Moutons

28 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans cette seconde partie de l'étude, elles subissent une ovariectomie sous anesthésie avec implant d'estradiol, des traitements intranasaux au sulfate de zinc et la pose d'une éponge intravaginale pendant douze jours, pour mesurer l'activation de neurones du bulbe olfactif par les odeurs de béliers. Le porteur signale des hématomes, douleurs et pertes de poids possibles après les interventions. Il justifie l'étude par l'"effet mâle" pratiqué en élevage et affirme qu'elle exige des "animaux entiers", les brebis étant euthanasiées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Chez les mammifères, les neurones exprimant la gonadolibérine (GnRH) ont un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ceux ci, permettent la stimulation des cellules de l'hypophyse et la sécrétion d'hormones gonadotropes (que sont les hormones lutéinisantes et folliculo-stimulantes). A leur tour, ces hormones vont agir sur les gonades (ovaires chez les femelles, testicules chez les mâles) pour stimuler la production de gamètes (ovules, spermatozoïdes) ainsi que la prodction d'hormones stéroidiennes (estradiol, progestérone), qui vont rétroagir au niveau central sur le cerveau formant ainsi une boucle de régulation. Il a été montré que, au niveau central, cette boucle de régulation est, chez les ovins, sensible à l'exposition aux odeurs des partenaires sexuels, permettant ainsi de stimuler également le comportement sexuel. Dans ce contexte, les neurones à GnRH de l'hypothalamus semblent être une cible de choix. Cependant, les neurones à GnRH sont également localisés dans le bulbe olfactif, et sont relativement peu étudiés dans le contexte des expositions olfactives de congénères. L'objectif de ce projet est donc de déterminer dans quelle mesure les neurones exprimant la GnRH et localisés dans le bulbe olfactif de la brebis sont stimulés par les odeurs de partenaires sexuels chez la brebis. Le projet se déroule dans 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à étudier l'activation des neurones à GnRH présents dans le bulbe olfactif de brebis suite à l'exposition aux odeurs de mâles. Celui ci apportera une meilleure compréhension de l'implication de ces neurones dans l'effet mâle et donnera lieu à d'autres expérimentations visant à décortiquer le circuit neuronal contrôlant l'effet mâle.

Procédures

Sous anesthésie générale, les brebis seront soumises à des ovariectomies avec pose d'implant d'estradiol sous cutané ainsi que des traitements intranasaux au sulfate de zinc ou solution saline, des injections d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroidiens. La procédure complète nécessite une anesthésie générale d'environ 30 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°1 (EU1). Les animaux seront soumis à 3 mises à jeun de 15h maximum, à la pose d'une éponge intravaginale (procédure d'une durée inférieure à une minute) qui restera en place pendant 12 jours, et à des déplacements de quelques minutes pour le transfert d'un batiment à un autre. Les batiments étant très proches les uns des autres, la durée estimée des déplacement sera inférieure à 15 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°2 (EU2).

Impact sur les animaux

A la suite de ces interventions, des hématomes, douleurs, perte de poids, de mobilité peuvent cependant être observées. Les différentes injections nécessaires aux anesthésies et les différentes étapes de transport peuvent engendrer du stress pour les animaux. La pose des éponges intravaginales peut aussi constituer un acte désagréable pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront récupérés pour des études immunohistochimiques ultérieures

Remplacement

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entier et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique et préciser le rôle des neurones à GnRH du bulbe olfactif dans le contrôle de l'effet mâle.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Aussi, une partie des animaux utilisés dans le cadre de ce protocole sont des animaux issus d'un protocole précédent. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 9 animaux par type d'exposition afin d'obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude. Ces habituations permettrons de réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats beaucoup plus propres (le moindre stress pouvant induire une activation neuronale pouvant biaiser les résultats finaux). Le comportement (notamment l'isolement du groupe) et l'apparence des brebis sera suivi avec attention et les animaux seront pesés pendant 3 jours après l'ovariectomie, en pretant attention à ce que je lpourcentage de perte de poids ne dépasse pas 15%. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Dans tout les cas, la décision sera prise avec l'appui d'un avis vétérinaire. En cas d'hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l'naimal sera réanesthésié et nous rechercherons le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entiers et ne peux être substituée par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction bien développée et mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté. Ainsi les brebis auront atteint l'âge adulte.

28 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie sous anesthésie avec pose d'un implant d'estradiol, des traitements intranasaux au sulfate de zinc, la pose d'une éponge intravaginale pendant douze jours et trois mises à jeun de quinze heures, pour étudier comment les odeurs de béliers activent certains neurones du bulbe olfactif. Le porteur indique que ces interventions peuvent provoquer hématomes, douleurs et perte de poids. Il rattache l'étude à l'"effet mâle" utilisé en élevage et affirme qu'elle exige des "animaux entiers", sans substitution possible, les brebis étant euthanasiées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Chez les mammifères, les neurones exprimant la gonadolibérine (GnRH) ont un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ceux ci, permettent la stimulation des cellules de l'hypophyse et la sécrétion d'hormones gonadotropes (que sont les hormones lutéinisantes et folliculo-stimulantes). A leur tour, ces hormones vont agir sur les gonades (ovaires chez les femelles, testicules chez les mâles) pour stimuler la production de gamètes (ovules, spermatozoïdes) ainsi que la prodction d'hormones stéroidiennes (estradiol, progestérone), qui vont rétroagir au niveau central sur le cerveau formant ainsi une boucle de régulation. Il a été montré que, au niveau central, cette boucle de régulation est, chez les ovins, sensible à l'exposition aux odeurs des partenaires sexuels, permettant ainsi de stimuler également le comportement sexuel. Dans ce contexte, les neurones à GnRH de l'hypothalamus semblent être une cible de choix. Cependant, les neurones à GnRH sont également localisés dans le bulbe olfactif, et sont relativement peu étudiés dans le contexte des expositions olfactives de congénères. L'objectif de ce projet est donc de déterminer dans quelle mesure les neurones exprimant la GnRH et localisés dans le bulbe olfactif de la brebis sont stimulés par les odeurs de partenaires sexuels chez la brebis. Le projet se déroule dans 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à étudier l'activation des neurones à GnRH présents dans le bulbe olfactif de brebis suite à l'exposition aux odeurs de mâles. Celui ci apportera une meilleure compréhension de l'implication de ces neurones dans l'effet mâle et donnera lieu à d'autres expérimentations visant à décortiquer le circuit neuronal contrôlant l'effet mâle.

Procédures

Sous anesthésie générale, les brebis seront soumises à des ovariectomies avec pose d'implant d'estradiol sous cutané ainsi que des traitements intranasaux au sulfate de zinc ou solution saline, des injections d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroidiens. La procédure complète nécessite une anesthésie générale d'environ 30 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°1 (EU1). Les animaux seront soumis à 3 mises à jeun de 15h maximum, à la pose d'une éponge intravaginale (procédure d'une durée inférieure à une minute) qui restera en place pendant 12 jours, et à des déplacements de quelques minutes pour le transfert d'un batiment à un autre. Les batiments étant très proches les uns des autres, la durée estimée des déplacement sera inférieure à 15 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°2 (EU2).

Impact sur les animaux

A la suite de ces interventions, des hématomes, douleurs, perte de poids, de mobilité peuvent cependant être observées. Les différentes injections nécessaires aux anesthésies et les différentes étapes de transport peuvent engendrer du stress pour les animaux. La pose des éponges intravaginales peut aussi constituer un acte désagréable pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront récupérés pour des études immunohistochimiques ultérieures

Remplacement

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entier et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique et préciser le rôle des neurones à GnRH du bulbe olfactif dans le contrôle de l'effet mâle.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Aussi, une partie des animaux utilisés dans le cadre de ce protocole sont des animaux issus d'un protocole précédent. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 9 animaux par type d'exposition afin d'obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude. Ces habituations permettrons de réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats beaucoup plus propres (le moindre stress pouvant induire une activation neuronale pouvant biaiser les résultats finaux). Le comportement (notamment l'isolement du groupe) et l'apparence des brebis sera suivi avec attention et les animaux seront pesés pendant 3 jours après l'ovariectomie, en pretant attention à ce que je lpourcentage de perte de poids ne dépasse pas 15%. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Dans tout les cas, la décision sera prise avec l'appui d'un avis vétérinaire. En cas d'hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l'naimal sera réanesthésié et nous rechercherons le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entiers et ne peux être substituée par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction bien développée et mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté. Ainsi les brebis auront atteint l'âge adulte.

24 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'ostéo-intégration d'un implant sternal chargé en antibiotiques. Chaque animal subit une sternotomie sous anesthésie générale d'environ une heure, porte un drain pendant trois jours et fait l'objet de six prélèvements sanguins, avec plusieurs transports entre deux sites. Le jour de la mise à mort, les brebis toujours anesthésiées servent aussi à la formation chirurgicale d'internes. Le porteur affirme que le prélèvement de l'implant après colonisation "n'est pas possible in vitro ou chez l'homme".

Objectifs

Objectif principal : Observer chez la brebis l'intégration par le tissu hôte de 2 types d’implant sternal (stabilisant le sternum) : -Groupe témoin : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite ne contenant pas d'Antibiotiques - Groupe expérimental : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite contenant des Antibiotiques (gentamicine et vancomycine) / Objectifs secondaires : - doser la concentration locale (dans le drain) en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques - Evaluer la cinétique de concentration systémique en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques. - Documenter par imagerie l’intégration des 2 types d’implant par du tissu hôte de nature osseuse. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire immédiat auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2). Puis les brebis retourneront sur le site n°1 pour la mise à mort et réalisation des prélèvements.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de documenter la colonisation de l’implant par le tissu hôte ("l'ostéo-intégration" de l’implant sternal) qui est une propriété fondamentale pour un implant de réparation/remplacement sternal (tolérance à long-terme, résistance à l’infection). Ce processus dure plusieurs semaines à plusieurs mois. Grâce à l'explantation du bloc sternum-implant à l'issue de la procédure (à 3 mois et 6 mois), ce projet permettra de réaliser une évaluation anatomopathologique du processus d’ostéo-intégration de l’alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatitevia des analyses macroscopiques (des photographies seront réalisées), microscopiques et histologiques des pièces opératoires. De plus, certains implants étant chargés en antibiotiques, ce projet permettra d'observer d’éventuels effets sur ce phénomène de la diffusion locale initiale de gentamicine et de vancomycine. L'imprégnation de l'implant en antibiotiques permet leur diffusion locale dans des tissus inflammatoires et remaniés. Cela permet une action antibactérienne locale plus difficilement accessible par voie orale ou par injection. Dans ce sens l'implant sternal imprégné d'antibiotiques permet de répondre aux deux problématiques de l'ostéite sternale post sternotomie à savoir la stabilisation de la cage thoracique après exérèse large et complète de tissus infectés et nécrosés ainsi que l'implantation d'un matériau résistant à l'infection, dans un milieu septique, permettant de traiter une éventuelle colonisation bactérienne résiduelle. Les dosages en antibiotiques dans le drain et le sang veineux des lots expérimentaux les premiers jours post-implantation permettront de s'assurer de la diffusion locale à haute concentration de gentamicine et de vancomycine et vérifier l'absence de diffusion dans l'ensemble du corps

Procédures

Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 1h). Puis 6 prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (H3-H6-H12-H24-H48-H72), estimé à 10 minutes chacun. Le jour de la fin de procédure (soit à 3 mois ou à 6 mois selon le lot) et donc de mise à mort, les animaux toujours sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d’une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior. Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 mois à 6 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress modéré peut être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant les anesthésies, lors des prises de sang et lors des transports et changements de lieu. La présence d’un drain de Redon (sur 3 jours), avec un flacon plastique maintenu sur le dos par un bandage, peut gêner l’animal dans ses déplacements. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post-opératoires sont possibles (prises en charge selon le protocole prévu).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure (même ceux utilisés dans le cadre de formation d’internes en chirurgie, décrit dans un dossier particulier), le prélèvement de la pièce anatomique étant nécessaire pour effectuer des analyses sur l’implant, et n’étant pas compatible avec le réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de pouvoir réaliser des analyses histologiques de la colonisation de l’implant sternal par le tissu hôte : cela nécessite impérativement le prélèvement de l’implant après colonisation, qui n’est pas possible in vitro ou chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum par lot (3 par lot). En cas de données insuffisantes, l’expérimentation pourra être renouvelée une fois. Par ailleurs, dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique de la plateforme, les animaux, lorsqu’ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (à 3 mois ou à 6 mois selon les lots), ne seront pas directement euthanasiés mais utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, sous anesthésie générale, avant l’euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).

Raffinement

Les brebis proviennent d’un éleveur agréé (site n°2) et seront acheminées vers la plateforme (site n°1) a minima 5 jours avant l’implantation (période d’acclimatation). La procédure d’implantation de l’implant sternal se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d’analgésie préopératoire et un ajustement des doses en cas d’apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Les brebis seront surveillées en postopératoire immédiat sur le site n°1 puis seront transférées dans l’établissement fournisseur, également agréé (site n°2). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Les animaux ne seront ramenés dans la structure n°1 pour la fin de procédure que quelques jours avant pour les maintenir au maximum dans cet environnement. Les animaux seront suivis quotidiennement quel que soit leur lieu d’hébergement. Une convention, précisant les attendus respectifs, sera signée entre les deux parties avant le début du projet. Une grille de scores est établie avec une vigilance sur l’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi en fonction de la taille du sternum proche de celle de l’Homme. Des brebis adultes sont nécessaires afin d’avoir un stade de développement et une croissance maximale atteinte.

24 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une sternotomie sous anesthésie générale pour la pose d'un implant sternal, six prélèvements sanguins, plusieurs transports entre deux sites, puis la mise à mort à trois ou six mois. Le porteur indique qu'avant l'euthanasie les brebis encore anesthésiées serviront à la formation chirurgicale d'internes, présentée comme une mesure de "réduction" du nombre d'animaux. Il justifie le choix de la brebis par la taille de son sternum proche de celle de l'homme.

Objectifs

Objectif principal : Observer chez la brebis l'intégration par le tissu hôte de 2 types d’implant sternal (stabilisant le sternum) : -Groupe témoin : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite ne contenant pas d'Antibiotiques - Groupe expérimental : implant en alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatite contenant des Antibiotiques (gentamicine et vancomycine) / Objectifs secondaires : - doser la concentration locale (dans le drain) en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques - Evaluer la cinétique de concentration systémique en antibiotiques chez les brebis opérées avec un implant chargé en antibiotiques. - Documenter par imagerie l’intégration des 2 types d’implant par du tissu hôte de nature osseuse. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire immédiat auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2). Puis les brebis retourneront sur le site n°1 pour la mise à mort et réalisation des prélèvements.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de documenter la colonisation de l’implant par le tissu hôte ("l'ostéo-intégration" de l’implant sternal) qui est une propriété fondamentale pour un implant de réparation/remplacement sternal (tolérance à long-terme, résistance à l’infection). Ce processus dure plusieurs semaines à plusieurs mois. Grâce à l'explantation du bloc sternum-implant à l'issue de la procédure (à 3 mois et 6 mois), ce projet permettra de réaliser une évaluation anatomopathologique du processus d’ostéo-intégration de l’alumine poreuse revêtue d'hydroxyapatitevia des analyses macroscopiques (des photographies seront réalisées), microscopiques et histologiques des pièces opératoires. De plus, certains implants étant chargés en antibiotiques, ce projet permettra d'observer d’éventuels effets sur ce phénomène de la diffusion locale initiale de gentamicine et de vancomycine. L'imprégnation de l'implant en antibiotiques permet leur diffusion locale dans des tissus inflammatoires et remaniés. Cela permet une action antibactérienne locale plus difficilement accessible par voie orale ou par injection. Dans ce sens l'implant sternal imprégné d'antibiotiques permet de répondre aux deux problématiques de l'ostéite sternale post sternotomie à savoir la stabilisation de la cage thoracique après exérèse large et complète de tissus infectés et nécrosés ainsi que l'implantation d'un matériau résistant à l'infection, dans un milieu septique, permettant de traiter une éventuelle colonisation bactérienne résiduelle. Les dosages en antibiotiques dans le drain et le sang veineux des lots expérimentaux les premiers jours post-implantation permettront de s'assurer de la diffusion locale à haute concentration de gentamicine et de vancomycine et vérifier l'absence de diffusion dans l'ensemble du corps

Procédures

Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 1h). Puis 6 prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (H3-H6-H12-H24-H48-H72), estimé à 10 minutes chacun. Le jour de la fin de procédure (soit à 3 mois ou à 6 mois selon le lot) et donc de mise à mort, les animaux toujours sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d’une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior. Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 mois à 6 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress modéré peut être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant les anesthésies, lors des prises de sang et lors des transports et changements de lieu. La présence d’un drain de Redon (sur 3 jours), avec un flacon plastique maintenu sur le dos par un bandage, peut gêner l’animal dans ses déplacements. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post-opératoires sont possibles (prises en charge selon le protocole prévu).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure (même ceux utilisés dans le cadre de formation d’internes en chirurgie, décrit dans un dossier particulier), le prélèvement de la pièce anatomique étant nécessaire pour effectuer des analyses sur l’implant, et n’étant pas compatible avec le réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de pouvoir réaliser des analyses histologiques de la colonisation de l’implant sternal par le tissu hôte : cela nécessite impérativement le prélèvement de l’implant après colonisation, qui n’est pas possible in vitro ou chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum par lot (3 par lot). En cas de données insuffisantes, l’expérimentation pourra être renouvelée une fois. Par ailleurs, dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique de la plateforme, les animaux, lorsqu’ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (à 3 mois ou à 6 mois selon les lots), ne seront pas directement euthanasiés mais utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, sous anesthésie générale, avant l’euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).

Raffinement

Les brebis proviennent d’un éleveur agréé (site n°2) et seront acheminées vers la plateforme (site n°1) a minima 5 jours avant l’implantation (période d’acclimatation). La procédure d’implantation de l’implant sternal se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d’analgésie préopératoire et un ajustement des doses en cas d’apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Les brebis seront surveillées en postopératoire immédiat sur le site n°1 puis seront transférées dans l’établissement fournisseur, également agréé (site n°2). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Les animaux ne seront ramenés dans la structure n°1 pour la fin de procédure que quelques jours avant pour les maintenir au maximum dans cet environnement. Les animaux seront suivis quotidiennement quel que soit leur lieu d’hébergement. Une convention, précisant les attendus respectifs, sera signée entre les deux parties avant le début du projet. Une grille de scores est établie avec une vigilance sur l’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi en fonction de la taille du sternum proche de celle de l’Homme. Des brebis adultes sont nécessaires afin d’avoir un stade de développement et une croissance maximale atteinte.

Des brebis de 2 à 3 ans subissent une mastoïdectomie, ouverture chirurgicale de l'os situé derrière l'oreille, et reçoivent du gadolinium dans l'oreille interne, par ultrasons d'un côté et par injection de l'autre, sous une anesthésie de trois heures dont deux d'imagerie. Une seconde anesthésie de 30 minutes permet de prélever du liquide de leur oreille interne. Au total, 14 brebis, dont 2 en réserve en cas de problème, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme effets néfastes, le porteur ne cite que le stress de la contention et un possible hématome à la jugulaire, écrit qu'il n'est "pas à prévoir de conséquences particulières" après la première anesthésie, et se fixe pour objectif de vérifier "l'absence de retentissement sur la fonction auditive". Toutes les brebis sont pourtant tuées à l'issue, mise à mort qu'il justifie par une "perte de la fonction auditive irréversible", des "vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale" et une "paralysie faciale empêchant une alimentation normale".

Objectifs

L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de momlécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.

Bénéfices attendus

Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.

Procédures

La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Il n'est pas à prévoir de conséquences particulières suite à cette anesthésie. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.

Devenir

L'ensemble des brebis seront euthanasaniées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.

Remplacement

Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 12 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème.

Raffinement

Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène véhiculant l’isoflurane pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale à base permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront être renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.

Choix des espèces

La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.

120 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie osseuse sous anesthésie générale, avec création puis comblement d'un défaut osseux, avant d'être tuée pour analyser les échantillons d'os. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une fracture ou une inflammation prolongée avec douleur locale, la fracture déclenchant un point limite. L'objectif déclaré est de tester un biomatériau destiné à la médecine humaine et d'obtenir les autorisations de mise sur le marché, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas d'autres méthodes" que l'animal.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un ensemble de programme de recherche qui s’intéressent à l’ingénierie tissulaire et le développement des biomatériaux susceptibles de stimuler la formation de tissus osseux, seuls ou en association avec des cellules de moelle osseuse isolées et/ou de molécules actives. L’objectif de ce projet est de confirmer l’apport de ces biomatériaux sur la cicatrisation osseuse par l’utilisation du modèle brebis. Les résultats in vivo permettrait d’obtenir les autorisations nécessaires pour des études cliniques chez l’Homme ainsi que les autorisations de mise sur le marché (marquage CE, FDA).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et du comportement de ce biomatériau destiné in fine à un usage en médecine humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Après un période postopératoire (plus ou moins longue selon les protocoles), les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les echantillons osseux.

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, les effets indésirables majeurs sont la survenue d’une fracture ou le développement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation pouvant générer une douleur locale et une inflammation chronique. La survenue d’une fracture constitue une atteinte immédiate des points limites. Un retentissement systémique de la réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit entraînant une perte de poids constitue également un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

A la suite de la procédure,les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prelever et analyser les defauts osseux.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédemment réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. L’animal étant son propre témoin, cela nous permet de réduire la variabilité individuelle, d’augmenter la puissante du test statistique et de travailler sur des faibles effectifs (n=6) sans perdre la validité statistique. Réduction du nombre d'animaux par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux et prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l'atteinte de points critiques en cours de protocole.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille présentée en annexe 1 : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (sur une grille de 1 à 10). De façon générale, la gestion de la douleur per et post-opératoire est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles d’analgésie et d’antalgie en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la brebis est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes car maturité squelettique - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie - Animaux faciles à gérer en stabulation - Modèles de reconstruction osseuse chez la brebis largement répandu décrit dans la littérature Animaux adultes : aspect anatomique (modèle validé)

30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de remplacement de la trachée par une matrice soutenue par une endoprothèse d'environ 150 minutes, une partie subissant en plus une fibroscopie ou une bronchoscopie rigide. Le porteur indique attendre douleur post-opératoire, risque infectieux et stress, pris en charge par morphine et antibiotiques. Il teste deux matrices de substitution à l'allogreffe artérielle et affirme que le remplacement par une méthode sans animaux n'est pas possible pour une greffe des voies aériennes.

Objectifs

Les tumeurs trachéales sont une pathologie rare (2 à 6 nouveaux cas/100000 personnes chaque année). Le traitement qui assure les meilleurs résultats à long terme de la survie globale est la résection chirurgicale. Pour des résections limitées à moins de 5 cm de la trachée il est envisageable de réaliser une résection et anastomoses des extrémités. Le problème se pose quand la tumeur envahie plus de 5cm de trachée. Dans ce cas il nous faut un substitue trachéale ou trachéobronchique en fonction de l’étendue de la pathologie (extension à l’arbre bronchique ou la carène). La greffe trachéo-bronchique est un véritable défi chirurgical et biologique. Des échecs successifs ont été observés avec les prothèses synthétiques, les bioprothèses, les allogreffes trachéales, et les autogreffes d’organes et tissus divers. Notre équipe a proposé le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle cryopréservée soutenue par une endoprothèse. Cette technique est la seule à avoir prouvé son efficacité et durabilité. Ces résultats ont été démontrés chez l’animal (brebis) et ils ont permis des applications cliniques chez l’homme. L’apparition de néo-cartilage semble se développer à partir des cellules souches mésenchymateuses du receveur, le corps humain agissant comme bioréacteur naturel. Cependant il existe une pénurie d’allogreffe artérielle qui, face à la demande accrue grâce à une technique qui a montré son intérêt et qui se répand dans d’autres pays, devient un problème de disponibilité. Une matrice alternative de disponibilité illimitée et sur mesure représenterait l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes. L’objectif principal de ce projet est de tester deux matrices alternatives à l’allogreffe artérielle cryopréservée dans le remplacement des voies aériennes in vivo chez la brebis : une matrice en collagène et une matrice biologique (aorte porcine décéllularisée). Les deux matrices ont été étudiées in vitro par rapport la capacité d’être colonisée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Il est nécessaire maintenant de tester in vivo chez la brebis ces matrices alternatives. Celles-ci seront comparées à l’allogreffe aortique cryopréservée en termes de propriétés mécaniques, biologiques, capacité de colonisation par les cellules de l’hôte et génération de novo de cartilage.

Bénéfices attendus

Ce projet représente la suite des travaux de recherche concernant le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle, réalisée chez la brebis, permettant l'utilisation de la technique chez l'homme, avec la formation de nouvelles voies respiratoires. Ce nouveau projet représente une étape fondamentale d’un travail de recherche essentiel qui vise à tester l'efficacité de matrices alternatives à l'allogreffe artérielle afin de proposer des solutions thérapeutiques plus facilement accessibles, de disponibilité illimitée et sur mesure. Cela pourrait représenter l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions exclusivement sous anesthésie générale. Trois types de procédures sont prévues : 1)Les 30 animaux subiront tous la procédure chirurgicale de remplacement trachéal par matrice stentée. La procédure aura une durée moyenne de 150 minutes. 2)Une fibroscopie flexible sous anesthésie générale sera réalisée pour 6 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 5 minutes. 3)Une bronchoscopie rigide avec ablation de l’endoprothèse trachéale sous anesthésie générale sera réalisée pour 12 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont le risque anesthésique, la douleur post-opératoire, une infection post- opératoire, une perte de poids temporaire au cours de la période post-chirurgicale, le stress. En fonction du moment per/post opératoire, l’analgésie est obtenue : par injection, lors de l’induction, de chlorhydrate de morphine (par voie intra-musculaire ; morphine Lavoisier, France) renouveler toutes les 4 à 6 heures. Ce traitement analgésique pourra être poursuivi, après évaluation de la douleur de l’animal et examen clinique, pendant les 48 à 72 heures post-opératoires. Une injection de Ketofen 10 % (par voie intramusculaire ; Ceva, France) est réalisée sur l’animal extubé. Ce traitement anti-inflammatoire sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours. Afin de prévenir les infections, un traitement antibiotique prophylactique sera réalisé par injection de Vetrimoxin 48 heures (15 mg d'amoxicilline par kg de poids vif deux fois à 48 heures d'intervalle, par voie intramusculaire, Ceva, France). En cas d’infection post-opératoire, qui peut être décelée par une perte de poids ou rougeur et chaleur au niveau de la cicatrice, le traitement par antibiotique sera renouvelé. Afin de réduire le stress associé à la chirurgie, les animaux seront hébergés deux semaines avant la date de l’intervention et ils seront gardé dans des boxes communs sauf en immédiat postopératoire.

Devenir

A la fin de la période expérimentale (de 1 mois à 12 mois après la chirurgie) les animaux seront mis à mort selon le calendrier prévu. Des prélèvements des matrices et des trachées en contiguïté des greffons seront réalisés afin de réaliser les études d’ histologie et d’immunohistochimie prévues.

Remplacement

Avant l’implantation des matrices chez les brebis les matrices ont été testées in vitro afin d’étudier leurs propriétés biologiques et la capacité d’être colonisées par des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Néanmoins, le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la greffe des voies aériennes au sein d’un organisme vivant complexe. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme, n’existant pas d’autre méthode alternative. Cette affirmation se base sur : des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie et chirurgie thoracique ; une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2010-2023 dans les bases de données en utilisant es mots-clés suivants: replacement, trachea, aorta, alternatives.

Réduction

Un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe avec un taux de survie postopératoire globale de 90% à 12 mois. L’expérience de notre équipe sur ce modèle animal nous permettra de réduire le nombre d’animaux normalement prévus pour une mise au point chirurgicale. Néanmoins il faudra considérer une mise au point par rapport les matrices alternatives qui seront greffées et la nécessité d’avoir un groupe « contrôle » afin de pouvoir comparer les résultats de la même série d’expériences (validité des matrice alternatives par rapport l’allogreffe artérielle cryopréservée). Le nombre d'animaux a donc été déterminé par une approche statistique qui nous permet de n’inclure que 30 animaux, 10 par groupe. Les paramètres étudiés seront : la tolérance clinique de la matrice, l’apparition de complications postopératoires, les résultats histologiques et immunohistochimique sur les matrices après mise à mort des animaux (l’apparition et l’évolution des structures cartilagineuses issues d’un processus de néochondrogénèse et ré-épithélialisation).

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Les animaux seront laissés dans des boxes communs sauf dans les premiers jours postopératoires afin d’éviter des problèmes au niveau des cicatrices. Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voire les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Ces périodes ont une durée variable qui va de minimum 2 semaines jusqu’à que l’animal ne nécessite plus d’une surveillance rapprochée au sein de l’animalerie du Laboratoire. Cette durée est déterminée par le vétérinaire responsable qui doit donner son accord afin que l’animal puisse repartir dans son centre d’origine. Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort. Les animaux sont maintenus à jeun 12 heures avant l’intervention chirurgicale (alimentation solide) l’eau est laissé à disposition. Un examen clinique pré-anesthésique est réalisé : couleur des muqueuses, temps remplissage capillaire, auscultation cardiaque et pulmonaire, fréquences cardiaque et respiratoire, température, tympanisme gastrique. Les paramètres de surveillance anesthésiques seront évalués toutes les cinq minutes : Couleur des muqueuses et temps de recoloration capillaire ; Tonus musculaire mandibulaire ; Positionnement du globe oculaire (Myosis/mydriase, Réflexe palpébral) ; Fréquences cardiaque et respiratoire ; Oxymétrie de pouls ; Température ; Electrocardiogramme ; Pression artérielle invasive. L’expérience de l’équipe chirurgicale dans ce type de procédures représente un gain au raffinement, en termes de temps d’intervention, gestion et maitrise des risques ; en effet l’intervention de remplacement des voies aériennes est une procédure utilisée en soins courants chez l’homme dans notre centre.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ce projet est l’ovin. La pertinence est justifiée par l’expérience de l’équipe sur ce modèle animal. En effet un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe. Le modèle animal choisi pour cette étude est la brebis d’un âge moyen de trois mois et d’un poids compris entre 20 et 30 kg. Ce choix est justifié par l’importante expérience de notre équipe sur le remplacement trachéal, de la carène et des bronches sur ce modèle animal. Tous les animaux seront issus du même élevage et recevront des soins en accord avec les principes du « Guidelines on the protections of experimental animals » du Conseil de la Communauté Européenne (1986).

56 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie de pose d'un implant intra-utérin sous anesthésie générale de deux heures, sept à neuf prises de sang et des transports entre deux sites, avant d'être tuée. Le porteur indique que, juste avant l'euthanasie et toujours sous anesthésie, les brebis sont aussi utilisées pour la formation chirurgicale d'internes dans le cadre d'un autre projet. Il écarte le primate, habituellement utilisé pour ce type d'étude, "pour des raisons éthiques et de disponibilités", et retient la brebis pour son anatomie utérine.

Objectifs

L’objectif principal est la tolérance d'un implant utérin (type stérilet) qui permettrait de traiter localement les fibromes chez la femme. Le devenir dans l'organisme du principe actif contenu dans les implants intra-utérins à libération longue durée sera évalué. Les critères d’évaluation sont: - La teneur en principe actif dans les tissus utérins à différents temps (1 mois, 2 mois ou 3 mois) - La teneur en principe actif dans le plasma sanguin par prise de sang à différent temps et au stade terminal. Les objectifs secondaires et critères d’évaluation sont les suivants: - Evaluation de la tolérance locale du principe actif par une évaluation macroscopique et histologique des organes en terminal (utérus, ovaires, vagin, foie, rein) - Évaluation de l’état du système de délivrance du principe actif à l'issue de l'expérience par prélèvement de l’implant. L’évaluation de la dégradation est macroscopique et des caractérisations physico-chimiques seront réalisées. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2).

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation animale permettra d’évaluer les prototypes d’implants en termes de profil pharmacocinétique, notamment la durée et le niveau de concentrations circulantes. Ce projet permettra d’évaluer la performance et la sécurité des prototypes de dispositifs intra-utérin à libération prolongée d’un principe actif avant de passer en phase clinique. Le projet est nécessaire pour démontrer le profil pharmacocinétique du principe actif, l’exposition locale utérine, l’exposition systémique ainsi que la tolérance locale du principe actif et du système de libération vis à vis des organes.

Procédures

Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 2h). Puis de 7 à 9 prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile (estimé à 10 min chacun). Le jour de la fin de procédure et donc de mise à mort, les animaux sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d'une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior (durée inférieure à 4h avant sacrifice, toujours sous anesthésie générale). Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 semaines à environ 3 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

En termes d’effets indésirable, le principe actif est approuvé aux Etats-Unis pour une utilisation chronique dans le syndrome de Cushing afin de contrôler l'hyperglycémie chez les patients. Le système de délivrance du médicament testé chez les animaux contiendra une dose beaucoup plus faible que celle usuellement pratiquée par voie orale. Avec une libération prolongée sur 3 mois, le risque d’entraîner des effets indésirables chez l’animal est extrêmement faible. Un stress peut également être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant l'intervention, avant les anesthésies, lors des 4 prises de sang en post opératoire et lors des transports et changements de lieu. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post opératoires sont possibles. Une légère douleur au point de prélèvement des prises de sang est également envisagée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort le dernier jour de suivi. Néanmoins, avant l'euthanasie, l'animal toujours sous analgésie et anesthésie générale, pourra être utilisé à des fins de formation des internes de chirurgie dans le cadre d'un autre projet autorisé (pour une durée inférieure à 4 heures). L'animal est ensuite euthanasié.

Remplacement

Le projet consiste à démontrer l’efficacité d'un système de délivrance d’un principe actif qui a d’ores et déjà été étudié et vérifié via des études in vitro. Avant de passer en phase d'étude clinique, l'étape in vivo est requise et ne peut être remplacée pour valider l’efficacité du système de délivrance. L’efficacité du système de délivrance repose notamment sur des processus biologiques d’absorption, d’accumulation et d’élimination, qui ne peuvent être simulés en intégralité par des modèles non vivants ou par des modèles in-silico. Par ailleurs, nous avons considéré de remplacer les primates utilisés habituellement pour des études de ce genre par des ovins.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au strict minimum (6 animaux par lot : 2 par durée de suivi). Il a été préféré de limiter ce nombre à son minimum et de permettre de renouveler chaque lot une fois en cas de besoin. Dans l'objectif de réduction du nombre d'animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique du site porteur, les animaux lorsqu'ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (au bout d’un mois, de deux mois ou de trois mois de suivi selon le groupe), les animaux ne seront pas directement mis à mort mais utilisés à des fins de formations des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, toujours sous anesthésie générale, avant euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).

Raffinement

La procédure d’implantation du dispositif se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d'analgésique préopératoire et un ajustement des doses en cas d'apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Une analgésie post-opératoire sera également mise en place. Les animaux seront re-transférés sur leur lieu d'approvisionnement (site n°2 agréé à l'expérimentation animale) qui est plus adapté pour les périodes prolongées. Les temps de trajet des animaux sont de courte durée (inférieurs à 30 min). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Une grille de score est établie avec suivi des points limites (grille de scores). La même grille de score sera applicable quel que soit le lieu d'hébergement.

Choix des espèces

Le système de délivrance du médicament est destiné à être implanté dans la cavité utérine des femmes adultes dans l’objectif de diminuer la taille des fibromes utérins. Par conséquent, l’espèce a été choisie en fonction de l’anatomie utérine, de telle sorte que celle-ci soit la plus similaire possible à celle de l’anatomie de la femme. L’utérus de la femme est un utérus simplex, caractéristique des humains et des primates. Le primate n’a pas été sélectionné pour l’étude pour des raisons éthiques et de disponibilités de l’espèce. Les autres espèces possèdent soit un utérus duplex (rat, lapin, cochon d’inde, etc), bipartite (jument) ou bicorne (chienne, truie, vache, brebis). Les espèces pouvant être utilisés pour l’expérimentation animale possèdent donc une anatomie différente de celle de la femme. Afin de sélectionner l’espèce la plus pertinente pour l’étude, la taille de l’utérus a donc été le second critère de choix.L’utérus de l’espèce doit pouvoir recevoir l’implant dans son intégralité pour pouvoir transposer les résultats obtenus vers l’application clinique. La taille des cornes utérines de la brebis et de la truie permettent l’implantation de l’implant dans sa totalité. La brebis représente un meilleur modèle que la truie en raison de sa taille, de l'anatomie pelvienne et de la taille des vaisseaux utérins. La brebis adulte a donc été sélectionnée comme l’espèce la plus pertinente.