Moutons

6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées par ultrasons focalisés de haute intensité sous anesthésie générale, avec un suivi échographique sur un à deux mois, pour évaluer une technique destinée à traiter les varices avant un premier essai chez l'homme. Le porteur rapporte des brûlures observées lors d'essais précédents, qu'il dit avoir corrigées par un refroidissement de la peau. Les brebis sont tuées après un ou deux mois pour prélever leurs veines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet concernant le traitement HIFU en mode thermique sont : - de vérifier sa sécurité, en terme d'évaluation des effets tissulaires locaux; - de vérifier son efficacité, en terme d'occlusion veineuse. Il précède une première étude chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les varices (dilatation anormale d'une veine) sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les veines saphènes, situées sur la face interne des membres postérieurs des brebis, sont traitées par HIFU, ou par radiofréquence pour une veine de la première brebis. La veille du traitement, la zone à traiter est marquée et des mesures sont effectuées par échographie. Le traitement se fait sous anesthésie générale avec une anesthésie péri-veineuse de la zone à traiter. Un suivi échographique a ensuite lieu sept jours, quatorze jours puis un mois après le traitement. Si nécessaire, les animaux sont sédatés pour cet examen. Au bout d’un mois quatre brebis sont mises à mort pour prélever leurs veines saphènes dans le but de les analyser. Les deux dernières brebis ont une nouvelle échographie deux mois après le traitement avant d’être aussi mises à mort pour le prélèvement des veines traitées. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée est inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.

Impact sur les animaux

Dans les essais précédent des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde.

Devenir

Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiterles points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.

Réduction

Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis ont déjà été réalisées. Elles ont permis de déterminer les meilleurs conditions d'utilisation du traitement par HIFU et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons.

Raffinement

Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis sont logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminents. De plus, le personnel animalier observe régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant l’administration du traitement, les brebis sont placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié poour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphène du mouton. Les animaux seront adultes, car c'est à ce stade que l'anatomie de leurs veines saphènes est comparable à l'humain. De plus, l'étude durant plus de deux mois pour certains animaux, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance dont le développement pourrait interférer avec les effet du traitement.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie par voie vaginale de trois à quatre heures pour l'implantation d'un filet, matrice biologique ovine ou prothèse synthétique, puis est gardé en vie de deux à six mois avant sa mise à mort et le prélèvement des organes du bassin. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer un non-réveil, des saignements abondants, des infections et des douleurs. Il justifie le recours à la brebis par la proximité anatomique de sa région pelvienne avec celle des femmes et par l'absence d'alternative in vitro reproduisant le système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement du Prolapsus des Organes Pelviens (POP). Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser sa biointégration. Nous souhaitons montrer qu’un filet de MAC ovine peut être implanté avec succès dans un modèle de gros animal pertinent et allogénique. Pour cela, nous souhaitons évaluer le remodelage du filet de MAC, incluant sa stabilité mécanique et la réponse immunitaire (innée et adaptative) de l’hôte, dans la région urogénitale de brebis en comparaison avec une prothèse synthétique (Ex : Restorelle® de Coloplast Corp.). Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Les greffons seront implantés entre le vagin, le péritoine pariétal et le rectum et fixés avec des sutures non résorbables. Notre hypothèse est que le greffon de MAC entraine moins de complications qu’une prothèse synthétique (réponse immunitaire moins importante, pas d’exposition et moins de contraction de la prothèse, etc.) démontrant ainsi la supériorité de ce matériau. Après euthanasie des animaux, les implants seront récupérés et des analyses mécaniques et histologiques à différents temps de suivi (2 et 6 mois) seront effectuées. Les temps de suivi de 2 et 6 mois ont été choisis car ce sont des temps classiquement décrits dans la littérature pour suivre l’évolution de prothèses implantées dans la région urogénitale de brebis permettant la comparaison des résultats obtenus. Cette première expérimentation permettra de montrer le potentiel clinique du greffon de MAC, c’est-à-dire valider si le filet de MAC présente des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le POP dans un modèle de gros animal. En effet, les données récoltées permettront la comparaison directe des greffons de MAC avec un traitement standard du POP en termes de stabilité mécanique, de réponse immunitaire, d’intégration tissulaire et de taux de complications.

Bénéfices attendus

Le Prolapsus des Organes Pelviens (POP), aussi appelé descente d’organe, est un problème médical important pour les femmes. On estime qu'1 femme sur 10 subira une intervention chirurgicale pour traiter un POP au cours de sa vie. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente pour soutenir l’organe « descendant », elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques robustes et rigides permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues (jusqu’à 3x moins de récidive). En revanche, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale ont été retirées du marché dans de nombreux pays, comme la France, les Etats-Unis…, en raison d’un taux de complications élevé (douleurs, expositions, infections). Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des filets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) les plus adaptés pour produire un greffon de MAC aux caractéristiques cliniques pertinentes pour traiter le POP. Les gains attendus par la nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : cette approche biologique apportera une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : la réduction des complications/récidives bénéficiera économiquement au système de santé en évitant les coûts des réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 3 à 4h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 12 jours (non consécutifs). Chaque brebis recevra une condition expérimentale : un filet de matrice extracellulaire assemblée par des cellules ou une prothèse synthétique. Après réveil, les animaux seront gardés en vie sur des périodes différentes : 2 à 6 mois. Dans le cas où l’une des brebis ne se réveillerait pas suite à l’intervention, nous prévoyons un animal supplémentaire pour remplacer l’animal décédé (pour chaque lot). Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Les brebis seront transportées dans un véhicule adapté par deux afin de limiter l’isolement social. La durée du trajet est limitée (45 minutes maximum). Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : non-réveil de l'animal du fait de l'anesthésie, saignements (abondants), infections, constipations, douleur, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirable sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’anesthésie et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de la procédure, les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Bien qu’un modèle humain puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles permettent d’évaluer la prothèse implantée dans la région abdominale uniquement. Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe allogénique et une région anatomique pertinente simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 75 brebis sont nécessaires (3 lots de 25 brebis). Chaque animal recevra un filet de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) ou une prothèse synthétique. Nos objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l'intégration supérieure des greffons de MAC dans la paroi vaginale en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et contraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique du remodelage et de la réponse immunitaire (innée et adaptative). Nous souhaitons également montrer que les greffons de MAC possèdent des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le prolapsus des organes pelviens dans un modèle de gros animal (pas de récidive). Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. D’après la littérature, nous avons sélectionné 6 brebis par groupe et par temps de suivi pour montrer une différence significative entre le filet de MAC et la prothèse synthétique standard, principalement au niveau des complications liées à l’implant (exposition et contraction de la prothèse) et de la réponse immunitaire. En effet, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, 100% de cas de contraction de l’ordre de 30 à 50% pour les prothèses synthétiques avec, autour, des marqueurs de la réaction à corps étranger (cellules géantes à corps étranger). Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec le filet de MAC, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et moins de contraction du filet, ce qui démontrerait une grande supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour ajouter des animaux à l’étude. Ces expérimentations seront potentiellement effectuées jusqu’à 3 fois afin de confirmer certains résultats, de tester des conditions de production des greffons de MAC supplémentaires, ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue). Concernant l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons non appariés avec le test t de Student.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et seront gérées par une anesthésie générale durant toute la procédure chirurgicale. Les paramètres vitaux seront suivis pendant l’intégralité de la chirurgie. Un protocole d’analgésie post opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront gérés par l’unité d’hébergement et de stabulation de l'établissement utilisateur (EU). Les animaux seront suivis dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté, et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Un suivi quotidien sera réalisé. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pré, per et post- opératoire par admission d’antalgiques. Cependant, l’animal sera rapidement euthanasié (Pentobarbital sodique en IV pour l'euthanasie indiqué dans le paragraphe 3.3.3., soit 80 mg/kg) si : - le rythme cardiaque est >150 bpm ou 41°C ou < 32°C - une hémorragie importante est constatée. Les points limites identifiés se situent principalement au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement. • Perte d’appétit, anorexie • Altération du comportement, grincements de dents excessifs • Apathie, abattement • Position anormale ou prostration • Locomotion ou déplacements anormaux • Difficulté respiratoire • Auscultation et/ou examen cardiaque anormaux • Décubitus prolongé ou isolement • Hypovigilance ou hypervigilance anormale Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points cités ci-dessus ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’EU assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire de l’EU assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de prolapsus des organes pelviens bien établi dans la littérature. Par ailleurs, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir des feuillets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) similaires à ceux produits par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réaction immunitaire et le remodelage des greffons de MAC par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Nous souhaitons réaliser une cure du prolapsus. Pour que les brebis aient une descente d’organe, nous sélectionnerons des brebis âgées (≥ 5 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas).

100 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes maintenues en vie pour être utilisées ensuite dans un second projet. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation d'un dispositif ECG et d'un stimulateur cardiaque au cours d'une chirurgie de quatre heures, puis une stimulation rapide du cœur destinée à installer une fibrillation auriculaire durable, avec examens d'imagerie et prélèvements répétés pendant trois à six mois. Le porteur indique que la fibrillation reste asymptomatique chez la brebis et qu'aucune n'est morte de complications au laboratoire. Il présente ce modèle comme destiné à la communauté scientifique et à des "partenaires industriels", et affirme qu'aucune méthode de substitution ne reproduit la fibrillation et sa réponse aux traitements.

Objectifs

L’objectif est ici de rendre ce modèle accessible à l’ensemble de la communauté scientifique et clinique de l’institut ainsi qu’à nos partenaires industriels. Ce projet vise à créer et étudier des animaux en fibrillation auriculaire (FA) chronique afin qu’ils puissent être utilisés dans d’autres projets. Ces derniers auront pour objectif d’étudier la pathologie sous différents angles, notamment pour ce qui concerne les remodelages cardiaques classiques (électrique et structurel) mais également les changements systémiques en termes biomarqueurs et d’autres organes. En parallèle, ce modelé fournira un contexte beaucoup plus similaire aux patients afin de développer des outils diagnostiques et thérapeutiques avec nos partenaires industriels.

Bénéfices attendus

La création d’un modèle de FA permet l’investigation de plusieurs mécanismes favorisant ou perpétrant la maladie. Cela peut par conséquent nous amener à l’individuation des nouvelles cibles thérapeutiques, donnant des possibilités de thérapie pharmacologiques innovants – notamment compte tenu que les courants traitements pharmacologiques sont très limités et peu efficaces. D’ailleurs les thérapies interventionnelles comme l’ablation par radiofréquence et par champs pulsés, ainsi que les outils et logiciels diagnostiques, seront validés de manière beaucoup plus similaire au contexte clinique, améliorant leur développement et validation

Procédures

Les animaux subiront primariament l’implantation, sous anesthésie générale et angiographie, d’un dispositif de monitorage ECG (télémétrie) et d’un stimulateur cardiaque, ce qui nous permet d’appliquer un protocole de stimulation atriale rapide conduisant à une fibrillation auriculaire persistante. Cette intervention aura une duree de 4 heures. Avant l’implantation et pendant le suivi les animaux subiront, tous les 15 ou 30 jours selon la typologie, des examens d’imagerie et de cardiographie cardiaque, ainsi que de prelevements de sang, urine et selles. Ces interventions seront sous anesthesia generalepour une duree de 4-6 heurs. La durée du suivi est de 3 a 6 mois apres implantation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). Cependant ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM, scanner et électrophysiologique) sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis en FA est très bien maîtrisé au laboratoire depuis de nombreuses années et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie sur avis de la responsable d'animalerie et/ou vétérinaire, pour entrer ensuite dans un second projet et en accord avec la demande de projet justifiant la création du modèle de fibrillation auriculaire chronique.

Remplacement

Aucune méthode de substitution (modèle de cœur en matériau synthétique par exemple, ou simulateur) n’est à l’heure actuelle disponible pour permette de reproduire les phénomènes physio-pathologiques de la FA et sa réponse à des méthodes thérapeutiques. D’autre part, la fibrillation auriculaire induit également une réponse systémique impossible à évaluer dans un modèle in-silico. Il n’est donc pas envisageable de s’affranchir de l’évaluation in-vivo sur un modèle animal dont les caractéristiques anatomiques et fonctionnelles sont proches de l’homme.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, toute utilisation d’un animal dans ce projet de création de modèle pathologique se fera uniquement si l’animal est prévu dans un projet ultérieur programmé ET autorisé. Aucun modèle animal FA chronique sera créé sans que cette condition ne soit remplie. De plus chaque animal sera son propre contrôle grâce aux examens complémentaires d’imagerie et de cartographie qui pourront être réalisés en ligne de base, servant ainsi de contrôle interne pour les examens réalisés ensuite.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. L’angoisse, la douleur et la souffrance seront réduites par une prémédication incluant un analgésique. Nous allons monitorer les parametres vitaux pendant toutes les procedures et les interventions, avec des procedures mise en place en cqs d’urgence. Durant les périodes intermédiaires entre les procédures, nous allons poursuivre l’administration de medicament au besoin, et nous allons continuer une monitorage quotidian de l’etat de santé des animaux. Les observations anomales seront prise en charge par le vétérinaire de l’EU avec l’accord du responsible de projet. La télémétrie permettra de raffiner le protocole en évaluant la vitesse de progression de la FA, la complexité de l’arythmie et son impact sur la function cardiaque. La télémétrie permet de réaliser des enregistrements pendant 160 jours en mode continue ou sur plusieurs années en fonction de la gestion des enregistrements. Cela nous permet de repondre rapidement en cas de stress de l’animal. La procédure expérimentale d’implantation du boitier de télémétrie est maîtrisée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le mouton a été retenu car (i) les équipes de l’IHU possèdent une très grande expérience sur la création du modèle de FA dans cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion des ovins. Ovins : adultes à partir de 7 ans afin d'obtenir une anatomie et un modèle transposable à l'Homme.

Ce projet doit fournir aux organismes de sélection ovine des indicateurs de l'efficacité alimentaire et des émissions de méthane des agneaux, pour orienter la sélection de l'élevage ovin allaitant. 1 000 jeunes moutons de race Romane vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à ce que le porteur appelle leur "carrière de production". Sans anesthésie ni sédation, chacun subit une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces à la main dans le rectum et l'aspiration d'environ 40 mL de liquide du rumen par une sonde de 12 mm de diamètre et d'un mètre de long descendue par la bouche, deux fois pour les mâles et une fois pour les femelles. Le régime 100 % concentré peut en outre les exposer à une acidose du rumen. Le porteur conclut que l'usage des agneaux "ne peut donc être évité", et vise une sélection qui limite l'impact environnemental de l'élevage tout en maintenant "la rentabilité économique pour les éleveurs".

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’identifier des prédicteurs de l’impact environnemental de l’élevage d’ovins allaitants. Les impacts seront étudiés sous l’angle de l’ingestion (aliments et eau) et des émissions de gaz à effet de serre. Nous utilisons des agneaux mâles et femelles de race Romane, descendants de béliers sélectionnés pour valoriser efficacement (ou peu efficacement) ce qu’ils ingèrent, une valorisation efficace signifiant que les individus ingèrent moins que les autres tout en ayant le même niveau de production. Le projet portera sur l’étude des 5ème et 6ème génération de sélection. Après 4 générations de sélection, la divergence est bien marquée : les agneaux issus de béliers efficaces ingèrent 10% de moins de concentré que les agneaux issus de béliers peu efficaces, tout en ayant des performances de croissance identiques. Ces différences sont très réduites bien que significatives, avec un régime plus riche en fourrages. La connaissance des émissions de gaz à effet de serre dans chacune des lignées et sous deux régimes différents nous renseignera sur les liens génétiques entre l’efficacité alimentaire et l’impact environnemental. Chaque année, une centaine d’agneaux de chacun des deux sexes (50% issus de béliers efficaces et 50% issus de béliers peu efficaces) seront mesurés pour leurs émissions de gaz et leurs ingestions d’aliments et d’eau. Les différents outils de mesures reposent sur l’identification électronique des animaux qui sont ainsi mesurés tout en étant maintenus dans leurs lots d’élevage. L’impact environnemental sera évalué sous deux régimes alimentaires différents : un régime 100% concentré basse énergie quand les agneaux auront entre 3 et 5 mois d’âge, puis un régime plus riche en fourrages quand les agneaux auront entre 6 et 9 mois d’âge. Enfin, l’enregistrement en routine des émissions de gaz et des quantités ingérées est peu envisageable à grande échelle, à des fins de sélection. Nous rechercherons donc des prédicteurs de ces caractères dans différents tissus/fluides : le plasma sanguin, le fluide ruminal et les fèces. Les prélèvements de chacun de ces fluides seront réalisés au maximum 2 fois dans la vie de chaque animal, à l’issue de chacune des phases d’alimentation, avec un délai de 3 à 4 mois entre les deux prélèvements. Les émissions de gaz à effet de serre sont principalement dues aux fermentations ruminales, donc l’étude du microbiote ruminal sera central dans ce projet en lien avec le microbiote fécal.

Bénéfices attendus

Notre projet propose d’étudier des animaux sélectionnés sur leur efficacité alimentaire et de répondre à la question suivante : des animaux plus efficaces émettent-ils plus de gaz à effet de serre que des animaux moins efficaces ? La sélection sur chacun des caractères pourra alors être différente en fonction des résultats obtenus, de façon à ce que l’impact environnemental de l’élevage ovin soit limité, tout en maintenant la rentabilité économique pour les éleveurs. De plus, l’ensemble des prélèvements sera utilisé pour rechercher des prédicteurs des émissions de méthane, car ces dernières restent encore peu accessibles en élevage conventionnel. Ces prédicteurs pourront être utilisés par les organismes de sélection, pour inclure l’efficacité alimentaire et/ou les émissions de gaz à effet de serre dans leurs programmes de sélection

Procédures

Pour ce protocole, les agneaux mâles auront chacun deux séries de prélèvements, espacées de 3 mois minimum. Les femelles ne seront prélevées qu’un seule fois, après la phase d’alimentation fourragère. Pour ces prélèvements, les animaux ne seront ni anesthésiés ni sédatés. Chaque année, les 200 animaux étudiés seront prélevés. Sur la totalité du projet, ce seront ainsi 1000 animaux qui seront échantillonnés. Ces prélèvements correspondent à une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces au niveau rectal, et un prélèvement de fluide ruminal par sondage gastro-oesophagien. L’ensemble de ces 3 prélèvements est réalisé en moins de 10 minutes, sans isoler l’animal de ses congénères. Chaque mâle aura donc 2 prises de sang, 2 prélèvements de fèces et 2 prélèvements de fluide ruminal. Les prélèvements sont faits à 5 mois et 8 mois d’âge, pour les mâles. Les femelles n’auront qu’une prise de sang, un prélèvement de fèces et un prélèvement de fluide ruminal, lorsqu’elles auront environ 8 mois d’âge. Pour le prélèvement à la jugulaire et le prélèvement rectal, l’animal sera en attente dans un couloir. Un animalier lui soutiendra la tête pendant qu’un autre animalier fera le prélèvement de sang à la jugulaire. Suite à la prise de sang, un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Ensuite, environ 5g de fèces seront prélevés directement dans le rectum par un animalier dont le gant sera enduit de lubrifiant, un second animalier soutenant toujours la tête de l’animal. Enfin, l’animal passera du couloir au restrainer, matériel de contention adapté aux ovins. Celui-ci portera l’animal jusqu’au poste de prélèvement du fluide ruminal. La tête de l’animal sera maintenue par un animalier, pendant qu’un second animalier fera descendre la sonde gastro oesophagienne souple (12 mm de diamètre et 100 cm de longueur) par la bouche jusqu’au rumen. Une fois la sonde placée, la pompe à vide (reliée à l’autre extrémité de la sonde) sera activée et environ 40 mL de fluide ruminal sera prélevé. La pompe sera ensuite éteinte et la sonde retirée avec précaution. L’ensemble de ce prélèvement (de l’introduction de la sonde à son retrait) n’excède pas deux minutes. Un renforcement positif par distribution manuelle de concentré sera réalisé à la fin du prélèvement de fluide ruminal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pendant la première phase de contrôle pourraient être liés à l’alimentation 100% concentrés (à base de céréales) à volonté lors du premier contrôle, avec des risques d’acidification importante du milieu ruminal. L’aliment concentré a été formulé pour respecter des recommandations élevées en fibres et il a été enrichi en bicarbonate, pour prévenir cette acidose ruminale. Les soigneurs sont habitués à l’élevage de ruminants et connaissent ce trouble digestif et ses symptômes. En cas d’acidose aigüe, ils ont à leur disposition des traitements à administrer par voie orale. Ils sont formés à ce geste. Lors des phases d’adaptation prévues dans le projet, les animaux qui auraient du mal à se familiariser avec les automates d’ingestion sont entraînés par les animaliers, avec un renforcement positif par distribution manuelle de concentré. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Durant toute la phase d’élevage et d’expérimentation, en cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids…), ou d’impact sur l’état général des animaux, une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). En cas de non réponse aux traitements et sur décision vétérinaire, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Les agneaux poursuivront leur carrière de production suite à la procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet porte sur l’impact environnemental de la sélection sur l’efficacité alimentaire. Les principales émissions de gaz à effet de serre proviennent de la digestion des fibres dans le rumen, par les ruminants. Ces émissions de gaz poduits dans le rumen ont des origines génétiques et alimentaires complexes. Cette variabilité individuelle ne peut être étudiée en dehors des animaux eux-mêmes. De plus, nous cherchons des prédicteurs biologiques de ces émissions de gaz, donc il est indispensable de prélever des échantillons sur les animaux mesurés afin d’avoir le lien direct entre les mesures et les prédicteurs testés. Le recours à l’animal ne peut donc être évité.

Réduction

Notre projet repose sur le phénotypage de 200 agneaux par an, soit 1000 agneaux sur 5 ans. Ces effectifs ont été calculés pour nous permettre d’observer des différences faibles entre nos deux lignées d’animaux, sur des caractères autres que la consommation résiduelle. Nous avons choisi de travailler sur les deux sexes, afin d’appliquer le modèle de transmissibilité aux caractères que nous étudions. Ce modèles nécessite des trios (parents-descendants) phénotypés à un âge identique entre les générations. L’estimation des paramètres génétiques repose sur l’analyse de nombreux animaux (au moins 700). Les enregistrements issus de ce projet viendront compléter des bases de données issues de projets antérieurs de façon à avoir les effectifs suffisants nous permettant les analyses génétiques des nouveaux caractères.

Raffinement

Durant notre projet, les animaux sont élevés en lots pour exprimer leurs comportements sociaux. Les mesures réalisées reposent sur l’utilisation d’automates que les animaux fréquentent selon leurs besoins. Toutes les données sont gérées en temps réel et intégrées par un logiciel dédié. Le suivi des animaux est quotidien, par cet outil informatique, par des caméras, mais aussi par les nombreux passages des animaliers pour un suivi visuel. Les temps d’occupation des automates sont régulièrement contrôlés pour s’assurer que chaque animal se nourrisse à volonté. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Les animaux sont logés sur des aires de copeaux de bois, pour nous assurer qu’ils ne mangent pas leur litière, ce qui fausserait l’étude. Des disques à mordiller seront suspendus dans les parcs. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge au contact humain, et en particulier à être manipulés. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements sont réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et auquel les animaux sont habitués. Les prélèvements de fèces, sang et de contenu ruminal se font successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention. Les prélèvements de sang et de fèces sont similaires à ceux qui peuvent être réalisés en élevage classique pour du génotypage, de la prophylaxie ou du diagnostic de parasitisme gastro-intestinal. Pour les prises de sang, les agneaux pouront être tondus au niveau du coup pour faciliter la visualisation de la veine jugulaire. Un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Une attention particulière sera portée aux veines jugulaires pour repérer tout signe éventuel de phlébite. Les prélèvements de contenu ruminal ne sont pas des prélèvements habituels en élevage ovin. Néanmoins, le personnel de l’établissement utilisateur a été formé et pratique ce type de prélèvement depuis plusieurs années. A la fin des prélèvements, une poignée de granulés est donnée à l’animal pour un renforcement positif. Ils font l’objet d’une surveillance visuelle toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Les ingestions et les poids sont encore enregistrés sur les deux jours suivants les prélèvements, pour avoir une indication de leur état de santé.

Choix des espèces

L’étude des émissions de gaz à effets de serre est primordiale pour l’espèce bovine qui en est la principale responsable. Néanmoins, l’espèce ovine présente 2 avantages au sein des ruminants pour l’étude de l’impact environnemental des ruminants : des troupeaux avec de grands effectifs (mêmes conditions d’élevage), une sélection génétique opérationnelle. Le rumen est l’élément central de notre projet, donc l’espèce ovine est toute indiquée pour être support de ce travail. Notre projet porte ainsi sur l’utilisation d’ovins allaitants de race Romane sélectionnés sur leur efficacité alimentaire. Cette efficacité alimentaire est évaluée lors de la phase de croissance dans un premier temps. Les agneaux entrent en halle de phénotypage entre 10 et 12 semaines d’âge, afin de débuter la phase de contrôle autour de 90 jours d’âge, et ont 8 à 9 mois d’âge en fin de projet.

34 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur des cœurs déjà infarcis. Ils subissent sous anesthésie des examens d'imagerie, une angiographie, une cartographie de contact et une stimulation interventriculaire, cette dernière pouvant déclencher une tachycardie ventriculaire évoluant en fibrillation. Le cœur est prélevé après mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur affirme que le remplacement des tissus 'n'est pas possible' et présente ce protocole comme 'essentiel' à la compréhension de l'infarctus.

Objectifs

L’ischémie cardiaque est la principale cause des troubles du rythme ventriculaire dans le monde. Afin de mieux comprendre son mécanisme d’action, il est indispensable d’avoir une description détaillée de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le myocarde sain, notamment, dans les zones de transition entre ces deux types de tissus. Pour cela, le développement et l’optimisation de nouvelles méthodes d’imagerie cardiaque, d’analyse de signaux électriques et optiques sont indispensables. Dans ce projet nous utilisons une procédure pluridisciplinaire permettant donc une étude approfondie qui permet une analyse détaillée in vivo et ex vivo. Afin d’arriver à ce but, le développement de nouvelles techniques applicables dans le monde clinique, seront mises au point, montrant donc le versant translationnel du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’optimiser l’imagerie cardiaque de l’infarctus afin de caractériser le tissu sain à l’intérieur ou autour de la zone de cicatrice. Ces informations sont essentielles en clinique afin d’améliorer le diagnostic des patients et de déterminer la meilleure approche thérapeutique. Une cartographie électrique de contact permettra la visualisation de la transmission électrique dans la cicatrice de l’infarctus et dans le tissu sain. De plus, cette technique permettra d’observer les zones de jonctions entre le tissu sain et la cicatrice. La stimulation des cœurs infarcis à différents fréquences donnera des informations sur les risques des troubles du rythme cardiaque. Toutes ces techniques enrichiront les bases de données numériques afin de créer et améliorer les études de modélisation cardiaque préventive.

Procédures

Les animaux utilisés pourront subir des examens d’imagerie, d'angiographie, de cartographie de contact et de stimulation interventriculaire. Toutes ces analyses seront effectuées sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée. Les techniques d’imagerie utilisées sont de types non invasives (IRM, scanner et/ou échocardiographie, 180 min au total). Le protocole d’angiographie est prévu afin de déterminer la présence ou pas d’irrigation sanguine dans l’infarctus (environ 90 min). Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. La cartographie électrique du cœur pourra être effectuée pour évaluer les effets de l’infarctus in vivo (environ 90 min). Une stimulation interventriculaire pourra être effectuée pour déterminer la fonctionnalité ventriculaire à différentes fréquences de stimulation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesurer l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.

Impact sur les animaux

La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impactées légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasif (échocardiographie, IRM) ou mini-invasif (cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters: au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact ou de stimulation interventriculaire peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire qui peuvent déborder en fibrillation.

Devenir

Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études fonctionnelles (cartographie optique) et structurales ex vivo (histologie, micro-scanner, etc.), qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans le contexte actuel, malheureusement, le remplacement de tissus obtenus via l’expérimentation animale n’est pas possible pour répondre à l'objectif du projet. Le manque de connaissance au niveau de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le tissu normal ne le permet pas. L’intérêt clinique de l’étude, dû à la prévalence de la pathologie au niveau mondial, rend ce protocole essentiel pour la compréhension du fonctionnement de la maladie et le développement de nouveaux traitements pour les patients. De plus, les résultats obtenus avec les techniques d’imagerie, les mesures électriques et la cartographie optique vont nous permettre d’enrichir la base de données pour la modélisation cardiaque, permettant de s’affranchir dans de nombreuses études, du modèle animal.

Réduction

Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, nous avons effectué un calcul de puissance statistique pour déterminer le minimum d’animaux nécessaires afin d’avoir des résultats avec une différence statistique. Nous avons également intégré dans le même projet de recherche différents équipes: le pôle d’imagerie, le pôle physiopathologique, le pôle de traitement de signaux et le pôle de modélisation cardiaque. Ce regroupement interdisciplinaire au sein de notre projet, permet le développement et l’utilisation d’un maximum de techniques compatibles avec la quantité minimale d’animaux possible, permettant donc son optimisation.

Raffinement

Pendant les procédures, les animaux reçoivent un protocole antidouleur approprié et ils sont maintenus sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et surveillés par un ECG de surface et un capteur pression sanguine invasive. Cela nous permet d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur diphasique est toujours disponible en salle d’ablation pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités définies.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme, les ovins ont été retenus car : •Ces modèles sont une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles. Chez l’Homme, la plupart des infarctus se produisent à l’âge adulte. Pour cette raison, des ovins adultes ont été choisis pour ce projet.

200 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins et des chirurgies d'implantation de dispositifs urologiques pouvant durer plusieurs heures sous anesthésie, avant une mise à mort suivie de nécropsie et d'examen des tissus. Le porteur décrit des suites post-opératoires douloureuses pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité. Il affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider ces dispositifs implantables.

Objectifs

La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouvelles méthodes, molécules, dispositifs et techniques pour les affections de l’appareil urinaire et ses annexes par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et développement qui permet de mettre au point ces méthodes et d’en vérifier leur sécurité. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients humains représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

155 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par voie orale de milliers de larves de trichostrongles, dont une espèce se nourrit de leur sang, ils peuvent développer inflammation intestinale, diarrhées, perte de poids et baisse de l'hématocrite, un point limite étant fixé à 15 % de perte de poids. L'objet du projet est de produire du matériel biologique, larves et vers adultes, pour des études ultérieures sur la résistance aux antiparasitaires. Le porteur n'infeste que des mâles, jugés plus sensibles, et affirme que le passage sur l'ovin est une étape obligatoire du cycle du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique). Nous inoculons aux moutons 6000 (isolat sensible) à 10000 larves (isolat résistant) de trichostrongle par voie orale (dose de larves permettant une infestation correcte sans toutefois déclencher de signes cliniques; variable en fonction de la pathogénicité de l'isolat). Le cycle de développement complet se déroule sur environ 21 jours. A partir de ce stade, les larves sont devenues adultes (mâles et femelles), se reproduisent et excrètent des oeufs dans la lumière du tube digestif qui sont expulsés avec les matières fécales hors de l'hôte. Ainsi, à partir de J+21 nous prélevons les matières fécales et réalisons des contrôles coproscopiques pour déterminer le point de départ de l'excrétion d'oeufs dans les fèces. Lorsque l'excrétion se stabilise, nous prélevons les matières fécales pour réaliser les coprocultures qui nous permettent d'obtenir des larves infestantes notamment. Différents procédés permettent de récupérer suffisamment de matières fécales : 1) lorsque nous avons un faible besoin de matériel biologique, les matières fécales sont obtenues par prélèvement rectal 2) lorsque nous avons des besoins intermédiaires et s'il s'agit d'une souche sensible de nématodes, les moutons sont équipés de harnais permettant de collecter les fèces. 3) Lorsqu'il s'agit d'isolats résistants, les moutons sont placés en cage métabolique 24 à 48h (au pic d'excrétion des oeufs de nématodes) pour collecter la totalité des matières fécales émises et limiter au maximum les risques de dispersion d'un isolat résistant. Dans ce cas les moutons peuvent être placés individuellement en cage mais ne sont jamais seul dans l'espace qui leur est dédié et ont la possibilité d'échanges visuels avec leurs congénères. 4) Lorsque les besoins sont plus importants, deux moutons sont inoculés avec le même isolat et sont placés ensemble en cage métabolique le temps de récolter suffisamment de matériel. La durée maximale de collecte pour obtenir suffisamment de matériel de travail et minimiser le nombre d'animaux utilisé est de 12 semaines.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en i) comprenant les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques.

Procédures

Lorsque les vers adultes sont développés, nous collectons des matières fécales quotidiennement pour les mettre en culture (environ 15-30 min). Les volumes varient en fonction des besoins et sont associés a des techniques appropriées (cage métabolique ou harnais pour de grosses quantités ou prélèvement intra-rectal pour des besoins plus réduits). Le trichostrongle H. contortus se nourrit du sang de son hote. A ce titre, il est impératif de controler le niveau de perte sanguine des animaux infestés et déclarer le point limite atteint ou non. Pour ces infestations, une prise de sang de 5 mL à la veine jugulaire sera réalisée avant infestation (pour établir le niveau d'hématocrite physiologique) et 30 jours, 40j et 60j après l'infestation (mois de 5 min). Toute coproscopie supérieure ou égale à 15000 opg nécessitera un contrôle hématocrite.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de deux ordres: 1. l'effet de l'infestation: les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en cage métabolique des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminer dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe (soit 155 agneaux sur 5 ans).

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Durant la mise en cage métabolique individuelle, les animaux gardent un contact visuel avec un autre congénère situé dans une cage adjacente. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte: elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Si une perte de poids (supérieure ou égale à 15% du poids initial), une modification de l’apparence physique (abbatu, bellements) ou une modification du comportement (animal prostré, peu mobile) est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les trichostrongles d'intéret sont inféodés à l'espèce ovine. Les agneaux auront entre 3 et 4 mois (environ 30 kg). A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.