Macaques à longue queue

Gardés en vie à la fin du projet après examen vétérinaire, neuf macaques crabiers vont être réutilisés dans d'autres protocoles. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison d'une injection, seize prélèvements sanguins, quatorze échographies et deux biopsies cutanées par animal sur cinq semaines, chaque intervention se déroulant sous anesthésie générale. L'objet est de mettre au point une forme sous-cutanée d'un anticancéreux du sein aujourd'hui administré par voie intraveineuse, avec pour bénéfice annoncé le confort des patientes. Aucune alternative au "model primate non-humain" n'existe selon le porteur, les rongeurs ne permettant pas d'injecter un volume comparable à celui utilisé chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer du sein est une maladie qui touche de nombreuses femmes, une sur huit sera confrontée à cette maladie au cours de sa vie. Seules 20 à 30 % des cas, peuvent bénéficier d’un traitement par un anticorps commercialisé sous le nom d’Herceptin®. Il a transformé la maladie cancéreuse aiguë en maladie chronique pour une majorité de patiente. Depuis 2013, une nouvelle voie d’administration, la voie sous-cutanée a été autorisée par la Commission de l’Union européenne pour le traitement de ce type de cancer. Cette nouvelle voie est très prometteuse en termes de confort pour la patiente et de gain de temps pour le personnel hospitalier. Un nouveau traitement est actuellement proposé associant le même anticorps à un agent cytotoxique (T-DM1) en administration par voie intra-veineuse uniquement. Dans ce projet, nous proposons de développer une formulation sous-cutanée pour la diffusion progressive du T-DM1 (en l’associant à un hydrogel), améliorant grandement le confort des patientes tout en conservant la même efficacité. Dans ce projet, 9 macaques cynomolgus seront utilisés et répartis en 3 groupes.

Bénéfices attendus

Si ce projet démontre que l’utilisation de cette nouvelle formulation administrée par voie sous-cutannée est équivalente à l’utilisation du médicament administré par voie iv, cela permettra aux patients atteints d’une forme spécifique de cancer du sein de bénéficier d’un meilleur confort de traitement..

Procédures

Les gestes réalisés sur chaque animal (sous anesthésie générale) seront : - 1 injection - 16 prélèvements sanguins – 14 échographies (en même temps que certains prélèvements) sur 5 semaines - 2 biopsies cutanée. Chaque intervention durera de 10 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement) et d’une biopsie (plaies en cicatrisation). L’injection du traitement pourrait entraîner une possible inflammation au site d’injection. En accord avec la littérature, le traitement testé ne provoque pas d’effet secondaires majeurs à cette dose.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier qu’ils ont recouvré leur état de santé en fin de protocole.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative au model primate non-humain pour cette expérimentation. Les modèles rongeurs utilisés précédemment ont montré la non-toxicité de l’élément d’essai mais ne permettent pas d’injecter un volume suffisant similaire à celui utilisé chez l’Homme et permettant d’étudier la biodégradation du gel. Il en est de même avec les modèles sous-cutanés de peau humain ne permettant pas l’injection d’un volume suffisant pour valider la biodégradation du gel. De plus, les primates non-humains possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés a été réduit à son maximum pour répondre aux questions posées. Compte-tenu de l’apport des études préliminaires réalisées sur le modèle rongeurs, 3 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir les données de pharmacocinétique, de biodégradation et évaluer la réponse inflammatoire (au niveau du site d’injection) et au niveau global (dans la circulation sanguine). Ce projet représente une phase préliminaire aux études réglementaires utilisant un effectif plus important.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme de socialisation et d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et seront sous couverture analgésique pour les biopsies - Des points limites ont été définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance des animaux, évaluée grâce à une grille de scoring

Choix des espèces

Dans ce projet, des macaques cynomolgus seront utilisés, car ils présentent une similarité du récepteur FcRN qui permet une comparaison des pharmacocinétiques avec l’humain. De plus, de par leur taille/poids, ils sont plus adaptés que les modèles rongeurs pour des volumes d’injections >1mL ainsi que pour les prises de sang longitudinales. Actuellement c’est la seule espèce de primates de cette taille disponible. Ce projet ne justifie pas d’utilisation d’animaux d’un stade de développement particulier. Néanmoins, les animaux seront âgés de plus de 18mois (animaux juvéniles ou adultes).

Aucun des six macaques à longue queue de ce projet ne sera tué à l'issue, le porteur prévoyant de les transférer vers d'autres études sans retirer chirurgicalement le matériel implanté. Ils vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré, avec des injections intramusculaires d'aripiprazole par périodes de deux semaines sur quatre mois, quinze scans d'imagerie cérébrale sous anesthésie répartis sur plus d'un an, l'implantation par vis en titane d'un plot de tête et d'une chambre d'enregistrement ouvrant sur une craniotomie de 10 mm sur 10, puis trente injections intracérébrales hebdomadaires sur huit mois. Le porteur reconnaît un risque d'infection lié à la chambre et des lésions cérébrales à prévoir avec la répétition des pénétrations d'électrode, tout en jugeant une lésion débilitante "extrêmement rare". Le maintien en vie s'explique par la valeur acquise par ces animaux, entraînés à réaliser des tâches cognitives sur écran tactile et donc réutilisables pour des approches invasives.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.

Sur 304 macaques crabiers utilisés dans ce projet, 116 seront transférés vers d'autres projets après accord du vétérinaire et 188 tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit de une à quinze administrations d'un candidat médicament, subit jusqu'à neuf prélèvements sanguins par semaine, des prises de température rectale, une télémétrie sur vingt-quatre heures et un examen ophtalmologique sous anesthésie. Le nombre d'animaux, de un à trois par sexe et par dose, ne repose sur aucun calcul statistique. Le porteur conclut qu'il est "indispensable" de passer par une espèce non-rongeur avant la première administration chez l'humain.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif principal de la Recherche Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules à visées thérapeutiques qui seront évaluées durant des essais cliniques. Pour cela, un profil de sécurité de ces nouvelles molécules doit être établi conformément à la réglementation. Les études préliminaires vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique et ne sont réalisées que sur des molécules testées au préalable sur les méthodes alternatives disponibles. Ces études préliminaires sont généralement de courte durée (entre 1 jour et 2 semaines, peuvent exceptionnellement aller jusqu’à 4 semaines dans le cas de molécule de type biologique) et utilisent un nombre restreint d’animaux. Leur objectif est d’identifier le profil cinétique, les potentiels effets secondaires et de cibler la gamme de doses à tester dans les futures études réglementaires. La conception de ces études est optimisée de manière à obtenir un maximum d’informations pour rendre plus efficace l’utilisation de ces animaux. En effet, en fonction des données disponibles du médicament, les examens pourront inclure certains paramètres cliniques (suivi du comportement, de la température, du poids, de la consommation alimentaire), hématologiques, biochimiques et cinétiques nécessitant des prises de sang ou encore histopathologiques par autopsie. Ces analyses seront adaptées à la molécule étudiée et à la pathologie concernée. Les études réalisées dans ce cadre ont pour but d’aider à choisir les doses pour les études réglementaires précliniques et, à terme, permettre de sécuriser la première administration du candidat médicament chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, différents médicaments (molécule chimique ou biologique, thérapie génique, anticorps) pourront être testés en fonction des études réglementaires à réaliser.. Cela pourra inclure l'évaluation de médicaments avec une indication en cardiologie, en oncologie, en neuropsychiatrie ou pour le traitement de pathologies métaboliques et maladies auto-immunes. Liste des études concernées - Etudes précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus - Etudes précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque cynomolgus - Evaluation du profil toxicologique et toxicocinétique chez le macaque cynomolgus

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement la toxicité éventuelle de candidats-médicaments en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal). Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients.

Procédures

Les études incluses dans ce projet ont une durée de 1j à 4 semaines selon le mode d’administration prévu chez l’humain. Les voies d’administrations (orale ou parentérale) sont celles prévues chez l’Homme. Des examens réguliers seront faits à l’aide de matériel adapté à l’espèce et incluent : observations cliniques, prise de température corporelle (mesure rectale), prélèvements de sang pour vérifier les paramètres hémato-biochimiques et vérifier le passage du médicament dans le sang, examen cardiologique (ECG ou mesure de pression artérielle généralement par télémétrie non invasive sur 24h maximum), collecte d’urines sur 24h maximum (via des entonnoirs placés sous les unités d’hébergement), examen ophtalmologique (sous anesthésie, technique non invasive, en début et en fin d’étude : 30minutes maximum/examen ). Administration des traitements : voie IV (de quelques secondes à 30 minutes si perfusion) et PO (moins d’une minute) et sous-cutané (moins d’une minute); en fonction de la procédure, 1 à 15 administrations max Prélèvements sanguins : durée du prélèvement (moins de cinq minutes) 9 temps maximum sur plusieurs jours par semaine en fonction du type de candidat médicament (exemple : anticorps). Le volume total prélevé par semaine ne dépassera jamais à 7.5 % du volume total circulant

Impact sur les animaux

En fonction de la classe des produits et de la dose, on pourrait s’attendre à avoir, comme mentionné dans notre grille des points limites, des changements ou modifications de l’apparence (ex : absence de toilettage), du rythme respiratoire, de la consommation alimentaire et hydrique, de la température corporelle, de l’activité comportementale, des fonctions digestives et poids corporel. On s’assurera que la somme des observations ne dépassera le degré de sévérité mentionné dans chacune des procédures en mettant des actions correctives avec le support du vétérinaire du centre.

Devenir

L’euthanasie des animaux est envisagée pour effectuer des prélèvements d’organes et analyse histologique/biochimique post-mortem des tissus. Les autres animaux gardés en vie pourront être réutilisés dans d’autres projets après accord du vétérinaire 304 animaux au total dont 116 réutilisés et 188 euthanasiés.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux pour définir les marges « sécurité » d’un candidat-médicament. Il est indispensable de passer sur une espèce non-rongeur pour sécuriser le passage d’un composé en développement clinique (demande réglementaire).

Réduction

Pour ces études, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Il n’y a pas d’études statistiques utilisées dans ce cas. Le nombre d’animaux est classiquement défini pour répondre à l’objectif de ces études.

Raffinement

Dans les études de sécurité non clinique, il est rarement fait usage de médicaments qui risquent d’interférer avec le produit à étudier et on s’appuie sur les fiches de point-limite pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, euthanasie de l’animal etc…). Cependant, ponctuellement, le vétérinaire peut intervenir et décider de la mise en place de soins spécifiques (adaptés à l’observation notée). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie suite à l’administration d’un traitement) et mettre en place des techniques de raffinement telles que l’habituation par renforcement positifs (training) Une grille de points limite est employée afin de limiter la souffrance inutile de l’animal en permettant de mettre des actions correctives.Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de sécurité non-clinique n’ayant pas pour but de d’étudier un modèle de pathologie ni un effet thérapeutique mais de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicament chez l’Homme, des PNH sains peuvent être sélectionnés à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proche de l’humain en considérant la totalité des paramètres listés ci-dessous : - Pharmaco et toxicocinétique : exposition plasmatique au médicament, élimination, fraction libre du médicament … - Métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits - Pharmacodynamie : homologie, présence, affinité et répartition de la cible pharmacologique - Physiologique : le PNH ne doit pas présenter de réactions physiologiques spécifiques non pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme (ex : pH gastrique). - Techniques expérimentales : formulation et excipients tolérés, voie d’administration possible - Expérience des médicaments compétiteurs de la même catégorie. Les animaux utilisés dans ce projet seront de jeunes adultes ou adultes, conformément aux requis réglementaires.

Trois à quatre chirurgies de trois à cinq heures chacune, plus une heure d'IRM sous anesthésie : 6 macaques à longue queue de plus de trois ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur cerveau soit retiré du crâne et congelé. Le porteur signale des douleurs et des infections possibles après la pose des électrodes, et des troubles respiratoires ou cardiaques liés aux anesthésies répétées. Il qualifie les impulsions électriques envoyées dans le cerveau de "sans danger pour l'animal". Le macaque est retenu pour la ressemblance de son cortex et de ses ganglions de la base avec ceux de l'humain, et le porteur indique avoir choisi six individus faute de données antérieures permettant de calculer un effectif.

Objectifs

Le globus pallidus externe est une structure cérébrale qui joue un rôle central dans le contrôle de nos comportements. Son fonctionnement est également perturbé dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques. Longtemps, on a pensé que cette région du cerveau ne contenait qu’un seul type de neurones. Cependant, des recherches récentes menées chez les rongeurs, les primates non humains et même chez l’humain ont révélé la présence de deux catégories distinctes de neurones. Malgré cela, leur connectivité (c’est-à-dire les zones du cerveau auxquelles chaque type de neurone envoie des signaux), leur rôle dans les fonctions cérébrales, et l’impact potentiel de leur dysfonctionnement restent encore à determiner. Pour y parvenir, nous allons donc stimuler différentes zones du cerveau et observer comment ces stimulations influencent l’activité des deux types de neurones chez des singes anesthésiés. Ce projet se deroulera sur 2EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les connexions dans le cerveau de deux populations de neurones distinctes qui composent une région cérébrale essentielle dans le contrôle de nos comportements et dont le dysfonctionnement est mis en cause dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques humaines. L'étude de cette connectivité anatomique chez les primates non humains revêt donc une importance translationnelle significative. En effet, les primates non humains disposent d'un large éventail de comportements, proches de ceux de l'homme, et leur cerveaux présente une organisation similaire à celle de l'humain. Cela permettra donc d'étendre les conclusions de cette recherche à l'homme et participer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrants d'un dysfonctionnement de cette région du cerveau.

Procédures

Chaque animal subira une imagerie par résonnance magnétique pour obtenir une image morphologique en 3 dimension du cerveau (15min de transport et 60min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à 3 à 4 chirurgies d'une durée de 3 à 5h chacune. Chaque chirurgie permettra l’enregistrement de l’activité neuronale (quelques minutes) durant la procédure de stimulation cérébrale, c'est-à-dire durant l’application impulsions électriques monophasiques uniques de faible intensités, sans danger pour l’animal (durée de 0.1-0.3 ms, intensité de 0.05-0.5 mA) à des fréquences de 0.1-1Hz

Impact sur les animaux

Au cours de la procédure d'imagerie par résonnance magnétique, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. De plus, des douleurs/infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales pour le placement des électrodes d'enregistrement et de stimulation.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet à pour but de caractériser l'anatomie/connectivité d'une structure du cerveau qui contrôle nos comportements et qui dysfonctionne dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et de faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à normaliser son activité chez des patients souffrant de son dysfonctionnement. De ce fait, le recours au PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) est nécessaire.

Réduction

Pour mener notre étude, nous avons réduit au minimum le nombre d'animaux utilisés en planifiant soigneusement et en maximisant les données recueillies pour chaque animal. Comme nous ne disposons pas de données préalables dans la littérature pour déterminer précisément la taille de l'échantillon, nous avons choisi une méthode statistique qui recommande un échantillon de 5 à 10 animaux pour garantir des résultats fiables, et nous avons décidé d'utiliser six animaux. Ce petit nombre est suffisant pour des tests statistiques valides dans notre domaine, où les études sur les primates non humains utilisent souvent 3 à 5 animaux à cause de leur complexité.

Raffinement

Les singes seront hébergés dans des conditions standard (cycle lumière/obscurité de 12h avec lumière allumée de 7h00 à 19h00, ~ 60% d'humidité et ~ 22°C). Les animaux seront hébergés en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique, fourrage). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à proximité de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Durant le transport et l'acquisition de l'imagerie par résonnance magnétique (15min de transport + 60min de procédure), les constantes physiologiques de l'animal seront contrôlées à l'aide d'un oxymètre. La chirurgie sera réalisée de façon stérile et sous anesthésie profonde à l'isoflurane/oxygène, après une induction à la kétamine. Une couverture antalgique avec de la Buprénorphine en préopératoire et du Metacam en postopératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Nous administrons un anesthésique local avant incision. Une sonde sera insérée dans le rectum des animaux pour contrôler la température. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. La perte de poids, la déshydratation, la perte de poils et/ou un repli sur soi inhabituel entraineront une surveillance accrue de l'animal et les mesures nécessaires seront prises de concert avec le vétérinaire. Si la situation ne se normalise pas, l'animal sortira immédiatement du protocole.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertebrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation corticale et un réseau des ganglions de la base semblables à celle de l'homme. Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur des animaux de plus de 36 mois, âge où leur système nerveux central est mature. Cela garantit une meilleure comparaison des résultats avec les caractéristiques observées chez l'adulte humain.

180 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et ceux de tous les groupes subissent environ quarante anesthésies générales, autant de prises de sang, une trentaine d'écouvillonnages du nez et de la trachée et l'implantation d'une puce de télémétrie. Les macaques infectés par un virus de la grippe ou par le SARS-CoV-2 subissent en plus quatre prélèvements de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à huit semaines d'hébergement individuel, dont le porteur écrit qu'il peut entraîner "un stress ou de l'ennui". Il s'agit de tester des anticorps et d'autres immunothérapies avant un éventuel essai clinique. Une partie des macaques est tuée pour prélever des tissus, l'autre gardée en vie pour des réinfections ou un suivi de convalescence, et peut-être réattribuée à d'autres études : d'après les prévisions, 108 seraient tués et 72 réutilisés.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

Deux chirurgies d'une heure pour retirer un ganglion lymphatique, plus une ponction de moelle osseuse : 6 macaques à longue queue, juvéniles d'au moins 22 mois, subissent ces actes dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués en fin d'étude pour prélèvements terminaux. Après les opérations, un hébergement individuel peut leur être imposé, alors que ces animaux vivent en groupe. L'étude est pilote et pré-réglementaire, destinée à valider deux anticorps bispécifiques contre des cancers et des maladies auto-immunes, avec un dossier réglementaire et des essais cliniques comme horizon. Le porteur affirme que la complexité d'un "organisme entier" rend "indispensable" le passage par l'animal et que le primate non humain est la seule espèce pertinente, en invoquant la similarité des récepteurs et la réactivité croisée tissulaire avec l'humain.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’effectuer une étude pilote, pré-règlementaires, dans le cadre du développement d’une nouvelle plateforme d’anticorps bispécifiques destinés au traitement de cancers et de maladies auto-immunes. Cette plateforme utilise des anticorps bispécifiques innovants, dont un bras reconnait une protéine du complément et l’autre bras reconnait une cible définie, telle qu’un antigène spécifique à un cancer, ici un marqueur spécifique des cellules immunitaires de type B. Ces molécules ont pour but d’activer le système du complément et de détruire sélectivement des cellules cancéreuses ou des cellules responsables de maladies auto-immunes. Dans un modèle animal sain, l’efficacité de ces molécules est mise en évidence par une dépletion importante des cellules B. Ces études pilotes permettront de valider le concept et caractériser la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et les effets sur le système immunitaire, en particulier la déplétion des celleules de type B, de 2 premiers composés de cette plateforme .

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de valider le concept d’utilisation d’une famille de nouveaux médicaments (concept et méthodologie innovante brevetée, basée sur une batterie d’anticorps bispécifiques et l’activation du système du complément) destinés au traitement de cancers et de maladies auto-immunes. Elle permettra de caractériser la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et les effets sur le système immunitaire des premiers composés de cette batterie. Si le concept est validé, ce projet pourra donner lieu à un projet suivant, incluant des études pilotes sur d’autres composés de cette plateforme et des études réglementaires, en vue de la soumission d’un dossier aux autorités réglementaires et du démarrage d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux sont soumis à 2 chirurgies similaires, minimalement invasives, pour excision d’un ganglion lymphatique (en prétest et 7 à 15j après administration du composé) et/ou une ponction de moelle osseuse (en pretest), réalisées sous anesthésie générale, avec un protocole périopératoire (ex : analgésie) adapté. La durée de cette chirurgie est estimée à 1 heure. L’administration du composé est unique, par voie intraveineuse. Des prélèvements de sang sont effectués pour le suivi des paramètres d’hématologie, de coagulation et de biologie clinique, la caractérisation de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique du composé. L’administration et les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles, par les voies veineuses périphériques, et le nombre, les volumes administrés et prélevés et les fréquences maximales sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont revues par le comité éthique lors de l’évaluation individuelle de chaque étude. Les animaux sont hébergés en groupe, à l’exception de la période post-opératoire pendant laquelle un hébergement individuel peut être envisagé pour permettre une meilleure récupération de l’animal. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de déceler tout signe de toxicité, et un contrôle de morbidité et mortalité est effectué au moins 2 fois par jour. Le poids corporel est mesuré régulièrement et la consommation alimentaire est vérifiée quotidiennement. En cas d’atteinte d’un ou plusieurs points limites suggérant une douleur ou une souffrance sévère de l’animal ne pouvant être supprimée/réduite par les soins apportés, l’animal sera euthanasié.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux 2 chirurgies (effectuées sous anesthésie générale), et aux effets pharmacologiques du produit administré. La chirurgie (2 instances séparées d’au moins 3 semaines) peut être suivie de douleurs post-opératoires au niveau des sites d’interventions, de stress provoqué par l’intervention et/ou à la contention et interventions pour les soins post-opératoires. Le produit ayant pour cible le système immunitaire, le risque d’infections peut être augmenté. Des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent éventuellement être observés. D’autres nuisances correspondent au stress et douleurs liés à la contention et aux prélèvements de sang ; ou à l’hébergement individuel temporaire suite aux chirurgies ou dans le cas d’incompatibilité sociale.

Devenir

Les animaux subissant 2 chirurgies et nécessitant des prélèvements terminaux, ils sont tous euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Des tests cellulaires préalables montrent une efficacité de ces molécules supérieure à celle observée pour des anticorps similaires et thérapies existant sur le marché. Etant donné, notamment la complexité d’un organisme entier, il est actuellement indispensable de valider l’efficacité et la sécurité de ces nouvelles thérapies utilisant des composés biologiques, ici des anticorps bispécifiques, sur un modèle animal. De plus, dans le cas de ces composés, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques [antigénicité du composé testé vis-à-vis d’espèces animales non-primates, similarités physiologiques ou métaboliques homme-primate, affinité similaire au(x) récepteur(s) ciblé(s) par le composé, réactivité croisée tissulaire homme-primate uniquement].

Réduction

Le nombre d'animaux défini correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. A ce stade d’étude pilote, un seul sexe est utilisé, et la réalisation de 2 chirurgies sur le même animal, dans des conditions de raffinement adaptées (ex : analgésie, espacement maximisé entre les 2 interventions) permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et le matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux primates non humains. Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteurs, jouets…) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement, …). L’anesthésie générale et la chirurgie sont accompagnées d’un protocole analgésique et d’un suivi péri- et post-opératoire adaptés. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude, au moins quotidiennement, et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site chirurgical, perte de poids) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Des mesures barrières supplémentaires (ex : accès limité ; nettoyages additionnels, équipements de protection individuelle renforcés) seront mises en place pour minimiser le risque d’infections microbiennes opportunistes. Une surveillance vétérinaire est en place et d’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires et selon les observations.

Choix des espèces

Le primate non humain est la seule espèce utilisable pour ce projet ; son utilisation est justifiée par : -l’objectif de traiter des maladies graves comme le cancer et les maladies auto-immunes - les homologies avec l'homme : similarité des récepteurs des anticorps, similarité des réponses immunitaires et de la physiologie, cross réactivité au niveau tissulaire - l’antigénicité des composés dans d’autres espèces Les animaux utilisés sont des juvéniles d’au-moins 22 mois en début d'étude, ce qui correspond à l’âge moyen généralement requis dans les études de toxicité. Des animaux un peu plus âgés (jusqu’à 35-40 mois) peuvent être envisagés.

120 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et pour 96 d'entre eux le protocole prévoit une quarantaine d'anesthésies par animal. S'y ajoutent, toujours par individu, une quarantaine de prises de sang, sept ponctions de moelle osseuse, neuf biopsies, vingt-huit écouvillonnages, douze lavages broncho-alvéolaires et l'implantation d'une puce de télémétrie. Infectés par la grippe une ou deux fois, ils sont isolés en cage individuelle jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress et d'ennui. 38 macaques sont tués pour le prélèvement de leurs organes, les 82 autres restent en vie afin d'être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

La grippe est une maladie infectieuse et contagieuse causée par un virus influenza, affectant principalement le système respiratoire. La transmission interhumaine du virus se fait majoritairement par voie aéroportée par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration). Il existe 3 catégories de virus influenza infectant l’Homme : A, B et C. Les classes A et B du virus sont responsables des épidémies saisonnières. Les infections causées par un virus de la classe C induisent des symptômes plus faibles, s’apparentant à un rhume. Lors de la pandémie de 2009, le virus H1N1 a infecté entre 700 millions et 1,9 milliard d’individus dont environ 300 000 n’ont pas survécu. A ce jour, des traitements antiviraux administrés en prophylaxie ou en thérapeutique permettent de diminuer la sévérité des symptômes et la durée de la maladie. De plus, des campagnes de vaccination, fortement recommandée chez les personnes à risque, sont mises en place chaque année afin de limiter la propagation du virus et les formes graves de l’infection en réduisant les complications et leur incidence. En France, on estime sauver en moyenne 2 000 personnes âgées de 65 ans et plus par an grâce à la vaccination. Malgré l’application de traitements antiviraux et la vaccination, qui reste le moyen le plus efficace de se prémunir de la maladie, les épidémies saisonnières actuelles touchent encore 2 à 6 millions de personnes en France chaque année et sont responsables d’environ 10 000 décès. La constante évolution du virus rend, certaines années, l’efficacité de la vaccination insuffisante et nous oblige à ajuster la composition du vaccin en fonction des modifications génétiques identifiées. L’amélioration des vaccins, notamment en ciblant les parties conservées du virus, permettrait de cibler un spectre plus large de virus et de protéger contre les différents variants. Dans ce projet, nous prévoyons d’établir de nouveaux modèles de primates non humains d’infection pour tester de nouvelles stratégies vaccinales, .

Bénéfices attendus

Les nouveaux modèles d’infection qui auront été développés permettront d’avoir un modèle plus proche de l’infection humaine. Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez les modèles primates non-humains pourront à court terme être utilisés lors d’essai cliniques chez l’Homme. Ils pourront, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre la grippe saisonnière.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont : - Anesthésie des animaux (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Immunisation avec des candidats vaccins (3 fois environ, 5 minutes, 96 animaux) - Infection par le virus influenza (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 15 minutes, 112 animaux) - Prélèvement de sang (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 5 minutes) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois environ (24 animaux) ; 7 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Biopsie (5 fois environ (24 animaux) ; 9 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Ecouvillonnage mucosal (19 fois environ (24 animaux) ; 28 fois environ (96 animaux), 2 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (7 fois environ (24 animaux) ; 12 fois environ (96 animaux), 20 minutes) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, 120 animaux) - Imagerie in vivo (7 fois environ (24 animaux) ; 22 fois environ (96 animaux), 45 minutes) - Pléthysmographie (7 fois environ (24 animaux) ; 19 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Hébergement individuel (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 8 semaines maximum, 112 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux injections de vaccin (peu attendues) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, (dysorexie) troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux vaccinés. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site de prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible en clinique. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire la physiopathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par le virus influenza, notamment la réponse à l’infection et l’immunité induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Enfin, le primate non humain étant proche physiologiquement de l’Homme, son utilisation permet une transposition plus optimale des résultats, ce qui serait moins adapté avec une autre espèce animale.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de sélectionner le meilleur modèle d’infection, des groupes de 2 individus seront utilisés. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits effectifs. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, les animaux utilisés dans les groupes non exposés permettant l’analyse métrologique du système d’inoculation, pourront être réutilisés dans les groupes exposés au pathogène. De même que les animaux convalescents pourront provenir des groupes déjà exposés dans le projet.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation pourra être instaurée par l’apport de fruits secs, fruits frais additionnels, compléments nutritionnels Une grille de scoring a été mise au point pour évaluation de l’état de santé. Des points limites ont été définis afin de limiter l’angoisse et la souffrance. Si ces points limites sont atteints, un traitement symptomatique pourra être administré et une euthanasie sera envisagée. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de paramètres physiologiques peut induire une réaction au site d’incision (gonflement, suintement de la plaie). Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés individuellement suite à l’exposition virale pour empêcher une surinfection liée à une contamination croisée, ce qui peut générer un stress ou de l’ennui. Le programme d’enrichissement pourra être étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement individuel, validée par la structure chargée du bien-être des animaux, pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans les fluides mucosaux. L’injection des vaccins pouvant entrainer une réaction locale (démangeaisons, douleurs) une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Si la réaction locale est exacerbée (nécrose, suppuration) (pas attendu dans ce projet), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. L’exposition au virus influenza peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. En cas d’apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé. En cas d’aggravation de l’état de santé des animaux (léthargie sévère, état moribond), l’euthanasie de l’animal sera envisagée.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus a été particulièrement choisi pour sa proximité phylogénétique de l’Homme, rendant la transposition des résultats plus optimale. En effet, les symptômes induits par l’infection influenza et les réponses immunitaires induites par la vaccination sont similaires à ceux qui sont observés chez l’Homme. Enfin, les outils permettant les analyses immunologiques sont développés et éprouvés. La grippe infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveaux nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum âgés de 2 ans. Enfin, les candidats vaccins pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques, donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit deux perfusions d'un anticorps couplé à un agent cytotoxique, sanglé quarante minutes sur une chaise de contention, et subit quinze prélèvements sanguins avant un prélèvement de moelle osseuse dont il ne se réveillera pas. Le porteur attend des diarrhées, des hématomes et des poussées de fièvre, et prévoit de projeter aux animaux un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions. Le projet sert à choisir laquelle de deux formulations passera l'étude réglementaire suivante, étape qualifiée d'"indispensable" dans le développement du candidat médicament.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de deux formulations composés d’anticorps conjugués à des agents toxiques administrées à deux doses différentes de manière répétée (x2) en intra-veineux chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation et la dose maximale tolérée pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de selection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un anticorps capable de cibler les tumeurs de manière très spécifique, couplé à un agent cytotoxique capable d’éliminer les cellules tumorales. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de deux semaines entre les 2 administrations. Quinze prélèvements sanguins de 1 à 5ml par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Un prélèvement de moelle osseuse par animal sera réalisé (sous anesthésie générale et analgésie). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Les animaux ne seront pas réveillés après le prélèvement. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur possible cible gastro-intestinale, des selles molles et/ou des diarrhée pourront être observées. Aussi, des réactions locales du type hématomes léger au niveau des sites d'administration et une réaction de type fièvre peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 27 jours sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle du système immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cette molécule d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Jusqu'à sept prélèvements de sang sous anesthésie générale dans la même journée, puis un tous les deux jours pendant deux semaines : 45 macaques à longue queue âgés de deux à trois ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance impose une mise à jeun la veille, et la tête est fixée par les oreilles dans un cadre stéréotaxique pour l'injection entre les vertèbres. Tous sont tués par thoracotomie et perfusion intracardiaque, pour cartographier la distribution du traitement dans le système nerveux et les organes. Le porteur justifie le passage au macaque en indiquant que les résultats obtenus chez la souris ne prédisent pas la dose efficace chez l'être humain, et retient des animaux jeunes parce que les maladies visées touchent enfants et adolescents.

Objectifs

L’amyotrophie spinale avec épilepsie myoclonique progressive (SMA-PME) et la maladie de Farber sont des maladies ultra-rares liées à des mutations héréditaires qui affectent le fonctionnement d’une enzyme, la céramidase. Le dysfonctionnement de cette enzyme entraine l’accumulation d’un lipide, la céramide dans les cellules de plusieurs organes, provoquant des retards dans le développement psychomoteur, des problèmes de déglutition, une inflammation des articulations, et des problèmes de foie, cœur et reins. L'espérance de vie des patients SMA-PME ne dépasse pas l’adolescence. La maladie de Farber peut soit avoir une progression rapide jusqu’au décès du patient dans les premières années de vie, ou bien, plus rarement, avoir une progression lente jusqu’à l'âge adulte. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients atteints de ces maladies. Ce projet propose de tester chez le modèle animal primate deux approches thérapeutiques pour corriger le dysfonctionnement de l’enzyme : une thérapie génique ou une pharmacothérapie. Des résultats préliminaires ont validé l’innocuité et efficacité du traitement chez des souris transgéniques déficientes pour cette enzyme. Il s’agit maintenant d’évaluer la tolérance et la faisabilité de cette approche chez un modèle animal dont l’anatomie et le système immunitaire se rapprochent au maximum de ceux des patients. Ainsi, nous pourrons déterminer les paramètres d’administration optimales, à savoir la voie d’administration, le volume d’injection et la dose efficace d’agent thérapeutique. La biodistribution de l’agent thérapeutique sera évaluée et quantifiée dans les différents organes affectés. De plus, la comparaison des deux approches vise à déterminer si une seule administration serait suffisante (thérapie génique) ou si au contraire il faut envisager un traitement chronique (pharmacothérapie).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de s’assurer de l’innocuité des agents thérapeutiques dans un modèle plus proche de l’Homme à l’aide de paramètres biochimiques et immunologiques dans le sang et une observation comportementale rapprochée. La comparaison sur ce modèle des traitements et de ses paramètres d’administration permettra de choisir le plus efficace et le moins invasif pour l’homme. Ces données constituent une preuve de concept incontournable avant de démarrer un essai clinique qui est essentiel car aucun traitement est disponible pour les patients atteints de ces maladies à ce jour.

Procédures

Les administrations et prélèvements se font sous anesthésie générale. Si la durée de l’anesthésie est de plus de 30min, les animaux sont intubés pour permettre un accès aux voies aériennes en cas de besoin. En fonction du groupe expérimentale, les animaux recevront une seule administration de thérapie génique ou un maximum de 4 administrations du traitement pharmacologique espacés de 1 semaine au minimum. Des prélèvements de sang sous anesthésie générale seront effectués régulièrement et au maximum 7 fois le jour de l’injection, soit sous anesthésie continue d’une heure, soit ponctuellement et espacés dans la journée (anesthésie 10min) puis une fois tous les deux jours les deux semaines suivantes (anesthésie 10min). Un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué sous anesthésie générale (10min) avant injection puis avant euthanasie. Ces prélèvements répétés permettront de déterminer la réponse humorale et immunitaire aux traitements, ainsi que la concentration de l’agent thérapeutique dans le sang entre traitements pharmacologiques. Ces données sont essentielles pour interpréter la biodistribution des traitements dans les organes du macaque et leur efficacité thérapeutique. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

L’administration de produit thérapeutique et anesthésique nécessite l’utilisation d’une aiguille, ce qui entraine une douleur locale, légère et de courte durée. Le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance de traitement ou prélèvement de sang entrainent un stress physique pour l’animal modéré jusqu’au réveil, nourrissage et remise en groupe social (moins de 24h). La durée des examens sous anesthésie est limitée à 1h max pour minimiser le jeûne et une potentielle perte de poids ou déshydratation. Malgré sa courte durée, il y a un risque de stress thermique (hypothermie) sous anesthésie générale jusqu’au réveil. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique (utilisé dans une voie d’administration uniquement pour fixer la tête dans une position précise qui donne accès à l’espace entre les vertèbres où l’injection a lieu) et de la gorge suite à l’intubation sont locales, légères et de courte durée (

Devenir

Il est nécessaire d’analyser les tissus des modèles animaux utilisés après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain, le cadre règlementaire impose une vérification directe de la distribution de l’agent thérapeutique dans l’organisme, de l’évaluation de son efficacité (correction de l’activité enzymatique) et de l’absence de réponse immunitaire au traitement. Ces données sont inaccessibles chez le patient et le recours à l’animal reste nécessaire pour prédire l’efficacité du traitement. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée, la céramidase, seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques (sur tissu frais) ou histopathologiques (sur tissu fixé).

Remplacement

Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux central et périphérique au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique délivré par surexpression virale. Le modèle rongeur, aux vues de sa petite taille et de son anatomie, n’est pas en mesure d’informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire, le titre et la voie d’administration. La taille et la structure du système nerveux central et périphérique du modèle primate permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une céramidase exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets uniquement in vivo (présence d’anticorps neutralisants dans le sérum) et post-mortem (par analyse immunohistochimique avec des marqueurs d’inflammation).

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même type d’étude qui ont été concluants sur l’innocuité et efficacité thérapeutique et donné lieu à des essais cliniques. Le suivi longitudinal/répété chez le même individu pour monitorer la réponse immunitaire, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour observer un effet significatif dans le temps entre les groupes. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été réduit au minimum (n=3) afin de pouvoir exploiter correctement les résultats d’un point de vue statistique. Une veille de la littérature a été faite pour éviter de répéter des expériences.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite à l’administration des produits ou à l’anesthésie, l’évaluation du comportement à l’aide d’une grille tout le long de l’expérience, un suivi du poids hebdomadaire, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre et le volume des prélèvements ainsi que la durée de l’anesthésie sont réduits au maximum. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les prélèvements et l’administration des traitements, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique). L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.

Choix des espèces

Le modèle primate se justifie par la nécessité de reproduire des résultats obtenus chez des espèces murines mais qui ne sont pas totalement prédictives de la dose à injecter pour obtenir un effet chez l’Homme (en termes de mise à l’échelle de la dose par rapport à la surface à transduire) et sans « réveiller » le système immunitaire. D’ailleurs, le suivi comportemental chez le macaque reste le plus comparable à celui fait chez le patient en clinique. L’étude chez le modèle animal primate permettra d’évaluer la faisabilité et l’efficacité potentielle des différents sérotypes de vecteur viral, paramètres d’administration (voie, volume, titre) et tolérance dans un cerveau animal de taille moyenne avec des connections anatomiques et fonctionnelles se rapprochant au maximum de celles des patients. Nous utiliserons des animaux jeunes (entre 2 et 3 ans) car les maladies étudiées touchent les jeunes enfants/adolescents.

Tous mis à mort pour une analyse post-mortem de leur cerveau, sept macaques, quatre à longue queue et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre à six heures, parfois refaite sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois, sous contrôle hydrique maintenu de douze à vingt-quatre mois. Le porteur indique que la descente d'électrodes dans le cerveau expose à une infection ou à un accident vasculaire, et que la chirurgie crânienne peut provoquer un œdème cérébral. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier ces fonctions chez le singe pour extrapoler à l'humain, et retient des animaux de 6 à 12 kg dont la morphologie du crâne est compatible avec l'implant.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.

Impact sur les animaux

1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.