Bovins

430 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie puis envoyés à l'abattage pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, jusqu'à onze prises de sang, des prélèvements de fèces et deux biopsies de tissu adipeux, pour mesurer l'efficacité alimentaire et des marqueurs de qualité de la viande selon les régimes d'engraissement. Le porteur revendique un "besoin constant d'animaux" et présente le projet comme une source de références techniques pour la filière et sa valorisation économique. Il affirme que le recours aux bovins est "obligatoire" puisqu'ils sont l'espèce cible de l'élevage étudié.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes (100 animaux max). Prises de sang : 4 fois /animal durant l'expérimentation (180 animaux) et 11 fois/animal durant l'expérimentation (250 animaux) (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation (180 animaux) et 6 fois/animal (250 animaux) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal (430 animaux max) en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours (80 animaux).

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de toutes les procédures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées. Dans certains cas une approche en carré latin pourra être utilisée (dans ce cas l'animal est son propre témoin et soumis aux différents régimes alimentaires expérimentaux) pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

9 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes à l'issue. Chacune subit des synchronisations hormonales, des collectes d'embryons et des ponctions ovariennes répétées sous anesthésie épidurale, jusqu'à six à huit ponctions pour la condition d'édition du génome. Le projet mesure le taux de mutations dans des embryons produits selon trois biotechnologies de la reproduction, dont l'édition génétique. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ni aucun modèle ex vivo ne peut se substituer aux génisses pour cette étude liée à la sélection des bovins.

Objectifs

Depuis plusieurs dizaines d’années, différentes biotechnologies de la reproduction sont développées chez les bovins, principalement pour augmenter le progrès génétique annuel réalisé dans le cadre des schémas de sélection. Encadrés par l’Etat, ces programmes d’amélioration génétique des bovins ont permis d’améliorer considérablement les performances des élevages selon les critères souhaités par la Société (limités initialement aux critères de production, ces critères s’élargissent à la durabilité des systèmes de production intégrant des notions de faible impact environnemental, de bien-être et de longévité des animaux…). Ces biotechnologies de la reproduction comprennent notamment (1) la production d’embryons in vivo consistant en la récupération d’embryons présents dans le tractus femelle 7 jours après insémination d’une femelle donneuse, (2) la production d’embryons in vitro consistant en la récupération d’ovocytes en vue de leur fécondation et de leur développement in vitro ainsi que (3) la technologie d’édition du génome permettant d’effectuer des modifications génétiques ciblées, en particulier dans l’embryon. Si certaines de ces technologies sont utilisées à des fins agronomiques (production d’embryons in vivo et in vitro), d’autres ne sont aujourd’hui étudiées qu’à des fins expérimentales (édition du génome). Les potentialités de cette dernière sont énormes dans le domaine médical ou l’élevage mais son utilisation fait débat, tant sur le plan éthique qu’en termes de biosécurité. En particulier, des questions se posent quant au risque de générer des néomutations hors cible. Au-delà des développements techniques pour améliorer leur efficacité, il convient d’étudier les conséquences de ces technologies plus finement et notamment leurs impacts sur l’intégrité de l'ADN. Le projet présenté vise à étudier le taux de néo-mutations post-zygotiques dans des embryons produits selon trois technologies différentes : in vivo (condition 1), in vitro (condition 2) et in vitro avec édition du génome (condition 3).

Bénéfices attendus

Le projet présenté ici permettra l’acquisition de connaissances fondamentales nécessaires au développement raisonné de ces technologies.

Procédures

La production des embryons selon les 3 biotechnologies nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 1 à 2 collectes d’embryons pour la condition 1, de 1 à 2 ponctions ovocytaires pour la condition 2 et de 6 à 8 ponctions ovocytaires pour la condition 3. Ces collectes d'embryons et d'ovocytes nécessitent un ensemble d'interventions sur les animaux: synchronisation des chaleurs (pose et retrait de dispositifs vaginaux, injection intra-musculaire), ponctions ovariennes mutliples sous contrôle échographique, traitement de superovulation (injections intramusculaires répétées), inséminations animales et lavage non invasif de l'utérus (condition 1 uniquement). Les ponctions ovariennes et le lavage de l'utérus seront effectuées sur animaux vigiles anesthésiés. es productions d'embryons selon les 3 conditions se feront selon un dispositif en carré latin, le premier lot de femelles produisant les embryons selon les conditions 1, 2 puis 3 alors qu'en parallèle, le deuxième lot produira les embryons selon les conditions 2, 3 puis 1 et enfin le 3ème lot selon les conditions 3, 1 puis 2.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale utilisée dans le cadre de ce projet comprend des biotechnologies de la reproduction couramment utilisées (collectes d'embryons et d'ovocytes) par les entreprises de sélection dans le cadre des schémas d'amélioration génétique. De ce fait, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses. Les collectes d'embryons et d'ovocytes seront réalisées sous anesthésie épidurale. Les animaux seront suivis de façon journalière. En cas d’atteinte du point limite (posture de compensation, station prolongée debout ou couché, difficulté pour manger et boire, modification comportementale induite par stimulation de la zone douloureuse, lésions, modifications neurovégétatives ou physiologiques), la décision sera prise d’euthanasier l’animal en concertation avec le vétérinaire sanitaire de l’élevage. Dans ce cas de figure, l’euthanasie sera effectuée par le vétérinaire sanitaire par injection lente par voie intraveineuse d’une surcharge de barbituriques après une sédation préalable.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire à partir d’un mâle (afin contrôler la variabilité introduite par le père, dont le statut physiologique peut influer sur le nombre de mutations germinales mâles) pour étudier la fréquence de néo-mutations post-zygotiques. En effet, si l’on considère qu’il est attendu environ 50 néomutations naturelles (i.e. en condition vivo) et que l’on souhaite détecter une augmentation de 10% (soit 5 néomutations supplémentaires) induite par l’un ou l’autre des conditions expérimentales, il est nécessaire de produire 30 embryons par catégorie pour atteindre le seuil de significativité fixé. L’utilisation de 9 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal.

Raffinement

L’étude est mise en place sur 9 génisses qui seront ainsi hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale, facilité d’accès à l’auge et à l’eau. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux collectes d’embryons et aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés, seau de mélasse à lécher,....) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention pour les collectes d'embryons et d'ovocytes.

Choix des espèces

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).

2 bovins vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie générale pour poser puis retirer une canule dans le rumen, ainsi que jusqu'à vingt-six prélèvements sanguins, pour mettre au point une canule temporaire présentée comme moins invasive que les canules permanentes. Le porteur indique une possible gêne mécanique pendant la cicatrisation et un léger écoulement au retrait. Il revendique un "besoin constant d'animaux" pour la recherche agronomique et affirme ne pas pouvoir remplacer le bovin par un fermenteur artificiel.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des GES, pollution des sols...) ou les attentes sociétales (bien-être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants, les animaux modèles utilisés sont ici des bovins. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (ovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour bovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm, diamètre interne = 1.5 cm, réalisé en plastique afin d’être peu dense et donc le plus léger possible pour éviter une gêne de l’animal) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 24 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion.

Bénéfices attendus

Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures, soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.

Procédures

Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Des prélévements sanguins par voie caudale (13, si besoin au maxium 26) seront réalisés sur les deux bovins vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure.

Impact sur les animaux

Il est possible d’avoir une possible gêne mécanique de la canule au niveau des faisceaux musculaires le temps de la cicatrisation des tissus. Par conséquent la gêne occasionnée est temporaire. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se ferme naturellement de manière mécanique.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les 2 vaches retourneront dans le troupeau après avoir complétement récupérées.

Remplacement

Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des bovins dans ce projet.

Réduction

Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible, pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en oeuvre (au moment de la pose et du retrait de la canule temporaire) deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour déceler si l'animal souffre des procédures réalisées.

Choix des espèces

Nous étudions la digestion des ruminants et le bovin est l'un des modèles d'études de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce bovine. Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives que la pose de canules permanentes ruminales, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux qui peuvent être utilisées à différents stades physiologiques : vaches en production ou taries. Le stade de lactation important peu pour cet essai.

45 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau et susceptibles d'être réutilisées. Trente-six d'entre elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide dans un quartier de la mamelle pour déclencher une inflammation, en plus de prises de sang répétées, afin de tester des compléments alimentaires censés prévenir les mammites. Le porteur indique que l'injection provoque une fièvre et une mamelle douloureuse de quatre à douze heures, et qu'aucun analgésique n'est administré car il interférerait avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la réponse immunitaire doit être évaluée à l'échelle de "l'animal entier", ce qu'aucun système in vitro ne permettrait.

Objectifs

Les mammites sont parmi les maladies les plus fréquentes en élevage bovin laitier. Elles affectent les performances zootechniques et économiques et sont source de mal-être des animaux. La capacité des bovins laitiers à résister à l'établissement de mammites est liée, en partie, à l'efficacité de leur système immunitaire mais également au fonctionnement du tissu mammaire. Par ailleurs, les vaches laitières sont sujettes à un stress oxydant intense au démarrage de la lactation. Le stress oxydant interfère avec le système de défense immunitaire et peut également entrainer des dommages tissulaires au niveau mammaire. Alimenter les vaches laitières avec des extraits de plantes riches en antioxydant et en d’autres principes actifs susceptibles d’agir directement sur le système immunitaire pourrait permettre d’optimiser le statut immunitaire et antioxydant des vaches laitières et ainsi prévenir les mammites, cliniques ou sub-cliniques. Ainsi, les effets de ces extraits de plantes sur les mécanismes impliqués dans la réponse du système immunitaire et le fonctionnement mammaire méritent d’être objectivés pour permettre le développement de ces solutions sur le terrain. L’objectif de cette étude est de déterminer si des extraits de plantes ou un apport de vitamine E peut agir sur le statut immunitaire et antioxydant de la vache laitière en situation d’épreuve inflammatoire en réduisant le stress oxydant et l’inflammation et en améliorant l’intégrité de l’épithélium mammaire. La supplémentation en vitamine E correspond à une stratégie de prévention des mammites dont les effets ont été objectivés dans la littérature et constitue un témoin positif. Les supplémentations en vitamine E et en extrait de plantes seront comparées à un traitement témoin non supplémenté. Les extraits de plante testés ont vocation à être commercialisés en fermes laitières et à ce titre leur usage répond à toutes les réglementations en vigueur garantissant leur innocuité pour les animaux.

Bénéfices attendus

Les mammites sont le fait d’une pathologie courante en élevage laitier, notamment pendant les premières semaines de lactation. C’est aujourd’hui une des premières causes d’usage des antibiotiques dans ces élevages. L’adoption de stratégies alimentaires de prévention des mammites pourrait être un levier, à associer à d’autres, pour réduire le risque de mammites. Cependant, afin de définir les stratégies les plus efficaces possible, leurs effets méritent d’être objectivés. Le présent projet a pour objectif de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces stratégies peuvent favoriser un fonctionnement adéquate du système immunitaire face à une infection. Les bénéfices attendus sont une réponse inflammatoire améliorée avec les suppléments de vitamine E ou extraits de plantes. Cette réponse sera suivie par la mesure dans le lait des marqueurs de l’inflammation notamment la présence de cellules somatiques et le dosage de molécules de l’inflammation dans le sang et le lait. L’épreuve inflammatoire mise en œuvre dans ce projet peut être qualifiée de mécaniste par rapport à des approches épidémiologiques qui pourraient être une alternative. Elle se traduit par l’implication de peu d’individus dans l’objectif de mesurer l’effet des stratégies ciblées sur un mécanisme en amont de la déclaration des mammites (à savoir la réponse immunitaire) avec l’objectif de généraliser ces résultats. Ces travaux pourront permettre de donner de nouvelles recommandations pour une nutrition préventive des vaches laitières en début de lactation. La substitution des traitements antibiotiques par un ensemble de stratégie de prévention répond au concept de gestion intégrée de la santé aussi bien à destination des animaux, notamment en élevage, que des hommes.

Procédures

Durant ce projet, 45 vaches seront soumises à 2 prises de sang au niveau de la veine de la queue avant leur mise-bas. Parmi ces vaches, 36 seront soumises à l'injection d'un composé inflammatoire (lipopolysaccharide) dans un des quartiers de la mammelle en 5ième semaine de lactation et à 4 prises de sang au niveau de la veine jugulaire, une avant l'injection de LPS, les 3 autres, 4h, 28h et 76h après l'injection. En parallèle, des échantillons de lait seront également prélevés par traite partielle avant l’injection puis 0h, 4h, 7h, 10h, 28h, 52h et 76h après l’injection. L’injection de LPS dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire.

Impact sur les animaux

Entre quatre semaines avant la date prévue de vêlage et la fin de la 4ième semaine de lactation, les vaches seront conduites de la même façon que les autres vaches de la ferme, à la seule différente de la nature des stratégies de supplémentation destinées à prévenir les mammites. Le traitement ‘sans supplémentation’ se traduira par la non administration de suppléments alimentaires susceptibles d’aider les vaches à prévenir les maladies infectieuses, ce qui donnera lieu à un suivi rapproché afin de détecter précocement tout signe d’infection et de sortir rapidement les animaux de l’essai pour un traitement adapté. Les doses de vitamine E offertes seront toujours inférieures au maximum tolérable et l’extrait de plante utilisé a été évalué en amont de l’essai pour son absence de nocivité pour les vaches. Lors de cet essai, nous observons aussi les conséquences d’une injection d’un composé pro-inflammatoire dans un quartier de la mamelle. L’injection de lipopolysaccharide dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté sera douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les animaux seront par ailleurs suivis de près pour détecter dans les jours qui suivent tout cas de pathologie autre que cette injection pourrait masquer. Enfin, les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigils. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront réintégrés dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux laitiers expérimentaux. Ces animaux sont donc susceptibles d’être réutilisés pour d’autres projets expérimentaux.

Remplacement

Même si des premières études sur cellules en culture ont permis de réaliser une première sélection des extraits de plantes susceptibles de moduler favorablement la réponse immunitaire et dont l’usage en ferme pourrait être envisagé, il n’est pas possible de remplacer entièrement l’utilisation d’animaux pour définir les modes d’actions des extraits de plantes. En particulier, l’amélioration de la réponse immunitaire et du statut antioxydant doit être évalués à l’échelle de l’animal entier afin de prendre en compte à la fois les régulations cellulaires mais aussi systémiques de ces réponses. La méthode proposée permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier et permet de ré-introduire les animaux en élevage et donc de les garder en vie.

Réduction

L’objectif est de disposer de résultats sur 12 animaux par stratégie testée. Ce nombre a été évalué pour disposer d’une puissance statistique suffisante compte-tenu que chaque lot de vache ne recevra qu’un des trois traitements au cours de l’expérimentation. L’objectif est de disposer de suffisamment d’animaux pouvant détecter une différence entre les groupes en fonction des traitements et des réponses analysées. L’épreuve inflammatoire nécessitant de disposer d’animaux répondant à deux conditions qui sont difficiles à anticiper, des animaux de réserves (3 par stratégie) vont devoir être inclus. Les deux conditions sont de disposer au moment de l’épreuve de vaches à un même stade de lactation et ayant au moins un quartier de la mamelle avec un très bon niveau sanitaire constaté par une concentration faible de cellules somatiques dans le lait. Selon les dates effectives de vêlage et les résultats d’analyses de lait avant l’épreuve inflammatoire, certaines vaches pourront être remplacées par ces vaches de réserve pour l’épreuve inflammatoire. Des résultats expérimentaux passés permettent d'évaluer que 3 animaux de réserve par stratégie seront suffisants. Au final, le nombre d’animaux impliqués sera donc de 45, dont au maximum 36 seront soumis à l’épreuve. Les données seront analysées par analyse de variance en modèle mixte à l’aide du logiciel R. Nous étudierons l'effet des traitements en mesures répétées avec analyse de l’effet du temps et prise en compte de la vache en effet aléatoire.

Raffinement

La conduite d’élevage sera respectueuse du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux (fièvre supérieure à 40°C, animal couché faible, et les œdèmes de la mamelle qui engendre une sensibilité importante) sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et traiter si besoin les animaux malades. Les parties du protocole pouvant entraîner de la souffrance chez les animaux sont clairement identifiées (prise de sang et épreuve inflammatoire). Le traitement visant à induire une inflammation dans un quartier de la mamelle est suivi d’une réponse inflammatoire de courte durée avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de cette inflammation. De plus, contrairement à une infection expérimentale, ce protocole permet de garder les animaux en vie tout en permettant de mimer les premières étapes d’une mammite. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être contentionnés lors de la distribution des aliments. A la fin de l’essai tous les animaux réintègreront le troupeau de la ferme.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. L’incidence des mammites étant la plus forte et de façon nette en début de lactation, de même que le stress oxydatif, les vaches impliquées seront majoritairement en début de lactation.

8 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort, toutes réintégrant ensuite le troupeau. On leur injecte dans un quartier de la mamelle un composé inflammatoire qui provoque une fièvre brève et une douleur à la palpation entre quatre et douze heures, avec des prélèvements de lait et de sang. Le porteur indique qu'aucun analgésique n'est administré car il fausserait l'inflammation étudiée. Il affirme que cette approche évite une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarrissage.

Objectifs

Ce protocole s’inscrit dans le cadre de travaux visant à améliorer la résistance des animaux aux mammites, ces dernières représentant une des maladies majeures à ce jour en élevage bovin. Notre but est de mieux connaître les globules blancs, et plus particulièrement les neutrophiles qui ont un rôle essentiel dans la défense des vaches contre les mammites. Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à arriver sur le site de l'inflammation mammaire lors des mammites bovines, d’où l’importance de la connaissance précise de ces cellules. Parmi les globules blancs des bovins, ces neutrophiles se répartissent en deux sous-groupes, chacun possédant des propriétés spécifiques soit d'activation ou de diminution de la réponse inflammatoire. L'objet de la présente demande est de nous permettre de caractériser finement les neutrophiles de la glande mammaires lors d'une inflammation et d’étudier comment les proportions et les activités biologiques respectives de différents types de neutrophiles évoluent, à la fois dans le sang et dans le lait, lors d'une inflammation mammaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration de la résistance des vaches laitières aux mammites. Il contribuera à une meilleure connaissance des neutrophiles recrutés dans le lait lors d'une inflammation et de leur rôle dans le contrôle de cette inflammation. Les données préalables recueillies dans le cadre du projet Masticells suggèrent que la proportion des neutrophiles régulateurs parmi les neutrophiles du lait à différents temps après déclenchement d'une mammite sont variables. Ces neutrophiles régulateurs ayant des capacités de modulation de la réponse immunitaire de l'hôte, ils pourraient intervenir dans les processus de contrôle de l'inflammation et potentiellement de réparation tissulaire après inflammation. A termes, cette meilleure caractérisation des neutrophiles du lait pourrait être introduite dans les critères d’amélioration génétique de la résistance des vaches laitières aux mammites.

Procédures

Une inflammation mammaire sera induite par injection, via le canal du trayon, d'un composé inducteur d'inflammation dans un des 4 quartiers de la glande mammaire des 8 vaches recrutées. Des prélèvements de lait (2x40ml) et de sang (à la jugulaire) sont prévus à 4 temps (t=0h, 4h, 72h et 144h post-injection de LPS).

Impact sur les animaux

Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté est douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Les animaux réintègreront le troupeau de l’unité expérimentale sur décision de la personne responsable du bien-être des animaux. La réponse inflammatoire consécutive à l'injection de LPS est de courte durée. Ce traitement n’engendre classiquement que peu d’inconfort et, par ailleurs, les animaux seront dans tous les cas soignés en cas de pathologie.

Remplacement

Les informations collectées lors de ce protocole porteront sur l'espèce concernée par les mammites (vache). L'approche proposée permet de remplacer une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarissage. Cette méthode alternative permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèle in vitro permettant de reproduire le recrutement des neutrophiles sanguins dans la glande mammaire suite à une infection mammaire.

Réduction

Huit vaches laitières en lactation seront incluses dans le projet. Ce nombre permet d'obtenir une valeur médiane des proportions de neutrophiles régulateurs dans le lait lors d'une inflammation mammaire. Nous comparerons l'évolution de ce pourcentage à différents points au cours de l'inflammation (t=4h, t=72h, t=144h). Les proportions des neutrophiles régulateurs aux différents temps seront analysées statistiquement par des approches de statistiques adaptées aux petits échantillons. Ce nombre a été déterminé pour satisfaire une condition de validité du test statistique qui sera utilisé (effectif d'au moins 5 animaux) et prendre en compte la possibilité d'une non-réponse de certains animaux (situation rencontrée lors de tests précédents à une fréquence de 5%). La capacité maximale de l'installation est de 8 animaux traités simultanément. Ce nombre d'animaux permettra de traiter tous les animaux en une seule série et ainsi contrôler des variations qui auraient été liées à plusieurs séries espacées dans le temps. Les variables contrôlées seront la race des animaux et le stade de lactation : les animaux seront de la même race (Prim'Holstein) et seront en milieu de lactation (entre 3 et 7 mois).

Raffinement

L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité et la durée de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les animaux seront gardés à proximité des bâtiments le jour de l’injection afin de pouvoir les surveiller de façon suivie. Tout signe d’une dégradation de l’état de santé d’un des animaux entraînera l’intervention du vétérinaire praticien de l’unité. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Elles sont réalisées par du personnel expérimenté. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le bovin. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein en lactation. Les travaux sont réalisés sur la vache laitière car c'est une des espèces sujette aux mammites. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Il s'agit de vaches adultes (âgées de 3 à 6 ans) en lactation (stade de lactation entre 3 et 7 mois) non mises en reproduction.