Macaques à longue queue

Retenus pour la proximité de leur cerveau avec celui de l'humain, des macaques à longue queue sont utilisés à l'exclusion de toute autre espèce. 100 d'entre eux vont l'être sur cinq ans, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à dix prélèvements de sang en 48 heures, des ponctions de liquide céphalo-rachidien, trois heures d'imagerie sous anesthésie, une chirurgie intracérébrale de deux à quatre heures et jusqu'à six heures d'immobilisation en chaise de contention, l'évaluation de la sensibilité impliquant l'atteinte de seuils douloureux tactiles ou thermiques. Ils sont tués en fin de projet pour des analyses ex vivo, leurs organes pouvant ensuite être proposés à d'autres équipes de recherche.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracéérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, fourrage, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Une hypercalcémie provoquée par administration d'hormone parathyroïdienne, une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour implanter un dispositif, un jeûne allant jusqu'à vingt heures la veille, un prélèvement de sang par jour pendant cinquante jours au maximum et jusqu'à cinq séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme : 16 macaques cynomolgus vont être soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'hypercalcémie peut entraîner fatigue, tremblements, faiblesse musculaire, vomissements, douleurs abdominales et troubles de la mémoire, et que les effets indésirables des candidats-médicaments ne sont pas prévisibles au démarrage. Il affirme que l'animal reste un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme, et que le macaque a remplacé le chien dans ces programmes. Les 16 macaques survivront au projet et seront réutilisés dans d'autres protocoles si le vétérinaire l'autorise, pour une gravité légère, modérée ou sans réveil.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicament sur la régulation de l’hypercalcémie liée à des troubles parathyroïdiens. En effet, l'hormone parathyroïdienne est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Chez l’homme ce trouble d’hypercalcémie hormono-dépendante peut avoir plusieurs origines : 1/un hyperparathyroïdisme primaire associé à une production excessive d’hormone parathyroïdienne (PTH) par les glandes parathyroïdes du fait de la présence d’un adénome ou de l’hypertrophie d’une glande, 2/une hypercalcémie humorale maligne, provoquée par la production par une tumeur d’un peptide mimant les effets biologiques de la PTH, la PTH-related protein (PTHrP). Les symptômes d’une hypercalcémie prolongée et sévère peuvent être entre autres une fatigue sévère, des douleurs et fragilisations osseuses ou des défaillances rénales. Chez l’homme, dans le cas d’un hyperparathyroidisme primaire, les traitements sont le plus souvent chirurgicaux mais tous les patients ne sont pas éligibles à la chirurgie, et dans le cas d’une hypercalcémie humorale maligne, les traitements sont généralement symptomatiques.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'hypercalcémie, une pathologie humaine touchant 2 millions de patients uniquement pour l'hyperparathyroidie primaire en Europe et aux Etats-Unis dont 20% des patients qui ne sont non éligibles à la chirurgie ou qui sont en récidive post chirurgie, soit près de 380 000-400 000 patients. Du fait de la cible thérapeutique, ces nouveaux médicaments pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental d'hypercalcémie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subiront une intervention chirurgicale (30 min) pour implanter un dispoditif médical, sous anesthésie générale, selon un protocole chirurgical et analgésique maitrisé accompagné d'un suivi postopératoire adapté. Les animaux seront mis à jeun la veille de la chirurgie (maximum 20h). Les différents candidats médicaments seront administrés par voie sous-cutanée (2 min) et différents prélèvements sanguins (2 min) seront réalisés (1 fois par jour pendant 50 jours maximum). Pour le recueil urinaire, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée maximale 24h (5 fois maximum sur 50 jours).

Impact sur les animaux

Une hypercalcémie légère à modérée telle qu'attendue dans ce projet peut entrainer des symptômes aspécifiques tels que la fatigue, tremblement, faiblesse musculaire, constipation, nausées, vomissements, douleurs abdominales, perte de l’appétit ou encore un dysfonctionnement cognitif (troubles de la mémoire par exemple). L'hypocalcémie susceptible d'être induite par le candidat médicament pourra entrainer les mêmes symptômes qu'une hypercalcémie légère. Dans tous les cas, les niveaux de calcémie seront régulés soit par la modulation des doses de PTH/PTHrP, soit par un supplément d'apport en calcium dans la nourriture. Les animaux de ce projet pourront subir une contrainte liée à la privation de nourriture avant la chirurgie, une contrainte liée à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et à l’hébergement individuel suite à la chirurgie pour la récupération post chirurgie, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration des candidats médicaments, de l'anesthésie et des prélèvements sanguins. Les effets indésirables potentiels du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Ils feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux le cas échéant et mettre en place les traitements nécessaires à leur prise en charge.

Devenir

Les animaux seront généralement réutilisés pour d'autres projets si l'état général des animaux (attesté par le vétérinaire) le permet. Le projet suivant sera de gravité sans réveil, léger ou modéré.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le Primate non humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces non rongeur adaptée à ce type de modèle d’étude et n'est utilisé que si les autres espèces non rongeurs ne sont pas appropriées, pour des différences de métabolisme par exemple.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 / par groupe. L’analyse statistique faite sera adpaté au modèle. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • La mise au point de procédures rigoureuses, • La formation du personnel, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages.

Choix des espèces

Le primate non humain a été démontré selon les critères de l’EMA (Europeen Medicines Agency) comme étant l'espèce animale non-rongeur la plus pertinente dans une approche translationnelle par rapport à l'homme pour le développement de traitement de régulation des troubles de la calcémie liés à une hypo ou hypersécrétion de PTH. Des tests ont été réalisés chez le chien et il a été démontré que chez cette espèce, l’effet de la PTH sur le calcium est différent de chez l'homme. En effet, il a été démontré que le singe est moins sensible aux variations de calcémie produites par la PTH, et donc moins sujet au phénomène de toxicité rénale qui est importante chez le chien. Le singe a donc remplacé le chien dans les programmes de développement de traitements visant à corriger les troubles de la calcémie liés à la parathormone. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

15 macaques cynomolgus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, ils reçoivent une injection de thérapie génique dans chaque œil, passent un examen oculaire de trente minutes par semaine pendant au moins trois semaines et subissent deux prélèvements de sang, avant que leurs yeux soient prélevés après leur mise à mort. Le porteur décrit une preuve de concept, dont les retombées annoncées pour les malades de la rétine restent renvoyées au long terme. Le choix du macaque tient à la fovéa, absente chez les rongeurs, les chiens et les porcs, et que le porteur dit ne trouver que chez les simiens.

Objectifs

L'utilisation de thérapies géniques dans le cadre de restauration de vision ont vu un essor depuis les 10 dernières années et est testé aujourd'hui dans plusieurs essais pré-cliniques et cliniques chez l'Homme. Une des causes de ce succès grandissant est l'utilisation de virus adénoassociés (AAV) comme vecteur de ces thérapies. En effet, les AAV permettent d'apporter précisément l'agent thérapeutique dans les cellules d'intérêt. En effet, l'enveloppe de ces petits virus, la capside est l'élément permettant de cibler spécifiquement les tissus à atteindre et plus précisément les cellules (ce qui est appelé le tropisme). Ainsi, en modifiant génétiquement les capsides d'AAV, méthodes actuellement à la pointe de la technologie, il est possible d'administrer des thérapies géniques dans des cellules très spécifiques comme les cellules photoréceptrices de la rétine. Toutefois, les capsides des AAV utilisées aujourd'hui pour des essais cliniques ne sont pas encore capable de migrer efficacement entre l'humeur vitrée de l'oeil et la rétine (membrane limitante interne ILM), ce qui limite les méthodes d'administration à des injections sous-rétiniennes, technique invasive et qui ne permet de limiter l'étendue de distribution de l'agent thérapeutique qu'à la région environnante du site d'injection, pouvant parfois représenter moins de 5 % de la rétine. Un moyen plus adapté pour l'administration d'AAV est l'injection intravitréenne (IVI). Cette méthode classiquement utilisée en médecine humaine et vétérinaire est non seulement moins invasive mais également préventive de toute altération anatomique des tissus rétiniens et environnants. Ainsi, l'objectif de ce projet est d'évaluer des outils de thérapie génique robustes, injectables par voie intravitréenne et migrant de manière efficace dans l'œil. L'objectif plus global quant à lui est d'identifier et de caractériser de nouveaux variants de capsides d'AAV, mieux adaptés aux thérapies géniques in vivo de la rétine humaine, qui seront utilisés dans de futurs essais cliniques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils de thérapie génique ciblant le traitement de maladies touchant le système visuel. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront de base à l'amélioration de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies de la vision.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation d'examens oculaires par: 1 examen réalisé pré-injection puis plusieurs examens d’environ 30 minutes par animal à raison d’un examen toutes les semaines pendant la phase d’incubation (minimum 3 semaines) ; (2) injections intraoculaires de la thérapie génique (une seule injection par oeil d’une durée d’environ 5 min) ; (3) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale ; (4) prélèvement des yeux réalisé sous couverture analgésique et anesthésie profonde suivi de la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, l’injection de l’anesthésique, les contentions répétées (pendant 5-7 jours post injection) pour d’éventuels soins consécutifs à l'injection. Les administrations, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un léger inconfort au niveau de la zone d’injection les jours suivant l'injection et provoquer une légère réaction inflammatoire de la sclère. Sur le plan expérimental, les AAV injectés peuvent engendrer dans de très rare cas une réaction inflammatoire non souhaitée dans l'humeur vitré.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant reçu les AAV seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus oculaires.

Remplacement

Les maladies rétiniennes héréditaires affectent les cellules photoréceptrices de la fovéa et les outils de thérapie génique ciblent ces cellules, c'est pourquoi l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa, structures oculaires cible dans cette étude. De plus, les vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validés in vitro sur des explants rétiniens humains et permettent de restaurer la sensibilité à la lumière. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à plus long terme une application pour des études cliniques chez l'Homme. Ce passage à la clinique nécessite donc cette phase sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. 15 macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans. Ce nombre d'animaux a été défini en fonction d'études similaires réalisées chez le PNH et montrant des résultats positifs quant à l'intégration d'AAV administrés par injection intravitréenne. Les vecteurs ont déjà été évalué sur des modèles rongeurs ainsi que sur des modèles organoïdes et seront injectés dans les deux yeux permettant de réduire ainsi le nombre d'animaux utilisé. Les analyses statistiques qui seront conduites afin de comparer les cellules ayant intégré ou non les AAV permettront de démontrer de manière fiable les résultats obtenus et l'efficacité de l'outil de thérapie génique.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L’ensemble des méthodes expérimentales a été pensé et choisi pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les maladies de la vision humaine pour lesquelles le bénéfice du développement de thérapie génique est le plus porteur concerne les maladies altérants les photorécepteurs de la fovea, partie centrale de la rétine. Cette région de l’oeil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain (PNH) a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de 3 à 5 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.

Jusqu'à dix prélèvements sanguins en 48 heures, une ponction de liquide céphalo-rachidien, trois heures d'imagerie et une chirurgie intracérébrale de deux à quatre heures : 100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent aussi jusqu'à six heures en chaise de contention pour la microdialyse et deux séances hebdomadaires de tests comportementaux qui ne sont pas nommés, avec un inconfort attribué à la captivité et au conditionnement, et l'atteinte de seuils douloureux tactiles ou thermiques. Le projet mesure la diffusion de candidats médicaments contre les maladies neurodégénératives et leurs effets sur la sensibilité. Le porteur justifie le recours au primate par sa proximité anatomique avec l'être humain, et présente ce passage avant l'essai clinique comme relevant d'un "principe éthique".

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), du toucher et de la température corporelle. Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Le protocole prévoit quatre études par an sur des candidats médicaments contre les maladies neurodégénératives, à raison de cinq macaques au plus par étude, dans le cadre d'une activité préclinique. 100 macaques à longue queue vont ainsi être utilisés en cinq ans, tous tués à la fin du projet pour des analyses de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils peuvent subir une chirurgie dans le cerveau de deux à quatre heures, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien, jusqu'à dix prises de sang en 48 heures, des séances d'imagerie de trois heures sous anesthésie, jusqu'à six heures en chaise pour la microdialyse et des tests de sensibilité menés jusqu'au seuil de douleur tactile ou thermique. Le porteur reconnaît qu'un effectif de cinq individus par étude est "faible pour avoir une puissance statistique élevée", et le justifie par ce qu'attendent les comités de lecture.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), du toucher et de la température corporelle. Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Choisis pour la proximité de leur système immunitaire avec celui de l'humain, deux jeunes macaques crabiers de deux ans et demi sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis tués. Chacun subit une prise de sang sous anesthésie dans le mois précédant l'essai, un traitement immunosuppresseur la veille sous anesthésie d'une heure, l'injection intraveineuse du produit sous anesthésie de trois heures, enfin une dernière prise de sang avant la mise à mort, sept jours plus tard. Le porteur affirme que la complexité des réactions immunitaires exclut toute méthode substitutive, et désigne l'humain, dans son texte, comme le "Primate Humain". L'essai consiste à injecter un mélange de trois bibliothèques de capsides virales fabriquées au laboratoire, pour repérer en une seule fois lesquelles s'accumulent dans le cœur et le muscle plutôt que dans le foie.

Objectifs

Les troubles neuromusculaires et musculo-squelettiques sont parmi les principales causes d’handicap en Europe. Les thérapies géniques représentent la seule approche permettant de développer un traitement curatif pour ces affections, qui résultent d'un défaut génétique ou d'une mutation. Toutefois, pour que les gènes thérapeutiques soient efficacement transférés, il est crucial de disposer d'outils de transfert de gènes qui soient à la fois sûrs, efficaces et spécifiques aux cellules ou organes visés. Dans cette étude, nous nous concentrons sur les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Ces vecteurs sont les plus utilisés en thérapie génique. Les vecteurs AAV de première génération, présentent une affinité pour différents types de cellules et nécessitent des doses élevées pour atteindre des niveaux thérapeutiques. Au sein de notre Laboratoire, nous optimisons ces vecteurs pour améliorer leur affinité envers des cellules cibles, réduisant ainsi la dose de vecteur, la charge antigénique et le risque d'effets secondaires. Nous visons aussi à limiter les effets sur les cellules non-ciblées, augmentant ainsi la sécurité de la thérapie génique. Nous avons créé trois nouvelles bibliothèques d’enveloppes protectrices (capsides) de ces AAV. Ces bibliothèques seront injectées en tant que mélange 1:1:1 par voie intraveineuse et analysées ensuite pour identifier les variantes s'accumulant dans les cellules cibles souhaités (cellules cardiaques, cellules musculaires) ainsi que les cellules hors cibles (cellules hépatiques). La combinaison des trois bibliothèques de capsides AAV avec une analyse des tissus cible et hors cible, nous permettra de révéler des capsides optimisées et identifier ainsi des nouvelles variantes prometteuses en un seul essai.

Bénéfices attendus

En général, les vecteurs AAV présentent une affinité pour différents types de cellules et nécessitent des doses élevées pour atteindre des niveaux thérapeutiques. Toutefois, l'optimisation de ces vecteurs grâce aux nouvelles stratégies développées permettra d'augmenter l'efficacité du traitement au niveau des cellules et organes cibles. Cette optimisation permettra de : - Réduire la dose de vecteur nécessaire. - Diminuer les risques d'effets secondaires pour les patients. - Réduire, voire éviter, les effets sur les cellules non ciblées. - Améliorer la sécurité des thérapies géniques de manière générale.

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : - Dans le mois avant l’injection, les 2 animaux auront 1 prélèvement sanguin, sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin d’obtenir des valeurs de base concernant leur suivi médical et leur sérologie. - La veille de l’injection (J-1) et en fonction de la sérologie ; un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 1 heure) - Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur testé. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) - A 7 jours post-injection (J7) : un prélèvement sanguin sous anesthésie (entre 15 et 30 min), avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque entraîne les effets indésirables suivants : La piqûre d'aiguille pour l’injection et les prélèvements sanguins entraîne une douleur légère de courte durée. L'anesthésie avant les manipulations peut provoquer une nausée légère de courte durée. Le jeûne préalable à l’anesthésie peut entraîner une sensation de faim légère de durée limitée (maximum 12 heures). La contention nécessaire pendant les manipulations peut provoquer un stress léger de courte durée. Ces interventions sont effectuées en accord avec la classe de gravité des procédures, et les effets indésirables sont réduits au minimum grâce aux raffinements apportés.

Devenir

Les 2 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 7 jours après l’injection du vecteur thérapeutique puis euthanasiés pour des prélèvements de tissus en post-mortem. L’euthanasie des 2 animaux est nécessaire pour obtenir ces prélèvements sur lesquels s’appuieront plusieurs types d’analyse essentielles pour le projet.

Remplacement

Les études réalisées chez le Primate Non Humain apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité (capacité de déclencher un réponse immunitaire) de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives et justifie donc notre recours à des animaux. Les résultats obtenus sont transposables en terme de biodistribution et tolérance et permettent d'envisager de futurs essais cliniques chez l'homme (Primate Humain).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible et des résultats significatifs et fiables. Ce nombre d’animaux est basé sur des études précédentes en thérapie génique et sur ce sujet spécifiquement. Ce nombre réduit nous permettra d’identifier des nouvelles variantes de capsides d’AAV de grandes valeurs transgéniques, grâce à un seul essai sur des organismes vivants.

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement tout le long du projet (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections intraveineuses de vecteur AAV associé à une immunosuppression par voie orale et intraveineuse) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min). Ces actes étant peu ou pas douloureux, le protocole analgésique ne sera pas basé sur des opioïdes mais par contre sur les effets analgésiques des molécules anesthésiques utilisées et/ou des anti-inflammatoires. Afin de favoriser les échanges sociaux et le bien-être des animaux, les deux primates seront hébergés ensemble dans une volière enrichie tout le long du projet. Toutefois, pour des raisons de biosécurités, ils seront hébergés en cages individuelles en post-injection, puis remis en volière dès que possible. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau à volonté ainsi qu’un environnement enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés. Cet enrichissement sera renforcé en hébergement individuel. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Le choix du macaque fascicularis comme espèce animale dans cette étude est justifié par les critères suivants : La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans des organes et tissus pour y exprimer un gène thérapeutique varie en fonction de l’espèce. Ainsi, des vecteurs efficaces chez des rongeurs peuvent ne pas l’être chez l’humain. Le macaque fascicularis est particulièrement pertinent en tant que modèle préclinique en raison de sa proximité phylogénique avec l’homme, de sa morphologie et de sa physiologie similaire, ainsi que de la ressemblance de son système immunitaire avec celui de l’homme. Ces caractéristiques en font un modèle idéal pour évaluer la biodistribution, l'efficacité et la réponse immunitaire aux nouveaux variants de vecteurs AAV, en particulier lorsqu'une injection intraveineuse est nécessaire. En conséquence, l'utilisation du macaque fascicularis permet de maximiser la transposabilité des résultats obtenus vers l’homme, notamment en termes de ciblage cellulaire et tissulaire, ce qui est crucial pour envisager des essais cliniques futurs. 2 primates mâles (âgés de 2.5 ans et pesant entre 3.5 et 4.5 kg) seront inclus dans ce projet. Les animaux utilisés dans cette étude sont des jeunes adultes ayant un système immunitaire mature, indispensable pour notre projet.

Quinze jours d'acclimatation, deux prélèvements sanguins hebdomadaires, puis l'implantation sous la peau d'une pompe sous anesthésie générale, une heure d'intervention : 8 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pompe diffuse une hormone qui fait monter leur taux de calcium sanguin, avec pour effets attendus apathie, diarrhées et augmentation du volume urinaire, avant l'injection de l'anticorps censé faire redescendre ce taux, dont un surdosage provoquerait contractions musculaires, faiblesse, tétanie et convulsions. Chaque jour à partir de l'implantation, un prélèvement sanguin est réalisé sur animal vigile, la contention durant cinq à dix minutes. La pompe est ensuite retirée sous anesthésie et les huit macaques sont gardés en vie, décision que le porteur présente comme une manière de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l'effet pharmacodynamique et de définir la pharmacocinétique d’un anticorps monoclonal humanisé ciblant le recepteur PTH1R (récepteur à la parathormone) sur deux modèles différents d’hypercalcémie provoquée chez le primate : 1) un modèle d‘hyperparathyroïdie primaire (HPP), induit par la perfusion de parathormone (PTH), une hormone impliquée dans la régulation du calcium 2) un modèle d’hypercalcémie humoral maligne (HHM) induit par une perfusion de peptide lié à la parathormone (PTHrP), une hormone également impliquée dans la régulation du calcium L’augmentation provoquée de la PTH (dans le premier modèle) ou de la PTHrP (dans le second modèle) va induire une augmentation du taux de calcium sanguin. Le but de l’anticorps ciblant le récepteurs PTH1R est de faire diminuer ce taux de calcium dans les deux modèles (modèle HPP et HHM). Le projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins répétés seront réalisés avant et après l’administration de l’anticorps. Différents paramètres physiologiques pertinents seront également relevés (température corporelle, poids). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, toutes les doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement permettant d’agir sur l’hypercalcémie lié à des pathologies comme la HPP (hyperparathyroïdie primaire) et HHM (hypercalcémie humorale maligne). Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de minimum 15 jours. Les animaux recevront deux administrations par voie sous cutané de l’élément à tester. Après les administrations, les prélèvements de sang et un suivi des paramètres physiologiques (poids et/ou température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’évolution du taux de calcium et la pharmacocinétique de l’élément testé (temps contention compris entre 5 et 10 minutes en moyenne). Des mesures basales de ces données seront réalisées pour les comparer avec celles obtenues post-administration dans le but de détecter toute variation physiologique après administration du candidat médicament. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les administrations de l’anticorps et les prélèvements de sang seront moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Les prélèvements sanguins dureront ponction moins de 5 minutes en moyenne. En amont de la pose de la pompe, deux prélèvements quotidien seront réalisés une fois par semaine. A partir de l'implantation de la pompe, un prélèvement sera fait quotidiennement. La pompe permettant l’administration des hormones sera implantée en sous-cutané. Pour le confort et pour le bien-être des animaux, cet acte sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie chimique fixe).L'intervention durera environ une heure. Les animaux devront être mis à jeun avant la réalisation l’implantation (moins de 16h). Les animaux seront gardé en vie à la fin de la procédure ce qui implique l'explantation de la pompe. Cette prodédure ce dérulera de la même façon que l'implantation (anesthésie générale chimique). Cette intervention durera envrion 30 minutes. Enfin les animaux seront récompensés à la fin de toute manipulation.

Impact sur les animaux

L’induction d’une hypercalcémie peut provoquer des symptômes associés à cette biochimie. On pourrait observer une apathie (baisse d’énergie globale), des diarrhées ou encore une polyurie (augmentation du volume urinaire). A la suite de l’injection de l’anticorps, il pourrait y avoir une hypocalcémie. En effet, l’effet attendu de ce traitement est une diminution du taux de calcium. Une dose trop élevée lors des administrations de l’anticorps pourrait induire des effets indésirables. Les signes cliniques classiquement observés lors d’une hypocalcémie sévère sont : agitation, contractions musculaires faciales ou généralisées, faiblesses, anorexie, tétanie et convulsions. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié : 1) à la mise à jeun, qui peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieure à 16h. 2) à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...); 3) au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de l'étude dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Cette décision sera prise par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Etre Animal)

Remplacement

Cette étude de pharmacocinétique / pharmacodynamique chez l’animal est indispensable au développement d’une nouvelle molécule pharmaceutique. En effet, celle-ci permet de déterminer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de la molécule testée. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet et pour obtenir des résultats interprétables et transportable à l’homme. Pour ce projet 2 lots de 4 animaux (un lot HPP et un lot HHM) seront utilisés. Comme le protocole le permet, les animaux seront gardés en vie à l’issue de l’étude dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques (cette décision sera validée par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Être Animal)).

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (ex : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 15 jours minimum sera mise en place avant le début de l’étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable.

Choix des espèces

Le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. Cette espèce de primates non humains (PNH) partage de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de leurs principales caractéristiques physiologiques. La régulation du calcium par la PTH est connue pour être nettement différente chez les rongeurs et les chiens par rapport à l'homme, rendant ainsi les données obtenues chez ces espèces difficiles à interpréter en ce qui concerne la physiologie humaine. En comparaison, la molécule testée a déjà été testé sur des macaques cynomolgus et a montré un effet pharmacologique prolongé, confirmant ainsi la pertinence de cette espèce. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, à ce stade développement, les animaux disposent d’un système hormonale mature. De plus ce stade de développement a déjà été utilisé pour des études de pharmacodynamique.

Quarante minutes de contention sur chaise à chaque administration, treize prélèvements sanguins par animal, et pour trois d'entre eux deux ponctions de liquide cérébrospinal sous anesthésie : 12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois fois par voie intraveineuse des ARN interférents couplés à un anticorps censé leur faire franchir la barrière hématoencéphalique, pour un développement industriel de transport de médicaments vers le cerveau. Le porteur reconnaît que les ponctions peuvent provoquer une infection post-opératoire, de la fièvre ou un œdème au point de piqûre, et annonce dans le même temps n'attendre aucun effet indésirable lié au produit testé. Le choix du macaque tient selon lui à sa proximité phylogénétique avec l'être humain, et celui de jeunes adultes au fait que des animaux plus âgés présenteraient des anomalies susceptibles d'altérer la qualité des échantillons prélevés après leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de trois molécules d'intérêts, conjugués à un même transporteur, passant la barrière hématoencéphalique chez le primate non humain dans le but de transporter des médicaments dans le système nerveux central. Le premier objectif est d’évaluer les structures qui sont ciblées dans le système nerveux central par les trois molécules d'intérêts. Le deuxième objectif est d’évaluer le devenir dans le sang des trois molécules d'intérêts couplées au transporteur avec deux méthodes différentes afin d’évaluer leur stabilité dans le sang. Le troisième objectif sera d’évaluer les concentrations dans le cerveau des trois molécules d'intérêts à la fin du projet. Enfin, le quatrième objectif sera d’évaluer le profil général de sécurité des molécules d'intérêts testées. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une molécule permettant le passage de médicaments directement dans le système nerveux central via une simple administration intraveineuse. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse (sédation en cas de besoin). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre chaque administration. Treize prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Deux prélèvements de liquide cérébrospinal par animal seront réalisés sur 3 animaux (sous anesthésie générale et analgésie). La chirurgie durera environ 1 heure (anesthésie et réveil compris) Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’environ 5 semaines entre les deux prélèvements. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront tout de même accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. D’après des études préliminaires réalisées sur le primate, nous n’attendons pas d’effet indésirable lié à l’élément d’essai sur ce projet. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de liquide cérébrospinal pourront provoquer des réactions locales au niveau des sites de ponction, une infection post-opératoire et/ou une réaction systémique de type fièvre. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort liés la mise à jeun, à l'induction et au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Enfin, le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) pourra provoquer un stress léger sur une courte période.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 12 primates réparties en 4 lots de 3. 4 lots car nous testons trois molécules différentes (une molécule par lot) et un lot contrôle en plus pour pouvoir comparer les résultats selon une base. Le fait d'avoir 3 animaux par lot permet d'avoir plus d'assurance en cas de résultats variables au sein d'un groupe. En effet, des résultats divergeant sur deux animaux sont difficiles à interpréter, trois animaux par groupe est donc le plus petit nombre possible qui permet cette approche de détermination égalitaire des résultats.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement.Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (exemple : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises (exemple : céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces molécules d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.