Macaques à longue queue

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux PET-scans de deux heures, une IRM d'une heure trente, quatre ponctions lombaires et trois transports entre deux établissements. Tous les gestes se font sous anesthésie générale, avec le risque d'hypothermie et de dépression cardiorespiratoire que le porteur signale. Les ponctions de liquide céphalorachidien peuvent provoquer des fuites, des maux de tête, des vomissements et des signes neurologiques. La thérapie génique testée a déjà été validée chez quatre modèles de souris et le passage par le primate est décrit comme une étape réglementaire exigée par l'ANSM, les trois macaques étant tués à la fin pour prélever leurs organes, l'essai chez des patients restant à ce stade une perspective.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones. De nos jours, il n’existe aucun traitement efficace. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la maladie. Notre approche thérapeutique se base sur la thérapie génique. Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 4 modèles de souris de la pathologie par administration dans une zone précise de cerveau de ces animaux. L’objectif ici consistera d’une part à évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intraveineuse de notre thérapie génique chez le primate non humain (PNH). D’autre part, ce projet a également pour objectif de valider un marqueur d’imagerie comme biomarqueur pour le suivi de l’efficacité thérapeutique. Le suivi de l’effet de notre thérapie génique nécessitera de travailler dans 2 établissements ( établissement 1 et établissement 2) pour l’utilisation d’un appareil d’imagerie spécifique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de la faisabilité et de l’efficacité d’une nouvelle approche de thérapie génique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer ainsi que de valider un marqueur d’imagerie afin de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et ainsi d’amener à une étude clinique chez des patients souffrants de cette pathologie (165000 cas par an en France) mais aussi de valider un biomarqueur de suivi de la pathologie.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale, et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes. Dans l’ établissement 2, les animaux, sous anesthésie générale, réaliseront deux imageries PET-scan à environ 2 mois d’intervalle, qui nécessiteront à chaque fois 1 injection intraveineuse d’une substance faiblement radioactive et un prélèvement de sang (durée par imagerie environ 2h). Dans l’établissement 1, les animaux, au cours de la même anesthésie générale, auront une imagerie par résonance magnétique (environ 1h30), recevront une administration intraveineuse de thérapie génique (environ 10min) et auront une prise de sang et une ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements). Pour le suivi ( établissement 1), les animaux, sous anesthésie générale, auront 3 autres prises de sang et ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements) avec un minimum d’une semaine de repos entre chaque prélèvement. Les animaux réaliseront 3 transports assurés par un transporteur agréé entre les établissements 1 et 2 (durée inférieure à 1h par trajet). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire afin de réaliser le prélèvement des organes d’intérêts pour l’évaluation de notre thérapie génique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection intraveineuse de thérapie génique, pour les prélèvements (sang et liquide céphalorachidien) et pour les examens d’imagerie. Ces anesthésies seront associées à une hypothermie et un risque de dépression cardiorespiratoire. Les animaux ressentiront un stress lié à leur capture en cage à l'induction de l'anesthésie. Les 3 transports de l’animal entre les deux établissements pourront engendrer un stress. De plus en raison de la conformation des cages de l’ établissement 2, une anesthésie brève sera réalisée pour les 2 transports au départ de cet établissement, mais du fait de leur courte durée elles ne présenteront qu’un risque très rare de dépression cardiorespiratoire pour l’animal. Les prélèvements de sang seront associés à un risque d’hématomes et d’induration au niveau de la zone de prélèvement. Les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) seront associés à un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes. Les administrations pour les anesthésies et la prise en charge péri-opératoire (immunosuppresseurs, analgésie...) engendreront un stress, un inconfort et une légère et brève douleur au point d’injection.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélever les organes d’intérêt pour les études histologiques et de biodistribution qui permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de cette thérapie génique comme nouvelle piste thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de notre thérapie ont été évaluées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille facilitant ensuite la translation vers un essai clinique chez l’humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 3 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans une animalerie agréée, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L’observation journalière permettra tout au long du projet de suivre l’atteinte de points limites mis en place dans le projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. L’ensemble des gestes techniques seront faits sous anesthésie et analgésie adaptées. Lors de ces anesthésies nous contrôlerons et maintiendrons les paramètres physiologiques de l’animal. Nous nous assurons ensuite du réveil et de la bonne récupération des animaux. Le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures, par exemple prise de sang et ponction lombaire sont faites au sein de la même anesthésie générale. Les animaux auront un temps de récupération de minimum 1 semaine entre chaque session de prélèvement, et nous respecterons les volumes de prélèvement maximaux recommandés pour l’espèce (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal). Ce projet se déroulera dans deux établissements, afin de minimiser le stress induit par les changements d’établissement utilisateur les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée pour chacun des sites. Le transport entre les 2 Etablissements utilisateurs sera assuré par un transporteur agréé et avec un animal vigile. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du primate non humain, en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration de notre thérapie par voie intraveineuse et l’étude de son effet sur un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). Une fois validée chez un modèle de rongeurs, l'injection de notre thérapie génique chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique avant de passer à l’Homme. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-15 ans) (3 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé compte tenu des patients ciblés par notre approche.

Leur accès à l'eau est contrôlé pour qu'ils restent motivés par les tâches à accomplir. Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué : trois seront replacés et trois réutilisés dans d'autres projets. Chacun subit deux interventions chirurgicales de quatre à cinq heures, onze examens d'imagerie cérébrale sous anesthésie générale dont six avec injection directe dans le cerveau, et des séances comportementales quotidiennes d'une heure trente à deux heures pendant quatre à cinq mois. Le projet vise à cartographier les circuits sous-corticaux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, le porteur retenant le macaque comme l'espèce "la plus près de l'être humain".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Six macaques à longue queue subissent chacun deux opérations du crâne de quatre à cinq heures, onze séances d'imagerie sous anesthésie générale et vingt injections directes dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tests comportementaux occupent une heure trente à deux heures par jour pendant quatre à cinq mois, l'accès à la boisson étant contrôlé pour maintenir la motivation des animaux. L'objectif déclaré consiste à cartographier les circuits cérébraux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, puis à mesurer sur ces circuits l'effet d'antidépresseurs et d'anxiolytiques. Trois macaques doivent partir en centre de retraite à l'issue du protocole, les trois autres étant réutilisés dans d'autres procédures, ce que le porteur présente comme une recherche orientée vers les "4R".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Des injections répétées de streptozotocine provoquent chez treize macaques à longue queue des symptômes de maladie d'Alzheimer, après une ou deux chirurgies d'implantation sous anesthésie générale. Ces treize primates vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, pour que soient analysés biochimiquement et anatomiquement les effets d'une illumination du crâne par casque infrarouge. Le porteur liste parmi les nuisances attendues douleurs postopératoires, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection et hallucination temporaire, puis écrit n'attendre "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Il annonce neuf prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien ainsi que "des tests comportementaux", sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 13 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une voir 2 procédures chirurgicales et des injections sous anesthésie générale- de la photobiomodulation extracranienne - 9 prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien - des tests comportementaux

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par l’animal sont liées : -à la chirurgie d’implantation et aux suites post opératoire avec des risques de douleurs post opératoire, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection. Une attention particulière sera apportée dans les premiers jours suivant l’intervention chirurgicale et sera maintenu durant quelques semaines. - aux injections répétées de streptozotocine avec des risques d’infection, œdème, inflammation, hallucination temporaire. Ces injections sont réalisées sous anesthésie générale et leur effet sur le comportement de l’animal sera suivi dans les heures et jours suivants. Afin de réduire le stress lié aux différents actes pratiqués, il y aura une phase de conditionnement positifs sur les actes post-opératoires afin d’assurer leur coopération sur notamment le retrait des points ou les soins de la plaie en vigile. En cas de détection de signe de douleur, de perte de poids ou de signes d’infection, une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres de la SBEA sera mise en œuvre de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

Afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien- être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain pour la pathologie étudiée. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

Gardés en vie pour être réintroduits plus tard dans d'autres protocoles, 50 porcs, 25 macaques à longue queue et 25 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur prélèvent sous anesthésie salive, cellules de joue, sang ou moelle osseuse, cette dernière ponction pouvant provoquer une douleur au point de piqûre et imposant au moins quatre semaines de récupération. Aucune question scientifique propre n'est posée ici. Ces prélèvements alimentent des tests in vitro préalables, destinés à décider si telle ou telle espèce sera utilisée ensuite, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour obtenir ces échantillons.

Objectifs

Cette demande correspond à un autorisation de prélèvements d’échantillons biologiques en dehors et/ou en amont de projet autorisés. Effectivement, il est parfois nécessaire de réaliser en dehors et/ou en amont de protocoles autorisés des prélèvements biologiques de petits ou moyens volumes/quantité (sang, moelle osseuse, salive, cellules buccales par exemple …) pour permettre la réalisation de test in vitro préalable à une étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces prélèvements sont de pouvoir étudier et évaluer in vitro certains paramètres liés à ces espèces. Ces résultats préliminaires établis in vitro en amont des protocoles d’expérimentation animale permettent de définir, de cibler et d’affiner l’intérêt et la rationalité d’utiliser ou non telle ou telle espèce, et potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans une démarche de respect de la règle des 3R.

Procédures

Prélèvements sous anesthésie : salive par aspiration (5 min), prélèvement de cellules de bas-joues par frottement (5 min), de sang (5 min) ou de moelle osseuse (15 min). Prélèvement unitaire suivi d’une période de récupération pour chaque individu.

Impact sur les animaux

Les prélèvements biologiques sont réalisés sous anesthésie de façon à atténuer le stress des animaux. Les prélèvements de salives, cellules buccales et de sang sont des prélèvements peu invasifs qui peuvent induire de l’inconfort. Les prélèvements de sang nécessitent un temps de récupération selon le volume prélevé. Le prélèvement de moelle osseuse peut induire une douleur au point de ponction et sera associée à une analgésie. Il nécessite un temps de récupération d’au moins 4 semaines après le prélèvement.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et pourront être introduits ultérieurement dans un autre projet expérimental dans le cadre d'une procédure légère ou modérée, après décision du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de remplacement possible pour l’obtention d’échantillons biologiques intrinsèques aux animaux pour tests in vitro. Ces prélèvements répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement.

Réduction

Cette autorisation correspond à des besoins ponctuels d’échantillons biologiques chez des animaux en dehors et/ou en amont de protocoles, c’est pourquoi aucune approche statistique n’est envisagée. Cependant les animaux concernés par cette autorisation, en première utilisation ou en réutilisation après un protocole antérieur, seront inclus ultérieurement dans différents projets d’études expérimentales pré-cliniques autorisés, selon décision du vétérinaire, ce qui contribue à une réduction du nombre d’animaux utilisés à moyen terme.

Raffinement

De façon à diminuer le stress et l’inconfort des animaux, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, sur tapis chauffant. Le volume des prélèvements sanguins sera limité à la volémie de chaque individu. Leur fréquence sera limitée au temps de récupération par rapport au volume précédemment prélevé. Cependant, dans la grande majorité des cas, les volumes de sang prélevés seront largement inférieurs aux limites. Le prélèvement de moelle osseuse sera accompagné d’un traitement analgésique. De façon à diminuer les interventions et si les besoins scientifiques de mise au point le nécessitent, plusieurs prélèvements pourront être réalisés en même temps sur un même individu à conditions qu’ils n’altèrent pas la récupération de l’individu. De façon à s'assurer du bien-être des animaux prélevés, les points limites mis en place seront observés et appliqués si besoin. Les primates sont hébergés en volière de façon à respecter leur mode de vie en communauté. Les porcs, selon leur taille, sont hébergés par 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. L’ensemble des animaux sera soumis une surveillance quotidienne.

Choix des espèces

Les prélèvements échantillons biologiques de macaques, babouins et porcs, sont nécessaires à la connaissance de plusieurs paramètres en amont d’évaluation précliniques. Ces animaux présentent des similitudes au niveau anatomique, physiologique, métabolique et immunologique avec l’homme. Il s’agit de jeunes adultes et adultes correspondant aux animaux utilisés dans notre établissement selon l’objectif des projets.

Trois à quatre chirurgies de trois à cinq heures chacune, sur le même animal : 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit d'abord une IRM sous anesthésie, puis les interventions permettant d'implanter des électrodes de stimulation et d'enregistrement dans son cerveau. Il s'agit de cartographier deux populations de neurones du globus pallidus externe, dont la connectivité reste mal connue. Les six animaux sont ensuite tués sous anesthésie profonde, leur cerveau retiré du crâne et congelé, seule façon selon le porteur de localiser les sites d'enregistrement.

Objectifs

Le globus pallidus externe est une structure cérébrale qui joue un rôle central dans le contrôle de nos comportements. Son fonctionnement est également perturbé dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques. Longtemps, on a pensé que cette région du cerveau ne contenait qu’un seul type de neurones. Cependant, des recherches récentes menées chez les rongeurs, les primates non humains et même chez l’humain ont révélé la présence de deux catégories distinctes de neurones. Malgré cela, leur connectivité (c’est-à-dire les zones du cerveau auxquelles chaque type de neurone envoie des signaux), leur rôle dans les fonctions cérébrales, et l’impact potentiel de leur dysfonctionnement restent encore à determiner. Pour y parvenir, nous allons donc stimuler différentes zones du cerveau et observer comment ces stimulations influencent l’activité des deux types de neurones chez des singes anesthésiés. Ce projet se deroulera sur 2EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les connexions dans le cerveau de deux populations de neurones distinctes qui composent une région cérébrale essentielle dans le contrôle de nos comportements et dont le dysfonctionnement est mis en cause dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques humaines. L'étude de cette connectivité anatomique chez les primates non humains revêt donc une importance translationnelle significative. En effet, les primates non humains disposent d'un large éventail de comportements, proches de ceux de l'homme, et leur cerveaux présente une organisation similaire à celle de l'humain. Cela permettra donc d'étendre les conclusions de cette recherche à l'homme et participer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrants d'un dysfonctionnement de cette région du cerveau.

Procédures

Chaque animal subira une imagerie par résonnance magnétique pour obtenir une image morphologique en 3 dimension du cerveau (15min de transport et 60min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à 3 à 4 chirurgies d'une durée de 3 à 5h chacune. Chaque chirurgie permettra l’enregistrement de l’activité neuronale (quelques minutes) durant la procédure de stimulation cérébrale, c'est-à-dire durant l’application impulsions électriques monophasiques uniques de faible intensités, sans danger pour l’animal (durée de 0.1-0.3 ms, intensité de 0.05-0.5 mA) à des fréquences de 0.1-1Hz

Impact sur les animaux

Au cours de la procédure d'imagerie par résonnance magnétique, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. De plus, des douleurs/infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales pour le placement des électrodes d'enregistrement et de stimulation.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet à pour but de caractériser l'anatomie/connectivité d'une structure du cerveau qui contrôle nos comportements et qui dysfonctionne dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et de faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à normaliser son activité chez des patients souffrant de son dysfonctionnement. De ce fait, le recours au PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) est nécessaire.

Réduction

Pour mener notre étude, nous avons réduit au minimum le nombre d'animaux utilisés en planifiant soigneusement et en maximisant les données recueillies pour chaque animal. Comme nous ne disposons pas de données préalables dans la littérature pour déterminer précisément la taille de l'échantillon, nous avons choisi une méthode statistique qui recommande un échantillon de 5 à 10 animaux pour garantir des résultats fiables, et nous avons décidé d'utiliser six animaux. Ce petit nombre est suffisant pour des tests statistiques valides dans notre domaine, où les études sur les primates non humains utilisent souvent 3 à 5 animaux à cause de leur complexité.

Raffinement

Les singes seront hébergés dans des conditions standard (cycle lumière/obscurité de 12h avec lumière allumée de 7h00 à 19h00, ~ 60% d'humidité et ~ 22°C). Les animaux seront hébergés en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique, fourrage). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à proximité de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Durant le transport et l'acquisition de l'imagerie par résonnance magnétique (15min de transport + 60min de procédure), les constantes physiologiques de l'animal seront contrôlées à l'aide d'un oxymètre. La chirurgie sera réalisée de façon stérile et sous anesthésie profonde à l'isoflurane/oxygène, après une induction à la kétamine. Une couverture antalgique avec de la Buprénorphine en préopératoire et du Metacam en postopératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Nous administrons un anesthésique local avant incision. Une sonde sera insérée dans le rectum des animaux pour contrôler la température. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. La perte de poids, la déshydratation, la perte de poils et/ou un repli sur soi inhabituel entraineront une surveillance accrue de l'animal et les mesures nécessaires seront prises de concert avec le vétérinaire. Si la situation ne se normalise pas, l'animal sortira immédiatement du protocole.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertebrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation corticale et un réseau des ganglions de la base semblables à celle de l'homme. Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur des animaux de plus de 36 mois, âge où leur système nerveux central est mature. Cela garantit une meilleure comparaison des résultats avec les caractéristiques observées chez l'adulte humain.

Neuf séances d'imagerie sous anesthésie générale, la tête maintenue dans un cadre par les oreilles, précédées chacune d'une mise à jeun la veille, et trois ponctions de liquide céphalorachidien. 15 macaques à longue queue vont subir cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après qu'un syndrome parkinsonien leur a été provoqué par une vingtaine d'injections hebdomadaires d'un neurotoxique. Le RNT qualifie l'imagerie de "non-invasive et indolore" et limite la durée sous anesthésie à deux heures, quand la description des procédures annonce trois heures au maximum. Tous les macaques seront tués à la fin de l'étude pour comparer les mesures non invasives à des dosages dans les tissus, le porteur présentant le don de leurs tissus comme une façon de "valoriser l'animal".

Objectifs

La créatine (Cr) est une molécule qui, dans le cerveau, permet aux cellules de se constituer une réserve d'énergie. Elle circule dans le sang et rentre dans le cerveau via le transporteur de la créatine (CRTR). Le déficit de ce transporteur est responsable d’une maladie neurologique rare : en entrainant une absence de Cr et donc un déficit énergétique au niveau cérébral, il conduit à des retards mentaux sévères, un syndrome autistique et des crises d’épilepsie chez les enfants. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. La supplémentation en Cr a été évaluée mais le traitement ne peut pas entrer dans le cerveau . On a développé une Cr modifiée (appelée « molécule test »)) pour le traitement des maladies neurologiques avec un déficit énergétique. Evaluée sur un modèle murin de la maladie liée au déficit de CRTR,, « molécule test » sous forme de microémulsion a permis l’amélioration des fonctions cognitives ainsi qu’une restauration des niveaux de Cr dans le cerveau. Afin d’envisagerun essai clinique de phase 1, il est important de mettre en place au préalable des outils non invasifs de suivi et de poursuivre ces expériences dans des modèles d’étude précliniques plus pertinents. De plus, dans la perspective de généraliser ce traitement à d’autres maladies neurologiques qui présentent des déficits énergétiques, des essais sur des modèles murins de la maladie de Parkinson montrent un effet thérapeutique significatif après un mois d’administration intra-nasale. En effet, la Cr est non seulement une importante source d'énergie pour les cellules, mais possède également des propriétés anti-oxydantes directes. Elle empêche la mort cellulaire en aidant au maintien de l'intégrité des mitochondries, les organites de respiration des cellules. Les déficits de fonctionnement des mitochondries et la génération d’espèces oxydatives sont des causes connues de mort cellulaire dans la maladie de Parkinson. En nous appuyant sur ces premiers résultats, et sur des données déjà acquises chez le modèle primate sain, l’objectif de notre étude est d’évaluer sur un modèle primate de la maladie de Parkinson l’efficacité thérapeutique de la « molécule test »contre cette maladie et de valider les biomarqueurs pertinents qui permettraient de suivre l’efficacité de ce traitement avec des outils non invasifs tels que l’imagerie cérébrale .

Bénéfices attendus

Il existe un besoin de traitement efficace contre les dysfonctionnements mitochondriaux bien établis dans la maladie de Parkinson. Aujourd’hui, aucun traitement n’est disponible, en particulier à cause de la difficulté de pénétrer dans le cerveau en passant la barrière hématoencéphalique. La « molécule test », capable de rentrer dans le cerveau, pourrait relever ce défi. ralentissant ou arrêtant les dysfonctionnements mitochondriaux des neurones afin d’éviter leur mort et ainsi d'entraver la progression de la maladie de Parkinson. Notre approche originale de l’administration de la « molécule test » grâce à un spray intra-nasale vise ainsi à améliorer les symptômes moteurs et la cognition des patients atteints de la maladie avec une approche peu invasive. Au-delà de fournir un nouveau traitement, le développement et la validation des techniques d’imagerie non invasive proposées aura des applications directes en clinique. Ceci permettra de mesurer directement in vivo le taux de la créatine présente, un biomarqueur essentiel dans le suivi des patients qui subiront ce type de traitement.

Procédures

Tous les primates subiront 9 examens d’imagerie non invasive sous anesthésie générale de 3h max. Trois prélèvements de sang et liquide céphalorachidien (LCR) seront faits sur tous les animaux sous anesthésie générale (30min). La maladie de Parkinson sera induite chez tous les animaux par injection intramusculaire chronique hebdomadaire d’une molécule chimique, utilisée depuis 40 ans en milieu scientifique. Le nombre d’injections est animal dépendante et variable mais inférieur à 20 et la durée du geste est de 2 minutes. L’évolution de la maladie chez les animaux sera évaluée à l’aide d’une échelle clinique (observation simple) basée sur la motricité pour ajuster le régime d’injections et atteindre des symptômes parkinsoniens modérés. Les primates seront également filmés une fois par semaine pendant 3 mois au maximum et les vidéos de 30 minutes seront analysés pour quantifier la distance totale parcourue et la vitesse de déplacement.. Une fois le modèle stable, le traitement avec la « molécule test » ou son solvant comme contrôle lui sera administré par spray intranasale une fois par jour, 5 jours par semaine pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont pris en compte à l’égard des point limites. La durée des examens sous anesthésie est limitée à 2h pour minimiser tout inconfort et le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaids). L’irritation locale au niveau des oreilles, pour maintenir la tête dans un cadre, est possible. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient minimiser les nuisances pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération causée par les mises à jeun répétées et de compenser avec un supplément de nourriture avant d’arriver aux points limites si besoin. L’induction du modèle parkinsonien demande des injections intramusculaires qui, selon l’expérience de notre laboratoire, ne sont pas irritantes localement. Une alternance droite-gauche sera quand même mise en place pour réduire l’inconfort. L’induction du syndrome parkinsonien peut donner lieu à un manque d’appétit et de soif transitoire et une prise en charge pour le soutien alimentaire des animaux au quotidien (plusieurs fois par jour) sera faite . L’administration intranasale du produit est rapide et indolore mais demande une contention qui pourrait être stressante pour les animaux. Une accoutumance à la contention et à l’interaction avec les intervenant formés à réaliser ce geste sera effectuée au préalable. Le produit et la voie intranasale ont déjà été testés chez le primate sain et n’ont pas donné lieu à des irritations des muqueuses nasales, mais la dilution du produit et sa fréquence d’administration seront adaptés si besoin. Si nécessaire, les administrations intra-nasales se feront sur l’animal sédaté très légèrement en vue de la proximité de la bouche et du risque pour le manipulateur. L’hébergement individuel lors des mises à jeun ou des intoxications pourrait être une source de stress pour les animaux qui sera réduit au maximum, avec des mises en groupe temporaires et hors repas.

Devenir

A la fin de l’étude, les modèles animaux seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse des mesures non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans les tissus, impossibles à pratiquer chez le patient. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction du nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet. En effet, aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui d’évaluer l’’utilisation de la voie nasale pour cibler directement le cerveau (voie « nose-to-brain ») via les nerfs olfactifs et trijumeaux. Seul un modèle animal permet de tenir compte des interactions structurelles et fonctionnelles de ces nerfs et cellules, et ainsi de valider une voie d’administration du traitement originale et peu contraignante pour les patients ainsi qu’un biomarqueur d’imagerie in vivo. Les animaux étudiés dans le cadre de ce projet proviendront d’élevages reconnus.

Réduction

Un total de 15 primates est prévu dans ce projet pour tester l’efficacité de la « molécule test » contre les dysfonctionnements métaboliques connus dans un modèle primate de la maladie de Parkinson. Les groupes expérimentaux permettront de comparer 4 animaux modérément parkinsoniens traités avec cette molécule thérapeutique, ou avec son solvant (n=4) et un groupe contrôle (n=4). Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même modèle animal qui ont démontré une efficacité thérapeutique robuste et donné lieu à des essais cliniques en utilisant les mêmes outils d’imagerie et étude comportementale. Le suivi longitudinal/répété chez le même individu par des méthodes d’évaluation non-invasives, comme le comportement et l’imagerie, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives dans le temps entre les groupes.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse les animaux l arriveront au moins un mois avant le début de l’étude. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. En lien avec ces procédures d’imagerie, certains point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus très rarement observée dans notre laboratoire. Les paramètres physiologiques (rythme cardiaque, pression artérielle, fréquence respiratoire) sont utilisés pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Le maintien de la température corporelle est assuré par une couverture chauffante avec rétrocontrôle (sonde rectale). Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. La durée de l’hébergement individuel sera limitée aux mises à jeun pour les séances d’imagerie et l’induction du syndrome parkinsonien, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurels (balançoire, miroir); alimentaires (fruits, graines dans le fourrage); manipulables (jouets); auditifs (musique). En effet, en préparation à toute manipulation pour le nursing lors de l’induction du parkinsonisme et des administration intra-nasales, un contact quotidien positif sera établi à travers la distribution de friandises à la main et entrainement à boire à la seringue. Les injections intramusculaires pour l’induction du modèle de Parkinson sont réalisées à l’aide de seringues de type « insuline » avec une aiguille très fine pour réduire l’inconfort locale liée à des injections répétées et en alternant les sites d’injection (droite-gauche). Le nombre totale d’injections pour générer un modèle modéré de la maladie de Parkinson ne devrait pas dépasser 30 piqûres sur 7-10 jours consécutifs, puis une injection hebdomadaire. Une échelle d’observation des symptômes sera utilisée au quotidien pendant la période d’induction du modèle pour ajuster le rythme des injections. Les administrations intra-nasales sont rapides et indolores mais une accoutumance à ce mode d’administration du produit sera également mise en place après acclimatation et avant l’initiation de l’étude.

Choix des espèces

Les primates non humains possèdent une architecture cérébrale semblable à celle de l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux sillons cérébraux et circonvolutions. De plus, leur métabolisme est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. La maladie de Parkinson et les déficits métaboliques qui entrainent une mort neuronale se produisent chez le patient adulte et les animaux recrutés pour l’étude seront également au stade adulte. Sans compter que la maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine ainsi que la génération du modèle parkinsonien chez le macaque juvénile est difficile en vue de sa plasticité. Adulte (développement du cerveau achevé) entre 4 et 9 ans. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine et la génération du modèle parkinsonien chez le macaque juvénile est difficile en vue de la plasticité extrême du système nerveux central.

Seuls les macaques crabiers ont montré une réactivité croisée avec l'anticorps testé lors des essais in vitro, ce qui écarte souris, rats, lapins et chiens. Quatre d'entre eux, jeunes adultes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection intraveineuse lente de quinze minutes sur chaise de contention, puis huit prélèvements sanguins et huit mesures du temps de saignement par micro-incision de la peau, étalés sur un mois, avec des contentions de trois à vingt-cinq minutes. Aucune mise à mort n'est prévue et tous sont gardés en vie à la fin du projet sur avis vétérinaire, en vue d'une réutilisation.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir d’un anticorps bispécifique (ciblant deux protéines sur les plaquettes) à deux doses différentes chez le singe cynomolgus dans le cadre du développement d’un traitement contre les maladies thrombo-inflammatoires chez l’Homme. Ce projet permettra d’établir le profil pharmacocinétique du candidat médicament et ses relations dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Les données qui seront extraites de ce projet vont également permettre d’évaluer la capacité de l’anticorps à inhiber l’activation plaquettaire tout en préservant une coagulation normale et donc d’obtenir des informations sur sa sécurité. Ce projet ouvrira la voie à des tests cliniques (sur patients humains), offrant l’espoir d’une nouvelle option de traitement pour les maladies causées par une coagulation et une inflammation anormales. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat-médicament. Des prélèvements de sang ainsi que des mesures du temps de saignement seront réalisés à différents délais avant et après administration de la molécule test. Différents paramètres physiologiques seront également suivis (ex : température corporelle, poids, état général). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de déterminer la dose toxique. C’est pourquoi, les deux doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques (d’après des études préliminaires in vitro réalisées sur la même molécule et in vivo sur un anticorps similaire utilisant la même voie d’action et la même cible). Enfin, aucune mise à mort n’est prévue pour raison scientifique dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

La thrombose artérielle est un trouble courant chez l’Homme qui est généralement causé par l'érosion ou la rupture d'une plaque d'athérosclérose (dépôt lipidique dans les vaisseaux sanguins) pouvant provoquer des lésions ischémiques. Lorsque qu’une plaque se rompt et provoque une occlusion dans les artères coronaires ou cérébrales, elle peut entraîner respectivement un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral (accidents vasculaires représentants les principales causes de décès dans le monde). Plusieurs médicaments sont maintenant disponibles pour traiter la thrombose artérielle. Cependant, ces médicaments ciblent des mécanismes communs à la thrombose et à l'hémostase. Leur utilisation entraîne donc un risque accru de complications hémorragiques non contrôlées en parallèle de leur efficacité antithrombotique. Dans ce contexte, il existe une réelle nécessité de développer de nouveaux traitements sûrs et efficaces sans effets secondaires systémiques tels que l'hémorragie. D’après différentes études réalisées in vitro, le candidat médicament (anticorps) testé dans le cadre de ce projet semble avoir le potentiel de fournir une activité immunomodulatrice ciblée avec un profil de sécurité très encourageant pour traiter de manière efficace ce type de maladies thrombo-inflammatoires. En effet, des données publiée sur un anticorps similaire ont montrées que le mode d’action utilisé était efficace et sûr chez les primates et chez l’Homme. En outre, cet anticorps similaire a démontré un excellent profil de sécurité, à la fois chez des volontaires humains sains et chez des patients souffrant d’un accident vasculaire cérébral ischémique aigu, renforçant ainsi le potentiel thérapeutique de ce type d’anticorps. Des tests préliminaires in vitro réalisés sur du sang humain et de singes ont déjà montré des résultats prometteurs pour l’anticorps testé, confirmant son efficacité sans nuire aux cellules sanguines. Les bénéfices attendus du projet sont donc, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps bispécifique utilisé comme thérapie ciblée, efficace et sûre contre les maladies thrombo-inflammatoires. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront notamment de sélectionner la dose à privilégier pour de futures études précliniques et cliniques.

Procédures

DDeux groupes de deux animaux seront inclus dans ce projet : Groupe 1 anticorps à 1mg/kg et groupe 2 anticorps à 5mg/kg. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. À l’issue de cette période, les animaux feront l’objet d’un examen vétérinaire qui permettra de déterminer l’état de santé général des animaux avant l’administration de l’anticorps. Deux prélèvements de sang ainsi que deux mesures du temps de saignement (temps nécessaire à l’arrêt spontané d’un saignement après réalisation d’une micro-incision de la peau) seront réalisés avant l’administration du candidat médicament. Les animaux recevront la molécule test par injection intra-veineuse lente de 15 minutes (temps de contention sur chaise d’environ 25 minutes). Ensuite, 6 prélèvements de sang et 6 mesures du temps de saignement seront réalisés à différent délais post-administration (prélèvements étalés sur une durée d’un mois) afin d'étudier le profil pharmacocinétique, l’effet de la molécule dans le temps et sa capacité à moduler l'activation plaquettaire tout en préservant la coagulation. Les mesures du temps de saignement impliquent une contention sur chaise à contention durant environ 15minutes. Les prises de sang nécessitent une contention de 3 à 15 minutes (contention manuelle ou sur chaise à contention au besoin). Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Les administrations intra-veineuses peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses ou des hématomes. Les prélèvements sanguins et les mesures du temps de saignement pourront provoquer un stress léger, une douleur légère, un saignement local mineur et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées ainsi que les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie (selon avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur).

Remplacement

Les études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de sécurité précliniques in vivo sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. Ce projet permettra de déterminer, entre autres, la concentration plasmatique dans le temps de l'anticorps, sa relation dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 groupes de 2 animaux ont été constitués, soit 4 animaux au total. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables. Les deux groupes permettront d’étudier les effets de l’anticorps testé à deux concentrations différentes. Le nombre de groupe ne peut donc pas être réduit d’avantage. Le nombre d’animaux par groupe a été limité à 2. Ce nombre permettra de détecter une tendance dans le groupe. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux seront hébergés en groupes sociaux. Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra: 1) Des enrichissements structuraux ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’anticorps étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. Cet anticorps a pour cible deux protéines spécifiques modulant l’activité plaquettaire. Or, au cours d’études préliminaires in vitro, seuls les singes cynomolgus ont démontré une réactivité croisée avec l’anticorps testé. L’absence de réactivité croisée chez la souris, les rats, les lapins et les chiens exclue donc l’utilisation de ces espèces dans ce cadre de ce projet. La proximité phylogénétique et physiologique entre les macaques et l'Homme, notamment concernant l’organisation de leur système immunitaire explique ces résultats. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système cardiovasculaire, il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Six macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à la fin du projet pour une étude post-mortem du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation pouvant durer six heures, des injections répétées de neurotoxine sur quatre mois qui les rendent parkinsoniens, un isolement de 72 heures après chaque injection, une tâche de vigilance de deux heures trois jours par semaine et des tests de latence d'endormissement de trois heures répétés au moins dix fois par condition. Un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place pour maintenir leur motivation. La luminothérapie ayant déjà été publiée chez la souris et le rat, avec des essais cliniques en cours, le porteur affirme qu'une étude chez le primate non humain reste "nécessaire" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude dans le temps et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.