Bovins
Effet du déficit alimentaire des vaches laitières sur la stabilité thermique des laits
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
22 bovins, des vaches en lactation, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, puis réutilisés dans d'autres essais ou gardés pour le renouvellement du troupeau. Elles subissent une restriction alimentaire de six semaines et quatre prises de sang à la queue, pour étudier l'effet d'un déficit d'énergie sur la stabilité du lait à la chaleur. Le porteur décrit une restriction sans sensation de faim, les vaches étant nourries à satiété avec un fourrage peu nutritif. Le projet vise à résoudre un problème industriel de floculation des laits lors des traitements de conservation.
Objectifs
Les laits de consommation subissent des traitements thermiques de type UHT pour permettre leur conservation dans le temps ou des ultrafiltrations pour concentrer certains éléments d’intérêt. Certains laits, pour des raisons mal déterminées, ne supportent pas ces traitements et floculent, soit immédiatement, soit lors de leur conservation en briques. Une meilleure compréhension des causes de la variabilité des instabilités du lait entre systèmes pourrait aider à cibler des leviers par lesquels les problèmes d’instabilité des laits pourraient être limités au niveau des élevages. En particulier, la stabilité des laits pourrait évoluer en fonction de la quantité d’énergie apportée aux vaches laitières. une restriction alimentaire pouvant provoquer une ouverture des jonctions serrées au niveau de la mamelle et une fuite des minéraux solubles vers le sang ce qui déstabiliserait la micelle de caséine du lait. L'objectif du projet sera de caractériser finement les effets d’une restriction alimentaire similaire à celle que l’on peut suspecter en été dans des systèmes relativement herbagers ou à celle vécue durant l'été 2022 sur la stabilité thermique des laits.
Bénéfices attendus
Nous allons mieux connaître les mécanismes de la stabilité thermique des laits afin de résoudre les problèmes sur le terrain. Nous pourrons valoriser ce travail auprès des éleveurs et de l'interprofession laitière. Nous participerons à l'identification de biomarqueurs de stabilité thermique dans le lait afin d'aider les éleveurs à mieux gérer ce problème et à le détecter en amont.
Procédures
Un lot de vaches aura une restriction des apports énergétiques et azotés pendant 6 semaines. Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue toutes les 2 semaines pendant 8 semaines, soit 4 prises de sang.
Impact sur les animaux
La diminution des apports alimentaires se fera grâce à l'apport d'un fourrage pauvre en nutriments mais très encombrant dans le rumen des vaches laitières. Du coup, les vaches seront alimentées à satiété tout en ayant un apport restreint en énergie et en azote. Cela évitera toute sensation de mal être liée à cette restriction des apports énergétiques et azotés. Les prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse et ces prises de sang à la queue sont moins stressantes qu'à la jugulaire. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc aucun stress lié à ce blocage car elles sont habituées (pratique quotidienne).
Devenir
Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible .
Remplacement
L'expérimentation concerne directement la qualité du lait. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui produisent ce lait.
Réduction
Le nombre de vaches laitières a été calculé pour pouvoir mettre en évidence des différences entre les traitements. Compte tenu du schéma expérimental en continu, il est difficile de diminuer le nombre de vaches laitières.
Raffinement
L'expérimentation est basée sur le lait. Les seuls actes invasifs sont des prises de sang (4 au cours des 8 semaines d'expérimentation). Leur nombre est vraiment faible. Ces prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc aucun stress lié à ce blocage. Les vaches seront maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est parfaitement adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux, sanitaires, et elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées.
Choix des espèces
Vache laitière de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre fin septembre et début décembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
6 vaches laitières vont être utilisées, gardées vivantes et réutilisées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent six prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang au cours de l'essai, pour tester l'effet d'une levure vivante ajoutée à une ration pauvre en protéines sur la production laitière et les émissions de méthane. Le porteur met en avant un "gain économique" et une réduction de l'empreinte environnementale. Il justifie un effectif de deux vaches par groupe par un plan expérimental croisé où chaque animal est son propre témoin.
Objectifs
L'objectif de ce travail est d’étudier l’effet de la supplémentation de la levure vivante Actisaf sur les performances de production laitière, la physiologie (digestibilité, métabolisme azoté, fermentations ruminales), la prédiction des émissions de méthane par les acides gras du lait chez la vache laitière
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples : 1) tester l’effet de levure vivante sur les performances zootechniques, 2) comprendre si la levure vivante ajoutée dans une ration pauvre en protéines permet les même performances qu’une ration riche et par conséquent assurer un gain économique en réduisant l’empreinte environnementale, 3) comprendre l’effet de la levure vivante sur le métabolisme, fermentation ruminales et statut immunitaire avec des rations contrastées
Procédures
Prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang à raison de 6 prélèvements par vache sur la totalité de l'essai
Impact sur les animaux
Même si toutes les précautions seront prises durant l’essai pour atténuer les effets indésirables sur les vaches, il se peut que les animaux soient dans un état d’inconfort lors de leurs contentions pour des prélèvements de sang par exemple.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure. Durant la procédure expérimentale, il n’y aura pas d’intervention qui nécessite l’arrêt de l’utilisation des vaches après la fin de l’essai. Les vaches continueront à être hébergées dans les même conditions (bâtiment, aliment, soin), surveillées par des personnes dédiés (chercheurs et techniciens) et aussi par des vétérinaires si besoin. Les prélèvements durant l’essai n’engendrent pas une dégradation de l’état général des animaux, ni leur bien-être. Notre procédure est de classe légère et par conséquent permet la réutilisation des animaux après la fin de l’essai.
Remplacement
La digestibilité varie selon les rations et aussi d’un animal à un autre ayant même potentiel de production. Sa mesure nécessite l’utilisation des animaux dans des cages métaboliques pour obtenir des résultats pertinents. Néanmoins, elle peut aussi être prédite par des équations issues de la bibliographie, mais cette estimation nécessite une importante quantité de données pour valider la robustesse du modèle. Dans le cas présent, nous utiliserons la méthode de prélèvement ponctuel de fecès ainsi que la méthode indirecte de mesure de digestibilité (iNDF) in vitro avec incubation des échantillons fécaux et d’aliment. Poiur cette procédure, nous ne pouvons remplacer complètement l'animal mais on substituons une partie du protocole in vivo en in vitro.
Réduction
Nous utilisons un plan expérimental en carré latin qui nous permet de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans notre projet. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statistique et en se basant sur les données bibliographiques. L’essai sera mené en un design expérimental en cross-over. Ainsi, toutes les vaches reçoivent les 3 traitements successivement. L’avantage de l’essai croisé est d’être, à effet identique, plus puissant que l’essai en parallèle. La prise du sujet comme son propre témoin diminue la variabilité de la mesure de l’effet traitement. L’évaluation de l’écart type faite dans le calcul du nombre d’animaux nécessaire (n) tient compte de ce principe. Pour l’étude de performances, d'après le calcul d’effectifs et compte-tenu de la variance connue à ce jour, animaux par groupe permettent de détecter une différence significative (critère continu gaussien) avec un risque de 1ere espèce (faux positifs) de 5% et un risque de 2eme espèce (faux négatifs) de 20% en ce qui concerne les paramètres zootechniques principalement ciblés pendant cette étude. Nous avons donc choisi d’évaluer 2 vaches par groupe Cet effectif est en accord avec les études récentes portant sur les performances zootechiques des vaches ayant reçu des levures vivantes soit en modifiant la teneur en azote dégradables, la teneur en amidon ou la dose.
Raffinement
Pour le raffinement du protocole, nous nous sommes contraints à réduire le nombre d’échantillons à prélever et par conséquent réduire le nombre de manipulation sur les animaux qui pourrait engendrer du stress. Les prélèvements d’échantillons de fèces et d’urine se feront au même moment pour réduire au maximum la manipulation et contention des animaux. Les animaux seront surveillés en permanence pour contrôler leur comportement et chaque risque de souffrance ou de détresse. Des critères physiologiques comme la production laitière, l’état de la mamelle, l’ingestion, le poids et la note d’état corporel serviront comme critères de prise de décision. Des critères d’évaluation allant de 0 à 3 pour chaque critère seront établis avec 0 (état normal) et 3 (changement très important par rapport à la normale). Dans le cas d’un changement important, le recours à l’avis d’un vétérinaire sera pris en compte.
Choix des espèces
La vache est considérée comme une productrice de gaz à effet de serre et donc un modèle pertinent pour notre étude. De plus, à nos connaissances, il n’y a pas d’étude sur les effets de l’ajout de levures vivantes dans des rations pauvre en protéines sur les paramètres zootechniques et environnementaux. L’évaluation des ingestions, de l’efficacité et de la digestibilité n’est possible qu’avec des mesures quotidiennes des quantités ingérées. Dans ce projet, les animaux seront inclus à partir de 45 jours de lactation (variable selon l’adaptation des vaches au auges) car l'objectif étant de tester l'effet du probiotique Actisaf Sc 47 durant cette période.
Etude comparative de deux techniques d’insémination et de constat de gestation sur le bien-être des bovins
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
10 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes à l'issue. Elles subissent deux inséminations et deux constats de gestation par voie transrectale ainsi que des prélèvements sanguins à la veine caudale, pour comparer deux techniques de reproduction au regard de leur bien-être. Le porteur attend peu de nuisances, ces pratiques étant courantes en élevage, et un stress transitoire lié aux prises de sang. Il justifie l'étude par une demande sociétale sur le bien-être des animaux non-humains et affirme qu'aucun système ex vivo ne permet de mesurer cet impact.
Objectifs
Dans un contexte de demandes sociétales accrues vis-à-vis du bien-être animal, les entreprises et organismes agricoles cherchent à prendre en compte cette notion au sein de leurs activités. Les entreprises de sélections et de mise en place souhaitent pouvoir étudier l’impact des technologies de la reproduction sur le bien-être des animaux en vue éventuellement de les améliorer. Principale technologie de la reproduction utilisée en élevage, l'insémination animale nécessite des manipulations transrectales pour faire progresser le dispositif d'insémination dans le col de l'utérus et déposer la semence du niveau du corps utérin. Récemment, un nouveau dispositif d'insémination a été développé permettant d'inséminer sans manipulation transrectale mais nécessitant l’introduction d’un dispositif vaginal de taille supérieure et une aspiration de l'entrée du col de l'utérus par dépression. Si les bénéfices pour l'opérateur sont évidents (diminution du risque de troubles musculo-squelettiques), l'impact de ce nouveau procédé sur le bien-être des femelles doit être objectivé en comparaison avec l'insémination classique. De plus, ce nouveau dispositif permet également la réalisation de constat de gestation habituellement réalisé par examen échographique transrectal. Pour cet usage également, l'impact sur le bien-être des animaux doit être évalué. Le projet présenté ici a donc pour objectif de mesurer l’impact de deux protocoles d’insémination et de constat de gestation (procédé "classique" vs procédé "sans manipulation transrectale") sur les bien-être de 10 génisses de race Holstein évalué de façon multicritère.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir des données préliminaires sur l’intérêt du nouveau procédé d’insémination et de constat de gestation au regard du bien-être animal. En fonction des résultats qui seront obtenus, de nouvelles perspectives de développement pourraient voir le jour pour raffiner ces technologies de la reproduction.
Procédures
Les 10 génisses expérimentales seront soumises au total et de façon chronologique à deux inséminations (durée de 3 minutes) puis, 30 à 40 jours plus tard, à deux constats de gestation (durée de 5 minutes) au cours d'une période de temps de l'ordre de deux mois. Afin d'évaluer les niveaux de stress et d'inflammation périphérique causés par l'une ou l'autre des 4 manipulations (correspondant à l'un des paramètres mesurés dans notre évaluation multicritères du bien-être), des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale (durée d'une minute).
Impact sur les animaux
Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. En effet, les pratiques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment utilisées par les professionnels chez les bovins qui ne semble pas impacter la santé et le bien-être des animaux. Le bien-être animal sera évalué par des mesures non invasives en dehors des prélèvements sanguins. Ces prélèvements, même si ils peuvent générer du stress de façon transitoire, ne devraient pas conduirent à des nuisances importantes (hématome de façon exceptionnelle) pour les animaux puisque ceux-ci sont peu nombreux et de faible volume.
Devenir
Les interventions réalisées sur les animaux étant des procédures d'élevage classiques qui n'induiront, à priori, que peu de nuisances, toutes les génisses seront normalement gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Aucun système ex vivo ne permet de mesurer l’impact des technologies étudiées sur le bien-être des animaux.
Réduction
L’effectif d’animaux utilisé a été déterminé en s’appuyant sur les autres études menées sur ce sujet et de manière à avoir un minimum de variabilité individuelle. Toutefois, chaque animal étant son propre témoin ceci permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation. Les animaux pressentis pour ce projet sont des animaux déjà présents en station expérimentale et n’ayant subi que des procédures légères.
Raffinement
Les résultats de cette étude serviront à étudier et éventuellement à raffiner deux des technologies de la reproduction les plus répandues en élevage. Les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (10m²/animal avec un accès aisé à l’auge et aux points d’abreuvement, présence de tapis caoutchouc pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales…). Il n’est pas possible d’appliquer des procédures de renforcement positif dans cette étude afin de ne pas biaiser les impacts mesurés des procédés qui doivent être représentatifs de ce qui pourrait être mesuré en élevage classique.
Choix des espèces
Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. Les animaux utilisés sont nécessairement des femelles compte-tenu de l’objectif de l’étude. La race choisir est la race Prim Holstein qui est la première race en effectif en France et à l’étranger. En France, l’âge au premier vêlage varie entre 24 et 36 mois. Du fait de cette donnée et de la réutilisation d’animaux expérimentaux, l’utilisation ici de génisses ayant environ 2 ans correspond aux pratiques observables sur le terrain.
Impact de l’acidose ruminale sur le microbiome digestif de la vache laitière et étude des mécanismes inflammatoires déclenchés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
14 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rejoindront le troupeau de l'établissement. On leur provoque une acidose ruminale par un régime riche en amidon, avec prélèvements par fouille rectale, prises de sang et sondage gastro-oesophagien. Le porteur indique que les prélèvements peuvent provoquer une gêne ou une souffrance et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ce désordre. L'objectif inclut des recommandations d'usage de probiotiques en élevage.
Objectifs
Explorer in vivo l’effet de l’acidose ruminale et l’impact de levures probiotiques au-delà du rumen sur le pathobiome fécale (ensemble des microbes (incluant leurs génomes) susceptibles de provoquer une maladie - cela inclut les agents pathogènes spécialisés et opportunistes) et des marqueurs de l’inflammation. Le suivi du pH ruminal, de la rumination et du comportement alimentaire nous permettont également de caractériser le bien-être de l’animal. Enfin, nous évaluerons l’intérêt de prélèvements dans la cavité buccale pour représenter l’environnement ruminal (microbiote notamment).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre l’impact d’un désordre digestif sur la prévalence de pathogènes à risque pour l’animal mais aussi de pathogènes responsables de zoonoses chez l’Homme, via une approche de métagénomique. Par ailleurs il permettra de décrire l’effet et les modes d’action d’une supplémentation en levure probiotique, via l’alimentation, au-delà du rumen et ce jusqu’au lait ce qui permettra de mieux définir des recommandations d’utilisation de ces additifs en élevage. Un effort sera particulièrement apporté au niveau de l’analyse du lait, avec mesure du profil en acides gras, de la caséine, et de premiers essais de purification d’exosomes du lait dont les compositions peuvent varier en situation de challenge alimentaire. Les méthodes développées dans le cadre de cette expérimentation sont susceptibles d’être appliquées en situation d’élevage. Les recherches conduites dans cet essai devront permettre d’identifier des marqueurs périphériques au rumen qui devraient faciliter le diagnostic de l’Acidose Ruminale Sub Aigüe (ARSA) sur le terrain et d’objectiver son impact sur la santé et le bien-être des animaux. Les résultats de cette étude pourront être disséminés via les écoles vétérinaires, les lycées agricoles, les écoles d’ingénieurs et pourront être directement utilisés par les techniciens d’élevage.
Procédures
Les animaux seront soumis pendant une semaine à une modification de régime alimentaire susceptible d'entraîner l'apparition d'acidose chronique. L'objectif du projet étant de monitorer les modifications du microbiote digestif et des marqueurs de l'inflammation de l'animal, nous réaliserons des prélèvements de fèces par fouille rectale (n=8) , des prises de sang à la veine caudale (n=6) et des prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-oesophagien (n=5). L'ensemble des prélèvements dure moins de 10 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière, induisant notamment une acidification du contenu ruminal. Il est attendu que les animaux éprouvent ce désordre, mais sans atteindre le stade clinique de la maladie, via le monitoring du pH ruminal. Si une baisse anormale du pH ruminal et/ou une altération du comportement alimentaire au-delà des seuils rapportés pour l’acidose ruminale sub-aigue étaient observées, l’arrêt de la distribution du granulé riche en amidon et le retour immédiat à un régime classique seront décidés. Par ailleurs, une gène ou une souffrance pourra être ressentie par les animaux lors de la mise en oeuvre des prélèvements (sondage gastro-oesophagiens, prélèvements de fèces et prises de sang)
Devenir
Etant données la sévérité et la fréquence des procèdures inclues dans le projet, il n'est attendu aucune gêne, stress ou souffrance résiduelle chez l'animal à la fin de l'expérimentation. Les animaux pourront donc rejoindre le reste du troupeau de l'établissement utilisateur et retrouver les conditions de logement, d'alimentation et de vie classique du troupeau laitier.
Remplacement
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de prévention du risque d’ARSA, comme les probiotiques, doit se faire chez l’animal afin de démontrer leur efficacité et ainsi pouvoir les recommander en élevage.
Réduction
Il s'agit d'un projet exploratoire visant à identifier des biomarquerus d'ARSA facilement utilisables en condition de terrain et réduisant le stress et la douleur liés aux prélèvements (remplacement du prélèvement de contenu ruminal par sondage par des biomarqueurs prélevables dans d'autres comportiments, tels que les fèces, le sang ou le lait). D'après notre expérience concernant la variabilité individuelle du microbiote, notamment ruminal, et les résultats de tests statistiques préliminaires, le nombre d'animaux recrutés (2 lots de 7 vaches laitières) est réduit au maximum, sans compromettre la mise en évidence de différences statistiques entre les deux lots. Ce nombre est par ailleurs justifié au regard de données de la littérature, rapportant l'utilisation de 6 à 8 vaches par lot dans un design experimental comparable.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. Cet essai a également pour but d'évaluer l'intérêt de la mesure de paramètres non invasifs dans le lait ou dans la cavité buccale, ou de la mesure du comportement alimentaire qui pourraient être considérés comme marqueurs de l'ARSA et/ou de l'effet bénéfique de la solution microbienne testée. De ce point de vue le projet est également respectueux de la règle des 3R puisque la mesure d'indicateurs non invasifs pourrait à terme remplacer les mesures susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de prévention du risque d’ARSA, comme les probiotiques, doit se faire chez l’animal afin de démontrer leur efficacité et ainsi pouvoir les recommander en élevage. L’acidose ruminale chronique n’est pas une pathologie mais un désordre digestif fréquent chez les bovins en production.
Etablissement de ruminants monofaunés pour des études sur les protozoaires du rumen
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Bovins : 9
9 moutons et 9 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant qu'ils peuvent ensuite retourner dans le troupeau expérimental. De jeunes agneaux et veaux non faunés sont inoculés avec un protozoaire puis subissent, sur quatre mois, des prélèvements répétés de contenu ruminal par sonde œsophagienne, de sang et de fèces. Il décrit un léger inconfort lié surtout à la contention et une douleur légère lors des prises de sang. Il affirme que la culture in vitro de ces protozoaires reste trop limitée, l'objectif étant d'étudier leur rôle dans la digestion et la production de méthane.
Objectifs
Ce projet propose d'utiliser des jeunes ruminants (ovin, bovin) naturellement dépourvus de protozoaires (non-faunés) qui seront ensuite inoculés par une seule espèce de protozoaire provenant de la cryobanque ERCULE (projet EU) avec l’objectif d’effectuer des études génomiques et fonctionnelles car les protozoaires du rumen ne peuvent pas être cultivés de manière axénique et en quantité suffisante in vitro.
Bénéfices attendus
A l’issue du projet, nous aurons des données génomiques et fonctionnelles pour appréhender le rôle des protozoaires dans l’écosystème digestif du ruminant qui reste mal connu. Les données alimenteront la base de données publique du projet HoloRuminant. Les informations obtenues dans ce projet serviront à évaluer le rôle des certains protozoaires dans la digestion des aliments et leur effet sur la production de méthane dans le rumen.
Procédures
Les animaux feront l'objet de 3 types de prélèvements : Contenu ruminal : Le volume prélevé sera adapté à la taille et au développement de l'animal : jusqu’à 100 ml pour un agneau de 20 kg ou 200 ml pour un veau, 6 fois au cours de toute la période de 4 mois et sera réalisé en moins de 3 minutes (entre le début de la contention et la fin du prélèvement). Sang : Les animaux seront prélevés 2-3 fois pendant la période de "mono-faunation". Les quantités prélevées sont de 10-15 ml et largement inférieures à 10% du volume sanguin total afin d’éviter tout risque d'hypovolémie, anémie ou stress physiologiques et durera moins d'une minute. Fèces : Les agneaux et les veaux seront prélevés 6 fois au cours de toute la période de 4 mois. Le volume prélevé sera d'environ 5-10 g et durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les techniques des prélèvements sont des pratiques couramment appliquées. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde oesophagienne. La procédure génère un léger inconfort, surtout du à la contention de l’animal mais aucune douleur ni souffrance n’est attendue. Si nécessaire, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. La prise de sang génère une douleur légère.
Devenir
Les procédures appliquées aux animaux sont peu invasives et la fréquence des prélèvements est faible. Les veaux et agneaux peuvent à l'issu de cette procédure retourner dans le troupeau expérimental.
Remplacement
A l’heure actuelle, la culture des protozoaires in vitro est très fastidieuse. La croissance in vitro est très limité et les cultures sont souvent perdus sans raison apparente après quelques jours. En plus, le nombre réduit des protozoaires que puissent être obtenues in vitro ne permet pas d’effectuer certaines études et il n’y pas asses d’information indiquant que les caractéristiques fonctionnelles des protozoaires cultivés in vitro sont similaires à celles des protozoaires dans son milieu naturel, le rumen.
Réduction
Le nombre des animaux tient compte surtout des aspects éthiques (compagnie des animaux grégaires). L’animal n’est pas l’unité expérimentale mais le moyen pour obtenir des protozoaires en quantité suffisante pour des études de séquençage du matériel génomique.
Raffinement
Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés rapidement par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L'objectif est de comprendre les déterminants microbiens déclancheurs des diarrhées chez le jeune ruminant, un travail sur les ovins et les bovins s'avère donc, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle, plus pertinent qu'un autre modèle pour les ruminants d’élevage. L'étude de la modulation du microbiote gastrointestinal après le sevrage nécessite d'utiliser des agneaux ou veaux qui ont eu un contact limité avec des adultes pour éviter la comtamination en protozoaire.
Prélèvement de moelle osseuse chez des veaux pour établissement d’une lignée cellulaire à des fins de culture bactérienne
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
46 veaux non sevrés vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque veau subit un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale, d'une durée d'environ vingt minutes, avant d'être mis à mort. Le porteur indique choisir de jeunes veaux car la proportion de cellules souches diminue avec l'âge, et justifie l'anesthésie par le confort de l'animal et des manipulateurs. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour obtenir ces cellules bovines, l'objectif étant à terme d'établir une lignée cellulaire pour s'affranchir de l'animal.
Objectifs
Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire stricte (se développant dans les cellules), majoritairement transmise par les tiques. En Europe, c'est une bactérie d’importance économique majeure, notamment dans les élevages bovins où elle provoque des avortements. In vivo, cette bactérie infecte une catégorie de globules blancs mais qu'il n'est pas possible de maintenir en culture ou de cultiver sur le long terme. In vitro, les souches humaines et les souches équines et canines peuvent être maintenues en culture au sein de cellules de moelle osseuse immortalisées humaines ou de tiques. En revanche, les souches infectant les ruminants ne peuvent actuellement être cultivées que sur cellules de tiques. Or les cellules de tiques se divisent lentement et supportent mal les techniques de conservation par le froid, ce qui représente un obstacle à leur utilisation pour la culture bactérienne. De plus elles ne permettent pas d’étudier les interactions entre A. phagocytophilum et la cellule hôte des vertébrés. L’absence de lignées de cellules de moelle osseuse bovines limite aussi l’étude des facteurs responsables de la spécificité de souche pour certains hôtes vertébrés. Il est donc nécessaire d'établir une lignée cellulaire immortalisée de moelle osseuse in vitro pour la culture des Anaplasma infectant les bovins. L’utilisation de lignées cellulaires présente de nombreux avantages, elles permettent notamment de s’affranchir de l’obligation de réaliser régulièrement des prélèvements pour renouveler les cultures, ce qui leur confère aussi un intérêt en terme de bien-être animal. Une fois établies, les lignées sont composées d’une population cellulaire homogène permettant une standardisation des conditions de culture et des expérimentations pour une meilleure répétabilité.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : Cette étude conduira au développement d’une lignée de cellules permettant la culture des souches bovines d'une bactérie ne poussant que dans des cellules, A. phagocytophilum. Ce projet aboutira au dépôt de la/des lignée(s) cellulaire(s) dans une banque de cellules. Bénéfices à long terme : A plus long terme, comprendre les interactions entre la bactérie et les cellules bovines pour développer des moyens de lutte sanitaire ciblés contre cette bactérie dans les troupeaux de bovins. Ces cellules pourront aussi être utilisées par la communauté scientifique pour réduire certaines expérimentations in vivo dans d’autre domaines (autres agents pathogènes ou études de toxicité par exemple). Les techniques mises en œuvre dans ce projet pourraient aussi être appliquées à d’autres espèces animales pour lesquelles une lignée cellulaire n’est pas encore disponible alors qu'elle pourrait présenter un intérêt pour l’étude des interactions mammifère-A. phagocytophilum ; c'est le cas des cervidés sauvages.
Procédures
Les veaux prévus pour ce projet auront un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale et locale. La procédure dure au totale environ 20 min.
Impact sur les animaux
Possibilité de douleur ou stress pour l’animal : La ponction de moelle osseuse est un acte réalisé sur animal sédaté le plus souvent, avec ou sans anesthésie générale en pratique vétérinaire, l’animal étant en box de contention et/ou immobilisé à l’aide de cordes ou en décubitus latéral si le format de l’animal le permet. Par souci de confort et de sécurité pour l’animal et pour les manipulateurs, pour ce projet, la ponction sera réalisée sur animal anesthésié.
Devenir
Les veaux seront mis à mort en fin de procédure pour retour dans le circuit pédagogique.
Remplacement
Actuellement, il n'y a pas de méthode in vitro permettant la culture les souches de ruminants d'Anaplasma phagocytophilum et l'étude des intéractions hôté vertébré - agent pathogène. Le but de ce projet est in fine de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants pour la culture d’A. phagocytophilum et pour l’étude des interactions hôte vertébré – agent pathogène. Le tissu hématopoïétique est très sensible d’une part à l’hypoxie (en cas de mort de l’animal) et aux médicaments, ce qui nous interdit le recours à des cadavres d’animaux tout juste décédés. Notre but est d’obtenir le plus de cellules souches hématopoïétiques possible pour pouvoir attendre de ce projet qu’il soit fructueux.
Réduction
Ce projet nécessite l’optimisation de protocoles utilisés en médecine humaine, en particulier pour les étapes de prélèvement de moelle osseuse, de purification puis de culture des cellules souches hématopoïétiques et enfin d’immortalisation de ces cellules. Chaque animal ne sera prélevé qu’une seule fois et nous estimons que nous aurons recours à un maximum de 46 veaux. La moelle des individus jeunes étant beaucoup plus riche en cellules souches hématopoïétiques que celle des adultes le nombre de veaux impliqués dans cette étude sera plus faible que si ce projet était réalisé avec des animaux adultes. Il est aussi possible que la souffrance occasionnée soit moindre chez les veaux que chez les adultes, les prélèvements étant plus aisés à réaliser. Les personnes impliquées dans les étapes d’isolement des cellules souches hématopoïétiques, leur culture et leur immortalisation vont être formées pour maximiser nos chances de réussite. Une étude préliminaire visant à déterminer si les outils utilisés pour immortaliser les cellules humaines peuvent fonctionner sur des cellules bovines. A chaque étape d’optimisation du protocole, le nombre d’animaux utilisés pour l’étape sera contrôlé. Les prélèvements de bonne qualité après optimisation de l'étape n seront utilisés pour débuter les essais d'optimisation de l'étape n+1.
Raffinement
Les veaux auront un hébergement collectif, par 2, sur copeaux, respectant une alternance jour/nuit (12h/12h). Il seront nourris au seau avec du lait artificiel. Pour réduire au maximum les nuisances au bien-être animal lors des procédures expérimentales, chaque individu ne sera prélevé qu’une seule fois, sous sédation et anesthésie générale. Les animaux seront immobilisés pour éviter leur chute lors de la sédation ou lors de l'anesthésie. Pour prevenir une hypothermie, les animaux seront placés sur tapis chauffant. La totalité de la procédure prendra au maximum 20 minutes incluant environ 5 minutes pour le prélèvement de moelle. Les animaux seront mis à mort immédiatement après le prélèvement. Si pendant l'anesthésie les animaux montrent des signes cliniques d'hémorragie ou de défaillance cardiaque ils seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation de bovins (Bos taurus) pour l’obtention de cellules souches myéloïdes de cette espèce animale. Les veaux sont des jeunes non-sevrés (1 à 1.5 mois, 40 à 70 kg). Le choix de collecter de la moelle osseuse sur des veaux à ce stade de développement est basé sur deux raisons : - La raison principale a trait au fait que la proportion de cellules souches dans la moelle diminue drastiquement avec la croissance et l’âge des animaux (sur la base des données humaines et vétérinaires disponibles). En effet, au fur et à mesure de la croissance, une partie de la moelle est remplacée par du tissu graisseux, limitant la quantité totale de cellules que l’on pourrait obtenir. Notre but étant d’obtenir un maximum de cellules souches pour les transformer, notre choix s’est porté sur des veaux plutôt que des bovins adultes pour ne pas multiplier les prélèvements chez des animaux adultes tout en maximisant nos chances d’obtenir une grande quantité de cellules souches à transformer. - La seconde raison porte sur l’ossification au cours de la croissance des animaux qui rend inaccessibles, chez les bovins certains sites de prélèvement intéressants pour ce projet, puisque riches en moelle.
Caractérisation génétique de la relation entre production laitière, mobilisation corporelle et efficacité alimentaire en race Holstein
- Recherche appliquée
- Maladies animales
300 vaches Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées vivantes puis renvoyées au troupeau comme reproductrices ou vers d'autres expérimentations. Elles subissent des prélèvements sanguins répétés au cornadis tout au long de la lactation, ainsi qu'un suivi du poids, de l'ingestion et des émissions de méthane. Le projet vise à établir une relation génétique entre mobilisation des réserves corporelles et "efficacité alimentaire", pour orienter la sélection des vaches laitières. Le porteur affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent pas être reproduits en culture cellulaire ou in silico.
Objectifs
L’amélioration de l’efficacité alimentaire (EA) des bovins laitiers est une thématique d’actualité pour ses atouts économique (diminution des quantités ingérées) et écologique (diminution des émissions directes et indirectes liées aux cultures). La sélection génétique est une stratégie possible pour cette amélioration. Cependant l’EA est un caractère complexe, impliquant la production laitière, la mobilisation par l’animal de ses réserves corporelles (le « gras » stocké), les quantités d’aliment ingéré, … et leurs relations. Il est nécessaire de comprendre ces relations pour déterminer sur quel(s) caractère(s) faire porter la sélection génétique. L’émergence de nouvelles technologies offre des opportunités pour étudier plus finement l’EA. L’objectif de ce projet est de mesurer des caractères non disponibles en ferme concernant la durabilité des vaches Holstein : mobilisation corporelle, ingestion individuelle, production de méthane, …, à l’échelle d’une ou deux lactations. Une des questions à laquelle le protocole devra répondre est : y a-t-il une relation génétique entre mobilisation des réserves et efficacité alimentaire ?
Bénéfices attendus
Le bénéfice scientifique principal est la compréhension de la relation génétique entre l’état corporel et l’efficacité alimentaire, sur toute la durée de la lactation (contrairement à la plupart des études qui se limitent au début de lactation), voire sur plusieurs lactations. Dans un objectif de développer une sélection génétique de l’efficacité alimentaire en France, les résultats de cette étude pourraient apporter des éléments pour la définition de cet index et la collecte des phénotypes le constituant. Ainsi à terme, l'objectif serait de pouvoir sélectionner des vaches laitières qui seraient moins impactées par la perte d'état coporel en début de lactation et les problèmes métaboliques et sanitaires qui y sont liés.
Procédures
Pour étudier la mobilisation corporelle de la vache, il est nécessaire de mesurer sa production laitière, son poids vif, son état corporel et son ingestion alimentaire ainsi que son métabolisme sanguin tout au long de la lactation. Pour le suivi du métabolisme, des prélèvements sanguins (2 x 9 ml) seront effectués 5 fois au cours de la lactation, sur les vaches vigiles, maintenues au cornadis. Pour le suivi de la reproduction, des prélèvements sanguins (2 x 9 ml) seront effectués 4 à 5 fois au cours de la lactation, sur les vaches vigiles, maintenues au cornadis. Les mesures de production laitière, d’ingestion et d’émission de méthane se feront sans intervention humaine. Les mesures de poids et d’état corporel se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux.
Impact sur les animaux
La divergence génétique sur l’état corporel n’est pas assez grande pour qu’il y ait un effet indésirable sur les animaux négatifs, d’autant que leur état corporel restera au dessus de la moyenne grace à une alimentation plutôt riche. Les seuls effets indésirables seront liés aux prélèvements de sang (douleur de la piqure de l'aiguille), et au stress induit par la contention et la manipulation lors des mesures.
Devenir
La procédure ne justifie pas la mise à mort des animaux. A la fin de leur(s) lactation(s) expérimentale(s), les vaches rejoindront le reste du troupeau de l'unité en tant que reproductrices, ou intègreront d'autres expérimentations.
Remplacement
Les objectifs du projet concernent directement l’espèce choisie et nécessitent la production de lait sur plusieurs mois et le suivi alimentaire et morphologique des vaches. Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico.
Réduction
La variabilité du caractère étudié doit être suffisante pour des analyses génétiques. Ce projet porte sur 300 femelles en lactation, primipares ou multipares sur 7 campagnes. Il participera à la constitution d’une base de données internationale sur l’efficacité alimentaire et pourra être complété de campagnes supplémentaires si la divergence observée et les effectifs ne sont pas suffisants pour répondre complètement aux objectifs. La sélection divergente pratiquée par l’utilisation des taureaux devrait permettre un gain de puissance substantiel, réduisant ainsi l’effectif requis.
Raffinement
Afin de minimiser la douleur, les prises de sang nécessaires au protocole seront réalisées au niveau de la queue des animaux, peu fréquentes, pour des volumes ne dépassant pas 2*9 ml et espacées d'au moins 24h. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée, un robot de traite et une ration complète distribuée dans des auges en accès libre. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en oeuvre du projet. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein, principale race laitière française et internationale. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des adultes en lactation car la production de lait est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques.
Formation de personnels aux techniques de mesures et de prélèvements sur ovins et bovins
- Formation professionnelle
36 bovins vont être utilisés, gardés vivants et réintégrés au troupeau à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit des prises de sang, des prélèvements de jus de rumen par sonde œsophagienne et des prélèvements de fèces, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels aux techniques de prélèvement. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer une douleur légère et du stress lié à la manipulation et à la séparation du troupeau. Il affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer les animaux puisque l'objet même du projet est la formation.
Objectifs
L'objectif est de former les concepteurs et applicateurs de procédures expérimentales ainsi que les soigneurs de l'EU aux techniques de prélèvements spécifiques utilisées régulièrement dans les projets de recherche qui sont mis en oeuvre sur l'EU. Ces techniques sont: les prises de sang, les prélèvements du jus de rumen par sonde oesophagienne, les prélèvement de fèces sur bovins laitiers. Chaque technique fera l'objet d'une formation d'une journée. Ces formations entreront dans le cadre de la formation continue des personnels et seront inscrites dans leur livret de compétences.
Bénéfices attendus
Les attendus pour les stagiaires sont: comprendre les attentes d'un prélèvement et les conditions de réussite, maitriser les techniques de prélèvement pour répondre au enjeux scientifiques, augmenter les taux de réussite des prélèvements (et donc réduire le nombre de prélèvements), faciliter le dialogue entre concepteurs, applicateurs et soigneurs. Le projet contribue à l'amélioration du bien être des animaux, au raffinement des techniques de prélevement et à réduire la douleur lors des prélèvement.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (3 prélèvements sur une journée), de contenu ruminal (2 prélèvements sur une journée) et de fèces (2 prélèvements sur une journée). Les journées de prélèvement sont espacées d'au moins 1 mois afin d'assurer une période récupération suffisante des animaux.
Impact sur les animaux
Les 3 techniques de prélèvement faisant l'objet du projet correspondent à des procédures légères. Les nuisances pour les animaux peuvent être une douleur légère et temporaire liée aux prélèvements et du stress du fait de leur manipulation et de la séparation des animaux concernés du reste du troupeau lors de la journée de formation.
Devenir
Tous les animaux utilisés pour la formation seront gardés en vie et réintègreront le troupeau à l'issue de la journée de formation.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer les animaux du fait même de l'objet du projet qui est de former des personnels aux techniques de prélèvement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit au nombre de stagiaires de chaque groupe pour que chaque stagiaire puisse pratiquer en autonomie. Cela permet de réduire le nombre de prélèvements sur chaque animal qui serait un facteur agravant de son stress et de sa douleur.
Raffinement
Chaque jour de formation comprendra 1 partie d'apports de connaissances sur le BEA, la règle des 3R, les points limites, les indicateurs de suivi des animaux, les modes de raffinement appropriés aux techniques de prélèvements (par exemple : préparation des animaux, leur habituation, choix du matériel ou de la méthode de prélèvement adaptés selon les attendus scientifiques du prélèvement). En ce sens, la formation contribuera à la pratique de méthodes raffinées de prélèvements dans les projets de recherche conduits dans notre EU.
Choix des espèces
Le projet utilise des bovins c'est l'espèce sur lesquelles sont conduites les recherches dans notre EU. Dans le cadre de notre projet, le stade physiologique n'a pas d'importance majeure.
Formation de personnels aux techniques de mesures et de prélèvements sur ovins et bovins
- Formation professionnelle
Bovins : 45
18 moutons et 45 bovins vont être utilisés, gardés vivants, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang, des prélèvements de jus de rumen par sonde œsophagienne et des prélèvements de fèces, répartis sur des journées espacées d'au moins un mois, avant de réintégrer le troupeau. Ces séances ne servent pas à produire des connaissances mais à entraîner les personnels de l'établissement aux techniques de prélèvement. Le porteur affirme que le remplacement est impossible puisque l'objet même du projet est de former du personnel sur des animaux.
Objectifs
L'objectif est de former les concepteurs et applicateurs de procédures expérimentales ainsi que les soigneurs de l'EU aux techniques de prélèvements spécifiques utilisées régulièrement dans les projets de recherche qui sont mis en oeuvre sur l'EU. Ces techniques sont: les prises de sang, les prélèvements du jus de rumen par sonde oesophagienne, les prélèvement de fèces sur ovins, bovins allaitants et bovins laitiers. Chaque technique fera l'objet d'une formation d'une journée pour chacune des 3 catégories d'animaux. Ces formations entreront dans le cadre de la formation continue des personnels et seront inscrites dans leur livret de compétences.
Bénéfices attendus
Les attendus pour les stagiaires sont: comprendre les attentes d'un prélèvement et les conditions de réussite, maitriser les techniques de prélèvement pour répondre au enjeux scientifiques, augmenter les taux de réussite des prélèvements (et donc réduire le nombre de prélèvements), faciliter le dialogue entre concepteurs, applicateurs et soigneurs. Le projet contribue à l'amélioration du bien être des animaux, au raffinement des techniques de prélevement et à réduire la douleur lors des prélèvement.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (3 prélèvements sur une journée), de contenu ruminal (2 prélèvements sur une journée) et de fèces (2 prélèvements sur une journée). Les journées de prélèvement sont espacées d'au moins 1 mois afin d'assurer une période récupération suffisante des animaux.
Impact sur les animaux
Les 3 techniques de prélèvement faisant l'objet du projet correspondent à des procédures légères. Les nuisances pour les animaux peuvent être une douleur légère et temporaire liée aux prélèvements et du stress du fait de leur manipulation et de la séparation des animaux concernés du reste du troupeau lors de la journée de formation.
Devenir
Tous les animaux utilisés pour la formation seront gardés en vie et réintègreront le troupeau à l'issue de la journée de formation.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer les animaux du fait même de l'objet du projet qui est de former des personnels aux techniques de prélèvement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit au nombre de stagiaires de chaque groupe pour que chaque stagiaire puisse pratiquer en autonomie. Cela permet de réduire le nombre de prélèvements sur chaque animal qui serait un facteur agravant de son stress et de sa douleur.
Raffinement
Chaque jour de formation comprendra 1 partie d'apports de connaissances sur le BEA, la règle des 3R, les points limites, les indicateurs de suivi des animaux, les modes de raffinement appropriés aux techniques de prélèvements (par exemple : préparation des animaux, leur habituation, choix du matériel ou de la méthode de prélèvement adaptés selon les attendus scientifiques du prélèvement). En ce sens, la formation contribuera à la pratique de méthodes raffinées de prélèvements dans les projets de recherche conduits dans notre EU.
Choix des espèces
Le projet utilise des ovins et des bovins car ce sont les espèces sur lesquelles sont conduites les recherches dans notre EU. Dans le cadre de notre projet, le stade physiologique n'a pas d'importance majeure.
Nouvelles approches pour caractériser la valeur des aliments et leur digestion chez les vaches laitières pour une meilleure maitrise du rationnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2 vaches vont être utilisées, gardées vivantes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la caillette, huit semaines de perfusions digestives continues de nutriments, puis l'obturation chirurgicale du cathéter, avec un suivi comportemental et des prises de sang pour mesurer le stress et l'inflammation. Le projet cherche à mettre au point une chirurgie moins invasive que la canule permanente du duodénum, présentée comme un raffinement au service d'études futures sur la digestion des ruminants. Le porteur affirme que les systèmes in vitro et in silico ne peuvent reproduire la répartition des nutriments entre organes et justifie le recours à l'espèce bovine.
Objectifs
Ce projet porte sur le développement d’alternatives à l’utilisation de ruminants fistulés avec des canules permanentes pour développer de futurs essais sur la digestion et le métabolisme avec des vaches opérées par des techniques chirurgicales moins invasives. Il répond ainsi aux principes de réduction du nombre de bovins canulés de façon permanente et de raffinement des approches chirurgicales (règles des 3R). L’élevage des bovins doit faire face à de nombreux enjeux, tels que limiter les impacts environnementaux et la compétition avec l’alimentation humaine. Pour cela, il est nécessaire de bien connaitre les processus de digestion afin d’optimiser l’apport de nutriments (azotés, minéraux, vitamines) à l’animal et les processus métaboliques qui permettent à l’animal à la fois d'utiliser ces nutriments pour les différentes fonctions (immunitaire, reproduction, la synthèse de viande et de lait) et limiter leurs rejets dans l’environnement (pollutions). Du fait de la digestion microbienne dans le rumen, pour établir les recommandations sur les nutriments absorbés dans l’intestin grêle, il faut pouvoir maitriser leurs apports, ce qui ne peut se faire que par des perfusions de ces nutriments dans un compartiment post-rumen (comme la caillette ou le duodénum). L'objectif de cette demande d’autorisation est donc de soumettre à l’évaluation, une procédure chirurgicale moins lourde que la pose de la canule permanente du duodénum en la remplaçant par la pose d’un cathéter dans la caillette de petit diamètre. La chirurgie se fera sous anesthésie et analgésie locale. Une vérification de l’adéquation de la prise en charge de la douleur à la pose et de la bonne récupération des animaux à l’issue de la pose et après l’obturation du cathéter sera effectuée par un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et paramètres sanguins du stress et de l’inflammation). Une vérification de la fonctionnalité du système de perfusion des nutriments dans la caillette sur un temps comparable à un essai de perfusions de nutriments dans le duodénum sera également réalisée.
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de ce projet est de pouvoir réduire le nombre de bovins canulés du tube digestif de façon permanente et de raffiner les procédures en permettant de développer une approche chirurgicale (règles des 3R) moins invasive (anesthésie et analgésie multimodales locales vs. anesthésie et analgésie générale). Le bénéfice scientifique de la mise au point d’une telle procédure est de poursuivre le travail sur l’amélioration des systèmes d’alimentation des ruminants visant à calculer au plus juste les apports alimentaires en terme de nutriments absorbés dans l’intestin et leur effet sur le métabolisme. Ces différentes études nécessitent la connaissance / la maitrise des apports par perfusions digestives des nutriments étudiés. Pour éviter les modifications (transformations, utilisations, synthèses) dues à la digestion microbienne dans le rumen, ces perfusions doivent être réalisées dans les compartiments digestifs se situant en aval du rumen (comme la caillette équivalent de l’estomac chez les monogastriques). En effet, les recommandations alimentaires actuelles en acides aminés, vitamines et minéraux sont incomplètes en termes de composés et de situation d’élevage. Il est important, dans une démarche de transformation agroécologique des systèmes d’élevage, de pouvoir préciser les besoins des ruminants, les apports réels dans la ration, la biodisponibilité pour l’animal et le statut de déficit (carence en calcium, insuffisances en vitamine, acides aminés limitants), ou d’excès (pollutions) correspondant. Ces aspects ne peuvent être évalués qu’au travers d’expérimentations visant le plus souvent à relier des apports maitrisés de ces différents composés aux réponses de leurs biomarqueurs sanguins chez les ruminants. Ainsi, des projets sur l’étude de l’effet de certaines vitamines, minéraux et acides aminés (méthionine) sur la fourniture d’antioxydants et la santé des ruminants laitiers dans un concept d'une seule Santé (nutrition de l’animal et santé de l'animal et de l’homme par les produits laitiers) sont en cours d’évaluations. De plus, des études seront menées pour maitriser l’apports de nutriments tels que les acides aminés et le phosphore pour établir leurs recommandations tout en limitant leurs impacts environnementaux (excès d’azote ou de phosphore, deux sources de pollutions). Ces études nécessiteront le recours à l’apport de nutriments pour l’intestin par perfusions digestives dans la caillette.
Procédures
Les 2 vaches subiront 3 étapes décrites ci-dessus : - Etape 1 : Pose d'un cathéter dans la caillette sous anesthésie locale et analgésie. Dans cette procédure qui dure 14 jours, l’animal aura une intervention chirurgicale et la douleur sera gérée grâce à des antalgiques adaptés, et grâce à un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress). - Etape 2 : Perfusions digestives de nutriments sur deux vaches munies d'un cathéter dans la caillette. Ces perfusions seront réalisées en continue (24h/24) durant 4 séquences de 7 jours (soit 8 semaines, ce qui correspond aux temps de perfusions de nutriments dans le duodénum). Ces perfusions ne sont pas douloureuses, et sont réalisées sur animal vigile. - Etape 3 : Obturation du cathéter de la caillette placé en sous-cutané sous anesthésie locale. Dans cette procédure qui dure 14 jours, le suivi de la bonne cicatrisation se fera par une approche mutiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress).
Impact sur les animaux
La présence d'un cathéter de la caillette n'engendre pas de nuisance pour les animaux, une fois qu'ils ont récupéré de la chirurgie (sous anesthésie locale, anti-inflammatoire et analgésique de type dérivé morphinique). La contention physique pour la réalisation des prises de sang (via des cathéters à la jugulaire) sera brève et très légère (tenue de la tête avec un licol) par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Ce stress sera de courte durée et sans douleur pour les animaux. Lors des essais de perfusions de nutriments il existe un petit risque de développement d'un point d'infection à la sortie du cathéter au niveau de la peau. Pour pallier à ce risque, une surveillance quotidienne de cette zone sera effectuée avec un nettoyage par des antiseptiques de la zone deux fois par semaine. En cas de début d'infection, notre vétérinaire sera consulté. Ce cathéter ne peut pas être retiré car il est cousu à la caillette mais il peut être raccourci (coupé au raz de la peau) et obturé par un nœud avant d'être placé en sous-cutané. Ceci permet une cicatrisation complète de la peau au niveau du point de sortie. Pour éviter toute nuisance au moment de l'obturation du cathéter et de son placement en sous cutanée, les animaux seront de nouveau placés sous anesthésie locale et un suivi multiparamétrique sera effectué sur les jours suivants. Une fois le point de sortie du cathéter cicatrisé, nos collègues n'ont constaté aucun développement d'infection sous cutanée. Cependant, la zone sous-cutanée où se trouve placé le cathéter fera l'objet d'une surveillance hebdomadaire des animaux tout au long de leurs vies (par exemple au moment de la traite ou de l’alimentation) pour vérifier l’absence de rejets.
Devenir
A chaque étape (pose d'un cathéter à la caillette, perfusions de nutriments et obturation du cathéter en sous-cutanée) l'animal est gardé en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement utilisateur ou son délégataire.
Remplacement
Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives en remplacement de la pose de canules permanentes du duodénum, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal à ces variations de flux de nutriments digérés. Les réponses multiples des animaux en termes de digestion et répartition des nutriments entre différentes fonctions comme la synthèse de lait par la mamelle (ex : exportation de calcium dans le lait), la reconstitution des réserves (ex : calcification osseuse) et les fonctions de santé ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants ; les cultures cellulaires de différents tissus ne miment en effet pas la répartition des nutriments qui s’opère entre différents organes et fonctions. Des systèmes ayant été mis en œuvre par le passé pour étudier des phénomènes d’absorption épithéliale (type cellules ou chambres de Ussing) nécessitent d’utiliser des fragments de paroi du tube digestif fraichement prélevés mais sont peu reproductibles et donc peu utilisables pour des comparaisons entre groupes d’individus recevant des alimentations contrastées, par exemple. Leur intérêt repose plutôt pour l’étude de mécanismes biologiques d’absorption ou de transfert trans-épithélial. Enfin, les systèmes in vitro d’étude des phénomènes de digestion intestinale (comme le TIM gastro-intestinal system proposé par le TNO) ne sont pas adaptés aux modèles ruminants dont l’étape de digestion et fermentation ruminale entraine une modification trop importante du bol alimentaire pour le mimer dans un système in vitro de ce type et les spécificités des phénomènes biologiques d’absorption (liés à l’espèce ou au type de composés d’intérêt dont certains nécessitent des protéines de transport membranaires ou intracellulaires) ne sont pas transposables à des systèmes de membranes non biologiques. Compte tenu de l’absence presque totale de données dans la littérature pour certains de composés d’intérêt (vitamines par exemple), une approche in silico est actuellement impossible.
Réduction
Notre stratégie d’expérimentation est de réduire au maximum le nombre d’animaux participant à ces tests méthodologiques de raffinement des procédures chirurgicales. Pour la procédure de pose de cathéters dans la caillette, il s’agit d’adapter une technique pratiquée couramment en médecine vétérinaire, l'omentopexie, qui consiste en la fixation de la caillette sur le flanc droit. L’introduction d’un cathéter dans la caillette est pratiquée par nos collègues Canadiens (Doepel et al., 2006) qui nous ont guidé dans le développement du mode opératoire. Nous souhaitons faire la demande pour seulement 2 chirurgies pour 2 vaches, sachant que 2 autres vaches ont déjà été utilisées pour réaliser la même procédure sur un autre site. Notre vétérinaire maitrise à la fois la technique d’omentopexie et celle de poses de cathéters. Ce nombre de deux animaux a été raisonné avec notre vétérinaire pour rester faible mais suffisant pour être capable de reproduire le geste. Ainsi 4 animaux auront (2 par sites) été utilisés pour mettre au point cette nouvelle méthodologie sachant que les essais futurs nécessitant ces techniques utiliseraient également 3 à 5 animaux.
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour le raffinement des conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose du cathéter à la caillette, et de son obturation, le protocole médicamenteux est adapté afin de s'assurer de la prise en charge de toute douleur lors de ces actes. Pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien-être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en œuvre (au moment de la pose et de l'obturation du cathéter à la caillette) deux fois par jour de J-2, J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et des critères liés à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour vérifier si une douleur résiduelle existait malgré l’analgésie multimodale pratiquée.
Choix des espèces
Ces techniques permettront de continuer de travailler sur les recommandations alimentaires en nutriments et micronutriments des vaches dans un concept d’évolution agroécologique. En effet, il s’agit de réduire certains apports nutritionnels pour diminuer les rejets polluant pour l’environnement tout en maitrisant le volume et la qualité technologique du lait. Il s’agit aussi d’intégrer dans ces conditions le concept d’une seule santé pour l’animal et l’homme en apportant les nutriments nécessaires à une bonne santé de la vache, du veau, tout en améliorant la qualité nutritionnelle des laits pour l’homme (protéine idéale, calcium, vitamines, antioxydants, micronutriments etc.). Pour cela, des études de digestion et métabolisme de certains nutriments et métabolites spécifiques sur les vaches laitières sont requises pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes. Il faut donc travailler sur l'espèce bovine. Le troupeau est constitué de vaches Prim'Holstein, la race de vaches laitières la plus utilisée.
Formation de personnels aux techniques de mesures et de prélèvements sur ovins et bovins
- Formation professionnelle
Bovins : 27
45 animaux, 18 moutons et 27 bovins, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrés au troupeau. Chaque animal subit des prises de sang, des prélèvements de jus de rumen par sonde œsophagienne et des prélèvements de fèces, répartis sur des journées espacées d'au moins un mois. Le porteur précise que ces gestes ne servent pas à produire des connaissances mais à entraîner concepteurs, applicateurs et soigneurs à des techniques de prélèvement. Il affirme que le remplacement est impossible puisque l'objet même du projet est la formation des personnels.
Objectifs
L'objectif est de former les concepteurs et applicateurs de procédures expérimentales ainsi que les soigneurs de l'EU aux techniques de prélèvements spécifiques utilisées régulièrement dans les projets de recherche qui sont mis en oeuvre sur l'EU. Ces techniques sont : les prises de sang, les prélèvements du jus de rumen par sonde oesophagienne, les prélèvement de fèces sur ovins et bovins allaitants. Chaque technique fera l'objet d'une formation d'une journée pour chacune des 2 catégories d'animaux. Ces formations entreront dans le cadre de la formation continue des personnels et seront inscrites dans leur livret de compétences.
Bénéfices attendus
Les attendus pour les stagiaires sont: comprendre les attentes d'un prélèvement et les conditions de réussite, maitriser les techniques de prélèvement pour répondre au enjeux scientifiques, augmenter les taux de réussite des prélèvements (et donc réduire le nombre de prélèvements), faciliter le dialogue entre concepteurs, applicateurs et soigneurs. Le projet contribue à l'amélioration du bien être des animaux, au raffinement des techniques de prélevement et à réduire la douleur lors des prélèvement.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (3 prélèvements sur une journée), de contenu ruminal (2 prélèvements sur une journée) et de fèces (2 prélèvements sur une journée). Les journées de prélèvement sont espacées d'au moins 1 mois afin d'assurer une période récupération suffisante des animaux.
Impact sur les animaux
Les 3 techniques de prélèvement faisant l'objet du projet correspondent à des procédures légères. Les nuisances pour les animaux peuvent être une douleur légère et temporaire liée aux prélèvements et du stress du fait de leur manipulation et de la séparation des animaux concernés du reste du troupeau lors de la journée de formation.
Devenir
Tous les animaux utilisés pour la formation seront gardés en vie et réintègreront le troupeau à l'issue de la journée de formation.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer les animaux du fait même de l'objet du projet qui est de former des personnels aux techniques de prélèvement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit au nombre de stagiaires de chaque groupe pour que chaque stagiaire puisse pratiquer en autonomie. Cela permet de réduire le nombre de prélèvements sur chaque animal qui serait un facteur agravant de son stress et de sa douleur.
Raffinement
Chaque jour de formation comprendra 1 partie d'apports de connaissances sur le BEA, la règle des 3R, les points limites, les indicateurs de suivi des animaux, les modes de raffinement appropriés aux techniques de prélèvements (par exemple : préparation des animaux, leur habituation, choix du matériel ou de la méthode de prélèvement adaptés selon les attendus scientifiques du prélèvement). En ce sens, la formation contribuera à la pratique de méthodes raffinées de prélèvements dans les projets de recherche conduits dans notre EU.
Choix des espèces
Le projet utilise des ovins et des bovins car ce sont les espèces sur lesquelles sont conduites les recherches dans notre EU. Dans le cadre de notre projet, le stade physiologique n'a pas d'importance majeure.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Bovins : 970
1 470 moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une substance d'essai puis sont inoculés avec les agents de la fièvre catarrhale ovine, de la diarrhée virale bovine ou du virus respiratoire syncytial, et subissent des prélèvements et des écouvillonnages nasaux, pour évaluer l'efficacité de produits immunologiques vétérinaires. Le porteur indique que l'épreuve virulente peut provoquer boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes et jetage, et que tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet car infectés ou vaccinés avec des vaccins vivants. Il présente l'évaluation sur l'"espèce cible" comme une exigence réglementaire.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai chez les bovins et chez les ovins contre 3 pathologies : la Fièvre Catarrhale Ovine chez les ovins et chez les bovins, contre la Diarrhée Virale des Bovins chez les bovins et contre l’infection au Virus Syncithial Respiratoire chez les bovins. Les études d’efficacité par épreuve consistent dans un premier temps à immuniser les animaux par administration de la substance d’essai puis dans un second temps à inoculer l’agent pathogène de la maladie concernée afin d’évaluer la protection apportée par la substance d’essai testée. Ces études sont des obligations règlementaires menées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de différents guidelines et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Avant de réaliser ces études règlementaires d’efficacité par épreuve, il est nécessaire de mettre au point les modèles d’épreuve et parfois d’amplifier le pathogène in vivo pour constituer un stock suffisant de souche d’épreuve. Aussi, dans un but d’amélioration continue, en fonction de l’évolution des connaissances, de nouvelles études peuvent être réalisées pour optimiser le modèle d’épreuve. Cette optimisation permet d’obtenir un modèle plus fiable, plus reproductif et plus représentatif de la pathologie dans son développement réel. La finalité des études menées au sein de ce projet est la mise au point de vaccins d’un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins sont essentiels en élevage afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses, de diminuer l’usage des antibiotiques et de garantir les performances zootechniques et économiques.
Bénéfices attendus
La finalité des procédures décrites dans ce projet est de valider l’efficacité de produits immunologiques contre 3 pathologies dont les effets sanitaire et économique sont très importants. La disponibilité de produits efficaces permet : - de protéger l’animal en tant qu’individu, - de réduire le nombre d’animaux affectés et/ou la gravité de la maladie, ce qui augmente la protection au niveau du troupeau, - d’améliorer le contrôle de la dispersion géographique de la maladie.
Procédures
Pour la première étape d’immunisation des animaux, l’administration de la substance d’essai est réalisée sur des animaux vigiles, 1 à 3 injections sont réalisés avec 1 à 3 semaines d’intervalles. Ces injections durent de 1 à 2 minutes maximum en incluant la contention. Pour la deuxième étape d’administration, les injections s'effectuent sur animal vigile, une cage de contention pourra être utilisée. Ces administrations durent de 1 à 2 minutes maximum, à l’exeption de l’administration avec une nébulisation électronique qui dure approximativement 5 minutes. Les prélèvements s'effectuent sur animaux vigiles, des cages de contentions pourront être utilisées, un miminum de 48H entre deux prélèvements. Des prélèvements terminaux pourront être réalisés, ils seront toujours réalisés sous anesthésie. Des prélèvements par écouvillonnage nasaux s'effectuent sur animal vigle, des cages de contention pourront être utilisées, un miminum de 24H entre deux écouvillonnages. Ces prélèvements durent de 2 à 3 minutes maximum en incluant la contention. Pour les administrations de substances – de la souche de challenge et/ou pour les prélèvements une tranquilisation des animaux pourra être réalisée si les animaux présentent un niveau de stress important, se caractérisant par un comportement défensif, et/ou de fuite. Des prélèvements terminaux de sang ou de liquide broncho-alvéolaire seront toujours réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans ce document vont avoir des effets directs et indirects sur les animaux. Les effets directs sont considérés comme peu invasifs car les manipulations (contention, administration) et les prélèvements (prélèvement sanguin, écouvillonnage) sont de courte durée. Les effets indirects découlent des effets potentiels des souches d’épreuve administrées. Pour les effets indirects, lié à l’administration de la souche d’épreuve, les différentes épreuves incluses dans le projet peuvent être classées en deux catégories, celles dont la pathologie reste frustre et sous-clinique, avec des signes cliniques rares et légers et celle qui entrainent des signes cliniques modérées : boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes, jetage, fièvre, hyperthermie, toux, dyspnée… ces modèles d’épreuve nécessitent un suivi clinique adapté et des points limites spécifiques permettant d’anticiper la dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet, car animaux hébergés, possiblement vaccinés avec des vaccins vivants diffusibles et/ou infectés avec des agents pathogènes.
Remplacement
Ces ruminants représentent les espèces cibles des substances d’essai testées. Les essais in vivo réalisés dans ce projet doivent être conduits chez l’animal afin qu’ils puissent répondre aux exigences règlementaires. Dans le cadre d’études non règlementaires, les procédures expérimentales réalisées chez les espèces cibles permettent d’avoir des résultats plus conclusifs. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible, décrites dans le présent projet, ne disposent pas d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives.
Réduction
Pour les études règlementaires, le nombre d’animaux requis est souvent déterminé par les textes (pharmacopées et/ou autres textes règlementaires concernés). Lors des phases de recherche en amont des études réglementaires, les effectifs sont évalués au plus juste (en fonction de la bibliographie, des guidelines, de l’historique, de la définition des objectifs…) de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont également déterminés de façon à empêcher les études non conclusives.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, la Structure chargée du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques et des conditions de vie pour les animaux. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans un but d’habituation avec l’environnement et le personnel, afin de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental- animaux devant être manipulés au moment du sevrage, et que l’on préfère laisser le plus possible avec leur mère). Des points limites, spécifiques ou non de la pathologie, ainsi qu’un suivi adapté (observations quotidiennes, bi-quotidiennes…) sont mis en place afin de prendre en charge les animaux le plus rapidement et efficacement possible lors du développement de pathologies entrainant une potentielle douleur chez l’animal. Ces critères sont en constante évolution afin qu’ils reflètent au mieux l’état des connaissances vétérinaires actuelles. Une gêne peut également être occasionnée en fonction de l’occurrence des administrations et/ou prélèvements. Afin de réduire cet inconfort, les opérateurs hautement qualifiés réalisent une contention adaptée (potentiellement incluant anesthésie et /ou analgésie) de l’animal et une alternance des sites d’administrations et/ou de prélèvements peut être mise en place.
Choix des espèces
L’évaluation chez l’espèce cible est une exigence règlementaire. Les bovins et les ovins sont les espèces cibles des substances d’essai étudiées. Les animaux utilisés peuvent être des nouveau-nés, de jeunes animaux en croissance et/ou des adultes (y compris des femelles gestantes). L’âge dépend des besoins pour les études d’efficacité par épreuve, de production de souches et/ou d’études de mise au point de modèle d’épreuve qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, de la substance d’essai testée et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités.