Carnivores

28 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants puis réutilisés pour des travaux d'enseignement ou proposés à l'adoption. Une inflammation douloureuse est provoquée à la patte par injection de kaolin sous anesthésie, avec un pic de douleur autour de 24 heures, pour tester un candidat vaccin anti-NGF censé soulager les douleurs d'arthrose. Les chiens subissent aussi jusqu'à huit prélèvements sanguins et l'administration du vaccin ou d'un traitement de comparaison. Le porteur affirme que le modèle est "complètement réversible" au bout de huit semaines et justifie l'étude par la "nécessité" de tester la réponse de l'"organisme entier" chez l'espèce cible.

Objectifs

Le NGF (Nerve Growth Factor) est un polypeptide impliqué dans la croissance, la prolifération et la survie des neurones et d'autres cellules. Le NGF semble aussi jouer un rôle important dans la sensiblisation des nocicepteurs après une blessure tissulaire. Il a été montré que l'inhibition par un anticorps monoclonal de la signalisation cellulaire médiée par le NGF permet de soulager les douleurs ostéoarticulaires. Un nouvel anticorps monoclonal, le bedinvetmab, est récemment disponible en médecine vétérinaire pour soulager ces douleurs ostéoarticulaires chez le chien. Un nouveau candidat vaccin est également à l'étude pour sa capacité à favoriser la production d'anticorps anti-NGF endogènes. Les objectifs de notre projet sont: (1) de tester chez le chien, l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin sur la réduction de la douleur dans un modèle de douleur inflammatoire au kaolin, (2) de comparer l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin à celle du bedinvetmab (Librela®), (3) de quantifier les concentrations en anticorps monoclonaux aux cours du temps après administration du candidat vaccin, (4) de vérifier que l'inhibition de la signalisation cellulaire médiée par le NGF ne perdure pas quand une nouvelle douleur apparait à distance de la vaccination.

Bénéfices attendus

L'arthrose est un maladie dégénérative, incurable et douloureuse dont la prévalence chez le chien est supérieure à 20%. Ce chiffre est par ailleurs en constante augmentation du fait de l'allongement de la durée de vie des animaux et de facteurs aggravants comme l'obésité. Cette pathologie entraine une douleur et un handicap majeur avec perte de mobilité et état dépressif de l'animal. Les premiers résultats des thérapies impliquant des anticorps monoclonaux sont prometteurs quand à l'amélioration de la qualité de vie de nos animaux. Cependant, la nécessité de renouveller les administrations de bedinvetmab régulièrement (en général tous les mois) présente le risque d'une mauvaise observance par le propriétaire de l'animal. Il est intéressant de déterminer ici si la mise en place d'un vaccin permettant l'activation d'anticorps endogènes pourrait permettre de prolonger la durée d'efficacité du traitement et d'espacer les administrations.

Procédures

1) Administration du candidat vaccin ou du placebo à 14 animaux; 2 administrations; 1 minute maximum; 2) Administration du bedinvetmab ou de meloxicam à 14 animaux; 1 seule administration; 1 minute maximum; 3) Prélèvements sanguins pour sérologie; 3 prélèvements sur 14 animaux et 8 prélèvements sur les 14 autres animaux; 1 minute maximum; 4) Administration de kaolin en sous-cutanée sous anesthésie générale; 1 seule fois pour 14 animaux et 2 fois pour les 14 autres animaux; 30 minutes/animal; 5) Pesée hebdomadaire de tous les animaux; 5 à 10 minutes/animal; 6) Mesures des paramètres pharmacodynamiques; 1h/jour/animal au minimum pour chaque jour de mesure.

Impact sur les animaux

Vu les très bons résultats d'innocuité obtenus après administration d'anticorps monoclonaux exogènes, il y a très peu de risque de réaction au vaccin. La nuisance majeure va résider dans la création d'une inflammation à la patte par administration de kaolin en sous-cutanée. Cependant, ce modèle a déjà été utilisé par la passé et présente l'avantage d'induire une inflammation limitée dans le temps et totalement réversible, ce qui permet de replacer les chiens sans sequelles après ce type d'étude. En effet, le pic de douleur survient autour de 24h après l'administration de kaolin. Cette douleur plus aiguë disparaît ensuite rapidement (autour de 48-72h) même lors d'un traitement placebo. Des paramètres moins critiques comme une diminution d'oedème au niveau de la patte (altérant peu les déplacements du chien mais permettant tout de même de mesurer l'efficacité d'un anti-inflammatoire) perdurent ensuite jusqu'à 10-15 jours après l'administration de kaolin. Enfin, le modèle est complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens. Il est à noter également que le candidat vaccin étant administré avant induction de l'inflammation, le pic de douleur devrait être plus faible pour ce groupe.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure. Ils pourront être réutilisés pour des travaux d'enseignement (procédures légères) après accord du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur ou seront proposés à l'adoption. Le modèle étant complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens, la réutilisation ou le placement des animaux pourra intervenir dès les 2 mois suivant la dernière inflammation au kaolin.

Remplacement

Le but de ce projet étant de tester la réponse de l'organisme entier à un vaccin (efficacité contre une douleur inflammatoire, cinétique d'anticorps, absence de réaction au vaccin), il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. Cependant, les études sont menées sur l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché.

Réduction

Nous souhaitons déterminer si le nouveau candidat vaccin est au moins aussi efficace que le bedinvetmab pour réduire une douleur d'origine inflammatoire chez le chien. Pour déterminer le nombre n d'animaux par groupe, un calcul de puissance a été donc effectué à partir de données de la littérature sur l'effet du bedinvetmab sur la réduction de la douleur chez des chiens atteints d'ostéoarthrose. Le calcul de puissance utilisé était le suivant: nA=2x(s2/Δ2)x(za/2-zpuis)2, avec nA le nombre de sujets par groupe, s2 la variance du paramètre à mesurer, Δ la différence minimale attendue pour ce paramètre, zα/2=1.96, zpuis=-0.842. De plus, la résistance à/la sensation de douleur étant un paramètre qui peut être influencé par le sexe, le nombre d'animaux par groupe a été doublé afin d'avoir n mâles et n femelles dans chaque groupe. Enfin, un animal par groupe a été ajouté au cas où un des animaux devrait être exclu de l'étude pour cause de traitement concomitant visant à réduire une douleur trop importante causée par l'administration de kaolin.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions du laboratoire puis entraînés aux manipulations pendant 25 jours avant l'administration du vaccin, et le seront aussi entre l'administration du vaccin et la réalisation de l'inflammation. Cela permettra de les habituer en douceur aux différents manipulateurs et d'obtenir des mesures de paramètres fiables tout au long du projet. De plus, les deux principaux expérimentateurs qui seront en charge des animaux tout au long du projet sont formés en éducation canine ainsi qu'aux différentes techniques de medical training. Les animaux seront hébergés en groupe dans des boxs comportant des jouets et auront accès quotidiennement à des courettes extérieures.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché. Les animaux seront âgés de 8 mois à leur arrivée, leur jeune âge facilitant leur capacité d'apprentissage et d'entrainement aux différentes mesures qui seront effectuées. Il ne faut pas d'animaux de moins de 6 mois car leur système immunitaire n'est pas encore totalement mature et différe trop de celui des chiens adultes voire plutôt âgés pour lesquels le vaccin souhaite être développé. L'étude sur des animaux âgés ou souffrant de problèmes ostéoarticulaires sera effectué par la suite en fonction des résultats obtenus au cours de ce projet.

25 chiens et cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer par IRM fonctionnelle des dispositifs d'anesthésie dentaire. Chaque animal reçoit un cathéter veineux et des anesthésies générales répétées, avec injection d'anesthésique dentaire à l'aiguille ou par un nouveau dispositif, parfois complétée d'un courant de iontophorèse. Le porteur indique que les chiens pourront rejoindre l'effectif permanent pour être réutilisés, alors que les cochons seront "majoritairement euthanasiés" faute de réutilisation possible. Il affirme que l'évaluation de la douleur en temps réel par IRM ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

L’anesthésie buccodentaire est actuellement effectuée de manière invasive via l’utilisation d’une aiguille. Or, cette dernière génère douleur et apréhension du patient. Le but du projet est de travailler sur des technologies en rupture permettant de sursoir à l’utilisation d’aiguilles métalliques d’une longueur supérieure au cm. L’évaluation de ces nouveaux dispositifs d’anesthésie dentaire sera effectuée grâce à la technique de l’Imagerie par Résonance Magnétique fonctionnelle (IRMf). L’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive et non-ionisante utilisant les propriétés magnétiques des atomes d’hydrogène qui nous composent. L’IRM fonctionnelle est une modalité qui permet d’évaluer en temps réel l’activité cérébrale du sujet en réponse à un stimulus (variations flux sanguin/oxygénation des aires cérébrales activées détectées par une séquence spécifique). L’objectif de ce projet est de réaliser une preuve de concept (POC) de nouveaux dispositifs d’anesthésie dentaire par IRMf afin de correspondre à la mise au point d’un système permettant d’atteindre de manière moins invasive une performance d’anesthésie équivalente à une procédure dentaire par injection dite « classique ».

Bénéfices attendus

L’objectif scientifique est d’évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs d’anesthésie dentaire, couplés ou non à la iontophorèse, pour empêcher le processus de douleur lors d’une intervention dentaire. La iontophorèse, si elle est utilisée, devrait accélérer la pénétration du produit anesthésiant dans les tissus. Son efficacité pourra être évaluée par un test de douleur ressentie lors d’une stimulation pertinente vis-à-vis d’une intervention dentaire en comparaison avec un protocole sans iontophorèse. Les résultats, communiqués à la communauté scientifique, doivent permettre de faire progresser les connaissances dans les deux domaines, à savoir les nouveaux dispositifs d’anesthésie dentaire et la iontophorèse pour la santé. Le second objectif scientifique est d’utiliser la technique d’imagerie par résonance magnétique pour évaluer la douleur ressentie. Le recours à cette technique permettrait d’ouvrir de nombreuses possibilités pour des études animales sous anesthésie avec une évaluation objective au lieu d’études sur patients volontaires, très onéreuses et longues à mettre en place, répondant à un score de douleur subjectif. Les études pourraient alors être plus précoces dans le développement de nouvelles technologies et permettre une meilleure efficacité des équipes de recherche. Enfin, le bénéfice à plus long terme du projet est de diminuer fortement le stress inhérent à la piqûre anesthésiante pour des soins dentaires et ainsi permettre à la population souffrant de phobies de mieux se soigner. Un fort bénéfice serait d’amener cette population à des soins plus précoces, diminuant leur coût car moins importants.

Procédures

Un catheter veineux sera posé à la veine céphalie (chien) ou auriculaire (porc) pour administrer le propofol ou l’alfaxalone (anesthésie sans effet analgésique) directement par voie Intra-Veineuse. Chez le Porc, l'anesthésie pourra également être réalisée grâce à une injection intramusculaire. Les animaux seront anesthésiés pour chaque point d’imagerie. Ces anesthésies seront espacées d’au minimum 2 jours. Avant les examens IRM, deux types d’anesthésies dentaires locales pourront être utilisés : - Injection via seringue et aiguille (bloc nerveux) d’un anesthésique local classiquement utilisé en dentisterie humaine tel que de la lidocaïne. - Utilisation du nouveau dispositif d’anesthésie dentaire locale. Les deux types pourront être utilisés le même jour sur le même animal, sur des zones différentes (exemple : injection gencive inférieure droite ; pose du nouveau dispositif gencive inférieure gauche). Les 5 animaux suivront le même protocole. La technique de iontophorèse pourra également être utilisée en complément afin de mieux faire diffuser l’anesthésique. Le courant a utiliser se situera dans la fourchette de 0,5 à 3 mA/cm2 pour des durées maximales de 15min. Au cours des examens IRM, des stimuli ayant pour but d’induire une douleur pulpaire brève seront répétés sur les dents de chaque animal. Ces stimuli seront induits par des méthodes utilsées en dentisterie humaine (exemple : spray réfrigérant) et ne dureront pas plus de quelques secondes chacun et seront espacés d’une période de repos. Une même zone (exemple : gencive inférieure droite) ne sera pas stimulée plus de 20 fois par animal par point d’imagerie. Par précaution les animaux recevront un antiinflammatoire avant réveil (meloxicam 0.4mg/kg IM). Si nécessaire, une injection de produit de contraste (acide gadotérique utilisé en médecine humaine et vétérinaire en IRM) par voie intraveineuse pourra être réalisée (0,2 mL/kg). Le nouveau dispositif d’anesthésie pourra également être chargé de d’acide gadotérique afin de vérifier grâce à un réhaussement de signal sur les images que le produit est correctement délivré dans les tissus.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable majeur lié aux dispositifs testés n'est attendu. L’effet indésirable lié au dispositif pourrait être la douleur passagère légère liée à son application ainsi qu'ne douleur passagère liée à l’injection classique de lidocaïne comme réalisé par les dentistes en médecine humaine. Afin de prévenir des risques pouvant intervenir en rapport avec l’utilisation de la iontophorèse, nous nous baserons sur la littérature scientifique : le courant à utiliser devra se situer dans la fourchette de 0.5 à 3 mA/cm2 pour des durées maximales de 15 minutes. Trois articles scientifiques nous permettent d’établir cette fourchette pour l’utilisation de la iontophorèse dans la cavité bucale. Une première étude, menée dans la cavité buccale du lapin pour des applications de courant prolongées (4h), utilise la valeur basse de 0.5 mA/cm2 pendant 4h , valeur connue pour être acceptable pour des utilisations prolongées sur peau humaine et donc sans aucun risque (1). La valeur de 2 mA/cm2 a quant à elle été utilisée dans une publication recourant à la iontophorèse pour améliorer la diffusion d’une molécule active dans la muqueuse buccale de porcs, avec cette fois-ci l’application du courant pendant une durée courte de 10 minutes (2). Enfin, une valeur de 3 mA/cm2 pendant 4 minutes a été utilisée in vivo lors de tests sur lapin et a permis de démontrer l’intérêt du couplage entre dispositif d’anesthésie locale et iontophorèse pour l’anesthésie dentaire (3). Nous savons par ailleurs que des valeurs de courant élevées sont parfois utilisées sur patients par la technique d'électrostimulation transcutanée (TENS), pouvant aller jusqu’à 3mA/cm2 pour l’instrument NeurTrac Multi-TENS. Dans ce cas l’application des électrodes se fait sur la peau et une sensation de douleur peut être recherchée à des fins thérapeutiques, celle-ci restant bien sûr acceptable par le patient. Les porcs devront être hébergés individuellement durant toute la durée des procédures, du fait de l'implantation d'un catheter jugulaire. Cet isolement ne dépassera pas une durée de 2 mois. Des contact seront maintenus entre les animaux (visuels, olfactifs tactiles, sonores)

Devenir

La procédure envisagée n'est pas supposée générer de dommage chez les animaux: les chiens pourront rejoindre l'effectif permament de notre structure en vue d'une réutilisation ultérieure. Les porcs pourront également être réutilisés à des fin pédagogiques ou dans des procédures sans réveil. Les possibilités de réutilisation pour cette espèce sont cependant rares, les animaux seront majoritairement euthanasiés.

Remplacement

L’évaluation de la douleur en temps réel par IRMf ne peut être réalisée que sur animaux vivants. En effet, les séquences d’IRM spécifiques détectent les variations de la quantité d’oxygène apportée par le sang dans les différentes aires cérébrales activées suite à des stimuli.

Réduction

Le nombre de 5 animaux par dispositif testé nous semble être le nombre approprié pour obtenir les résultats escomptés. Si toutefois après le premier point d’imagerie* les résultats statistiques montrent qu’il faut plus de données pour avoir la puissance statistique souhaitée, des points d’imagerie supplémentaires (et non pas des animaux supplémentaires) pourront être ajoutés, en limitant les anesthésies générales à deux par semaine par animal (espacées au minimum de 3 jours). *après le premier point d’imagerie, les images seront traitées et analysées statistiquement : l'analyse statistique effectuée après le pré-traitement des images consiste à évaluer le signal BOLD (séquence IRM spécifique de l’IRM fonctionnelle) de chaque voxel le long du temps d'acquisition, et déterminer s'il suit de manière statistiquement significative (à l'aide d'un t-test) la succession de stimuli et temps de repos attendue. Des analyses moyennées sur les animaux faisant partie de la cohorte, et par zone d'intérêt du cerveau, seront menées pour évaluer moyenne et écart type des signaux d'activation de la cohorte étudiée. Les animaux n’auront pas besoin d’être euthanasiés pour histologie ou autopsie, par conséquent ils pourront être utilisés à différents points d’imagerie pour générer plus de données sans pour autant augmenter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin d’assurer au maximum le bien-être des animaux, nous utilisons l’IRM, qui est une modalité d’imagerie non-invasive et non-ionisante contrairement à d’autres. Les animaux auront une période d’acclimatation à l’animalerie d'au minimum 7 jours avant le début des procédures expérimentales. Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place, même en l'absence de dommages attendus. Afin de limiter toute douleur éventuellement ressentie au réveil, les animaux recevront un traitement antalgique immédiatement après la fin des évaluations IRM (meloxicam 0.4mg/kg IM). Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, et l'administrations de récompenses lors de différents exercices (monter sur la balance, s'immobiliser, se coucher...), ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Tous les animaux recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des moments de récréation et de jeux avec les soigneurs seront mis en place. Les porcs équipés de catheters jugulaires devront être hébergés individuellement, mais conserveront un contact avec leurs congénaires grâce à des séparations de box ajourées.

Choix des espèces

Le porc est un modèle de choix pour l’ensemble des disciplines odontologiques car il présente des structures buccales similaires à l’homme comme la mandibule, la glande parotide, l’épaisseur de l’attache gingivale,… (1). De plus, il présente des propriétés de la peau/des muqueuses similaires à l’homme, que ce soit perméabilité, réseau vasculaire ou innervation (2). D’autres auteurs (3) ont utilisé ce modèle pour tester des molécules d’anesthésie buccale avec application de stimuli pour évaluer leur efficacité. Ce modèle est donc compatible avec nos objectifs scientifiques. Les chiens sont largement utilisés en recherche dentaire. Il présente des similarités avec l’homme notamment au niveau gingival. Il présente un parodonte identique à l’homme (4), et il est fréquemment utilisé en chirurgie muco-gingivale (5). La pulpe dentaire des chiens est richement innervée et est très similaire aux humains (6). C’est une espèce que l’on peut manipuler facilement et qui est compatible avec nos objectifs scientifiques. Les chiens seront adultes et les porcs seront des porcs juvéniles de moins de 70kg, afin d'avoir une anatomie buccale adaptée adaptée aux objectifs scientifiques du projet, notamment en ce qui concerne les dimensions des gencives.