge adulte afin de s’assurer d’un niveau de maturation du système nerveux central maximal. Pour l’étude de la maturation cérébrale, les animaux seront utilisés à différents stades du développement (de D6, jusqu’à >10 semaines).
Analyse du rôle de GD3 dans la progression tumorale du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 172 en gravité sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules de glioblastome sous la peau ou dans le cerveau, cette dernière suivie d'une étude de survie jusqu'au franchissement d'un score de souffrance. Le porteur euthanasie les animaux à une perte de poids de 20 % ou à un score de souffrance défini. L'objectif est d'analyser le rôle d'un ganglioside, le GD3, dans l'agressivité de cette tumeur cérébrale.
Objectifs
L'objectif est d’analyser le rôle de l'expression du ganglioside GD3 dans l'agressivité du GBM. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de GD3 dans la capacité des cellules de GBM à former des tumeurs (propriétés de tumorigénicité) ainsi que dans la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Le GBM est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La récidive est inévvitable dans un délai de 7 à 10 mois. Il est donc urgent de rechercher de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. L’utilisation du ganglioside GD3 comme cible thérapeutique comme agent anti-cancéreux pour le traitement du GBM a fait l’objet de plusieurs publications.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Greffes sous-cutanées (108 animaux, une seule intervention de 1 minute environ); 2) Greffes intra-cérébrales (172 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ); 3) Injection i.p. pour l'anesthésie des animaux avant les greffes intra-cérbrales ou les perfusions intra-cardiaques (172 animaux, quelques secondes d'intervention); 4) Injections sous-cutanées d'analgésiques lors des greffes intra-cérébrales (172 animaux, quelques secondes d'intervention).
Impact sur les animaux
Hormis une perte de poids qui reflète la progression tumorale des tumeurs intracraniales, aucun autre effet indésirable n'est attendu dans ce projet. Les administrations intracérébrales (exécutées sous anesthésie) n’induisent en principe pas de souffrances à la suite de la chirurgie. L’injection sous-cutanée induit une douleur légère, dont la durée est limitée à l’intervention. Néanmoins, Le suivi de l’état général des animaux sera réalisé en mesurant quotidiennement le poids corporel et en surveillant l’apparition de signes définis comme points limites. Lorsque nous observerons une perte de poids supérieure ou égale à 20%, en référence au poids initial de l'animal ou un score de souffrance supérieur ou égal à 10, les animaux seront euthanasiés sans délai (grille de scores en annexe).
Devenir
Procédure 1: tous les animaux seront euthanasiés lorsque les tumeurs atteindront 1500 mm3, ou en cas d'absence de prise tumorale. Procédure 2: tous les animaux seront euthanasiés 60 jours après la greffe tumorale pour effectuer des analyses histologiques. Procédure 3: tous les animaux seront euthanasiés dès le franchissement d'un score limite défini par la grille de scores (étude de survie). Procédure 4: tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour l'analyse des volumes tumoraux et des marqueurs histologiques.
Remplacement
l n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés, un maximum d'expériences sera réalisé in vitro. Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, posture, prostration, difficultés à respirer, à se déplacer, ataxie). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme animal modèle pour plusieurs raison : 1) La facilité, la praticité pour maintenir cette espèce dans notre structure et le fait que notre animalerie d’hébergement soit équipée pour accueillir des souris ; 2) Les personnes concernées par ce projet maîtrisent la manipulation de cet animal ; 3) le faible coût d’entretien des animaux ; 4) l’injection de cellules cancéreuses est communément pratiquée chez cette espèce et maîtrisée depuis de nombreuses années ; 5) La prise tumorale est rapide (entre 15 jours et 2 mois selon la lignée cellulaire concernée) quand des cellules de glioblastome sont injectées dans le cerveau. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Développement de nouveaux vaccins contre la myxomatose et la maladie hémorragique virale du lapin (RHD)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, une partie tuée dès l'apparition des signes cliniques, quelques-uns gardés vivants. Ils reçoivent des vaccins expérimentaux contre la myxomatose et la maladie hémorragique virale, puis une épreuve infectieuse, les six lapins témoins non protégés développant la maladie hémorragique mortelle avant euthanasie. Le porteur rappelle que cette maladie tue en moyenne 80 % des lapins atteints en 48 à 72 heures. Il justifie le recours à l'espèce cible par l'absence d'alternative pour évaluer la protection vaccinale.
Objectifs
La maladie hémorragique virale du lapin (Rabbit haemorrhagic disease, RHD) est une maladie infectieuse fulgurante, souvent fatale (80 % de mortalité en moyenne en 48-72 h), qui affecte les lapins de chair, de compagnie et sauvages. Elle est provoquée par un calicivirus, le RHDV. Détectée pour la première fois en Chine en 1984, la RHD a rapidement diffusé en Europe et a causé d’importantes pertes économiques dans les élevages industriels de lapins. Elle a également perturbé les écosystèmes naturels en Europe occidentale dans lesquels le lapin de garenne est une espèce clé. Pour combattre cette maladie, plusieurs vaccins ont été mis sur le marché. En 2010, un nouveau génotype, le RHDV2, a émergé en France et s’est rapidement propagé en Europe. Son échappement à l’immunité induite par le RHDV ou la vaccination a eu pour conséquence la réémergence de la RHD en élevage. Afin de pallier l'inefficacité des vaccins anti-RHDV « classiques », des vaccins anti-RHDV2 ont vite été commercialisés. Toutefois, il s’agit le plus souvent de vaccins à virus inactivés, produits sur animaux vivants, qui ont donc un coût de production élevé et qui posent d’évidentes questions éthiques. Depuis peu, une combinaison de vaccins recombinants vectorisés (myxomatose- RHDV1 et myxomatose-RHDV2) est disponible sur le marché. Néanmoins, quelques effets indésirables, liés à la souche de virus myxomateux employée, sont parfois notés. De plus, la stratégie choisie nécessite la production et le mélange de deux virus recombinés, ce qui accroit le coût de la vaccination. Dans ce contexte, nous souhaitons développer de nouveaux vaccins recombinants, afin de contourner ces problèmes. Nous avons réalisé deux constructions dans lesquelles les protéines immunogènes VP60 de l’une et l’autre des souches de RHDV (nommées VP60-1 ou VP60-2) sont exprimées simultanément au sein d’une souche vaccinale du virus myxomateux (SG33- MYXV), avec un mode de présentation original, ce qui devrait permettre une double protection RHD/myxomatose . Le premier objectif de ce projet est donc d'évaluer l'efficacité de ces deux vaccins candidats chez des lapins infectés expérimentalement par les virus RHDV1 et RHDV2. En parallèle, le second objectif est de produire des sérums de lapin contenant des titres élevés en anticorps anti-RHDV2, qui serviront de témoins positifs lors des tests immunologiques qui seront utilisés pour mesurer les titres en anticorps des lapins au cours des essais vaccinaux du premier objectif.
Bénéfices attendus
Développement de nouveaux vaccins recombinants dirigés à la fois contre le virus de la myxomatose et contre les génotypes 1 et 2 du virus responsable de la maladie hémorragique du lapin.
Procédures
1/ Injections de vaccins sur animaux vigiles : procédure 1 (n = 3 animaux) : 6 injections par voie sous-cutanée, espacées chacune de 6 mois, par animal ; procédure 2 (n = 30 animaux) : 1 injection vaccinale par voie sous-cutanée ou intradermique par animal. 2/ Inoculation d'épreuve sur animaux vigiles (procédure 2, n = 30 animaux) : 2 injections par voie sous-cutanée à 2 semaines d'intervalle. 3/ Prélèvements sur animaux vigiles : prises de sang à la veine marginale de l'oreille. Nombre : procédure 1 : 6 prises de sang au total par animal (4 mL à chaque fois), la premières réalisée à J30, puis les 4 suivantes effectuées à 6 mois d'intervalle, à respectivement J180, J360, J540, J720 et J900 ; procédure 2 : 3 prises de sang au total par animal (4 mL à chaque fois) à J0, J14 et J21.
Impact sur les animaux
Potentiels effets indésirables mineurs suite à la vaccination (tuméfaction passagère au point d'injection, hyperthermie transitoire rétrocédant spontanément). Lors de l'essai vaccinal : développement d'une maladie hémorragique chez les lapins non vaccinés (témoins négatifs) et chez les lapins non ou insuffisamment protégés suite à la vaccination (si échec vaccinal).
Devenir
Procédure 1 : les 3 lapins utilisés recevront uniquement un vaccin commercial anti-RHD et les volumes sanguins prélevés seront faibles ; ils seront donc en bonne santé et ne conserveront aucune séquelle de la procédure expérimentale, ce qui permet d'envisager leur placement. Procédure 2 : les lapins du lot contrôle positif (n=6) seront euthanasiés suite à l'épreuve infectieuse, dès qu'ils déclareront les signes cliniques de la RHD. Les lapins du lot contrôle positif (n=4), qui auront été immunisés avec un vaccin anti-RHD survivront, sans déclarer de signes cliniques, à l'épreuve infectieuse et ne conserveront aucune séquelle de la procédure, ce qui permet d'envisager leur placement. Les lapins auxquels seront administrées les 2 constructions vaccinales à tester seront euthanasiés soit en cours de procédure s'ils développent des signes cliniques de RHD (si échec vaccinal), soit à l'issue de la procédure car ils auront reçu des vaccins non homologués.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'efficacité de 2 constructions vaccinales contre la maladie hémorragique du lapin, chez l'espèce cible, avec pour principaux critères la séroconversion et la protection clinique conférée lors d'une épreuve infectieuse, ce qui, en l'absence d'alternative pertinente, nécessite obligatoirement le recours aux animaux. De même, la production de sérums hyperimmuns anti-RHDV2 nécessite une immunisation in vivo.
Réduction
Trente trois lapins seront utilisés lors du projet : - 3 lapins pour la production de sérums hyperimmuns anti-RHDV2, effectif minimal estimé permettant d'obtenir des sérums de qualité en quantité suffisante, en tenant compte de la variabilité interindividuelle de la réponse immunitaire, tout en limitant le nombre et le volume des prélèvements sanguins par animal - 30 lapins lors de l'essai visant à évaluer l'efficacté de nos 2 constructions vaccinales, effectif minimal permettant de mettre en évidence une éventuelle différence statistiquement significative entre les taux de mortalité et les titres en anticorps dans les différents lots d'animaux vaccinés (tests statistiques utilisés : test de Fisher, ANOVA)
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux nouvellement arrivés dans notre établissement, une période d'acclimatation d'au moins 7 jours sera respectée avant application des procédures. Les animaux seront hébergés en groupes de 2 (procédure 2), dans des cages de 4200 cm² ou de 3 (procédure 1) dans 2 cages de 4200 cm² accolées dont la séparation latérale aura été enlevée. Mâles et femelles ne seront pas hébergés ensemble et, dans la mesure du possible et afin d'éviter les comportements agressifs, les groupes seront composés d'animaux provenant de groupes sociaux harmonieux, déjà formés chez le fournisseur. Toutefois, si une cohabitation paisible n'est pas possible, les animaux seront séparés mais conserveront un contact visuel avec leur congénère du fait de la transparence des parois de séparation latérales des cages. Toutes les cages seront équipées d'une plate-forme et de jouets (balles ou haltères en plastique). Les injections et les prises de sang seront réalisées par du personnel qualifié : vétérinaires ou personnes formées par un vétérinaire. Les prises de sang à l'oreille seront réalisées alternativement à l'oreille droite et à l'oreille gauche, après application d'une crème anesthésique locale. Après chaque injection vaccinale, une surveillance attentive quotidienne sera mise en oeuvre : examen visuel et palpation du point d'injection, prise de température rectale en cas d'abattement ; toute anomalie entrainera l'intervention d'un vétérinaire. Lors de l'essai d'efficacité vaccinale, une surveillance renforcée (biquotidienne au lieu de quotidienne) sera mise en place après l'épreuve infectieuse afin de détecter le plus précocément possible les animaux déclarant les signes cliniques de la maladie hémorragique du lapin (point limite de la procédure) et nécessitant une euthanasie.
Choix des espèces
Le lapin européen est l'espèce naturellement infectée par la myxomatose et le virus de la maladie hémorragique du lapin. Lapins âgés d'au moins 8 semaines, âge de sensibilité totale aux virus de la myxomatose et de la maladie hémorragique du lapin.
Modulation du niveau de DNM2 par croisement génétique dans le traitement des myopathies liées à MTM1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant une myopathie myotubulaire, avec atrophie musculaire, paralysie progressive des membres postérieurs et déformation du dos, et subissent des tests moteurs puis une mesure terminale des propriétés musculaires sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche à valider une thérapie par croisement génétique modulant la protéine dynamine 2. Le bénéfice reste une "preuve de concept" pour de futures approches chez les patients.
Objectifs
Nous souhaitons valider chez la souris, une preuve de concept pour les myopathies myotubulaires lié à MTM1 en modulant le niveau de la protéine Dynamine 2 par croisement génétique. En effet, Les animaux mutant Mtm1-KO montrent une sur expression de la Dynamine 2 que nous souhaitons faire diminuer par croisement avec une souris mutante (atteinte de CMT) présentant une diminution du niveau de cette même protéine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à fournir une preuve de concept que la modulation de la protéine dynamine 2 peut améliorer le phénotype MTM1. Ceci pourrait conduitre au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de myopathie myotubulaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Ces expériences consistent à mesurer la force du musculaire, la position des pattes lors des déplacements, l’habilité à se déplacer sur une barre crantée (3 essais/jour/souris). Mesurer l’activité électrique musculaire par EMG (Electromyographie) et la mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). Pour ces 2 expériences seulement un essai sera réalisé.
Impact sur les animaux
Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteintes de la maladie de CMT présente un phénotpe léger avec une légère perte de poids par comparaison avec la souris contrôle. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. En revanche, la souris atteinte de myopathie myotubulaire (MTM1-KO) présente un phénotype sévère avec une atrophie musculaire pouvant conduire à une paralysie progressive des membres postérieurs et l’apparition d’une cyphose (dos arrondie). Cependant, les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutant et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. Les mesures d’électromyographies (EMG) nécessitent une immobilisation de l’animal réalisé sous anesthésie pour une durée maximum de 10 minutes. Pour réaliser la stimulation électrique, un courant de 0.9 mA à 4 mA est délivré grâce à des électrodes de stimulation (avec un diamètre équivalent aux aiguilles utilisé en acupuncture) implanté sous la peau de l’animal. De la même manière, une électrode de réception est également implantée sous la peau de la souris. Les expériences de mesure de la force musculaire (AURORA) sont réalisées sous anesthésie profonde. Une petite incision est réalisée au-dessus du nerf sciatique permettant de poser de part et d’autre de ce dernier les électrodes de stimulation électrique et un courant de 1 à 10 mA sera délivré pour induire la contraction du muscle. Un deuxième acte chirurgical consiste à dégager le muscle tibial antérieur afin de le fixer sur l’appareil de mesure.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante. Après les mesures électrophysiologique, l’animal est réchauffé sur une plaque maintenue à 37°C jusqu’à son réveil. La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA) sous anesthésie.
Remplacement
Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience, nous prévoyons 100 animaux pour cette étude (REDUCTION).
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. De la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de la modulation de cette protéine, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Lors d'une précédente étude nous avons constaté qu'à l’âge adulte c'est à dire à 7 et 8 semaines, le phénotype lié à la maladie était exprimé. Ainsi, nous souhaitons réaliser les test comportementaux à cet âge afin d'évaluer la maladie et le bénéfice de ce croisement sur la pathologie.
Etude de l’efficacité d’un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 120 en gravité sévère. Elles reçoivent quatre injections vaccinales, des prélèvements de sang en rétro-orbitaire, puis une inoculation de la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie nasale, avec un suivi clinique toutes les quatre heures. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des douleurs élevées et présente cette étape comme "indispensable" avant le passage à l'humain. Le bénéfice annoncé se limite au déclenchement d'essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
Le projet vise à étudier l’efficacité d’un vaccin optimisé contre Pseudomonas aeruginosa, bactérie pathogène représentant un problème de santé publique majeur. Ce projet permettra de mettre au point la preuve de concept de ce vaccin candidat en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’homme.
Bénéfices attendus
Obtention de résultats précliniques concernant l'efficacité d'un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa permettant de passer au déclenchement des phases cliniques suivantes.
Procédures
4 injections de doses vaccinales seront réalisées en sous-cutanée sur les animaux vigiles. 3 prélèvements de sang en rétro-orbitaire seront effectués sous brève anesthésie générale volatile. L'inoculation bactérienne sera unique par voie intranasale sous brève anesthésie générale volatile. L'état clinique des animaux sera observé sur animaux vigiles toutes les 4 heures lors du développement de l'infection. Le prélévement de la rate des animaux sera réalisé post-mortem.
Impact sur les animaux
Une douleur de niveau légère sera générée par l’injection de la dose vaccinale et de niveau modérée pour les potentiels effets de la vaccination. Des douleurs de niveau élevé pourraient résulter de l’infection induite à Pa.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour le prélèvement et l'étude de la rate.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet scientifique, un vaccin vivant atténué a été développé et optimisé. Une souche de Pseudomonas aeruginosa (bactérie pathogène pour l’Homme) modifiée génétiquement est inactivée par un traitement photochimique de façon à empêcher sa propagation suite à la vaccination et permettant de contrôler la dose injectée. La souche conserve cependant une activité métabolique permettant de déclencher une réponse immunitaire efficace. Ce vaccin présente ainsi la sécurité d’utilisation de bactéries mortes combiné à l’efficacité d’un vaccin vivant atténué. Le vaccin a fait l’objet d’optimisations tant sur le protocole de préparation des doses vaccinales que sur l’échelle de production et la forme du produit final de celui-ci. Le remplacement n'est pas possible dans le cas de cette étude pré-clinique indispensable pour valider la sécurité d'utilisation et l'efficacité du vaccin développé. Ce projet permettra d’évaluer la réponse immunitaire complexe suite à la vaccination à l’aide d’un vaccin candidat optimisé et ensuite face à un challenge infectieux à dose létale en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’Homme.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué d’un nombre d'animaux suffisant en adéquation avec les protocoles standards utilisés dans la littérature. Les lots d'animaux seront constitués de 6 souris répété 1 fois (2*6 souris par groupe expérimental) hormis les groupes utilisés dans l'étude préliminaire qui ne nécessitent pas d'être répétés (1*6 souris par groupe test) : nombre minimal et suffisant pour un traitement statistique approprié.
Raffinement
Les animaux seront placés en conditions SPF (« specific pathogene-free »). Les souris seront placées dans des cages standards et adéquates au niveau de la taille, de la propreté, de la température (23 +/- 2°C), du cycle lumineux (12h) et des congénères (toujours les mêmes souris ensemble dans une cage). La nourriture et la boisson sont disponibles en continu. Les animaux auront bénéficié d’une semaine d’acclimatation. Pour chaque prélèvement sanguin, les souris subiront une brève aesthésie générale. Des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance inutile des animaux. Dans le cas où les points limites seraient atteints, l’animal sera mis à mort avant la fin de procédure pour arrêter toutes souffrances inutiles.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et comparables aux études précédemment publiées dans le cadre des études de l’équipe de recherche et dans cette thématique de façon plus générale. Les souris C57BL/6 sont les modèles choisies car elles sont sensibles aux infections à Pa (aiguës ou chroniques) et qu’elles sont capable de produire des taux d’anticorps élevés. Stade de développement des animaux : âgés de 6 à 8 semaines. À ce stade, les animaux auront un système immunitaire mature.
Cellules souches et réparation osseuse – 5
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 360 en gravité sévère. Une blessure osseuse est provoquée sous anesthésie chez des souris génétiquement modifiées, certaines recevant ensuite des molécules inhibitrices, avant prélèvement des tissus osseux. Le porteur décrit une réparation spontanée en trois semaines et affirme qu'aucune souffrance visible n'apparaît après le premier jour. Il classe pourtant 360 de ces animaux en gravité sévère, sans détailler dans le résumé ce qui distingue leur atteinte.
Objectifs
Les maladies du système musculosquelettique touchent une large proportion de la population, que ce soient des maladies génétiques affectant le développement et la croissance osseuse, les cancers, les maladies dégénératives liées au vieillissement telles que l’ostéoporose et l’arthrose ou encore les défauts de régénération suite à un traumatisme. Ce projet vise à mieux comprendre le processus de régénération osseuse afin de mettre au point de nouvelles applications thérapeutiques cellulaires et pharmacologiques. Ce projet a 2 objectifs principaux: - développer des stratégies thérapeutiques pour les défauts de régénération osseuse liés à des pathologies génétiques ou à un traumatisme musculosquelettique. Pour cela, les souris présentant un défaut de réparation osseuse sont traitées avec différents inhibiteurs spécifiques de voie de signalisation impliquées dans ces défauts de réparation et l’impact de ces traitements sur la régénération osseuse est évalué. - identifier l’implication de nouvelles voies de signalisation dans les défauts de régénération osseuse. Pour cela, les gènes spécifiques de ces voies de signalisation sont invalidés dans les cellules souches osseuses et l’impact de ces mutations sur le phénotype de réparation osseuse est évalué.
Bénéfices attendus
Les fractures représentent les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est compliqué, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle de différentes voies de signalisation dans la régénération osseuse physiologique et pathologique. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.
Procédures
Afin de répondre aux questions du projet, nous utilisons des modèles murins transgéniques, permettant l’inactivation des gènes d’intéret. Une blessure osseuse est induite sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post-opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). Afin de tester des approches thérapeutiques, certains lots de souris sont traités avec des molécules inhibitrices pour déterminer l’effet des traitements sur les atteintes osseuses (durée du traitement entre 2 et 4 semaines).
Impact sur les animaux
Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse).
Devenir
Les animaux sont sacrifiés à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.
Remplacement
Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensable. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. Toutefois, nous combinons les études in vivo avec des analyses cellulaires in vitro lorsque que nous cherchons à identifier des défiences au niveau d’un type cellulaire particulier
Réduction
Dans notre expérience et grâce à des analyses statistiques, nous avons déterminé un nombre réduit de temps à analyser et une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe pour fournir des résultats statistiques valables. Avec une taille d'échantillon de 10 dans chaque groupe de comparaison, la probabilité de détecter une différence est supérieure à 80 %.
Raffinement
Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse). Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette, papier) sont placés dans les cages. Ces éléments sont adaptés aux procédures proposées.
Choix des espèces
Mus musculus est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. Mus musculus permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. La réparation osseuse est un processus physiologique très efficace en particulier chez Mus musculus permettant de controler et traiter la douleur et ne conduisant pas à des dommages durables. L’ensemble des procédures sont réalisées sur des animaux adultes, entre 2 et 6 mois pour les expériences de régénération osseuse et entre 6 et 16 mois pour le suivi de la physiologie osseuse.
Evaluation des effets thérapeutiques d’une nano molécule immuno-modulatrice dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 360 en gravité sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'une neurotoxine, le MPTP, pour reproduire une maladie de Parkinson, puis un dendrimère testé comme candidat-médicament. Le porteur signale une mortalité aiguë d'environ 10 % liée à la neurotoxine et un effet néfaste sur le système cardiovasculaire. La preuve d'efficacité recherchée reste au stade de l'espoir, présentée comme une "pré-maturation" du candidat.
Objectifs
La maladie de Parkinson est le deuxième trouble neurodégénératif le plus fréquent après la maladie d'Alzheimer. Les caractéristiques cliniques comprennent des tremblements, une rigidité musculaire, une lenteur des mouvements volontaires et une instabilité posturale. Ces symptômes sont attribués principalement à un déficit en dopamine dans le cerveau. Parmi les différents systèmes dopaminergiques du système nerveux central, la voie nigro-striée ascendante a été identifiée comme la plus gravement endommagée dans la maladie de Parkinson. Plusieurs traitements sont actuellement disponibles. Ils permettent une amélioration de la qualité de vie et une diminution des symptômes. Cependant, ces médicaments ne sont efficaces que sur une partie des patients et, fondamentalement, ne permettent pas la guérison de cette maladie. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies. A l’heure actuelle, ni la cause ni les mécanismes sous-jacents à la mort des neurones dopaminergiques nigro-striataux ne sont connus. Mais, il est maintenant communément admis que l’inflammation chronique contribue à la dégénérescence neuronale. Les cellules microgliales, macrophages résidents du système nerveux central, participent à l’instauration et au maintien de cette neuroinflammation chronique. Tout agent capable de moduler ces cellules et donc ce phénotype délétère sera un candidat-médicament de choix pour le traitement de cette maladie. Nous développons en ce moment dans le laboratoire, une molécule qui pourrait remplir cette fonction. En effet, nous avons précédemment montré que des molécules synthétiques de taille nanométrique, les dendrimères phosphorés, ont des propriétés anti-inflammatoires et immuno-modulatrices inédites. En particulier, nous avons apporté les preuves de concept in vivo du potentiel thérapeutique du dendrimère ABP dans des modèles murins de trois maladies inflammatoires chroniques : la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le psoriasis. Nous avons depuis des résultats in vitro qui prouvent que ce dendrimère ABP pourrait aussi être efficace pour combattre la composante inflammatoire dans la maladie de Parkinson. L'objectif global de ce projet est donc d'évaluer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Au terme de ce programme de pré-maturation nous espérons apporter la preuve d’efficacité dans le modèle murin de maladie de Parkinson (modèle d’intoxication au MPTP) et valider le dendrimère ABP en tant que candidat-médicament pour combattre la maladie de Parkinson. Ainsi, nous souhaitons valider notre concept de rééducation de la microgliose réactive par le dendrimère ABP qui sera alors un candidat-médicament validé pour le traitement de la maladie de Parkinson. Pour rappel, la microgliose réactive est commune à la plupart des maladies neurodégénératives. De fait, le dendrimère ABP sera un candidat-médicament pour d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaque amyotrophique. En outre, le rôle de la microglie dans l’étiologie d’autres pathologies neurologiques telles que l’autisme et l’épilepsie étant de plus en plus décrit, l’utilisation du dendrimère ABP pourrait aussi y être envisagée.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Injection intrapéritonéale de la neurotoxine MPTP ou PBS sur 720 souris vigiles (durée 5 sec ; 4x toutes les 2 heures sur 1 jour) 2) Injection intraveineuse du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 2 min): Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 3) Injection intracérébroventriculaire (Intervention chirugicale stéréotaxique) du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 20 min) : Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 4) Mise à mort par perfusion intracardiaque (durée 3 min) : Toutes les souris (1020) du projet subiront cette intervention chirurgicale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de l’intoxication au MPTP, est la forte mortalité aiguë (pour la souche C57BL/6 de l’ordre de 10%). Les effets du composé sur le système nerveux central ne sont pas mis en cause. Par contre, il semble qu’ils soient reliés à une diminution de la température corporelle et à un effet néfaste direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles 24h.
Devenir
Les souris de la prodédure 1 (Génération des souris MPTP modèles de la maladie de Parkinson) sont utilisés dans les procédures 2 et 3. Ensuite, toutes les souris des procédures 2, 3 (Et donc 1) sont utilisées dans la procédure 4. Cette dernière procédure consiste à la mise à mort des animaux afin de prélever leur cerveau pour des analyses de biologie cellulaire et moléculaire. Ces analyses permettront de détailler les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du dendrimère ABP. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter leur cerveau pour procéder les expériences suivantes : 1) Mesure de la fluorescence émise par ABP dans le cerveau pour établir la distribution de la nanoparticule dans le cerveau après injection i.v. ou i.c.v.. 2) Extraction et mise en culture de la microglie pour évaluer par cytométrie en flux leur profil pro- ou anti-inflammatoire dans le modèle MPTP suite aux injections i.v. ou i.c.v. d'ABP. 3) Immunohistochimie afin d'évaluer l'effet protecteur d'ABP sur la neurodégénérescence des cellules dopaninergiques de la substance noire. 4) Exprériences de RT-PCRq pour étudier les gènes impliqués dans le profil pro- ou anti-inflammatoire de la microglie.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées (doses inhibiteurs, durée du régime) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible (par priorité : alimentation ou boisson/injection i.p./ injection i.v./injection i.c.v.).
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20%. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires chroniques. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer que le dendrimère ABP est un candidat médicament pour la maladie de Parkinson. On appelle « développement d’un médiatement », le processus de fabrication d’un nouveau médicament. Il englobe les différentes étapes (toutes essentielles), de la conception à la demande d’autorisation de mise sur le marché. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait appel à l’expérimentation animale. Cette étape permet de définir la valeur thérapeutique potentielle d’une nouvelle molécule et d’obtenir les premiers éléments sur le comportement d’un candidat médicament (toxicité, efficacité, etc…). C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. En effet, ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Nous en sommes à cette étape concernant le dendrimère ABP dans la MP.L’expérimentation animale est indispensable au processus de création de nouveaux médicaments. Elle est donc rationnelle dans notre projet de développement d’une nouvelle molécule thérapeutique et elle sera réalisée en suivant les bonnes pratiques et en garantissant un traitement éthique des animaux.
Identification et manipulation des réseaux neuronaux encodant pour la valeur, la valence et la prépondérance des émotions de peur chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures de souffrance modérée et l'autre moitié sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cérébrales puis une perfusion intracardiaque et un prélèvement du cerveau, pour cartographier les circuits neuronaux de la peur au moyen d'outils comportementaux, électrophysiologiques et optogénétiques. Le porteur déclare pourtant "aucun" effet indésirable attendu, alors que 768 souris sont classées en souffrance sévère. Il conclut qu'il "n'existe pas de méthode alternative", une culture cellulaire ne contenant pas les connexions neuronales étudiées.
Objectifs
L’objectif principal de ce protocole est double. Premièrement, développer et valider un protocole de comportement chez la souris libre de ses mouvements pour distinguer les termes de valeur, de valence et de la prépondérance. Deuxièmement, l’identification et la manipulation des réseaux neuronaux qui encodent les signaux mentionnés ci- dessus. Ces objectifs seront atteints en utilisant une combinaison d’outils comportementaux, électrophysiologiques, pharmacologiques et optogénétiques.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole pour dissocier simultanément la valeur, la valence et la prépondérance nous permettra d’étudier comment les réseaux neuronaux dédiés encodent ces différents signaux. Cela nous permettra de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l’anxiété ou le trouble de stress post-traumatique où la prise de décision de ces signaux est souvent inadaptée.
Procédures
Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicales Prélèvements de tissus : touds les animaux sont soulmisd au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation
Impact sur les animaux
aucun
Devenir
Euthanaise de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau
Remplacement
L'identification et la manipulation des circuits impliqués dans l’encodage de valence, valeur et prépondérance de signaux de peur nécessitent l'utilisation d'un cerveau intact chez l'animal vigile. De plus, des méthodes telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neuronales qui sont le sujet de nos travaux. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 8 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 1536 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans le comportement de peur. De plus, nous utilisons ici des modèles transgéniques divers ce qui présente un intérêt scientifique fort. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Caractérisation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin du syndrome du QT long de type 3.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.
Procédures
Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.
Devenir
Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.