Chiens
Etude de l’évolution de la pathologie cardiaque chez des chiennes porteuses de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
20 chiennes porteuses de la myopathie de Duchenne vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quinze tuées pour prélever leurs tissus dont le cœur et cinq adoptées. Chaque animal subit des prélèvements de sang et d'urine, des biopsies musculaires sous anesthésie et des IRM de deux heures trente sous anesthésie, sur six mois de suivi. Le porteur souligne que ces chiennes ne présentent pas d'atteinte clinique évidente et que le principal risque est une mort subite par trouble du rythme cardiaque. Il décrit le chien GRMD comme un "modèle unique" reproduisant fidèlement la maladie humaine.
Objectifs
La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X, qui touche le muscle chez les jeunes garçons, les contraignant à l'usage du fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans, et entraînant un décès précoce d'insuffisance respiratoire ou cardiaque vers l'âge de 30 ans. Les mères et sœurs de ces garçons, porteuses de l'anomalie génétique, ont longtemps été considérées comme "porteuses saines" de la maladie. Cependant, de plus en plus d'études montrent que ces femmes peuvent présenter des atteintes musculaires squelettiques et cardiaques, à des degrés variables. Un suivi cardiologique leur est désormais proposé. La question se pose chez certaines de ces patientes de l’intérêt de mettre en place un traitement médicamenteux tel que des stéroïdes. Il n’est pas clairement établi si les anomalies cliniques de ces femmes sont évolutives ou non. Parmi les modèles animaux de DMD, le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy) occupe une place pré-clinique immédiate dans le développement de thérapies car il reproduit de manière fidèle la maladie humaine, dans un organisme de grande taille, pouvant être suivi sur le long terme. Une étude récente sur des chiennes porteuses de l’anomalie génétique à l’origine de la GRMD, adultes, ne présentant pas de signe clinique évident, a permis d’identifier une fibrose myocardique et des arythmies ventriculaires chez tous les animaux. Ces anomalies suggèrent que ces animaux montrent, comme les femmes porteuses de DMD, une symptomatologie cardiaque et pourraient être inclus dans des études pré-cliniques permettant de répondre aux nombreuses questions posées pour ces patientes. Ce projet a le double objectif de caractériser plus avant le phénotype à la fois musculaire strié squelettique et cardiaque de ces chiennes porteuses de GRMD, à un stade de fibrose myocardique déjà installée (chiennes adultes) et de déterminer si ce phénotype est évolutif et si oui dans quelle mesure. Dans ce but, des chiennes porteuses et non porteuses (témoins) seront suivies durant six mois à l’aide de différentes méthodes d’évaluation non-invasives. Des biopsies musculaires seront également prélevées. Cette étude permettra, par le biais d’une caractérisation approfondie, d’apporter une réponse à la question de l’évolutivité du phénotype chez les porteuses, et de poser les jalons de possibles études thérapeutiques pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une connaissance plus approfondie de ce modèle unique pour les femmes porteuses de myopathie de Duchenne, pré-requis à l'inclusion de ces animaux dans des études thérapeutiques. Les données obtenues au cours de ce projet pourront être utilisées comme données de référence pour comparer les données obtenues chez des chiennes après un traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents tests d'évaluation fontionnelle non invasifs. Ces tests seront soit réalisés vigiles, après une période d'habituation s'ils nécessitent la coopération du chien, soit sous anesthésie générale s'ils nécessitent une parfaite immobilité du chien ou s'ils peuvent engendrer un stress. Sept prélèvements sanguins (durée=moins de 5 minutes) seront réalisés au cours des six mois de suivi (un prélèvement par mois), et deux prélèvements d'urine (durée = 1 minute, au début et à la fin du suivi). Des biopsies musculaires de deux muscles de la cuisse seront prélevées au début du projet, par voie chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie (durée = 30 minutes). Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et dureront 2h30 environ. D'autres examens non invasifs ne requérant pas d'anesthésie générale (non stressants et non invasifs) seront mis en oeuvre pour explorer les fonctions motrice (durée 10 minutes), respiratoire (durée 10 minutes) et cardiaque (électrocardiogramme enregistré sur une nuit).
Impact sur les animaux
Les chiennes porteuses de myopathie de Duchenne ne présentent pas d'atteinte clinique évidente de prime abord, ni d'altération de leur qualité de vie (pas de "handicap" visible). Les anomalies identifiées au cours d'une précédente étude, certes importantes et généralisées à l'ensemble des individus évalués, l'ont été par le biais de méthodes d'investigation plus poussées qu'un examen clinique vétérinaire standard. Le principal risque identifié pour ces animaux suite à cette première caractérisation est celui d'une mort subite en raison de leurs troubles du rythme cardiaque. Néanmoins ces événements ne sont pas classiquement rapportés chez ce type d'animaux jusque là considérés comme porteurs sains. Il n'est a priori pas attendu de nuisances majeures liées au projet sur les animaux, hormis celles liées au stress généré par les procédures mises en oeuvre (anesthésies générales, enregistrements et prélèvements sur animaux vigiles). Nous veillerons particulièrement à établir des conditions permettant de minimiser ce stress. Pour les tests le nécessitant, une habituation préalable et progressive sera prévue. Les animaux seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage quotidien, et seront récompensés par la voix, des caresses et une friandise lorsque ce sera possible. Des complications post-opératoires des biopsies musculaires effectuées par voie chirurgicale ne peuvent être totalement écartées. Cependant cela est très improbable, et prévenu par le fait que les muscles prélevés sont des muscles superficiels qui ne nécessitent qu'une voie d'abord peu invasive, et que les prélèvements sont effectués dans des conditions d'asepsie conformes aux bonnes pratiques chirugicales. Si malgré les mesures de raffinement mises en oeuvre une complication post-opératoire se présentait (infection, déhiscence des sutures, hématome), les soins vétérinaires appropriés, incluant une gestion de la douleur, seraient mis en place.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par nécessité de prélever des tissus, notamment le coeur.
Remplacement
Les questions posées dans le cadre de ce projet (caractérisation et évolutivité avec l'âge d'un phénotype impliquant les fonctions locomotrice, respiratoire, cardiaque et leurs intéractions) ne peuvent être élucidées qu'in vivo. Par ailleurs, une pathologie cardiaque liée au statut de porteuse de dystrophinopathie n'a à ce jour été identifiée que dans l'espèce canine.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus dans ce projet a été déterminé afin de pouvoir objectiver, si elle existe, une augmentation de 35 % (équivalente à celle d'un chien atteint par la myopathie de Duchenne) d'un marqueur sanguin de stress cardiaque sur les 6 mois de suivi. Les données recueillies au cours de ce projet permettront une évaluation précise du nombre d'animaux à inclure dans de futures études thérapeutiques sur ce modèle, et elles pourront également servir de données de référence pour comparer des données acquises sur des chiens en essai thérapeutique.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous aurons recours essentiellement à des méthodes d'évaluation non invasives. Néanmoins, il sera nécessaire de prélever des biopsies musculaires, cela sera réalisé sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Dès qu'un examen, même non invasif, sera susceptible d'entraîner un stress, ou de requérir une immobilité prolongée, il sera pratiqué sous anesthésie générale. Les examens ou prélèvements réalisés sur chiens vigiles le seront avec douceur, en prévoyant des phases d'habituation si nécessaire et un renforcement positif systématique (voix, caresse, friandises). Des points limites adaptés ont été définis, portant principalement sur les risques liés à l'atteinte cardiaque de ces animaux, mais également sur de possibles, bien que peu probables, complications post-opératoires liées au prélèvement de biopsies musculaires. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme.
Choix des espèces
Actuellement, hormis chez le chien, il n'existe pas de modèle animal pertinent, décrit et utilisable pour les femmes porteuses de myopathie de Duchenne. Ce projet fait suite à une étude précédente menée chez les chiennes porteuses de GRMD, montrant qu'une atteinte cardiaque est présente chez des animaux adultes, et a pour objectif de déterminer si cette atteinte évolue au cours du temps une fois installée. Le chien est le modèle animal qui reproduit le mieux les caractéristiques cliniques et histologiques de la myopathie de Duchenne. Il peut donc être projeté que répondre à la question de l'évolutivité du phénotype chez ces chiennes porteuses permettra une transposition assez robuste des résultats obtenus aux patientes. Pour toutes ces raisons, cette étude sera menée dans l'espèce canine. Les chiennes seront des adultes de plus de 5 ans, afin de disposer d'animaux ayant déjà une atteinte cardiaque installée, et de pouvoir en déterminer la progressivité.
Projet matrice témoin chez le chien et le chat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Chiens : 100
Produire de la "matrice témoin", du sang, du plasma, de l'urine, des fèces, des biopsies de peau et de muscle exempts de tout produit testé, pour valider les méthodes de dosage d'autres études : 100 chiens et 105 chats vont être utilisés à cette fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon le prélèvement, chaque chien ou chat subit une prise de sang sous contention manuelle, un séjour de 24 heures au plus seul en cage à métabolisme, ou un prélèvement de tissu sous anesthésie. Le porteur déclare que l'effectif de 205 animaux non-humains est le "minimal" pour cinq ans, tout en reconnaissant n'avoir fait aucune approche statistique. Les deux déclarations sur le devenir gardent les 205 chiens et chats en vie pour d'autres usages, y compris après un prélèvement de tissu sous anesthésie, alors que la description des procédures estime à une ou deux minutes la durée d'une mise à mort.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de fournir des échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé ( par exemple du sang, du serum, du plasma, des excretas, des biopsies cutanées et musculaires et des liquides céphalo-rachidien) afin de permettre le dosage des échantillons. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin ou exempte de molécule active pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.
Bénéfices attendus
Il est indispensable d'avoir de la matrice témoin. Il s'agit d'échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Cela est indispensable pour valider les résultats d'une étude.
Procédures
Les animaux seront soumis à un seul prélèvement de sang. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice d'urine ou de féces, les animaux seront placés en cage à métabolisme de façon individuelle pour une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les échantillons d'urine ou de féces seront juste collectés sans aucune manipulation particulière de l'animal. Pour générer des matrices tissulaires , les animaux seront préalablement anesthésiés. Ces gestes seront réalisés par un personnel formé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la règlementation en vigueur. La durée de l'anesthésie est de l'ordre de la minute et la durée de l'euthanasie est de l'ordre de quelques minutes (estimation entre 1 à 2 minutes)
Impact sur les animaux
Pour pouvoir générer de la matrice témoin il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble. L'animal subira une contention manuelle pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Le temps d'immobilisation même de courte durée pourra induire un stress chez l'animal. Dans le cas de recueil d'excrétas, l'animal devra la plupart du temps être hébergé en cage à métabolisme (pour une durée maximale de 24h) pour pouvoir collecter des échantillons d'urine ou de fèces témoins. Ce type d'hébergement entraînant un isolement de l'animal qui peut également engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie: dans le cas de prélèvement sanguin classique (volume inférieur à 20 % du volume circulant de l'animal) et dans le cas de collecte d'excrétas (urine, féces) ou dans le cas de prélèvement tissulaire sous anesthésie générale.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal dans son ensemble . En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un bias dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.
Réduction
100 chiens et 105 chats sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique faite pour ce projet. Les mesures prises pour réduire le nombre d'animaux sont l'utilisation d'une méthode avec un seuil de quantification faible , l'appareillage utilisé devra avoir un seuil de détection faible afin de réduire au maximum la quantité d'échantillon utilisé pour la quantification. Le nombre d'échantillon nécessaire pour la quantification sera réduit afin d'assurer l'exactitude de la méthode.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe, à même le sol. De l'enrichissement sera présent autant que possible. Pour l'espèce chien , des balles, des cordes, des tablettes seront présentes. Pour l'espèce chat, des griffoirs, coussins, cordage seront présents autant que possible dans les hébergements. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et tout geste sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. En ce qui concerne les prélèvements de sang pour les matrices témoins sang / plasma, 7.5% du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée d'une semaine pour l'animal. 10 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée deux semaines pour l'animal. 15 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée de quatre semaines pour l'animal.. Pour la collecte d'excretas ( matrice d'urine ou de fèces), l'animal sera placé en cage à métabolisme pour une durée maximale de 24h et sera réduite autant que possible. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Dans ce projet les points limites sont : - Problèmes hématologique ou biochimique, dans ce cas l'animal ne sera pas inclus dans ce projet - Douleur observée au niveau du site de prélèvement avant la réalisation du prélèvement lui même, l'animal pourra être prélevé au niveau d'un autre site ou il n'y aura pas de prélèvement du tout. - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités). Dans ce cas, l'animal sera observé plusieurs fois par jour pour suivre les signes comportementaux et sera exclu du projet. Cette décision sera prise en accord avec le vétérinaire désigné. - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal. L'animal sera exclu de ce projet - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. En fonction de la fréquence et de la durée cela pourra éventuellement conduire à une exclusion du projet en accord avec la décision du vétérinaire responsable
Choix des espèces
Dans les études précliniques, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, tissus, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Les espèces chiens et chats sont largement utilisés dans ce type d'étude en tant qu'espèces non rongeurs Cela dépendra des matrices témoins. S'il s'agit de prélèvement sanguin un animal de stade jeune adulte conviendra le mieux. S'il s'agit d'un prélèvement de tissus, un animal adulte vieillissant pourra plutôt être sélectionné. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.
Evaluation de tolérance et de performance de dispositifs et techniques mini-invasifs pour la prise en charge de l’obésité
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Cochons : 69
90 animaux non-humains, 21 chiens et 69 porcs, vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil à modérées, la plupart tués à l'issue et une partie des chiens réutilisée. Ils reçoivent des dispositifs implantés dans l'estomac sous anesthésie pouvant durer trois heures, puis des prises de sang et des séances d'imagerie répétées, pour tester des techniques mini-invasives contre l'obésité. Le porteur signale une douleur post-opératoire prise en charge par un patch de fentanyl qui impose d'isoler chaque animal, et indique que les animaux tués seront ensuite utilisés pour la formation de vétérinaires. Il juge le recours à un organisme complet et vivant "indispensable" et rappelle l'évaluation in vivo comme un "impératif réglementaire", les bénéfices pour les patients restant renvoyés à plus tard.
Objectifs
Le projet a pour objectif le developpement de dispositifs médicaux innovants associés à de nouvelles techniques mini-invasives pour la prise en charge de l'obésité. Pour cela des étapes de validation de fonctionnalité, puis d'évaluation de sureté et de performance seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Actuellement, le traitement de l'obésité par chirurgie implique des modifications importantes et souvent irréversibles au niveau de l'appareil digestif du patient. Ces méthodes présentent une efficacité avérée, mais également des effets secondaires parfois graves ou persistants. Par ailleurs, elles ne peuvent pas être proposées à tous les patients, et certains patients éligibles ne souhaitent pas recourir à la chirurgie: ces deux catégories de patients se trouvent donc en impasse thérapeutique, avec des impacts graves sur leur état de santé et leur espérance de vie. Le développement de techniques mini-invasives efficaces pour la prise en charge de l'obésité permettrait à ces patients de bénéficier du traitement dont ils ont besoin, avec peu ou pas d'effets secondaires, une durée d'anesthésie et d'hospitalisation réduites, ainsi qu'une réversibilité du processus.
Procédures
Anesthésies pour mise en place des dispositifs: injection de quelques secondes, puis anesthésie de maximum 3h Prises de sang, maximum 1x/semaine: sous anesthésie brève chez le Porc, la ponction dure quelques secondes et l'anesthésie dure env. 20 minutes (si anesthésie spécialement pour la ponction). Vigile chez le Chien, durée de 10 secondes environ Imagerie: sous anesthésie, maximum 1h par session d'imagerie, 2 fois par semaine maximum Autant que possible les actes seront regroupés de façon à ne pas cumuler les temps d'anesthésie (de cette façon par exemple sur un délai d'1h peuvent être réalisé prise de sang + imagerie, ou sur un tempsps de 3h chirurgie+prise de sang+imagerie)
Impact sur les animaux
Les effets délétères attendus sur les animaux sont semblables à ceux observés chez les patients humains: complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie, douleur post-opératoire, inconfort digestif transitoire
Devenir
La plupart des animaux seront euthanasiés pour des prélèvements terminaux. Cependant, les chiens utilisés pour des essais préliminaires de pose-dépose de dispositifs pourront être gardé en vie et réutilisés sur des procédures, après validation du vétérinaire sanitaire et avis de la sbea. Les animaux euthanasiés seront valorisés pour la formation initiale et continue: formation d'étudiants vétérinaires aux autopsies et à l'anatomie, formation de personnel technique ou d'étudiants vétérinaires à des gestes invasifs sur cadavre/pièces anatomiques. Ces animaux pourront également permettre l'obtention de prélèvements ou données nécessaires aux équipes de recherche du site.
Remplacement
L'évaluation in vivo des dispositifs médicaux sous leur forme finale est un impératif réglementaire. Si une partie de cette évaluation se fait lors des essais cliniques (chez l'Homme), ces essais cliniques doivent impérativement être précédés de tests chez l'animal afin de valider le fonctionnement des systèmes de pose en conditions réelles d'utilisation, la non dangerosité des dispositifs, et leurs performances. La complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact auquel sera soumis le dispositif in vivo. L'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post implantation (sureté, tolérance) et les éventuels essais d'efficacité (perte de poids). Avant le passage à l'animal, une très grosse partie du développement des dispositifs se fait en laboratoire (pour toute la partie "mécanique") et également sur pièces anatomiques / cadavres.
Réduction
L'utilisation des animaux vivants ne surviendra qu'en fin de développement du dispositif, afin d'obtenir les données finales nécessaires pour permettre ensuite la mise en place d'essai cliniques, puis la mise sur le marché. De ce fait, le nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisemmant fiables sur la non-dangerosité des dispositifs en "conditions réelles", et éventuellement des données partielles sur leur efficacité (il ne s'agit que d'un objectif secondaire ici, la majorité des données d'efficacité pouvant être obtenue lors des essais cliniques ultérieurs: des données concernant la perte de poids pourront donc être collectées à l'occasion des essais de tolérance / performance, mais il n'y aura pas d'étude pré-clinique uniquement dédiée à l'étude de la variation pondérale). Le nombre d'animaux sera également réduit en utilisant au maximum des techniques permettant un suivi longitudinal, et ainsi en évitant d'avoir systématiquement recours à des euthanasies séquentielles: imagerie, réalisation de biopsies sous endoscopie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie, ce qui nécessitera un isolement individuel afin qu’ils ne puissent pas se l’arracher entre-eux, voir l’ingérer et risquer une surdose. Pour compenser cette isolement ils seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés: AINS et/ou morphiniques. Les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique voire remplacées par cette solution en période post-opératoire immédiate (afin de ne pas solliciter l'estomac avec des éléments solides). Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique minutieux, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie et des prélèvements sanguins viendront compléter cette évaluation.
Choix des espèces
Nous testons un dispositif complet dans sa version finale, destiné à être placé dans l’estomac d’un humain adulte, ou dans certains cas, dans l'estomac de chiens obèses. Le modèle animal doit donc avoir un estomac d’une taille comparable à celle de l’homme ou correspondre à l'espèce cible (chien). Les espèces retenues pour ce projet sont: Porc, Miniporc, Chien. Porcs et Miniporc seront désignés ici sous le terme "Porc". Le Porc est considéré comme le modèle animal le plus représentatif de l’être humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie digestive, avec un régime omnivore et un estomac de taille très comparable à l'Humain. Cependant, il présente des particularités anatomiques pouvant entrainer des difficultés lors d'endoscopies. Le Chien ne présente pas ces particularités anatomiques, ce qui rend les abords endoscopiques plus aisés. Par ailleurs, il peut être espèce cible des dispositifs médicaux. Les deux espèces sont adaptées pour la réalisation d'études portant sur la perte de poids. Le choix se fera au cas par cas, en fonction de l'étape de développement du dispositif, de sa forme, et de son moyen de fixation. Le chien ou le porc présentent des différences anatomiques qui nous orientent dans le choix. Les porcs seront des animaux juvéniles de 40 à 80kg, de façon à avoir une anatomie digestive similaire à l'Homme, et pour laquelle les dispositifs auront une taille adaptée. Les miniporcs seront des animaux adultes ou en fin de croissance (40-50kg) de façon à avoir une anatomie digestive similaire à l'Homme, pour laquelle les dispositifs auront une taille adaptée et afin de pouvoir réaliser des essais d'efficacité Les chiens seront des adultes, de façon également à avoir un estomac d'assez grande taille, et à pouvoir éventuellement réaliser des suivis de perte pondérale.
Maintien d’une lignée de chiens modèle de la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPS3B)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 chiens vont être utilisés pour entretenir une lignée reproduisant la maladie de Sanfilippo (mucopolysaccharidose de type IIIB), 25 d'entre eux étant tués, 60 réutilisés dans d'autres protocoles et 15 adoptés à la retraite. L'élevage repose sur des prises de sang, des frottis vaginaux, des inséminations artificielles et des prélèvements de semence, et le porteur indique que les chiots homozygotes développent une atteinte neurologique avec troubles locomoteurs dès douze à quinze mois. Le but déclaré n'est pas thérapeutique en soi mais de faire naître des chiens atteints pour un futur projet de thérapie génique, objet d'une autre demande. Sur le remplacement, le porteur qualifie le recours à un modèle gros animal d'"indispensable" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de tester une thérapie génique in vivo.
Objectifs
L'objecif principal de ce projet est de maintenir une lignée de chiens atteints de mucopolysaccharidose de type IIIB afin de générer des animaux nécessaires à l'évaluation d'un projet thérapeutique par thérapie génique qui fera l'objet d'une autre demande de projet.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Sanfilippo, ou MPS IIIB, est la conséquence d’une accumulation de molécules de sulfate d’héparane, partiellement dégradées, dans les tissus de l’organisme. Ceci est le fait d’une mutation génétique qui affecte l’activité d’une enzyme nécessaire pour la dégradation du sulfate d’héparane. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l’Homme, ils apparaissent habituellement avant l’âge de 3 ans. Par la suite, l’atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d’autonomie vers l’âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 10 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à obtenir des animaux atteint de la maladie puis d’évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques telles que les données de biodistribution du vecteur dans le cerveau et les organes périphériques des animaux injectés, l'étude histologique globale (expression du transgène, neurotoxicité avec marquages NeuN, astrogliose et microgliose, infiltration lymphoplasmocytaire), mais aussi la tolérance globale de l'approche avec le suivi IRM, les données hématologiques et le neurofilament Light Chain comme biomarqueur. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.
Procédures
Pour la mise en place de la colonie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Prise de sang pour dosage hormones sexuelles afin de déterminer avec précision l’insémination : au maximum 8 par cycle la prise de sang prend 5 min maximum Frottis vaginaux pour détermination du cycle sexuel : au maximum 8 frottis par cycle. Le prélèvement prend 5 min IA : 2 IA intra vaginal par cycle : l’intervention prend 10 min Prélèvements pour conservation de semences en congelé : prélèvement d’éventuels futurs mâles et l’intervention prend environ 30 min Injections possibles pour aider à la mise bas : 1 à 2 injections qui prennent quelques secondes Prélèvements buccaux et /ou poils sur les chiots pour déterminer statut génétiques : 1 fois à la naissance et prend 1 min
Impact sur les animaux
Les actes nécessaires au développement et maintien de lignée sont peu ou non invasifs. Les effets indésirables possibles sont ceux liés à la reproduction: - un risque de complication lors des gestations, mises bas et lactations - hématome lors de prise de sang nécessaire pour un suivi vétérinaire - risque de morsures entre reproducteurs - cannibalisme des chiots par la mère Pour les animaux malades MPS III B (-/-) : - une atteinte neurologique pouvant générer des anomalies locomotrices avec un début vers 12-15 mois Les animaux hétérozygotes MPS IIIB (-/+) ne présentent pas de phénotype dommageable
Devenir
Tous les reproducteurs seront adoptés lors de leur retraite. Les animaux réutilisés : - les hétérozygotes MPS III b générés deviendront reproducteurs pour la continuité de la lignée. - Les animaux homozygotes MPS IIIB malades obtenus seront intégrés dans des études d’évaluation de produits thérapeutiques. Les animaux HO MPS I obtenus en début de lignée seront euthanasiés. Les animaux sains WT seront soit inclus en tant que témoin sain dans les projets de recherche pré-clinique ou euthanasiés lors du génotypage suivant les besoins.
Remplacement
Toutes les études in vitro possibles ont été́ effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité́ des AAV. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaire pour une demande d’essai clinique de phase I/II pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de cette lignée de chiens MPS3B. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type IIIB
Réduction
100 animaux au total maximum, comprenant les animaux hétérozygotes servant de reproducteurs et les animaux homozygotes MPS3B qui seront inclus dans les études thérapeutiques ultérieures. De plus, autant que faire se peut, nous privilégierons l’utilisation de paillettes de semences congelées pour les inséminations, afin de diminuer le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens animaliers. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Egalement pour suivre efficacement l'état de santé des animaux et pour pouvoir rapidement mettre en place une action une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d’arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l’aide de mesures telles que l’euthanasie ou par un traitement adapté. Cf. Grille en annexe de la saisine.
Choix des espèces
Le modèle de chien choisi (MPS3B) porte la même mutation génétique que l’Homme, mutation génétique provoquant la maladie de San Fillipo. Des plans de reproduction seront établis au fur et à mesure des naissances afin d’obtenir des animaux MPS IIIB. Les mâles et femelles hétérozygotes porteurs (-/+) MPSIIIB et sains (WT) seront inclus en tant que reproducteurs. Les animaux pourront rentrer en reproduction entre 18 et 24 mois, et plus exactement lors des secondes chaleurs des chiennes. Les mâles seront également matures sexuellement à cet âge-là et pourront intégrer les cycles de reproduction pour inséminer les femelles à partir de ce moment.
Biomarqueurs de toxicité dans les études précliniques exploratoires
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 500
Chiens : 40
Cochons : 80
Macaques à longue queue : 80
1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.
Bénéfices attendus
L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.
Procédures
Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.
Prélèvement de globules blancs circulants canins pour mise au point d’un produit de thérapie cellulaire ciblée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
15 chiens vont être utilisés, réutilisés dans la suite du projet ou proposés à l'adoption plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins et une cytaphérèse de deux à trois heures sous anesthésie générale pour recueillir des globules blancs. Le porteur met au point la production de cellules CAR-T canines en vue de traiter la fibrose de la myopathie de Duchenne chez le chien malade. Il affirme que le prélèvement de lymphocytes T ne peut se faire que chez un individu vivant.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T(=sous-population de globule blanc) avec récepteur antigénique chimérique). Les globules blancs du patient sont isolés par cytaphérèse (procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple), puis modifiés en culture pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. Avant d'entamer une étude thérapeutique chez des chiens malades, il est nécessaire de réaliser une phase de mise au point pour maîtriser la production ex vivo des cellules CAR-T canines. Ce projet a donc pour objectif de prélever des globules blancs circulants chez des chiens afin de les mettre en culture et mettre au point la technique permettant de les manipuler génétiquement pour en faire des cellules CAR-T.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point la manipulation ex vivo des globules blancs canins nécessaire à la production de cellules CAR-T dirigées contre la protéine spécifique de la fibrose. Cela permettra de démarrer les études de tolérance et d'efficacité avec une bonne maîtrise et standardisation de ces étapes cruciales.
Procédures
- Prélèvements sanguins 50 mL (3 maximum par chien de plus de 20 kg, espacés d'au moins 3 semaines), sur chien vigile. Durée totale 10 minutes, 1 minute pour le prélèvement proprement dit. - Prélèvement de globules blancs (1 fois) par cytaphérèse, sur chien placé sous anesthésie générale. Durée 2-3 heures.
Impact sur les animaux
Au cours des deux procédures, les animaux pourront subir un stress, lié à la contention et à la ponction sur chien vigile pour la première procédure, et à l'anesthésie générale pour la seconde. Tout sera mis en oeuvre pour réduire ce stress, en travaillant avec douceur, en rassurant les chiens par la voix et les caresses. Les chiens seront manipulés uniquement par des personnes qu'ils connaissent bien. Ils recevront une friandise à la fin du prélèvement réalisé vigile. Par ailleurs, s'agissant dans les deux procédures de ponctions veineuses, la formation d'un hématome pouvant générer une douleur n'est pas exclue. Une vigilance sera portée à la bonne coagulation, mais si un hématome se formait, le chien se verrait prescrire des anti-inflammatoires non stéroïdiens durant 3 jours après le prélèvement. Durant la cytaphérèse, le citrate introduit par la machine comme anticoagulant, et réinjecté au chien après passage du sang dans le circuit, peut avoir un effet hypocalcémiant (chute de la quantité de calcium dans le sang). Ce point sera surveillé attentivement par des dosages à intervalles réguliers. Une perfusion de gluconate de calcium sera systématiquement mise en place, et son débit ajusté à la concentration sanguine en calcium.
Devenir
Les chiens pourront être réutilisés dans la suite du projet. Dans le cas contraire, ils seront proposés à l'adoption.
Remplacement
Afin de travailler in vitro sur des lymphocytes T de chiens, il est nécessaire de pouvoir les prélever chez un individu vivant. L'utilisation d'animaux dans ce contexte ne peut donc être évitée.
Réduction
Le nombre de chiens prélevés, que ce soit par prélèvement de sang classique ou par cytaphérèse sera réduit le plus possible. Pour ce faire, chaque prélèvement réalisé sera exploité le plus possible in vitro afin de limiter le nombre de prélèvements nécessaires pour la mise au point technique prévue. Il est très probable qu'il ne sera pas nécessaire d'utiliser les 15 animaux prévus dans ce projet.
Raffinement
Les prélèvements par cytaphérèse seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress généré par ce prélèvement non douloureux mais long (2-3 heures). Au cours des deux procédures, une attention particulière sera portée à la coagulation correcte après le prélèvement. En cas d'hématome, celui-ci pouvant générer une douleur, une analgésie (anti-inflammatoires non stéroïdiens) sera mise en place après le prélèvement. Au cours des prélèvements par cytaphérèse, l'anticoagulant utilisé pouvant avoir un effet de diminution de la concentration sanguine en calcium, cette concentration (calcémie) sera étroitement surveillée, et le chien sera complémenté par une perfusion continue de calcium, dont le débit sera adapté en fonction de la calcémie. Si un chien avait une valeur de calcémie basse en fin de cytaphérèse, l'anesthésie générale ne serait stoppée qu'après retour à une calcémie normale. Les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.
Choix des espèces
L'étape préclinique de validation de l'efficacité du produit thérapeutique en développement est prévue chez le chien. La mise au point de la production des cellules CAR-T dans ce contexte ne peut donc se faire que dans l'espèce canine. Nous utiliserons des animaux adultes, afin que leur poids corporel soit supérieur à 20 kg, et donc compatible avec un prélèvement sanguin volumineux et une cytaphérèse.
Production de sang et sérum canins servant de base à la production d’un vaccin à usage vétérinaire.
- Production de routine
- Tests réglementaires
100 chiens de grande taille vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et jusqu'à trente jeunes adoptés par des associations. Prélevés de 200 à 250 ml de sang toutes les deux semaines pendant sept ans au maximum, sur animal vigile, ils fournissent le sang et le sérum servant à fabriquer un vaccin vétérinaire. Le porteur reconnaît que le confinement prolongé peut provoquer des troubles du comportement, stéréotypies, agressivité et craintes, et que l'âge des animaux à l'issue empêche leur réutilisation. Il justifie la mise à mort par la "sévérité" de la procédure et l'absence de méthode alternative de production.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire du sang et du sérum canins servant de base à la production d'un vaccin à usage vétérinaire. Le vaccin produit avec ces dérivés sanguins permet de protéger les animaux contre une maladie parasitaire pouvant être sévère, voire mortelle. La production annuelle (environ 150 litres de sérum et 100 litres de sang) est fonction des besoins estimés annuellement par le donneur d’ordre pour produire le vaccin à usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la production d’un vaccin vétérinaire luttant contre une maladie parasitaire chez les animaux pouvant être sévère, voire mortelle.
Procédures
L’ensemble des chiens est soumis à des interventions de prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Leur fréquence est d’un prélèvement de 200 ml toutes les 2 semaines environ. Occasionnellement et seulement pour les chiens les plus gros, le prélèvement pourrait être de 250 ml. Dans tous les cas, la fréquence respecte les périodes de repos nécessaires pour la pleine récupération de l’animal en fonction du volume prélevé selon les recommandations du Gircor. Chaque séance de prélèvement dure environ 1 heure, et le prélèvement en lui-même pour un animal prend quelques minutes. Lors d’une séance de prélèvement, le chien est amené avec quelques congénères dans la salle de prélèvement où ils restent une dizaine de minute avant de retourner dans leur box d’hébergement. Le prélèvement en lui-même ne prend que quelques minutes. Les animaux seront inclus dans ce projet pendant 7 ans maximum.
Impact sur les animaux
Au moment du prélèvement sanguin, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et du prélèvement ainsi qu’une sensibilité légère et transitoire au point de prélèvement. Les animaux sont hébergés durant toute la durée du projet dans un environnement protégé en bâtiment clos. De par leur gabarit et leur comportement naturel, les enrichissements standards ne sont pas adaptés. La durée de confinement pour chaque chien peut entrainer des perturbations comportementales (dominance, stéréotypie, stress). Ils peuvent par exemple être plus craintifs à la vue de nouveaux éléments ou agressif envers leur congénère (dominance). Une réflexion spécifique sur l’enrichissement et la socialisation de ces animaux est prise en charge par la SBEA afin de limiter ces nuisances comportementales.
Devenir
En raison de la sévérité de la procédure et au vu de l’âge des animaux à l’issue de la procédure, la plupart des animaux seront mis à mort car ils ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet. Au cas par cas, et sur avis vétérinaire, certains jeunes animaux pourront être adoptés par le biai d'associations spécialisées.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car il n’existe pas de méthode alternative pour produire des dérivés sanguins permettant la fabrication du vaccin vétérinaire en question.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet correspond au minimum requis pour répondre au besoin en sang et sérum du producteur du vaccin. De plus, le choix d’un chien de grande taille permet de prélever des volumes sanguins importants tout en respectant son bien-être et ainsi optimiser le nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre de chiens dans ce projet est limité car les animaux inclus sont utilisés sur une longue période pouvant aller jusqu’à 7 ans. Cela représente le meilleur compromis entre le bien-être et le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
La fréquence et le volume des prélèvements sanguins sont déterminés en fonction du respect du bien-être et de la santé des animaux et respectent les recommandations du Gircor. Les volumes prélevés sont adaptés aux besoins du laboratoire vétérinaire producteur du vaccin qui sont évalués chaque année. Le prélèvement est réalisé par des personnes formées et les techniques utilisées visent à limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Un suivi attentif des animaux est réalisé afin de détecter tout signe de douleur ou d’inconfort au cours du prélèvement. Des compléments vitaminés sont donnés aux animaux à l’issue de la séance de prélèvement afin d’optimiser leur récupération et des bilans hémato-biochimiques sont réalisés régulièrement pour détecter toute perturbation des paramètres sanguins le cas échéant. Pour minimiser la prise de poids des animaux sur le long terme, leur poids est suivi régulièrement et leur alimentation est de composition adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement, en cas d’observation d’un signe clinique anormal le vétérinaire sera informé et pourra mettre en place des soins appropriés après examen de l’animal. Une réflexion spécifique sur l’enrichissement et la socialisation de ces animaux est prise en charge par la SBEA, elle mettra en place régulièrement de nouvelles actions afin de limiter les nuisances comportementales (stress, dominance, stéréotypie).
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de produire du sang et du sérum canins, donc à partir de prélèvements sanguins sur des chiens. En raison de la fréquence et du volume des prélèvements sanguins réalisés, les animaux utilisés sont des chiens adultes de grande taille (Golden retriever), avec un poids supérieur à 25 kg. Les animaux sont prélevés de l'âge de 12 mois à 8 ans maximum.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de produits vétérinaires chez le chat et le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 200
Issus parfois de procédures antérieures de niveau léger ou modéré, 200 chats et 200 chiens, soit 400 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, aucune mise à mort n'étant déclarée. Ils reçoivent des produits vétérinaires en une ou plusieurs administrations, éveillés ou anesthésiés, et subissent prises de sang et recueils d'urine, de salive, de fèces ou de poils, avec un hébergement individuel et des mises à jeun que le porteur dit sources de stress, et de possibles vomissements. L'objet est de fixer la dose et la voie d'administration de futurs médicaments pour chats et chiens, avant les études réglementaires exigées pour leur autorisation de mise sur le marché. À l'issue, 150 seront adoptés et 250 réutilisés dans de futures procédures, dont 150 chats, le porteur précisant qu'un individu présentant une "anxiété importante" ou une maladie chronique ne sera pas adoptable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de nouveaux produits vétérinaires destinés aux chats et aux chiens. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Il pourra concerner toute sorte de produits vétérinaires présentant un bénéfice pour la santé des chiens ou des chats ou leur apportant un meilleur bien-être. Il pourra s’agir par exemple d’antiparasitaires, d’antibiotiques, d’antidiabétiques, d’antihypertenseurs, ou de produits destinés aux maladies dermatologiques, respiratoires, cardiaques, métaboliques, nerveuses ou oculaires.
Bénéfices attendus
La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance active contenue dans un médicament après son administration. La pharmacodynamie a pour but d’étudier l’action exercée par un ou plusieurs principes actifs sur l’organisme, en particulier les effets biochimiques et physiologiques des médicaments sur l'organisme. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie contribuent à expliquer la relation entre la dose et la réponse, c'est-à-dire, l'effet du produit. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Ces informations sont nécessaires à l’autorisation de mise sur le marché de nouveaux produits.
Procédures
Les administrations
Impact sur les animaux
On ne s’attend pas à des effets secondaires notables. En effet, la plupart des produits à l’étude ont déjà fait preuve de leur innocuité chez d’autres espèces. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Stress dû à la contention - Douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements - Stress dû à l’hébergement individuel et/ou à la mise à jeun - Régurgitation / vomissements suite à l’administration
Devenir
Un animal présentant des troubles du comportement (ex: anxiété importante) et/ou une pathologie chronique ne sera pas adoptable.
Remplacement
Les modèles in silico et/ou in vitro/ex vivo permettent de sélectionner des molécules potentiellement efficaces. Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques d’un futur candidat médicament.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (3 ou 4 animaux par groupe). Il sera ensuite calculé pour les études suivantes selon la variabilité entre individus observée antérieurement et pourra atteindre jusqu’à 10 animaux. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique dont la durée optimale est de 7 jours. Les animaux font l’objet d’un soin de qualité avec respect de leur bien-être. Les chats et les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. Un training est réalisé en renforcement positif (friandises, caresses), afin de limiter le stress lié aux actes techniques (contention, administrations, prélèvements) et aux conditions d’études (hébergement individuel, alimentation…). La durée de ce travail est indéterminée, il sera réalisé jusqu’à ce que les animaux ne montrent plus de signes de stress contre-indiquant leur entrée dans la procédure (le cas échéant). Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements, les opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal et une anesthésie et/ou analgésie et/ou un changement du site peuvent être mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Des critères d'alertes spécifiques aux espèces chien, chat sont mises en place et appliquées. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. La SBEA garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces cibles pour les produits. Des données concernant l’espèce doivent être fournies au dossier d’AMM. Les chats et chiens utilisés ont plus de 2 mois. L’âge dépend des besoins pour les études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché.
Études de pharmacocinétique de formulations destinées aux animaux
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Chats : 250
Chiens : 250
900 animaux non-humains, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, chats et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des administrations répétées de formulations vétérinaires par voies variées et de multiples prélèvements de sang, jusqu'à dix chez les chiens et chats sur 48 heures. Le porteur indique que les rongeurs sont tués en fin d'étude tandis que les 250 chiens et 250 chats sont réutilisés puis proposés à l'adoption. Il qualifie ces études de "stricte nécessité" réglementaire, ne pouvant selon lui être remplacées pour la mise sur le marché des produits.
Objectifs
Lors de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le screening de substances actives ou le choix des ingrédients de la formulation est basé entre autres sur leur propriétés pharmacocinétiques. La connaissance des principes actifs et/ou ingrédients (bibliographie, historique des études etc...), l’usage de méthodes alternatives in silico et in vitro ainsi que de la modélisation pharmacocinétique permet une première sélection mais la complexité d’une formulation (mélange d’excipients, pH, volume injecté, etc.) nécessite une ou plusieurs évaluations préliminaires avant le choix définitif de la formulation (sélection ou optimisation de formulations) et de son utilisation (posologie, voie d’administration). En amont des essais sur espèces cibles, il est possible de réaliser des études sur des rongeurs. Si les résultats sont concluants, le produit pourra être testé sur la ou les espèces cibles.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produits.
Procédures
●Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 10 prélèvements sur 48h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. - Rongeurs : 1 minute par prélèvement . Souris, rats : maximum 1% du volume circulant total sur 24h et maximum 15% du volume circulant total sur une période de 28 jours. - Hamsters, cobayes : maximum 5 prélèvements par 48 h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. ●Prélèvements avec écouvillons : nasal, salive, larmes. Chiens et Chats : 1 minute par prélèvement. Rongeurs : 1 minute par prélèvement sur animal anesthésié. ●Prélèvements non invasifs : poils : sans restriction de nombre. Des administrations de produits pour toutes les voies : -1 traitement par voie (durée environ 5 minutes chez les carnivores et 1 minute chez les rongeurs. Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), gingivale, parentérale (entre autres sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch), auriculaire.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : écouvillon oral), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.
Devenir
Pour les rongeurs, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Pour les carnivores, l’ensemble des animaux sont ré-utilisés puis proposés à l’adoption.
Remplacement
Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant lors d’études préliminaires.
Réduction
Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : - soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée - soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets sur les 5 ans à venir et des animaux déjà utilisés sur ceux-ci. Les études peuvent être réalisées selon différents designs : - design croisé (cross-over) : tous les animaux reçoivent successivement tous les traitements (test et référence) dans un ordre aléatoire. L’essai croisé utilise le sujet comme son propre témoin ; - design en parallèle : chaque groupe d’animaux reçoit un seul type de traitement. L’essai en parallèle utilise généralement un groupe témoin versus un ou des groupes traités car les groupes sont indépendants entre eux ; - design par étapes : quand le nombre de sujets est important, l’étude peut être réalisée en deux étapes avec un nombre inférieur de sujets. Si la première étape (plus de 50% des sujets totaux) ne permet pas de répondre à la question, la seconde étape est réalisée avec le nombre de sujets pour compléter le nombre total. Entre chaque période de traitement, une période d’attente sera définie pour permettre aux animaux de récupérer et/ou permettre l’élimination du produit administré précédemment (principe actif et métabolites) ou de son effet pharmacologique. Des tests statistiques seront adaptés à chaque design d'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. - Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal - Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. - Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). - Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies. - En cas d’obligation d'héberger les animaux individuellement, des mesures complémentaires seront mises en place: une présence augmentée du personnel, possibilité pour les animaux de voir, sentir et entendre leurs congénères, augmentation du nombre de jouets dans l’hébergement, un suivi renforcé par les vétérinaires avec une attention particulière sur le comportement des animaux.
Choix des espèces
De façon réglementaire, les études de pharmacocinétique doivent être menées sur la ou les espèces de destination. Il est possible d’utiliser les rongeurs dans les études préliminaires de sélection de nouvelles molécules, formulations, voies d’administration ou posologie si pertinentes et avant les études sur espèces de destination. Les études sont réalisées chez des animaux sevrés, représentatifs de l’espèce de destination et de son statut physiologique, ceci comprenant entre autres l’âge ou la maturité sexuelle. Ces choix sont faits selon l’utilisation future du produit.
Variabilité de fréquence cardiaque chez un modèle canin de myopathie de Duchenne : investigation des anomalies par modulation pharmacologique.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, six chiens atteints d'une forme canine de myopathie de Duchenne et six chiens sains. Ils reçoivent trois molécules par voie orale ou par patch, un enregistrement ECG continu non invasif et neuf prises de sang, pour comprendre une anomalie cardiaque précoce. À l'issue, les chiens sains sont proposés à l'adoption et les chiens GRMD réutilisés dans un autre projet, sans mise à mort prévue. Le porteur affirme que cette anomalie ne peut être modélisée in vitro et que le chien GRMD est le modèle "le plus fidèle" de la maladie humaine.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui touche le muscle chez l'enfant. Les patients sont contraints à l'usage du fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans, et décèdent d'insuffisance respiratoire ou cardiaque vers l'âge de 30 ans. Le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy) reproduit de manière fidèle la maladie humaine, dans un organisme de grande taille, pouvant être suivi sur le long terme. Il occupe donc une place pré-clinique immédiate dans le développement de thérapies pour la myopathie de Duchenne. Au cours d'une étude visant à décrire les anomalies de l’électrocardiogramme des chiens GRMD à l'aide d'enregistrements holter réalisés au cours d'un suivi longitudinal de plusieurs années, la proximité des anomalies rencontrées chez le chien et chez l'Homme, tant dans leur nature que dans la séquence de leur survenue, a pu être démontrée. Cependant, une anomalie, encore jamais investiguée chez les patients, a été identifiée et est celle qui survient le plus précocement chez le chien et permet de prédire, plusieurs mois auparavant, l’atteinte fonctionnelle cardiaque ultérieure. Cette même anomalie a été relevée dans plusieurs études chez l'Homme, dans des contextes pathologiques divers, comme un marqueur de mauvais pronostic très robuste. L'origine de cette anomalie est cependant mal comprise, mais plusieurs hypothèses sont avancées. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’origine de cette anomalie chez le chien GRMD en ciblant par voie pharmacologique les différents acteurs possiblement impliqués dans sa survenue. Cela permettra de mieux comprendre cette anomalie électrocardiographique très précoce et prédictive de la dégradation de la fonction cardiaque et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre l'origine de cette altération électrocardiographique chez le chien GRMD, et plus largement de contribuer à la compréhension de l'origine de la puissance générée dans les très basses fréquences en variabilité de fréquence cardiaque. Cette anomalie survenant précocement dans le cours de la maladie, et semblant liée à la dégradation ultérieure de la fonction cardiaque, comprendre son origine permettra éventuellement d'identifier des cibles thérapeutiques permettant de retarder la survenue de la dysfonction cardiaque chez les chiens GRMD et a fortiori chez les patients atteints de myopathie de Duchenne.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les seuls gestes invasifs effectués sur les animaux seront des prises de sang (9 prélèvements), effectués sur animaux vigiles, en prenant soin d'effectuer une contention la plus douce possible, de prendre le temps de rassurer les animaux, d'effectuer un prélèvement rapide (durée du prélèvement en lui-même = moins d'une minute) et indolore, et de récompenser les animaux après chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les 3 molécules testées sont des molécules utilisées chez le chien, pour lesquelles les doses sont bien connues ainsi que les potentiels effets secondaires. Ces derniers seront principalement à surveiller pour ce qui concerne le donneur de NO (trinitrine). Une baisse importante de la pression artérielle pourrait être observée chez les animaux en cours de traitement. Afin d'éviter tout incident grave lié à une hypotension, les chiens seront surveillés de très près durant les premières heures de traitement, et leur pression artérielle (brassard) sera mesurée toutes les heures, la fréquence de ces mesures sera augmentée en cas de chute de plus de 20 %. Si la pression artérielle chute en dessous de 100 mm Hg, le patch de trinitrine sera immédiatement retiré. Le retrait des électrodes adhésives utilisées pour l'ECG pouvant être douloureux pour la peau, un anti-adhésif sera préalablement appliqué.
Devenir
Les chiens sains utilisés dans ce projet seront mis à l'adoption à l'issue du projet. Les chiens GRMD pourront être réutilisés dans un autre projet compatible, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné.
Remplacement
L'anomalie de l'électrocardiogramme étudiée dans ce projet ne pourrait pas être modélisée in vitro/ex vivo. En effet, il s'agit de mesurer la modulation de fluctuations des intervalles entre pulsations cardiaques, celle-ci étant sous le contrôle de facteurs multiples hormonaux, neurovégétatifs, vasculaires qui ne peuvent donc être étudiés autrement que dans un organisme vivant. L'anomalie que nous cherchons à comprendre ayant été identifiée chez les chiens GRMD, ce projet sera donc conduit chez ces animaux.
Réduction
Grâce à la variabilité connue de l'indice étudié chez les chiens GRMD, nous avons pu déterminer que 6 chiens seraient nécessaires et suffisants pour démontrer une augmentation de cet indice à une valeur intermédiaire entre celle mesurée chez les chiens GRMD non traités et celle observée chez des chiens sains du même âge. Dans un souci de réduction, les 6 chiens GRMD inclus dans ce projet seront réutilisés d'un projet précédent, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné, et/ou pourront être réutilisés dans un autre projet après celui-ci. De plus, les chiens sains ne seront inclus que si les données obtenues chez les chiens GRMD ne vont pas dans le sens de celles attendues au vu des données bibliographiques disponibles sur des chiens sains. Dans ce cas les chiens sains seront inclus afin de vérifier les données obtenues dans les conditions expérimentales de l'étude, sur des chiens sains de la même souche que les chiens GRMD.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous aurons recours à un enregistrement de l'ECG non invasif (électrodes adhésives de surface), et de type holter, permettant au chien de mener une vie normale tout en permettant l'enregistrement continu de son électrocardiogramme. Cela permet une réduction du stress et une meilleure représentativité des données obtenues par rapport à un enregistrement ponctuel. Par ailleurs, les trois molécules dont nous testerons l'effet seront administrées de manière également non invasive, soit par voie orale dans une friandise, soit par diffusion continue à l'aide de patches. Les prises de sang seront effectuées par des personnels formés à la fois au geste technique et aux méthodes de réduction du stress des animaux pendant un geste médical. Les animaux seront récompensés (voix, caresses et friandise) après chaque prélèvement. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme. Leur état clinique est étroitement surveillé : pesée et prise de température quotidienne et présence d'un vétérinaire 7j/7.
Choix des espèces
Le chien GRMD est le modèle de DMD présentant la plus grande pertinence translationnelle. En effet, il mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle murin, dans un organisme de grande taille, et permet donc de modéliser au plus près, au stade préclinique, les enjeux qui seront rencontrés dans les essais cliniques chez les patients. Dans le cadre de ce projet plus précisément, le fait de travailler sur les chiens permet de se placer dans le seul modèle animal qui reproduit de manière fidèle les anomalies électrocardiographiques décrites chez les patients DMD. Les chiens inclus dans cette étude devront être d'âge supérieur à 6 mois afin que les anomalies électrocardiographiques étudiées soient clairement présentes, et également que leur poids corporel soit compatible avec les dispositifs d'administraton utilisés (patches notamment), mais inférieur à 24 mois afin de ne pas être dans une situation d'insuffisance cardiaque.
Preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps monoclonal pour le contrôle du prurit induit par une cytokine chez le chien.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
15 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un autre projet après une période de repos. On leur injecte à plusieurs reprises une cytokine par voie intraveineuse pour provoquer délibérément des démangeaisons, filmées pendant deux heures, afin de tester un anticorps monoclonal contre la dermatite atopique. Le porteur indique que l'objectif final est la commercialisation d'un nouveau produit et décrit le chien comme l'espèce cible, un test sur une autre espèce ne serait pas informatif selon lui. Les démangeaisons provoquées poussent les chiens à se gratter, se mordiller et se frotter, effets présentés comme transitoires.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité chez le chien d’un anticorps monoclonal sur les démangeaisons induites par une cytokine. L’objectif final étant la commercialisation d’un nouveau produit permettant de traiter la dermatite atopique qui est la plus fréquente des maladies cutanées allergiques du chien. Un objectif secondaire de ce projet est de comparer l’efficacité de deux cytokines, produites sur deux systèmes cellulaires différents, sur l’induction du prurit chez le chien.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la production d’un nouveau produit dans le cadre de développement de nouvelles options thérapeutiques dans la prise en charge de la dermatite atopique chez le chien. La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique qui réduit significativement la qualité de vie de l’animal.
Procédures
La première phase expérimentale se déroulera sur 24 jours de prétests incluant les interventions suivantes pour 12 chiens : 1. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose d’un cathéter ou micro-perfuseur) à 6 ou 7 jours d’intervalles pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures (J-20, J-14 et J-7) 3. Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles pour la réalisation d’analyses sanguines (J-7). Puis la seconde phase expérimentale se déroulera sur 62 jours pour 8 à 12 chiens et incluant les interventions suivantes : 1. Une injection sous cutanée d'anticorps monoclonal sur animaux vigiles au démarrage de l’étude (J0). 2. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose de cathéter ou micro-perfuseur) pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures à 30 ou 31 jours d’intervalles (J1, J30 et J61). 3. Quatre prélèvements sanguins sur animaux vigiles à 30 ou 31 jours d’intervalles (J0, J14, J30 et J61) pour analyses sanguines.
Impact sur les animaux
L’injection de la cytokine par voie intraveineuse provoque délibérément une démangeaison transitoire chez le chien qui se dissipe naturellement en 1 à 2 heures. Le chien peut se gratter, se lécher, se mordiller les pattes, le flanc ou la région anale, trottiner, secouer la tête et se frotter le corps. Aucune lésion durable n'est attendue. Un érythème au niveau des zones léchées ou grattées plus intensément est cependant possible et réversible très rapidement, soit en moins de 24 heures. Les effets indésirables potentiellement attendus suite à l’administration du produit d’essai ou de référence sont mini¬mes. Des troubles gastro-intestinaux et une réaction locale au site de l’injection peuvent être observés dans de rares cas. Au moment des prélèvements sanguins ou injections de produit par voie intraveineuse ou sous-cutanée, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre projet, suite à un repos suffisant.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. D’autre part, aucune étude alternative ne peut à ce stade remplacer l’étude sur l’espèce cible. Il s'agit d'une étude pilote "preuve de concept" avant de s’engager sur la voie des études d’enregistrement.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet correspond au minimum requis pour réaliser une preuve de concept. Ce nombre ne permet pas une analyse de non-infériorité mais permet d'une part de démontrer que le produit test réduit le prurit chez les chiens recevant le challenge avec la cytokine et d'autre part que cette réduction est comparable à celle du produit de référence, appliqué à la même dose.
Raffinement
La salle de test est séparée de la salle d’hébergement habituelle des animaux. Les chiens, par groupe de 3 individus, seront habitués à l’environnement de cette salle de test pendant minimum 14 jours avant le début de l’étude pour limiter leur stress. Des enrichissements seront présents dans les box (jouets, radio…). Durant l’étude, les volumes administrés respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. Après l’injection de la cytokine, les animaux seront filmés et suivis pendant 2 heures afin de détecter tout signe de prurit très intense. Dans ce cas, l’animal concerné sera pris en charge immédiatement. Les mesures mises en place dépendront de la gravité et la nécessité de l’exclusion de l’étude sera évaluée au cas par cas. Si les résultats du produit d’essai sont statistiquement inférieurs au produit de référence lors du premier test de la seconde phase expérimentale, l’étude sera stoppée. Il ne sera pas nécessaire de faire les 2 tests suivants. Durant toute la durée du projet l’état clinique des chiens sera suivi et documenté (poids, état de la peau, condition générale, appétit, état des selles). Des analyses hémato biochimiques sont prévues pour surveiller les paramètres physiologiques des animaux.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du produit testé. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. Les animaux seront des adultes de 8 à 15 kg, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement.
Innocuité de l’instillation vésicale d’une solution bactérienne probiotique chez la chienne
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles urogénitaux
10 chiennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres projets avant d'être proposées à l'adoption. Elles subissent deux anesthésies générales pour des endoscopies des voies urinaires, des prélèvements de sang et d'urine répétés et l'instillation d'une suspension bactérienne dans la vessie. Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucune séquelle, l'objectif étant de vérifier l'innocuité d'un probiotique avant un usage clinique. Il justifie le choix de la chienne par la ressemblance de ses infections urinaires avec celles de la femme.
Objectifs
L’infection bactérienne du tractus urinaire est l’une des maladies infectieuses les plus fréquentes aussi bien chez l’Homme que chez le chien et l’une des principales causes de prescription d’antibiotiques. Ces traitements peuvent favoriser la sélection de souches résistantes. Face à l’augmentation croissante de germes résistants, il est nécessaire d’envisager des méthodes alternatives aux antibiotiques. L’utilisation in situ de souches bactériennes (Escherichia coli ) a été décrite et utilisée avec succès pour traiter des infections urinaires récidivantes spontanées. Notre objectif est de démontrer l'innocuité d'une instillation vésicale d'une suspension bactérienne contenant Escherichia coli chez la chienne avant une utilisation en contexte clinique. Notre hypothèse est que cela n'entraîne aucune répercussion sur l'état général et les voies urinaires de l'animal, comme suggéré par les données de la littérature et les études in vitro et qu'elle devrait en revanche présenter des propriétés antimicrobiennes contre plusieurs espèces d'entérobactéries.
Bénéfices attendus
Les souches probiotiques ont pour vocation d'être utilisées pour traiter des infections urinaires entraînant des manifestations cliniques, dues à des bactéries résistantes aux antibiotiques. Si l'expérimentation démontre l'innocuité, ces souches pourront faire l'objet d'essais cliniques chez l'animal de compagnie puis chez l'Homme dans des situations où l'administration d'antibiotiques est impossible ou néfaste pour l'animal ou la santé publique (émergence de résistances).
Procédures
Les chiennes vigiles seront soumises à des prélèvements sanguins (2 prélèvements de 8 mL à la jugulaire à 7 jours d'intervalle) et urinaires (5 prélèvements de 10 mL sur 1 semaine). Elles subiront par ailleurs 2 examens endoscopiques à 15 jours d'intervalle sous anesthésie générale (incluant de l'analgésie) pour une durée de 20-30 min chacune. Une instillation dans la vessie de la solution bactérienne sera également faite sous sédation.
Impact sur les animaux
Les chiennes subiront lors de la phase expérimentale 2 anesthésies générales à 15 jours d'intervalle pour la procédure endoscopique. L'endoscopie des voies urinaires n'est associé qu'à un inconfort léger qui sera traité par l'administration d'un analgésique adapté. La procédure dure environ 20 minutes. Chaque chienne bénéficiera de la pose d'une cathéter veineux périphérique dans la veine céphalique et d'une intubation trachéale pour sécuriser la procédure anesthésique. Les phases d'induction, de maintien et de réveil seront surveillées constamment par un vétérinaire jusqu'au réveil complet de l'animal. Aucune séquelle n'est attendue sur les chiennes. Chaque chienne subira un sondage urétral sous sédation. Le sondage urétral ne présente qu'un inconfort léger et ne dure que quelques minutes. Aucune séquelle n'est attendue. La suspension bactérienne placée dans la vessie n'est ni visqueuse, ni irritante. Durant la phase expérimentale, les chiennes subiront au total 2 prélèvements sanguins veineux de 8 mL à chaque fois (ponction jugulaire), à 1 semaine d'intervalle. La ponction veineuse n'est associée qu'à un inconfort léger. Les chiennes subiront enfin 5 prélèvements urinaires de 10 mL sur une semaine. Ce geste sera pratiqué sous contrôle échographique pour assurer sa réussite et sa rapidité. Aucune séquelle n'est attendue suite à ces prélèvements.
Devenir
Les chiennes utilisées pourront participer à d'autres projets conduits par l'unité de recherche avant d'être proposées à l'adoption.
Remplacement
Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet dont le but est d'étudier l'innocuité chez l'animal de souches probiotiques non pathogènes d'E. coli dans les voies urinaires du chien. Par ailleurs, le choix de ce modèle est justifié par la volonté de se rapprocher d'une future utilisation dans un contexte clinique chez l'animal de compagnie, puis chez l'Homme, la chienne présentant des infections urinaires dont la physiopathologie et l'expression clinique sont similaires à ce qui est rencontrée en médecine humaine, particulièrement chez la femme.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en anticipant l'apparition d'effets indésirables chez moins de 10% des individus. Il n’existe que peu de données sur l’innocuité d’une telle procédure. La seule publication récente fait état de l’absence complète d’effets indésirables identifiables à partir de 6 chiennes. Cette étude a été réalisée dans des conditions très similaires : même race, même sexe, même âge. Avec ce résultat (seul disponible) il n’est pas possible d’utiliser un test statistique de calcul d’effectif. Dans l’optique d’une utilisation clinique future, pour augmenter la puissance statistique et améliorer la sensibilité, un effectif de 10 chiennes recevant la suspension bactérienne est considérée pertinente. Ce nombre s'avère être le minimum requis pour atteindre notre objectif de démontrer l'absence d'effet néfaste d'une instillation vésicale de notre solution bactérienne.
Raffinement
Les chiennes seront hébergées dans des conditions compatibles avec leurs besoins (logement en binôme dans des chenils suffisamment grands sur litière adaptée). Elles auront accès à l'extérieur au moins une fois par jour et auront constamment accès à l'eau. A l'exception des journées où les chiennes seront anesthésiées ou sédatées, elles seront nourries une fois par jour, le matin. Lors des anesthésies/sédations, elles ne seront nourries qu'après réveil complet. A l'occasion des endoscopies, un protocole d'analgésie adapté est mis en place pendant et dans les heures qui suivent afin de garantir l'absence de douleur. Les prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés par du personnel formé à ces actes, après un entraînement préalables des animaux à la contention pour minimiser le stress lors de la procédure expérimentale. Les chiennes sont a minima visitées deux fois par jour. Après chaque procédure sous anesthésie, elles font l’objet d’une surveillance accrue (toutes les heures) dans les 4h post-examen puis 2 fois par jour pendant la semaine qui suit. Sont alors notés : le comportement général, la prise alimentaire, les signes d’atteinte du bas appareil urinaire (douleur à la miction, sang dans les urines, difficulté à uriner, mictions répétées, léchage génital excessif), signes de douleur abdominale. Quotidiennement, un examen clinique est réalisé incluant notamment la prise des constantes vitales. Ces informations sont consignées dans un tableau de scoring et gradé de 0 (absent/normal) à 4 (très marqué/modifié). Toute modification pouvant trahir la présence de douleur (score ≥1) sera utilisée comme point limite. L'animal concerné sera examiné immédiatement par l'un des vétérinaires impliqués dans l'étude et, selon le contexte, des examens complémentaires pourront être réalisés pour déterminer l'origine de ces signes (bilan sanguin/urinaire, imagerie). Autant que de besoin, un traitement analgésique sera mis en place immédiatement (méloxicam 0,1 mg/kg). La réponse inadéquate à l’ administration du traitement analgésique et/ou la mise en évidence d’une complication inattendue constitueront un critère d’arrêt. La chienne atteinte ne suivra pas la fin de la procédure expérimentale. Un traitement antibiotique visant la bactérie utilisée (amoxicilline 10 mg/kg matin et soir) sera utilisée en première intention, une culture urinaire avec antibiogramme sera réalisée pour ajuster éventuellement le traitement.
Choix des espèces
La chienne est une espèce particulièrement concernée par les infections urinaires, il s'agit de l'une des maladies infectieuses les plus fréquentes dans cette espèce. L'expérimentation doit se placer le plus proche possible du contexte clinique de l'utilisation de EcN2.0. Cliniquement, l'infection urinaire de la chienne est proche de celle de la femme. Ainsi nos résultats pourront être en partie extrapolés dans l'optique d'une utilisation en médecine humaine. Les chiennes seront âgées de 1.5 an, les infections urinaires étant davantage fréquentes chez les adultes.