Primates

Une chirurgie d'environ dix heures implante une électrode dans le noyau subthalamique et un neurostimulateur sous la peau de quatre macaques à longue queue, auxquels sont ensuite injectées des neurotoxines pour provoquer un syndrome parkinsonien qui persistera jusqu'à la fin de l'étude. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, pour vérifier après leur mort que l'électrode était bien placée. Ils réalisent une tâche de vigilance trente minutes par jour cinq jours sur sept, passent jusqu'à cinq séances de trois heures en cage de sieste par condition, subissent des ponctions lombaires sous anesthésie générale et restent isolés pendant les injections de toxine et les soixante-douze heures suivantes. Le porteur indique que deux animaux suffisent, deux autres étant commandés en cas de problème, et retient le macaque parce que sa taille permet d'évaluer un implant destiné aux patients, contrairement aux rongeurs dont les cycles de sommeil sont inversés.

Objectifs

Avec une incidence d’environ 60 à 70%, les troubles du sommeil sont très fréquents chez les patients parkinsoniens. Les patients présentent des insomnies associées à une désorganisation de l’architecture du sommeil. De plus dans la journée, les patients sont somnolents et ont du mal à rester éveillés ce qui se traduit par un temps excessif diurne passé à dormir avec des endormissements irrépressibles. Les somnolences diurnes excessives sont très invalidantes car incompatibles avec la réalisation d’activités quotidiennes nécessitant de l’attention, comme la conduite automobile, et de ce fait, elles contribuent à fortement limiter l’autonomie des patients. Ces troubles ne sont pas du tout diminués par les traitements disponibles et sont même souvent aggravés. La prise en charge de ces troubles du sommeil peut donc considérablement améliorer la qualité de vie des patients. La stimulation cérébrale profonde d’une structure cérébrale appelée noyau subthalamique est devenue un traitement chirurgical de choix pour améliorer les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Il serait intéressant de pouvoir utiliser ce traitement à la fois sur les troubles moteurs et sur les troubles du sommeil. L'objectif de cette étude est donc de déterminer de nouveaux paramètres de stimulation du noyau subthalamique pour réduire les troubles du sommeil dans le cadre de la maladie de Parkinson. Nous ne pouvons pas tester ces nouveaux paramètres sur des patients déjà implantés. En effet ceux-ci font partie d'un programme de stimulation bien définit, adapté pour traiter au mieux leurs symptômes moteurs. De plus nous utiliserons une nouvelle génération d'implants, avec laquelle les patients ne sont pas implantés. Le primate non humain est le modèle qui a permis la mise en place de la stimulation cérébrale profonde. C’est un modèle qui permet de reproduire un syndrome parkinsonien s'accompagnant d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de définir des paramètres de stimulations du noyaux subthalamique pour traiter les troubles du sommeil dont souffrent la majorité des patients parkinsoniens. Cela permetterait d'utiliser la stimulation cérébrale profonde pour traiter non seulement les symptomes moteurs mais également les troubles du sommeil des patients.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 30min par jour, à heure fixe et 5j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans leur cage d'hébergement. La chirurgie d’implantation durera environ 10h. Une électrode de stimulation sera implantée dans le noyau subthalamique et connectée à un neurostimulateur implanté sous la peau. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 5 nuits et de 5 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec stimulation la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec stimulation la nuit. Des tests pour mesurer le temps d’endormissement des animaux seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au maximum 5 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Les animaux seront isolés pendant les injection et 72h après la dernière injection jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 1 semaine. Des ponctions lombaires seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer une douleur post-opératoire pouvant durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation et potentiellement une hemoragie non détectable. L'implant peut être mal toléré par l'animal pouvant engendrer des irritations au niveau du site d'implantation, nécessitant des soins/reprises. Lors de la chirurgie un produit pouvant parfois induire des crises d’épilepsie est injecté. La mise place du modèle engendrera un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude. Lors de la mise en place du modèle, les injections nécessiteront un isolement pour ne pas contaminer les autres animaux ainsi que le personnel. Les ponctions lombaires peuvent engendrer des maux de tête.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort tous les animaux ayant participé à l'étude, afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour confirmer la bonne implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

Cette étude du comportement de veille/sommeil nécessite une analyse des cycles du sommeil. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Il est aussi impossible de tester de nouveaux paramètres de stimulation sur les patients déjà implantés. Le recours à des animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.

Réduction

C’est une étude dans laquelle l’animal est son propre contrôle. Peu d’animaux seront donc nécessaires, 2 sont suffisants. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans stimulation, parkinsonien avec ou sans stimulation) permettra d’évaluer l’impact de la stimulation cérébrale profonde du noyau subthalamique avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 2, et 2 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie et pour les prélevements, des analgésiques, anesthésiques et antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques afin de réduire au maximum les douleurs et en cas de signe d'infections, des antibiotiques seront administrés aux animaux. Du doliprane pédiatrique sera donné après les ponctions pour éviter les maux de tête. Lors de la mise en place du modèle, les animaux seront isolés, mais auront un contact visuel avec leurs congénaires. Le syndrome Parkinsonien sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l'animal.. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée par un petit volume de liquide (jus, sirop) ou solide (bonbons, fruits secs) selon leurs préférences. Un tableau de progression sera utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale sont mis en place pour intervenir le plus rapidement possible afin de limiter la souffrance animale.

Choix des espèces

L'anatomie cérébrale du macaque est très proche de celle du cerveau humain. En effet ces primates non humains, qui ne sont pas une espèce menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux sous-corticaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. De plus la taille de cet animal et de son cerveau permettent l'utilisation et l'évaluation d'un système enregistreur/stimulateur implantable qui est prévu pour être utilisé chez le patient. Des adultes seront utilisés, car les traitements évalués dans cette étude ciblent des patients adultes. De plus l'utilisation d'animaux adultes assure que le dévelopement du cerveau soit achevé.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux PET-scans de deux heures, une IRM d'une heure trente, quatre ponctions lombaires et trois transports entre deux établissements. Tous les gestes se font sous anesthésie générale, avec le risque d'hypothermie et de dépression cardiorespiratoire que le porteur signale. Les ponctions de liquide céphalorachidien peuvent provoquer des fuites, des maux de tête, des vomissements et des signes neurologiques. La thérapie génique testée a déjà été validée chez quatre modèles de souris et le passage par le primate est décrit comme une étape réglementaire exigée par l'ANSM, les trois macaques étant tués à la fin pour prélever leurs organes, l'essai chez des patients restant à ce stade une perspective.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones. De nos jours, il n’existe aucun traitement efficace. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la maladie. Notre approche thérapeutique se base sur la thérapie génique. Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 4 modèles de souris de la pathologie par administration dans une zone précise de cerveau de ces animaux. L’objectif ici consistera d’une part à évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intraveineuse de notre thérapie génique chez le primate non humain (PNH). D’autre part, ce projet a également pour objectif de valider un marqueur d’imagerie comme biomarqueur pour le suivi de l’efficacité thérapeutique. Le suivi de l’effet de notre thérapie génique nécessitera de travailler dans 2 établissements ( établissement 1 et établissement 2) pour l’utilisation d’un appareil d’imagerie spécifique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de la faisabilité et de l’efficacité d’une nouvelle approche de thérapie génique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer ainsi que de valider un marqueur d’imagerie afin de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et ainsi d’amener à une étude clinique chez des patients souffrants de cette pathologie (165000 cas par an en France) mais aussi de valider un biomarqueur de suivi de la pathologie.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale, et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes. Dans l’ établissement 2, les animaux, sous anesthésie générale, réaliseront deux imageries PET-scan à environ 2 mois d’intervalle, qui nécessiteront à chaque fois 1 injection intraveineuse d’une substance faiblement radioactive et un prélèvement de sang (durée par imagerie environ 2h). Dans l’établissement 1, les animaux, au cours de la même anesthésie générale, auront une imagerie par résonance magnétique (environ 1h30), recevront une administration intraveineuse de thérapie génique (environ 10min) et auront une prise de sang et une ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements). Pour le suivi ( établissement 1), les animaux, sous anesthésie générale, auront 3 autres prises de sang et ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements) avec un minimum d’une semaine de repos entre chaque prélèvement. Les animaux réaliseront 3 transports assurés par un transporteur agréé entre les établissements 1 et 2 (durée inférieure à 1h par trajet). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire afin de réaliser le prélèvement des organes d’intérêts pour l’évaluation de notre thérapie génique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection intraveineuse de thérapie génique, pour les prélèvements (sang et liquide céphalorachidien) et pour les examens d’imagerie. Ces anesthésies seront associées à une hypothermie et un risque de dépression cardiorespiratoire. Les animaux ressentiront un stress lié à leur capture en cage à l'induction de l'anesthésie. Les 3 transports de l’animal entre les deux établissements pourront engendrer un stress. De plus en raison de la conformation des cages de l’ établissement 2, une anesthésie brève sera réalisée pour les 2 transports au départ de cet établissement, mais du fait de leur courte durée elles ne présenteront qu’un risque très rare de dépression cardiorespiratoire pour l’animal. Les prélèvements de sang seront associés à un risque d’hématomes et d’induration au niveau de la zone de prélèvement. Les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) seront associés à un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes. Les administrations pour les anesthésies et la prise en charge péri-opératoire (immunosuppresseurs, analgésie...) engendreront un stress, un inconfort et une légère et brève douleur au point d’injection.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélever les organes d’intérêt pour les études histologiques et de biodistribution qui permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de cette thérapie génique comme nouvelle piste thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de notre thérapie ont été évaluées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille facilitant ensuite la translation vers un essai clinique chez l’humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 3 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans une animalerie agréée, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L’observation journalière permettra tout au long du projet de suivre l’atteinte de points limites mis en place dans le projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. L’ensemble des gestes techniques seront faits sous anesthésie et analgésie adaptées. Lors de ces anesthésies nous contrôlerons et maintiendrons les paramètres physiologiques de l’animal. Nous nous assurons ensuite du réveil et de la bonne récupération des animaux. Le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures, par exemple prise de sang et ponction lombaire sont faites au sein de la même anesthésie générale. Les animaux auront un temps de récupération de minimum 1 semaine entre chaque session de prélèvement, et nous respecterons les volumes de prélèvement maximaux recommandés pour l’espèce (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal). Ce projet se déroulera dans deux établissements, afin de minimiser le stress induit par les changements d’établissement utilisateur les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée pour chacun des sites. Le transport entre les 2 Etablissements utilisateurs sera assuré par un transporteur agréé et avec un animal vigile. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du primate non humain, en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration de notre thérapie par voie intraveineuse et l’étude de son effet sur un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). Une fois validée chez un modèle de rongeurs, l'injection de notre thérapie génique chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique avant de passer à l’Homme. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-15 ans) (3 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé compte tenu des patients ciblés par notre approche.

Leur accès à l'eau est contrôlé pour qu'ils restent motivés par les tâches à accomplir. Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué : trois seront replacés et trois réutilisés dans d'autres projets. Chacun subit deux interventions chirurgicales de quatre à cinq heures, onze examens d'imagerie cérébrale sous anesthésie générale dont six avec injection directe dans le cerveau, et des séances comportementales quotidiennes d'une heure trente à deux heures pendant quatre à cinq mois. Le projet vise à cartographier les circuits sous-corticaux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, le porteur retenant le macaque comme l'espèce "la plus près de l'être humain".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Six macaques à longue queue subissent chacun deux opérations du crâne de quatre à cinq heures, onze séances d'imagerie sous anesthésie générale et vingt injections directes dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tests comportementaux occupent une heure trente à deux heures par jour pendant quatre à cinq mois, l'accès à la boisson étant contrôlé pour maintenir la motivation des animaux. L'objectif déclaré consiste à cartographier les circuits cérébraux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, puis à mesurer sur ces circuits l'effet d'antidépresseurs et d'anxiolytiques. Trois macaques doivent partir en centre de retraite à l'issue du protocole, les trois autres étant réutilisés dans d'autres procédures, ce que le porteur présente comme une recherche orientée vers les "4R".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Quinze séances d'imagerie sous anesthésie pour les ouistitis infectés par une souche bioluminescente, huit prises de sang, huit écouvillonnages du nez et de la gorge et jusqu'à quatre lavages broncho-alvéolaires pour chacun : jusqu'à 70 ouistitis communs, des primates, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet. Jusqu'à 66 d'entre eux sont infectés sous anesthésie par la grippe A H1N1, qui peut provoquer toux, éternuements, fièvre, diarrhée et perte de poids, et 8 ouistitis sains sont logés avec 16 congénères infectés pour mesurer la transmission. Le porteur justifie leur mise à mort par le risque de contamination et par l'emploi d'une souche génétiquement modifiée. Avant tout test de vaccin, le projet vise à faire reconnaître le ouistiti comme espèce d'étude de la grippe, et le porteur cite parmi ses atouts "la facilité de contention et sa facilité d'approvisionnement".

Objectifs

D’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les virus de la grippe saisonnière sont responsables de 3 à 5 millions de malades sévères chaque année, dont 650 000 morts annuellement. En particulier, le virus de la grippe A H1N1, qui a été à l’origine de la pandémie de grippe en 2009-2010, continue aujourd’hui de circuler en tant que grippe saisonnière et de nouveaux variants font peser la menace d’une nouvelle pandémie. Que ce soit pour prévenir ou contenir une infection saisonnière à la grippe A, ou pour soutenir les mesures d’urgence dès l’apparition d’une pandémie, il est essentiel d’avoir des candidats-vaccins et candidats-médicaments éprouvés et validés par les autorités sanitaires. Avant de valider ces candidats, le modèle animal sur lequel ces validations auront lieu doit lui-même être validé. L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence scientifique du ouistiti commun (Callithrix jacchus) comme espèce non-rongeur pour les études concernant le virus de la grippe A H1N1. Cette espèce a déjà fait l’objet d’études publiées sur l’infection à la grippe A H1N1 dans d’autres centres avec des résultats prometteurs. Les deux souches utilisées dans ce projet seront la souche A/California/07/2009 (H1N1) WT et la souche bioluminescente CA07-PASTN NanoLuc® luciferase. Afin de valider ce modèle, une phase d’étude de la cinétique d’infection virale sera réalisée par imagerie de bioluminescence associée à un suivi de la charge virale et un suivi de la réponse immunitaire. Une deuxième phase permettra d’étudier la transmission virale entre des animaux préalablement infectés par la grippe A H1N1 et des animaux naïfs, en co-hébergement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser et valider l’utilisation du ouistiti commun comme espèce pertinente pour l’évaluation de la pharmacologie et de la sécurité des candidats-vaccins et candidats-médicaments contre la grippe A H1N1.

Procédures

4 animaux subiront au maximum 3 lavage broncho-alvéolaire réalisée sous anesthésie (geste répété au maximum 3 fois). La procédure de lavage broncho-alvéolaire durera environ 10 à 20 minutes incluant l’anesthésie. Au maximum 66 animaux seront infectés sous anesthésies. Ce geste durera maximum 25 minutes anesthésie comprise. Pour tous les animaux, 8 écouvillonnages nasaux et pharyngés et 8 prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés. Des lavages broncho-alvéolaires seront réalisés 3 à 4 fois sur chaque animal avec un minimum de 6 jours entre 2 lavages. Pour les animaux infectés avec les souches de virus bioluminescentes, des acquisitions d’imagerie par bioluminescence, sous anesthésie, seront réalisés 15 fois au cours de l’étude, avec une injection de substrat bioluminescent avant chaque acquisition. Une mise à jeun de 2 à 3h maximum sera réalisée avant chaque anesthésie. Afin de limiter les anesthésies, lorsque des actes auront lieu le même jour, ils seront faits au cours de la même anesthésie ainsi : - la durée d’une acquisition d’imagerie seule sera d’environ 20 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages nasaux et pharyngés et un prélèvement de sang sera d’environ 35 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages nasaux et pharyngés, un prélèvement de sang et un lavage broncho-alvéolaire sera de maximum 45 minutes anesthésie comprise. 8 animaux de ce projet seront hébergés en individuel pendant un maximum de 48h.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’infection par le virus de la grippe A H1N1 : éternuement, toux, jetage nasal, jetage oculaire, perte de poids, diarrhée, fièvre, modifications de la respiration. D’autres effets secondaires attendus sont liés aux actes techniques : - anesthésie : hypothermie, bradycardie, arythmie, arrêt cardio-respiratoire ; - prélèvement sanguin : hémorragie, hématome ; - LBA : toux, dyspnée ; - Ecouvillonnage nasal et laryngée : léger saignement, éternuement, toux ; - Injection IV : hémorragie, hématome.

Devenir

Le risque de contamination à l’homme ou à d’autres animaux par un pathogène de classe 2 et le risque pour l’environnement du fait de l’utilisation d’une souche génétiquement modifiée justifient que tous les animaux soient euthanasiés en fin de projet.

Remplacement

A ce jour, aucune alternative in-vitro à l’expérimentation animale ne permet de mimer les mécanismes d’infection de la grippe à l’échelle d’un organisme entier. De plus, malgré l’emploi d’autres modèles animaux comme les rongeurs (hamsters ou souris) ou les furets, leurs éloignements génétiques liés à l’évolution des espèces comportent quelques limites d’un point de vue physiopathologique et immunitaire. A l’inverse, les modèles de Primates Non Humains dont le ouistiti commun sont plus proches de l’Homme et en font de bons modèles pour étudier la réponse immunitaire/vaccinale et les modalités de transmission des virus respiratoires comme la grippe. Le ouistiti, légèrement plus éloigné génétiquement que le macaque cynomolgus, est une forme de remplacement partiel.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus par étude et par groupe a été évalué en fonction de l’objectif de chaque étape. Ainsi, pour l’étape 1 (étude pilote), seuls 4 animaux seront inclus pour valider la méthode de lavage broncho-alvéolaire. Pour l’étape 2 (cinétique virale), 18 animaux seront inclus et répartis en 2 groupes de 9 animaux. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux et éviter l’utilisation d’un groupe contrôle non-infecté, chaque animal sera son propre témoin, à partir des données récoltées à J-5. Si les résultats obtenus sont insuffisants ou incomplets, cette étape pourrait être répétée sur 24 autres animaux réparties en 3 groupes de 8 animaux afin de tester d’autres souches de virus bioluminescents. Pour l’étape 3 (transmission), 24 animaux seront inclus et répartis en un groupe de 16 animaux (infectés) et un groupe de 8 animaux (non infectés). Ainsi, entre 46 et 70 ouistitis seront utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les ouistitis seront hébergés en groupes sociaux de 2 ou 3 individus (sauf maximum 48h pour 8 animaux) déjà constitués par le fournisseur. Les cages sont conformes aux normes en vigueur, et sont équipées de perchoirs et plateforme, d’un hamac et d’un nid. Le programme d’enrichissement inclut du temps dédié à la socialisation homme-animal et l’habituation aux actes, de la recherche alimentaire (tapis de fouille avec friandises) et un apport de gomme arabique. L’acclimatation durera au moins 2 semaines durant laquelle les animaux seront seulement socialisés et habitués à des actes non invasifs (approche au grillage, nourrissage à la main, pesée, examen clinique), dans la continuité du programme réalisé chez le fournisseur. Une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant le transport. Si les hiérarchies sont maintenus, l’habituation aux actes débutera la seconde semaine d’acclimatation. Pour éviter une réorganisation des hiérarchies après le transport, des enrichissements de leur cage chez l’éleveur (avec leurs odeurs) seront conservés pendant le transport et transférer dans les nouvelles cages. Tous les actes seront regroupés au même moment, pour réduire le nombre d’anesthésie. Lors de l’anesthésie, du gel oculaire sera appliqué et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Pour surveiller l’état de santé des animaux, une grille de score sera utilisée au moins quotidiennement (si nécessaire et en fonction du score, les observations seront effectuées 2 ou 3 fois par jour). Pendant la période d’isolement, les animaux seront maintenus individuellement à côté les uns des autres (communication possible) et ils recevront une socialisation homme-animal plus importante. Des enrichissements de leur cage (en groupe) avec leurs odeurs seront transférés dans leur nouvelle cage pour l’hébergement individuel et une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant la remise en groupe.

Choix des espèces

Bien que d’autres modèles animaux soient utilisés pour étudier la grippe A (souris, furet), leur éloignement génétique n’en font pas de bons modèles prédictifs chez l’Homme sur le plan physiopathologique et des modalités de transmission. A l’inverse, les Primates Non Humains dont le ouistiti, plus proches d’un point de vue immunologique et physiologique, sont les modèles les plus proches de l’Homme pour l’étude des infections aux virus respiratoires comme la grippe. Plusieurs études ont montré la pertinence de cette espèce pour étudier la grippe A H1N1. De plus, cette espèce a plusieurs atouts comme la susceptibilité aux infections virales à tropisme respiratoire, la facilité de contention et sa facilité d’approvisionnement. Les animaux seront des animaux adultes d’âge compris entre 2 et 5 ans afin que les animaux aient un système immunitaire complétement mature et ainsi réaliser les études avec des groupes immunologiquement homogènes.

Des injections répétées de streptozotocine provoquent chez treize macaques à longue queue des symptômes de maladie d'Alzheimer, après une ou deux chirurgies d'implantation sous anesthésie générale. Ces treize primates vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, pour que soient analysés biochimiquement et anatomiquement les effets d'une illumination du crâne par casque infrarouge. Le porteur liste parmi les nuisances attendues douleurs postopératoires, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection et hallucination temporaire, puis écrit n'attendre "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Il annonce neuf prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien ainsi que "des tests comportementaux", sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 13 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une voir 2 procédures chirurgicales et des injections sous anesthésie générale- de la photobiomodulation extracranienne - 9 prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien - des tests comportementaux

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par l’animal sont liées : -à la chirurgie d’implantation et aux suites post opératoire avec des risques de douleurs post opératoire, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection. Une attention particulière sera apportée dans les premiers jours suivant l’intervention chirurgicale et sera maintenu durant quelques semaines. - aux injections répétées de streptozotocine avec des risques d’infection, œdème, inflammation, hallucination temporaire. Ces injections sont réalisées sous anesthésie générale et leur effet sur le comportement de l’animal sera suivi dans les heures et jours suivants. Afin de réduire le stress lié aux différents actes pratiqués, il y aura une phase de conditionnement positifs sur les actes post-opératoires afin d’assurer leur coopération sur notamment le retrait des points ou les soins de la plaie en vigile. En cas de détection de signe de douleur, de perte de poids ou de signes d’infection, une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres de la SBEA sera mise en œuvre de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

Afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien- être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain pour la pathologie étudiée. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

Onze macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à quarante séances sous anesthésie générale de une à six heures. Deux d'entre eux reçoivent en plus une chirurgie de quatre à huit heures pour l'implantation permanente d'électrodes intracrâniennes, avec les risques d'hémorragie et d'infection que le porteur décrit. Trois autres sont entraînés à rester éveillés, la tête fixée, dans un scanner IRM. Aucun n'est tué à l'issue, le porteur indiquant que les onze pourront être réutilisés dans d'autres projets selon la décision du vétérinaire, et justifiant le macaque comme "le meilleur compromis" entre proximité avec l'humain et adaptabilité aux conditions de laboratoire.

Objectifs

Peut-on rétablir la conscience suite à un coma par une stimulation du cerveau ? Un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral peuvent causer une perte de conscience. De nombreux patients ne recouvrent jamais un niveau de conscience normal. Ils restent dans un état chronique de troubles de la conscience, qui peut perdurer plusieurs années. Il s’agit de conditions dévastatrices, où les patients, tout en conservant les fonctions vitales comme la respiration, la digestion etc., perdent le cœur de leur identité : la conscience. Ces conditions ont un impact personnel, social et économique très lourd, et pourtant à ce jour nous ne disposons pas de traitement efficace prouvé. Des études récentes montrent que la stimulation cérébrale profonde du thalamus peut restaurer la conscience chez un primate anesthésié. Cependant cette technique nécessite une intervention chirurgicale invasive avec des risques tels que l'hémorragie cérébrale ou l’infection. En outre, le taux de réussite des études cliniques préliminaires reste modeste. Il est donc nécessaire de développer une nouvelle approche thérapeutique non invasive. Nous allons explorer l’usage de nouvelles technologies non invasives de stimulation cérébrale afin de restaurer l’état de conscience. Récemment les ultrasons focalisés de faible intensité sont apparus comme une technologie prometteuse. Il s’agit d’envoyer des vibrations non audibles (ultrasons, US) qui affectent les tissus. Combinés à une injection dans le sang, les US permettent la livraison de médicaments à des cibles spécifiques dans le cerveau, pour une thérapie plus efficace. Une deuxième technique est la TIS (stimulation électrique par interférence temporelle) qui produit un effet par l’intersection de deux courants électriques très faibles traversant le cerveau. Nous proposons donc d’étudier la possibilité de réveiller des primates anesthésiés avec une stimulation par ultrasons focalisés, associée ou non à l’injection de médicaments d’intérêt, ou par interférence temporelle. Pour suivre au cours du temps les effets de la stimulation, nous étudierons les signatures neuronales de la conscience par IRM fonctionnelle et électroencéphalogramme. Cela constituerait une première étape dans le développement d’une thérapie non invasive pour les patients dans un état de perte ou désordre de la conscience.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est le développement d’un nouveau traitement de la perte de la conscience aiguë (coma) et chronique (état végétatif, état de conscience minimale) par stimulation cérébrale non invasive. La validation préclinique est une étape importante vers la réalisation d’essais cliniques chez les patients comateux ou atteints de désordres chroniques de la conscience. Ainsi, en cas de succès, nous allons ensuite travailler pour la translation de ces techniques chez l’humain. Un deuxième bénéfice est d’ordre de la connaissance scientifique. Les ultrasons focalisés ont été développé récemment et ouvrent des voies nouvelles, impossibles avec d’autres techniques de stimulation plus traditionnelles. L’utilisation de l’imagerie cérébrale (IRM fonctionnelle) nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux précis de ces nouvelles technologies de stimulation cérébrale non invasive. Très récentes et prometteuses, elles sont encore peu étudiées, alors que leurs effets sur le cerveau sont très complexes. Notre projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces techniques, leur utilité clinique, leurs similarités et différences avec la technique plus vieille et invasive appelée DBS (deep brain stimulation, stimulation cérébrale profonde). Tout cela sera fait avec un focus sur les troubles de la conscience, mais les informations récoltées auront un impact beaucoup plus général, parce que ces deux nouvelles techniques de stimulation cérébrale pourront potentiellement être utilisées dans de très nombreuses applications médicales. À titre d’exemple, ce type de stimulation peut être bénéfique pour des troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson, ou psychiatriques comme la dépression.

Procédures

Nous aurons trois groupes d’animaux. Un premier groupe recevra des stimulations du cerveau sous anesthésie, pour voir si l’intervention peut restaurer la conscience. Les sessions sous anesthésie prévues seront jusqu’à 40 par animal et auront une durée comprise entre 1h et 6h. Le nombre exact de sessions dépendra du succès de la manipulation. La stimulation pourra être effectuée par ultrasons ou par des courants à basse intensité (1h max). Les mesures des effets seront effectuées par électroencéphalogramme (EEG) ou résonance magnétique (IRM). Les sessions de stimulation impliquent l’application d’un ou plusieurs dispositifs au contact de la peau de l’animal. Dans certains cas, la stimulation sera associée à l’injection de médicaments et de microbulles gazeuses dans le sang. Un deuxième groupe recevra ces mêmes stimulations, mais aussi une stimulation plus traditionnelle et invasive appelée stimulation cérébrale profonde (DBS, pour comparaison, toujours sous anesthésie. Les sessions prévues auront même durée (1h à 6h) et seront au plus 40 par animal. Les mesures des effets seront également obtenues par EEG et IRM. Les animaux de ce groupe subiront une chirurgie (4 à 8 h) pour installer l’équipement intracrânien. Un troisième groupe recevra les mêmes stimulations non invasives du premier groupe (au plus 20 sessions de 1h à 6h par sujet), mais réalisera aussi des sessions à l’état éveillé, et sans stimulation, comme contrôle. Ces animaux devront être entraînés par des sessions quotidiennes à rester calmes et le plus immobiles possible pendant ces sessions, à l’aide de récompenses alimentaires ; à la fin de cet entrainement les sessions de test seront acquises (jusqu’à 80 sessions de 1h à 2h, entrainement et test confondus). Les animaux de ce groupe devront avoir une chirurgie (3 à 6 h) pour recevoir un équipement extracrânien qui permet de garder leur tête immobile dans le scanner IRM.

Impact sur les animaux

● L’anesthésie peut causer des effets indésirables bien connus , Les nausées/vomissements , les lésions de la gorge/trachée dues à l’intubation , le maintien prolongé dans la même position peut causer des douleurs musculaires. Les effets indésirables graves et la mortalité restent extrêmement rares dans une anesthésie contrôlée de ce type. ● L’usage de l’agent de contraste utilisé peut causer une accumulation de fer dans les tissus, mais cela n’a pas d’impact appréciable sur la santé des animaux. ● Des stimulations trop intenses par FUS peuvent produire des lésions, donc nous en allons contrôler attentivement l’intensité. ● La DBS ne cause pas d’effets négatifs au moment de la stimulation, mais elle requiert la pose chirurgicale d’un implant permanent intracrânien. Cela entraîne des risques d’infection et d’hémorragie. Un suivi adapté est spécifiquement mis en place en post-opératoire. La chirurgie peut causer de la douleur post-opératoire. Sur le long terme, la présence de l’implant cause un inconfort minimal chez l’animal. ● L’implant extracrânien implique des effets différents. La chirurgie est moins invasive, donc le risque d’hémorragie est moindre. il peut occasionnellement produire une infection.. Si le singe exerce trop de force quand il est fixé, cela peut fragiliser l’implant et conduire à son détachement ou le casser. ● L’entraînement et l’IRM vigiles peuvent causer de l’inconfort voire du stress à l’animal à cause de la fixation de la tête, du bruit et des protections auditives, de l’espace restreint.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie en fin de procédure, car il n’y a pas d’éléments scientifiques dans ce projet qui nécessitent une mise à mort. Les animaux pourront être réutilisés pour d’autres projets selon la décision du vétérinaire.

Remplacement

Une procédure médicale comme la neuromodulation pour la restauration de la conscience doit être testée sur des organismes vivants avant d’être appliquée à l’homme. Il existe des modèles informatiques de la conscience, mais ces modèles ne sont absolument pas réalistes au point de pouvoir remplacer des études biologiques, parce que le cerveau est extrêmement complexe, et la conscience est une des facultés les plus sophistiquées du cerveau et encore très mal comprise. Au contraire, les mesures expérimentales que nous recueillerons dans ce projet pourront être utilisées pour perfectionner ces modèles informatiques. Il ne serait par ailleurs pas admissible d’appliquer directement sur des patients des techniques non testées, d’autant plus que cette population avec des troubles de conscience ne peut pas exprimer un consentement informé à la participation à une étude expérimentale. L’usage d’animaux pour cette recherche à visée médicale reste donc le choix privilégié.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi est basé sur la littérature scientifique et nos propres expériences précédentes. Il n'y a donc pas eu d'approche statistique necessaire. Nous testerons les trois types d’interventions sur un premier groupe de 6 sujets. Cette recherche demande de nombreuses sessions sous anesthésie, nous avons donc choisi 6 sujets pour trouver un équilibre entre le nombre d’animaux, le plus petit possible, et le fait que le nombre total et la fréquence des anesthésies par animal ne soient pas trop importants. Le groupe 2, recevant une intervention chirurgicale invasive est réduit au strict minimum de 2 sujets. Le groupe 3, utilisé comme contrôle pour effectuer des sessions « éveillées » comprend 3 sujets. Ce nombre a été choisi pour être également le plus petit possible, mais à cause des contraintes dues à l’entraînement, il devra être légèrement plus large que le groupe 2. Chaque session IRM sera analysée avant d’être répétée, afin d’estimer la qualité des données et la force des résultats, pour limiter le nombre d’examens par animal au minimum nécessaire.

Raffinement

Toute mesure sera prise pour améliorer le bien-être des animaux et réduire leur souffrance. La plus grande partie des étapes de ce projet sera réalisée sous anesthésie générale. Néanmoins il est nécessaire d’avoir des sessions de contrôle dans un état éveillé, pour juger de l’efficacité des interventions expérimentales. Anesthésie - Médicament pour protéger les oreilles en cas d’utilisation d’un support de la tête incluant des barres d’oreilles. - Anesthésie locale de la glotte avant intubation de l'animal. - Surveillance en continu des paramètres physiologiques pendant toute la durée de l’anesthésie. Couverture chauffante pour le maintien de la température corporelle. Hydratation intraveineuse. - Surveillance au moment du réveil jusqu’à que l’animal se lève et isolement des partenaires jusqu’à la reprise des forces, nécessaire pour éviter des combats pour la hiérarchie. Traitement anti-douleur - Lors des chirurgies, la douleur est prise en charge par un traitement pré-, per- et post-opératoire adapté. Comportement - Différents types d’enrichissement sont utilisés - L’entraînement à tolérer des sessions dans un état éveillé dans le scanner IRM est graduel et minimise le stress. - L’entraînement se fera sur la base du renforcement positif, donc avec des récompenses alimentaires (par exemple jus de fruit ou compote) et sans punitions. IRM - Usage de protections auditives. - La durée des sessions IRM vigiles sera réduite au minimum (on vise 1h et sans jamais dépasser les 2h). Neurostimulation - Les paramètres de stimulation seront calculés de manière à éviter tout effet indésirable Surveillance L’état général de chaque animal est évalué au quotidien dans sa propre cage par les expérimentateurs ou techniciens. Sont alors vérifiés l’apparence physique, la réactivité, le comportement (changement de l’attitude). Les courbes de poids des primates sont informatisées et surveillés de prêt afin de détecter des variations du poids. Mise en place de points limite adaptés.

Choix des espèces

Le macaque est le meilleur compromis pour avoir une espèce suffisamment proche de l’être humain, adaptable aux conditions de laboratoire, sans devoir travailler directement chez l’humain. Dans ce projet nous étudions les bases neurales de la conscience et la possibilité de la restaurer en cas de perte de conscience. Or des animaux évolutivement plus éloignés de nous, comme les souris ou les non-mammifères, ont une structure cérébrale considérablement différente, en particulier en ce qui concerne la conscience, car la conscience humaine dépend des parties évolutivement plus récentes du cerveau. Pour cette raison, une technique qui affecte l’état d’éveil chez un animal qui n’est pas un primate, ne va pas forcément être efficace pour restaurer la conscience d’un être humain. Le macaque est actuellement le modèle primate non-humain le plus utilisé au monde dans le domaine des neurosciences, précisément parce qu’il correspond au mieux à tous ces critères, et il est particulièrement approprié pour une étude préclinique sur la conscience. Nous allons utiliser des primates adultes pour que le développement du cerveau soit complet avec pour but ultime de traiter les troubles de la conscience chez les patients humains adultes. Nous n’aborderons pas ici des thématiques pédiatriques.

Venus des États-Unis, dix macaques rhésus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery, et dix élevés par leur mère, forment la cohorte que ce projet suit jusqu'à l'âge adulte. 21 macaques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué, tous étant réintroduits dans leur groupe social. Ils reçoivent une puce sous la peau de chaque avant-bras, sont capturés la veille de chaque IRM, transportés une heure et demie à l'aller comme au retour, puis anesthésiés et intubés pour trois sessions de scanner d'environ trois heures. Le porteur signale l'irritation de la trachée liée à l'intubation, l'accumulation d'agent de contraste dans le cerveau qui impose une injection de chélateur du fer, les conflits et blessures possibles au retour dans le groupe, et présente le suivi de cette cohorte déjà constituée comme un élément de réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.

Objectifs

Les effets de l'adversité sociale précoce ont un impact sur plusieurs domaines des fonctions sociales et cognitives, générant un certain nombre de déficits de régulation émotionnelle et d'attention qui peuvent perdurer tout au long de la vie de l'individu. Les troubles du développement humain, tels que l'anxiété et le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité, comptent parmi les formes les plus répandues de troubles psychiatriques et sont connus pour avoir un impact extrêmement négatif sur la vie sociale. Ce projet à pour but de mieux comprendre ces pathologies, d'un point de vue mécanistique et comportemental afin de mieux les détecter et de les traiter. Le projet proposé utilisera un modèle de primate non humain pour mieux comprendre l'impact de l'adversité sociale précoce sur l'émergence de déficits sociaux et cognitifs, de la préadolescence à l'âge adulte. Pour ce faire nous allons profiter de l’existence d’un groupe de macaques rhésus unique sur le territoire français composé d’individus avec des histoires de vie très différentes. Ce groupe en provenance des USA est composé de 10 individus élevés avec leur mère et de 10 individus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery avec d’autres bébés macaques. Le premier objectif du projet est de mieux comprendre comment la privation sociale précoce module le comportement dans trois dimensions principales de la cognition sociale : les fonctions de régulation émotionnelle, la perception sociale et l'attention. Afin de répondre a cet objectif nous utiliserons des tests comportementaux automatiques en accès libre (sans contrainte pour l’animal). Le deuxième objectif est de mieux comprendre comment l'altération des fonctions sociales associée à l'adversité précoce affecte l'activité des régions cérébrales impliquées dans le traitement sensoriel de la voix et des visages. Le troisième objectif est de mieux comprendre comment deux neurotransmetteurs naturellement présents dans le cerveau interviennent dans les déficits sociaux et d'attention associés à l'adversité précoce. Afin de répondre à ces deux derniers objectifs, l’activité cérébrale des macaques sera étudiée grâce à la réalisation des IRMs, une technique non invasive utilisé aussi chez l’humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs désignés EU1/2 et EU2/2.

Bénéfices attendus

Les effets de l'adversité sociale précoce chez l’humain ont un impact sur plusieurs domaines des fonctions sociales et cognitives, générant un certain nombre de déficits de régulation émotionnelle et d'attention qui peuvent perdurer tout au long de la vie de l'individu. Les troubles du développement, tels que l'anxiété et le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité, comptent parmi les formes les plus répandues de troubles psychiatriques et sont connus pour avoir un impact extrêmement négatif sur la vie sociale. Ce projet à pour but de mieux comprendre ces pathologies, d'un point de vue mécanistique et comportemental afin de mieux les détecter et de les traiter. Spécifiquement, nous prédisons des différences entre les individus exposés à une adversité précoce et les individus élevés avec leur mère au sein de leur groupe social, en ce qui concerne (i) leur performance à des tâches comportementales de type social impliquant des stimuli affectifs (vocalisations, visages) et (ii) dans les réponses cérébrales à des modulations sensorielles impliquant des stimuli sociaux (vocalisations, visages) ou des modulations neuropharmacologiques. Nous testerons l’impact de l’ocytocine, neuromodulateur impliqué dans les comportements sociaux, ainsi que l’impact de la noradrénaline, neuromodulateur impliqué dans le contrôle de l’attention et de l’impulsivité. Ces résultats permettront de mieux comprendre comment l’adversité sociale précoce affecte l’émergence de déficits sociaux et cognitifs à l’âge adulte, avec des applications potentielles pour la détection et le traitement de ces déficits chez l’humain.

Procédures

Pose d’une puce RFID en position sous-cutanée dans chaque avant bras : celle-ci se réalise dans l’EU2/2 lors du contrôle sanitaire des animaux qui dure en moyenne 20 minutes, la pose de puces en elle-même ne dure pas plus de 10 minutes. La capture des animaux se réalise la veille de l’IRM à l’EU2/2 et dure en moyenne une heure (avec ou sans anesthésie). Le transport des animaux jusqu’au centre IRM de l’EU1/2 se décompose en deux trajets (aller et retour) d’une heure et demie chacun. Chacune des trois sessions de scanning à l’EU1/2 dure environ 3 heures incluant la sédation et l’anesthésie de l’animal, son positionnement dans le scanner, l’acquisition des séquences anatomiques et fonctionnelles, puis sa sortie et son réveil. Les sorties, absences et réintroductions auront un impact sur le ou les groupes et sur les individus de ces groupes pouvant engendrer des conflits avec blessures pendant l'absence de certains animaux et aux retours d'autres.

Impact sur les animaux

1) Pose des puces RFID : Stress lié à la capture pouvant nécessiter (rarement) une télé-anesthésie; mise à jeûn 12h avant l’anesthésie ; douleur liée à la piqûre pour l’anesthésie. 2) Transport à l’EU1/2: Stress lié à la capture pouvant nécessiter (rarement) une télé-anesthésie si la méthode standard (cage au bout du tunnel) ne fonctionne pas ; stress lié au transport. 3) Scans IRMf : Stress lié à la capture en cage de contention dans un environnement peu familier; douleur liée à la piqûre pour l’anesthésie; irritation de la trachée liée à l’intubation pour l’anesthésie gazeuse; accumulation d’agent de contraste dans les tissus cérébraux nécessitant une injection d’un chélateur du fer après la 3e session. 4) Hébergement à l’EU1/2: stress lié à la séparation du groupe social pendant une semaine, affectant potentiellement les groupes de manière répétée; stress lié à l’hébergement dans un environnement non familier; stress et blessures potentielles liées à la réintroduction dans le groupe social à l’EU2/2.

Devenir

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduits dans leur groupe social.

Remplacement

La recherche scientifique actuelle montre que l’adversité sociale a des effets complexes sur le développement physiologique et cognitif, touchant le système immunitaire, la croissance, le métabolisme et des fonctions allant de la perception sensorielle à des capacités plus élaborées comme la socialisation et la régulation émotionnelle. Cependant, ces impacts ne peuvent être reproduits ni sur des modèles biologiques in vitro, ni sur des modèles computationnels in silico, nécessitant des études sur des organismes en interaction sociale. Ainsi, le recours à l’animal est essentiel. Pour modéliser les effets de l’adversité sociale en lien avec les comportements et les mécanismes cérébraux, les primates constituent des modèles privilégiés. Bien que diverses espèces sociales soient étudiées, seules les espèces partageant des structures cérébrales et des fonctions cognitives comparables à celles des humains offrent une pertinence suffisante. Parmi les primates, les macaques se distinguent par leurs comportements sociaux sophistiqués (hiérarchie, reconnaissance, coopération) et leurs similarités cérébrales avec l’humain, notamment au niveau du cortex préfrontal et de l’amygdale. Ces caractéristiques les rendent particulièrement adaptés à l’étude des effets de l’adversité sociale sur le cerveau et le comportement. Enfin, les études sur l’humain sont limitées par l’impossibilité de contrôler précisément les environnements précoces et leurs évolutions. L’expérimentation chez les macaques permet un contrôle rigoureux des conditions de vie, rendant les résultats plus fiables et transférables à l’humain. Ce projet s’appuie sur un groupe unique de macaques rhésus, dont une moitié a été séparée de leur mère à la naissance, offrant une opportunité unique pour explorer les liens entre adversité sociale, cerveau et comportement.

Réduction

Nous souhaitons profiter de la totalité de ce groupe de macaques unique composéde 10 individus contrôles et 10 individus avec adversité précoce. Ce nombre procurera la puissance statistique nécessaire pour détecter des différences même subtiles entre les deux groupes comme indiqué par des travaux publiés ayant comparé ces deux groupes plus jeunes. La taille de 20 individus correspond à la taille standard de groupes humains étudiés en IRMf et permettant des analyses avec les sujets en variable aléatoire (test T de Student) pouvant être généralisées au-delà de l’échantillon . Des analyses similaires réalisées lorsque ces mêmes animaux étaient plus jeunes ont permis d’observer de claires distinctions fonctionnelles sur des réseaux spécifiques. Les animaux correspondent à une cohorte suivie depuis le plus jeune âge. Le fait de suivre cette cohorte longitudinalement permet d'adresser les effets de l'adversité précoce chez les jeunes puis les adultes sans recours à de nouveaux animaux et correspond à un élément de réduction. Nous utiliserons un seul singe supplémentaire, non relié au groupe de 20 animaux, pour la mise au point du protocole d'IRM.

Raffinement

Les animaleries des deux EU font l’objet d’un planning d’enrichissements soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). La pose des puces de radio-identification se fera lors du contrôle vétérinaire annuel, afin de limiter les interventions. Pour la capture pour le transport à l’EU1/2 nous amènerons le singe à se rendre volontairement dans une boite de transport accolée au tunnel de son hébergement dans laquelle il sera transféré puis dans une zone d’isolement temporaire en attendant son transport. En cas d’échec de cette méthode, il sera capturé par anesthésie par fléchage. Le fait de grouper les trois sessions d’acquisition sur une semaine consécutive permettra de n’effectuer qu’une seule capture, transport et réintroduction par animal au lieu de trois. Transport : les animaux seront placés dans des cages de transport adaptées et maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache inox positionné sur la cage. Le compartiment du véhicule agréé est chauffé lors du transport. Séparation : Les individus ne seront séparés que temporairement (une semaine) de leur groupe social le temps du protocole d’anesthésie et d’acquisition IRM. Après la session IRM à l’EU1/2, au retour à l’EU2/2 les sujets sont surveillés en infirmerie puis réintégrés à leur groupe social le matin suivant. Les réintroductions sont faites selon les procédures validées par le responsable du BEA. Elles sont toutes supervisées par le responsable BEA et réalisées et suivies par l'assistante spécialisée. Sessions IRM au sein de l’EU1/2 : L’injection d’un agent de contraste permet d’augmenter le rapport signal/bruit et donc de diminuer le nombre de scans nécessaires par individu. Si un problème survient lors de l’anesthésie pendant l’IRM (par exemple arythmie, problème respiratoire, hypoxie, arrêt cardiaque, hypothermie etc.), alors le scan est stoppé immédiatement et l’animal est réveillé et surveillé. Les sessions de scans seront séparées par au moins une journée sans scanning permettant aux animaux une journée complète avec alimentation et hydratation normale avant la mise à jeun et anesthésie suivante. Les procédures ne prévoient pas d’infliger une douleur qui nécessiterait une analgésie; cependant des points limites adaptés ont été mis en place en cas de problèmes.

Choix des espèces

Les effets de l’adversité sociale sur le développement physiologique et cognitif touchent le système immunitaire, la croissance, le métabolisme, ainsi que des fonctions comme la socialisation et la régulation émotionnelle. Étudier ces impacts nécessite des organismes en interaction sociale, rendant l’expérimentation animale indispensable. Les macaques, par leur proximité cognitive et cérébrale avec l’humain, sont des modèles idéaux pour explorer ces effets. Leurs comportements sociaux complexes et leurs structures cérébrales, notamment au niveau du cortex préfrontal et de l’amygdale, permettent d’étudier des mécanismes comparables à ceux des humains. En raison des limites des études humaines, l’expérimentation chez les macaques, avec un contrôle strict des conditions de vie, offre des résultats fiables et transposables. Ce projet s’appuie sur un groupe unique de macaques rhésus pour approfondir ces liens: ce groupe en provenance des USA est composé de 10 individus élevés avec leur mère et de 10 individus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery avec d’autres bébés macaques. Le groupe principal est constitué d'adultes ayant soit subi une adversité précoce dans l'enfance ou non. La phase d'étude des animaux est justifiée par les objectifs du projet, à savoir l'étude de l'impact des conditions sociales de développement sur le comportement et l'activité cérébrale à l'âge adulte.

Gardés en vie pour être réintroduits plus tard dans d'autres protocoles, 50 porcs, 25 macaques à longue queue et 25 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur prélèvent sous anesthésie salive, cellules de joue, sang ou moelle osseuse, cette dernière ponction pouvant provoquer une douleur au point de piqûre et imposant au moins quatre semaines de récupération. Aucune question scientifique propre n'est posée ici. Ces prélèvements alimentent des tests in vitro préalables, destinés à décider si telle ou telle espèce sera utilisée ensuite, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour obtenir ces échantillons.

Objectifs

Cette demande correspond à un autorisation de prélèvements d’échantillons biologiques en dehors et/ou en amont de projet autorisés. Effectivement, il est parfois nécessaire de réaliser en dehors et/ou en amont de protocoles autorisés des prélèvements biologiques de petits ou moyens volumes/quantité (sang, moelle osseuse, salive, cellules buccales par exemple …) pour permettre la réalisation de test in vitro préalable à une étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces prélèvements sont de pouvoir étudier et évaluer in vitro certains paramètres liés à ces espèces. Ces résultats préliminaires établis in vitro en amont des protocoles d’expérimentation animale permettent de définir, de cibler et d’affiner l’intérêt et la rationalité d’utiliser ou non telle ou telle espèce, et potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans une démarche de respect de la règle des 3R.

Procédures

Prélèvements sous anesthésie : salive par aspiration (5 min), prélèvement de cellules de bas-joues par frottement (5 min), de sang (5 min) ou de moelle osseuse (15 min). Prélèvement unitaire suivi d’une période de récupération pour chaque individu.

Impact sur les animaux

Les prélèvements biologiques sont réalisés sous anesthésie de façon à atténuer le stress des animaux. Les prélèvements de salives, cellules buccales et de sang sont des prélèvements peu invasifs qui peuvent induire de l’inconfort. Les prélèvements de sang nécessitent un temps de récupération selon le volume prélevé. Le prélèvement de moelle osseuse peut induire une douleur au point de ponction et sera associée à une analgésie. Il nécessite un temps de récupération d’au moins 4 semaines après le prélèvement.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et pourront être introduits ultérieurement dans un autre projet expérimental dans le cadre d'une procédure légère ou modérée, après décision du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de remplacement possible pour l’obtention d’échantillons biologiques intrinsèques aux animaux pour tests in vitro. Ces prélèvements répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement.

Réduction

Cette autorisation correspond à des besoins ponctuels d’échantillons biologiques chez des animaux en dehors et/ou en amont de protocoles, c’est pourquoi aucune approche statistique n’est envisagée. Cependant les animaux concernés par cette autorisation, en première utilisation ou en réutilisation après un protocole antérieur, seront inclus ultérieurement dans différents projets d’études expérimentales pré-cliniques autorisés, selon décision du vétérinaire, ce qui contribue à une réduction du nombre d’animaux utilisés à moyen terme.

Raffinement

De façon à diminuer le stress et l’inconfort des animaux, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, sur tapis chauffant. Le volume des prélèvements sanguins sera limité à la volémie de chaque individu. Leur fréquence sera limitée au temps de récupération par rapport au volume précédemment prélevé. Cependant, dans la grande majorité des cas, les volumes de sang prélevés seront largement inférieurs aux limites. Le prélèvement de moelle osseuse sera accompagné d’un traitement analgésique. De façon à diminuer les interventions et si les besoins scientifiques de mise au point le nécessitent, plusieurs prélèvements pourront être réalisés en même temps sur un même individu à conditions qu’ils n’altèrent pas la récupération de l’individu. De façon à s'assurer du bien-être des animaux prélevés, les points limites mis en place seront observés et appliqués si besoin. Les primates sont hébergés en volière de façon à respecter leur mode de vie en communauté. Les porcs, selon leur taille, sont hébergés par 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. L’ensemble des animaux sera soumis une surveillance quotidienne.

Choix des espèces

Les prélèvements échantillons biologiques de macaques, babouins et porcs, sont nécessaires à la connaissance de plusieurs paramètres en amont d’évaluation précliniques. Ces animaux présentent des similitudes au niveau anatomique, physiologique, métabolique et immunologique avec l’homme. Il s’agit de jeunes adultes et adultes correspondant aux animaux utilisés dans notre établissement selon l’objectif des projets.