Primates

Infectés par le virus de la grippe H1N1 sous anesthésie, 76 ouistitis communs subissent huit écouvillonnages du nez et de la gorge, huit prélèvements sanguins, trois à quatre lavages des poumons et jusqu'à quinze séances d'imagerie, chaque fois sous anesthésie. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et tous les animaux sont tués à la fin, le porteur invoquant le risque de contamination humaine, l'usage d'une souche génétiquement modifiée et le prélèvement des poumons et des ganglions. L'objet du projet est de valider l'espèce elle-même comme modèle non-rongeur, avant d'y évaluer plus tard des candidats vaccins et médicaments. Le porteur qualifie le recours au ouistiti de "forme de remplacement partiel", au motif que ce primate est génétiquement un peu plus éloigné de l'être humain que le macaque.

Objectifs

PARAGRAPHE MODIFIE D’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les virus de la grippe saisonnière sont responsables de 3 à 5 millions de malades sévères chaque année, dont 650 000 morts annuellement. En particulier, le virus de la grippe A H1N1, qui a été à l’origine de la pandémie de grippe en 2009-2010, continue aujourd’hui de circuler en tant que grippe saisonnière et de nouveaux variants font peser la menace d’une nouvelle pandémie. Que ce soit pour prévenir ou contenir une infection saisonnière à la grippe A, ou pour soutenir les mesures d’urgence dès l’apparition d’une pandémie, il est essentiel d’avoir des candidats-vaccins et candidats-médicaments éprouvés et validés par les autorités sanitaires. Avant de valider ces candidats, le modèle animal sur lequel ces validations auront lieu doit lui-même être validé. L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence scientifique du ouistiti commun (Callithrix jacchus) comme espèce non-rongeur pour les études concernant le virus de la grippe A H1N1. Cette espèce a déjà fait l’objet d’études publiées sur l’infection à la grippe A H1N1 dans d’autres centres avec des résultats prometteurs. PLUSIEURS souches SERONT utilisées dans ce projet DONT DES SOUCHES RENDUES BIOLUMINESCENTES. Afin de valider ce modèle, une phase d’étude de la cinétique d’infection virale sera réalisée par imagerie de bioluminescence associée à un suivi de la charge virale et un suivi de la réponse immunitaire. Une deuxième phase permettra d’étudier la transmission virale entre des animaux préalablement infectés par la grippe et des animaux naïfs, en co-hébergement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser et valider l’utilisation du ouistiti commun comme espèce pertinente pour l’évaluation de la pharmacologie et de la sécurité des candidats-vaccins et candidats-médicaments contre la grippe A H1N1.

Procédures

PARAGRAPHE MODIFIE 4 animaux subiront au maximum 3 lavages broncho-alvéolaire réalisés sous anesthésie (geste répété au maximum 3 fois). La procédure de lavage broncho-alvéolaire durera environ 10 à 20 minutes incluant l’anesthésie. AU MAXIMUM 72 ANIMAUX seront infectés sous anesthésies. Ce geste durera maximum 25 minutes anesthésie comprise. Pour tous les animaux, 8 écouvillonnages pharyngés et nasaux OU LAVAGE NASALE et 8 prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés. Des lavages broncho-alvéolaires seront réalisés 3 à 4 fois sur chaque animal avec un minimum de 6 jours entre 2 lavages. POUR 3 ANIMAUX, DES LAVAGES BRONCHO-ALVEOLAIRES POURRONT ETRE REALISES AVANT INFECTION PUIS QUOTIDIENNEMENT PENDANT 7 JOURS POST-INFECTION (TOTAL DE 8 FOIS). Pour les animaux infectés avec les souches de virus bioluminescentes, des acquisitions d’imagerie par bioluminescence, sous anesthésie, seront réalisés 15 fois au cours de l’étude, avec une injection de substrat bioluminescent avant chaque acquisition. Une mise à jeun de 2 à 3h maximum sera réalisée avant chaque anesthésie. Afin de limiter les anesthésies, lorsque des actes auront lieu le même jour, ils seront faits au cours de la même anesthésie ainsi : - la durée d’une acquisition d’imagerie seule sera d’environ 20 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages pharyngés et nasaux OU LAVAGE NASALE et un prélèvement de sang sera d’environ 35 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages pharyngés et nasaux OU LAVAGE NASALE, un prélèvement de sang et un lavage broncho-alvéolaire sera de maximum 45 minutes anesthésie comprise. 8 animaux de ce projet seront hébergés en individuel pendant un maximum de 48h.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’infection par le virus de la grippe A H1N1 : éternuement, toux, jetage nasal, jetage oculaire, perte de poids, diarrhée, fièvre, modifications de la respiration. D’autres effets secondaires attendus sont liés aux actes techniques : - anesthésie : hypothermie, bradycardie, arythmie, arrêt cardio-respiratoire ; - prélèvement sanguin : hémorragie, hématome ; - LBA : toux, dyspnée ; - Ecouvillonnage nasal et laryngée : léger saignement, éternuement, toux ; - Injection IV : hémorragie, hématome.

Devenir

PARAGRAPHE MODIFIE Le risque de contamination à l’homme ou à d’autres animaux par un pathogène de classe 2 et le risque pour l’environnement du fait de l’utilisation d’une souche génétiquement modifiée justifient que tous les animaux soient euthanasiés en fin de projet. DE PLUS DES PRELEVEMENTS D’ORGANES TELS QUE LES POUMONS, LA TRACHEE, LES GANGLIONS LYMPHATIQUES AXILLAIRES, CERVICAUX ET MEDIASTINAUX POURRONT ETRE REALISES EN FIN D’ETUDE AFIN DE MESURER LA CHARGE VIRALE.

Remplacement

A ce jour, aucune alternative in-vitro à l’expérimentation animale ne permet de mimer les mécanismes d’infection de la grippe à l’échelle d’un organisme entier. De plus, malgré l’emploi d’autres modèles animaux comme les rongeurs (hamsters ou souris) ou les furets, leurs éloignements génétiques liés à l’évolution des espèces comportent quelques limites d’un point de vue physiopathologique et immunitaire. A l’inverse, les modèles de Primates Non Humains dont le ouistiti commun sont plus proches de l’Homme et en font de bons modèles pour étudier la réponse immunitaire/vaccinale et les modalités de transmission des virus respiratoires comme la grippe. Le ouistiti, légèrement plus éloigné génétiquement que le macaque cynomolgus, est une forme de remplacement partiel.

Réduction

PARAGRAPHE MODIFIE Le nombre d’animaux inclus par étude et par groupe a été évalué en fonction de l’objectif de chaque étape. Ainsi, pour l’étape 1 (étude pilote), seuls 4 animaux seront inclus pour valider la méthode de lavage broncho-alvéolaire. Pour l’étape 2 (cinétique virale), 18 animaux seront inclus et répartis en 2 groupes de 9 animaux. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux et éviter l’utilisation d’un groupe contrôle non-infecté, chaque animal sera son propre témoin, à partir des données récoltées à J-5. Si les résultats obtenus sont insuffisants ou incomplets, cette étape pourrait être répétée EN MODIFIANT SOIT DES PARAMETRES DU PROTOCOLE D’INFECTION AFIN D’OPTIMISER CELUI-CI SUR 6 AUTRES ANIMAUX SOIT en utilisant d’autres souches de virus bioluminescents sur 24 autres animaux réparties en 3 groupes de 8 animaux. Pour l’étape 3 (transmission), 24 animaux seront inclus et répartis en un groupe de 16 animaux (infectés) et un groupe de 8 animaux (non infectés). AINSI, ENTRE 52 ET 76 OUISTITIS SERONT UTILISES DANS CE PROJET.

Raffinement

PARAGRAPHE MODIFIE Les ouistitis seront hébergés en groupes sociaux de 2 ou 3 individus (sauf maximum 48h pour 8 animaux lors de l’étape 3) déjà constitués par le fournisseur LORSQUE CELA EST POSSIBLE. Les cages sont conformes aux normes en vigueur, et sont équipées de perchoirs et plateforme, d’un hamac et d’un nid. Le programme d’enrichissement inclut du temps dédié à la socialisation homme-animal et l’habituation aux actes, de la recherche alimentaire (tapis de fouille avec friandises) et un apport de gomme arabique. L’acclimatation durera au MINIMUM 3 SEMAINES durant laquelle les animaux seront seulement socialisés et habitués à des actes non invasifs (approche au grillage, nourrissage à la main, pesée, examen clinique), dans la continuité du programme réalisé chez le fournisseur. Une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant le transport. Si les hiérarchies sont maintenues, l’habituation aux actes débutera la seconde semaine d’acclimatation. LORSQUE CELA EST POSSIBLE ET pour éviter une réorganisation des hiérarchies après le transport, des enrichissements de leur cage chez l’éleveur (avec leurs odeurs) seront conservés pendant le transport et transférer dans les nouvelles cages. EN CAS D’INCOMPATIBILITE SOCIALE, LA SBEA ET LES CAPACITAIRES PNH CONSEILLERONT L’EU POUR LIMITER L’IMPACT SUR LES ANIMAUX. Tous les actes seront regroupés au même moment, pour réduire le nombre d’anesthésie. Lors de l’anesthésie, du gel oculaire sera appliqué et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Pour surveiller l’état de santé des animaux, une grille de score sera utilisée au moins quotidiennement (si nécessaire et en fonction du score, les observations seront effectuées 2 ou 3 fois par jour). Pendant la période d’isolement, les animaux seront maintenus individuellement à côté les uns des autres (communication possible) et ils recevront une socialisation homme animal plus importante. Des enrichissements de leur cage (en groupe) avec leurs odeurs seront transférés dans leur nouvelle cage pour l’hébergement individuel et une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant la remise en groupe.

Choix des espèces

PARAGRAPHE MODIFIE Bien que d’autres modèles animaux soient utilisés pour étudier la grippe A (souris, furet), leur éloignement génétique n’en font pas de bons modèles prédictifs chez l’Homme sur le plan physiopathologique et des modalités de transmission. A l’inverse, les Primates Non Humains dont le ouistiti, plus proches d’un point de vue immunologique et physiologique, sont les modèles les plus proches de l’Homme pour l’étude des infections aux virus respiratoires comme la grippe. Plusieurs études ont montré la pertinence de cette espèce pour étudier la grippe A H1N1. De plus, cette espèce a plusieurs atouts comme la susceptibilité aux infections virales à tropisme respiratoire, la facilité de contention et sa facilité d’approvisionnement. Les animaux seront des animaux adultes D’AGE COMPRIS ENTRE 1.5 ET 7 ANS afin que les animaux aient un système immunitaire complétement mature et ainsi réaliser les études avec des groupes immunologiquement homogènes.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est infecté par le virus de l'immunodéficience simienne, puis subit une quinzaine d'anesthésies générales, une quinzaine de prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse et environ sept ablations chirurgicales de ganglions lymphatiques, avec un hébergement individuel une fois infecté. Le porteur attend de l'infection une perte de poids, des diarrhées, une chute des lymphocytes, des nodules palpables et des lésions cutanées, et prévoit de compléter l'alimentation si les anesthésies répétées coupent l'appétit. Il affirme que le macaque est le seul modèle animal reproduisant la maladie humaine et qu'il n'existe "pas d'autre modèle animal" pour le sida, l'objectif restant de comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires échouent à contrôler le virus.

Objectifs

Malgré des décennies de recherche, il n'existe toujours pas de vaccin ni de traitement curatif contre le VIH/SIDA. Pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle de l'infection, nous utilisons deux modèles animaux primates non humains (il s’agit d’animaux d’élevage) infectés par le virus d’immunodéficience simienne (VIS) : • Le singe vert d’Afrique, naturellement infecté par le VIS sans développer la maladie, • Et le macaque cynomolgus, chez qui l’infection par le VIS est pathogène, comme chez l’humain. Un intérêt particulier est porté à un type de cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles (NK, natural killers), qui jouent un rôle crucial dans la réponse antivirale, notamment au sein des tissus lymphoïdes secondaires . Ces tissus, comme les ganglions ou la rate, sont les lieux stratégiques où les cellules immunitaires se rencontrent et s’activent pour organiser la défense de l’organisme. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules T, des globules blancs spécialisés qui reconnaissent spécifiquement un agent infectieux et coordonnent la réponse immunitaire. Tout comme elles,ces cellules NK peuvent acquérir des caractéristiques de mémoire et s'adapter fonctionnellement. Il a été d’ores et déjà montré chez le singe vert d’Afrique que les cellules NK adaptatives fortement différenciées se développent dans les tissus lymphoïdes secondaires et contribuent à un contrôle efficace du virus. Il n’y a pas de contrôle chez le macaque cynomolgus. Pour comprendre l'absence de contrôle du virus chez ce dernier, cette étude sera menée sur six macaques infectés par le VIS. Cette étude se concentre sur l’analyse de la charge virale ainsi que l’évaluation de l’ensemble des caractéristiques phénotypiques, tel que leur apparence ou les molécules présentes à leur surface et fonctions des cellules NK dans divers tissus. L’objectif global est de comprendre les conditions qui favorisent ou empêchent la génération de cellules NK efficaces, et d’identifier des éléments précis du système immunitaire sur lesquels on peut agir afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle macaque vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, sont dysfonctionnelles et incapables de contrôler l'infection par le virus VIS, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur ce modèle, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles sont régulées. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules dans l’infection. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui pourraient rendre ces cellules NK particulièrement efficaces pour éliminer les cellules infectées. Nos résultats pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus VIS (une fois, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection: Perte de poids, diarrhée, baisse importante des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’ablation de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où sont activées les cellules NK.

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le modèle primateest, pour toutes ses similarités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que celui-ci. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est pathogène, comme chez l’humain, nous permet d'analyser et de comparer, en absence de traitement, les réponses cellulaires dans différents tissus en plus du sang, notamment la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, l’intestin, le foie et la rate qui jouent un rôle dans la pathogenèse. Le modèle du macaque cynomolgus permet donc d’analyser les interactions hôte/virus dans des contextes contrôlés (virus, timing) facilitant ainsi l’identification des caractéristiques propres à l’organisme qui influencent sa réponse face au virus. Par ailleurs, seul le modèle animal permet d’analyser les interactions virus/hôte dès les premiers jours post-infection (période qui généralement est impossible à étudier chez l’humain infecté par le VIH), or il est connu que les temps précoces suites à l’infection sont fortement impliqués dans la régulation des réponses immunes et l’établissement des réservoirs viraux. Il est donc très important d’étudier cette période précoce pour mieux comprendre les facteurs responsables de l’induction d’un contrôle viral efficace.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec un soutien thermique pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (patés pour singe, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. En cas d’apparition de réaction locale, un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe. Les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Le macaque est le seul modèle animal, qui, lorsqu’il est infecté par le SIV présente une physiopathologie comparable à celle observée chez l’humain infecté par le VIH. C’est le modèle animal le plus pertinent pour étudier et comprendre les mécanismes de transmission du virus et de développement du SIDA chez l’Humain. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier pourquoi le système immunitaire est dysfonctionnel pour lutter contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Tués sous anesthésie 113 jours après l'injection pour que leurs organes soient récoltés, trois macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un candidat médicament différent contre le diabète de type 2, puis subit seize prélèvements sanguins sur dix-sept semaines et quatre biopsies du quadriceps sous anesthésie. Les prises de sang se font sur animal vigile, avec des contentions de trois à quinze minutes, le porteur expliquant que l'anesthésie modifierait les paramètres étudiés. L'étude sert à désigner lequel des trois produits poursuivra son développement, et le porteur affirme que seul un "organisme entier", où tous les organes interagissent, permet d'y répondre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments contre le diabète de type 2 agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Les candidats médicaments testés bloquent sélectivement certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ces candidats médicaments visent donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ces médicaments permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractéristiques principales des produits une fois administrés dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Les résultats de cette étude permettront de comparer les trois candidats médicaments afin de sélectionner le produit leader qui poursuivra son développement avant d’être mis sur le marché. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché du traitement innovant le plus efficace contre le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus de deux semaines d’acclimatation et d’habituation, les 3 animaux inclus dans le projet recevront une injection intra-veineuse lente du candidat médicament (perfusion d’un produit différent pour chaque animal durant 5 à 10 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile afin d'étudier la concentration du produit dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées au niveau des quadriceps des animaux (prélèvements réalisés à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) et durera environ 20 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration des candidats médicaments et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration intra-veineuse par perfusion lente peut provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 3 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des produits testés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Ce type d'étude in vivo chez l’animal est indispensable au développement de nouvelles thérapies. Les données issues de ce projet ne pourraient être obtenues in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 3 animaux seront utilisés (1/groupe). Chaque animal recevra un candidat thérapeutique différent, il est donc impossible de réduire d’avantage le nombre d’animaux utilisé par groupe. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grandes cohortes d’animaux pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum deux semaines avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Chacun des 180 macaques à longue queue de ce projet peut subir une quarantaine d'anesthésies générales, autant de prélèvements sanguins, une trentaine d'écouvillonnages nasaux, trachéaux et rectaux, quatre ponctions de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à dix lavages broncho-alvéolaires, le tout classé en souffrance modérée. Une puce de télémétrie est implantée sous la peau, et les animaux exposés au SARS-CoV-2 ou à la grippe passent jusqu'à huit semaines seuls en cage. La modification déposée pour cette version ajoute quatre biopsies de peau, quatre biopsies de muqueuse rectale ou buccale et quatre prélèvements de liquide séminal, pour "avoir accès à plus de compartiments". 108 macaques sont tués pour prélever leurs tissus, les 72 autres gardés comme modèles de réinfection ou comme convalescents, avec une réattribution à d'autres études que le porteur n'exclut pas.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique. MODIFICATION : Nous avons effectué des modifications pour pouvoir prélever plus de type d’échantillons différents lors des étude de biodistribution pour avoir accès à plus de compartiments.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux ET RECTAUX (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés) - MODIFICATIONS : -Biopsie de peau (4 fois maximum, 30 minutes)-Biopsie de muqueuse rectale ou buccale (4 fois maximum, 20 minutes). -Prélèvement de liquide séminal (4 fois maximum, 20 minutes, animaux de l’étude pilote)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

50 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, un émetteur implanté dans l'abdomen et des électrodes placées sous la peau enregistrant leur fonction cardiovasculaire. Ils reçoivent, une fois ou de façon répétée, des molécules en cours de test, et les prises de sang peuvent atteindre 19,5 ml toutes les deux semaines, soit 10 % de leur volume sanguin total. Le porteur écrit que l'implant, dont la durée de vie est d'environ deux ans, rend ces animaux inaptes à toute réhabilitation, et qu'ils seront réutilisés dans d'autres projets ou tués. La finalité est réglementaire : produire le rapport de pharmacologie de sécurité qui accompagne une demande d'essai clinique, étape que le porteur qualifie d'"indispensable" faute de "modèle de substitution".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un composé thérapeutique (potentiellement futur médicament). La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique des ces composés. Préalablement aux études cliniques, leurs effets sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire ces effets pharmacologiques. Seule l’expérimentation animale permet de définir l’innocuité des composés thérapeutiques afin de sécuriser les premiers essais chez l’homme. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations vétérinaires et pharmaceutiques internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de ces composés sur le système cardiovasculaire du macaque. L’évaluation de la fonction cardiovasculaire se fera par l’utilisation d’électrodes sous-cutanée et d’un émetteur placer dans l’abdomen, avant et après administration du composé thérapeutique test. La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé test sur la fonction cardiovasculaire. Ce rapport, requis par la réglementation, fera partie intégrante de la demande d’essai clinique.

Bénéfices attendus

À l’échelle mondiale, les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès avec environ 17,9 millions de morts par an, suivies des cancers (10 millions/an), des maladies neurologiques (9 millions/an), des maladies infectieuses (7,7 millions/an), des maladies respiratoires chroniques (3,9 millions/an) et du diabète (1,5 million/an). Pour ces pathologies, il n’existe à ce jour aucune solution thérapeutique satisfaisante. Ce projet vise à couvrir une étape indispensable dans le développement de solutions thérapeutiques. La pharmacologie de sécurité est une phase règlementaire indispensable au développement préclinique, préalable aux études cliniques. Elle permet de caractériser les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. 10 à 12 % des xénobiotiques échouent en essais cliniques en raison de problèmes de sécurité cardiovasculaire. Ces risques cardiovasculaires sont mieux identifiés et anticipés aujourd’hui grâce à l'intégration des études de pharmacologie de sécurité chez le macaque en raison de sa valeur prédictive, notamment dans le cadre des recommandations médicales internationnales. A court terme, le bénéfice premier de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique, spécifique à la fonction cardiovasculaire, d’un composé. A long terme, les données obtenues de ces études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers de demandes d’autoristion d’essais cliniques. Ces études réduiront les risques cardiovasculaires lors de ces essais et contribueront à : 1. améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. améliorer la sécurité des patients, en identifiant/caractérisant les effets cardiovasculaires indésirables 3. optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. réduire les coûts de santé (améliorer la sécurité/efficacité des traitements) 6. répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration, unique ou répété, d'une molécule thérapeutique en phase de test ou d'un composé de référence (témoin). Chaque administration dure quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Des prélèvements sanguins peuvent être effectués (5 minutes environ). La quantité et la fréquence acceptables dépendent du volume sanguin total (VST). Chez le macaque, il est estimé à 195 ml pour un macaque de 3 kg. Environ 10 % du VST peut être prélevé en toute sécurité toutes les 2 semaines (soit 19.5mL) , 7,5 % tous les 7 jours (15 ml) selon les recommandations internationnales vétérinaires. En cas de cinétique (plusieurs prélèvements rapprochés pour déterminer l'évolution de la concentration de la molécule dans le sang), les temps de prélèvement sont déterminés sont les caractéristiques de la molécule testée tout en respectant le volume maximal possible de 7,5% sur 7 jours glissant. Par exemple : prélèvement avant administration, puis 3h, 6h, 12h et 24h après, 0.5 à 1 ml à chaque temps. Dans une étude standard, 5 administrations sont nécessaires : 1 avec un placebo, 3 avec une doses différentes de la molécule thérapeutique, et une dernière avec le dose la plus importante utilisé afin d'effectuer des dosages de la molécule et s'assurer de la bonne exposition de l'animal.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration répétée d'une molécule peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque de lésions ou d’infection lors d’administration intrathécale, intracraniale (lésions neurologiques, paralysie partielle) ou intra-articulaire (boiterie, arthrite). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : il n’est pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie en raison de la faible dose administrée de xénobiotique ou d'une administration unique.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet ne sont pas aptes à une réhabilitation en raison du système d'enregistrement cardiovasculaire implanté. Le système a une durée de vie d'environ 2 ans. Dans la mesure du possible, les animaux seront ré-utilisés (après validation vétérinaire prenant en compte l'ensemble de la vie de l'animal) dans d'autres projets afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. S'ils ne sont pas aptes à une réutilisation, ils seront euthanasiés.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule étrangère à l’organisme (le composé thérapeutique) et une ou plusieurs cibles liées au système cardiovasculaire (objet de cette DAP). Ces interactions englobent les effets du composé ou de ses produits de dégradation, sur des cibles, mais aussi l’influence éventuelle de ces cibles sur le composé. Une compréhension fine des mécanismes toxique et pharmacologique est donc indissociable d’une connaissance approfondie des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. À ce jour, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes impliqués dans la toxicité cardiovasculaire ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe pas, en conséquence, de modèle de substitution. C’est pourquoi la réglementation impose l’évaluation de la sécurité pharmacologique d’un composé thérapeutique avant toute administration chez l’humain. Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie cardiovasculaire de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • des études pilotes seront réalisées, si nécessaire, sur un nombre limité d’animaux. L’objectif sera d’identifier les doses les plus favorables et les moins toxiques • un même animal pourra participer à plusieurs études si et seulement si : o les composés testés précédemment n’ont présenté ni effets cardiovasculaires irréversibles, ni effets toxiques oUne période de repos de 15 jours minimum entre la fin de dernière étude et la prochaine. Cette période peut être allongé selon les profils pharmacocinétiques des produits, un avis vétérinaire. o les paramètres biochimiques et hématologiques évalués avant l’étude se situent dans les valeurs de référence attendues pour cette espèce Le nombre d’animaux par étude est de 4 (4 males) et peut aller jusqu’à 8 (4 males et 4 femelles). Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation statistique pertinente des données, et la caractérisation correcte des effets cardiovasculaires potentiels.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : La gestion du stress et de l’angoisse : à leur arrivé sur site, les animaux seront acclimatés (3 semaines) aux conditions d’hébergement, et suivent un programme d’habituation et d’entrainement aux procédures expérimentales ainsi qu'aux manipulations vigiles, basés sur le renforcement positif. Ils seront également hébergés en collectivité, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi, validé par la structure en charge du bien-être animal et le service vétérinaire La prise en charge précoce de la souffrance : un opérateur observera a minima matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement selon une procédure interne rédigé par le service vétérinaire. Dès les premiers signes de douleur, une intervention vétérinaire sera effectuée. L’utilisation de grilles de signes cliniques ou de score de douleurs permettra aux opérateurs et aux vétérinaires de mettre en place les mesures les mieux adaptés à l’état de l’animal. Un vétérinaire est toujours présent aux heures ouvrées et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7 Certaines administrations seront effectuées systématiquement sous anesthésie Des soins vétérinaires adaptés si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotiques, analgésiques. En fonction des effets attendus ou observés du composé testé sur la fonction cardiaque, des molécules permettant de traiter ces éventuels effets peuvent être utilisées. L’intégration de points limites stricts afin de limiter toutes souffrances prolongées Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface et un gilet porté le temps des enregistrements est à l’étude.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates. Les macaques sont inclus dans les études de pharmacologie à partir de 2 ans.

Seuls des mâles adultes de deux à quatre ans, écartés de l'effort reproducteur annuel de la colonie, sont retenus dans ce projet sur un primate à saisonnalité marquée. 22 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux biopsies testiculaires d'un millimètre carré sous anesthésie générale, à trois mois d'intervalle, chaque prélèvement étant suivi d'une ponction de sang à la patte arrière. Les 22 animaux retournent ensuite dans la population de l'établissement, avec un suivi de cicatrisation renforcé et des cachettes supplémentaires pour limiter les agressions entre congénères que le porteur qualifie de naturelles.

Objectifs

La compétition spermatique in-utero est à l’origine de l’évolution du système reproducteur des mâles chez de nombreuses espèces, dont les primates. Les variations saisonnières du statut sexuel des femelles peuvent intensifier la compétition entre mâles reproducteurs. Ceci peut engendrer des variations physiologiques du système reproducteur des mâles au cours de la saison de reproduction, telles qu’une augmentation du taux de testostérone, une augmentation du volume testiculaire, ou encore la réactivation de la spermatogenèse. Plus largement, l'objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes génétiques sous-jacents à la variation phénotypique de la reproduction saisonnière chez les primates en identifiant les gènes qui sont impliqués dans la spermatogénèse et la maturation spermatique, en particulier ceux impliqués dans des fonctions particulières telles que la réponse au stress oxydatif ou à l’immunité.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre d'augmenter la compréhension de l’impact des variations moléculaires associées à la reproduction saisonnière chez les primates, dans une approche comparative. L’espèce concernée faisant partie de la branche primitive des primates, les résultats de ce projet contribueront à clarifier les processus évolutifs qui ont contribué la régulation du système reproducteur chez l'humain. L'objectif sera ici de mettre en évidence les mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt momentané puis de la reprise de la spermatogenèse selon la saison chez un primate saisonnier. Ceci permettra ainsi de progresser dans la compréhension de l’ensemble des nombreux contributeurs à la régulation de la fertilité chez les mâles, tels que ceux observés au niveau du système immunitaire ou encore pour lutter contre le stress oxydatif. Par ailleurs les résultats attendus ont également un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'humain, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Procédures

Chaque animal du projet aura 2 prélèvements successifs, réalisés sous anesthésie générale et à 3 mois d'intervalle. Les prélèvements consisteront en une biopsie testiculaire de 1mm² réalisée avec un dispositif stérile dédié, suivie d'un prélèvement sanguin réalisé à la patte arrière de l'animal, dans la limite de 200µL maximum de sang par animal et par prélèvement.

Impact sur les animaux

Les gestes associés à cette procédure sont maîtrisés par les expérimentateurs et réalisés sous contrôle vétérinaire. Seuls les individus mâles adultes ne présentant aucune contre-indication vétérinaire et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel participeront à ce projet. De plus, un contrôle quotidien renforcé sera réalisé les jours suivant l’échantillonnage afin de s’assurer de la bonne cicatrisation des zones de biopsie et de l’absence d’interactions antagonistes au sein des groupes. Un enrichissement adapté et renforcé sera mis en place dans les hébergements concernés. Les produits vétérinaires utilisés dans cette procédure sont régulièrement utilisés au sein du laboratoire et les effets secondaires potentiels sont bien identifiés. Enfin, une étude pilote sur 2 animaux sera menée en amont afin de s'assurer du maintien du bien-être animal sur le long-terme et de valider la mise en place de la procédure expérimentale d'échantillonage sur la majorité des animaux (N=20) concernés par ce projet.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée 2 fois sur une durée de 3 mois, les 22 animaux du projet retourneront dans la population.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. L'animal utilisé dans ce projet est un modèle particulièrement adapté à l’étude de l’influence de la saisonnalité sur la spermatogenèse chez les primates, car il est soumis à une compétition spermatique extrême lors de la saison de reproduction qui est très courte. Les mâles participent à une compétition intense pour l’accès à l’accouplement, sachant que les femelles vont s’accoupler avec plusieurs mâles lors de la période de reproduction. A cause de cette très forte compétition spermatique, les mâles ont un des plus haut ratio taille des testicules/ taille du corps chez les primates ; leurs testicules vont augmenter de 4 à 5 fois leur volume initial en préparation de la saison de reproduction. Ce processus démarre 2 à 3 mois avant l’entrée des femelles en oestrus et la spermatogenèse est totalement arrêtée au cours de la saison de repos.

Réduction

Nous collecterons 44 biopsies testiculaires et 44 échantillons sanguins sur 22 mâles adultes au total (phase pilote + expérimentale). Chaque mâle sera donc échantillonné à deux reprises: au cours de la réactivation de l’activité sexuelle (quelques semaines avant l'accouplement) puis lorsque l’axe reproducteur est complètement actif (pendant la période d'accouplement). Ces deux périodes de l’année correspondent à des états physiologiques, et en particulier de l’axe reproducteur, très contrastés et très bien documentés, qui supplanteront la potentielle variabilité inter-individuelle. Comme nous souhaitons réaliser du séquençage ARN sur ces échantillons, ce nombre d'individus total est conditionné par le fait qu'une analyse de puissance de l'expression génique différentielle attendue a été effectuée.

Raffinement

Une étude pilote va être menée sur 2 individus en amont du projet afin de valider la procédure et de s'assurer du maintien du bien-être animal après la procédure. Tous les produits vétérinaires utilisés dans la procédure sont connus et leurs effets sont maîtrisés par les expérimentateurs. Dès l'apparition éventuelle d'inconfort, ou de souffrance (absence d’alimentation, prostration, agressivité anormale, réaction à la palpation), l'animal sera sorti du projet et un suivi vétérinaire sera enclenché. D'un point de vue zootechnique, un enrichissement adapté sera développé au sein des zones d'hébergements concernées afin de limiter les intéractions antagonistes qui existent de manière naturelle entre les animaux, notamment lors de la periode de reproduction. Ainsi des cachettes supplémentaires seront ajoutées, les zones de fourragements seront multipliées et le taux d'occupation des hébéregement pourra être diminué si nécessauire.

Choix des espèces

Outre sa proximité phylogénétique avec l’humain, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans le contrôle de la reproduction, qui est saisonnière même en captivité, ce qui est rendu possible par un contrôle du régime photopériodique. Seuls des animaux mâles adultes, matures sexuellement (entre 2 et 4 ans) et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel seront échantillonnés. Les résultats attendus ont un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'Homme, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

11 babouines vont être capturées et anesthésiées six fois chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois de ces anesthésies servent à une échographie, un prélèvement de 16 millilitres de sang et une injection de denosumab ou de placebo, une quatrième à l'ablation chirurgicale des deux ovaires, les deux dernières à de nouveaux prélèvements. Le porteur indique que le médicament provoque fréquemment des douleurs ostéoarticulaires chez la femme ménopausée et que la chirurgie expose à des saignements, une infection ou une réouverture de la plaie, suivis de deux à cinq jours d'isolement. Toutes sont gardées vivantes dans leurs groupes sociaux d'origine, le porteur estimant que ces prélèvements "ne sont pas invalidants", après le retrait de leurs deux ovaires.

Objectifs

Dans le squelette, certaines cellules osseuses expriment une protéine "RANKL" qui se lie et active un récepteur spécifique "RANK". Ce système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur dans la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que le système RANKL est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Les données chez les femmes qui subissent une fécondation in vitro suggèrent que le système RANKL intervient dans le stade précoce de la folliculogenèse et qu'il est également associé à l'âge (sa concentration son inhibiteur plus faible chez les femmes les plus jeunes que chez les femmes âgées de plus de 40 ans). Sur la base de nos données préliminaires, nous suggérons que la signalisation du RANKL joue deux rôles distincts dans la fonction ovarienne : l'un régulant la réserve folliculaire, l'autre jouant un rôle clé durant les dernières étapes de la maturation ovocytaire. Nous émettons l'hypothèse que la signalisation RANKL joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne en régulant la réserve folliculaire et en modulant la maturation ovocytaire pendant les étapes finales du développement folliculaire. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons une étude chez le primate non humain (PNH) afin de découvrir le rôle régulateur de la signalisation RANKL pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. Ainsi, l'objectif global de ce projet est de découvrir une nouvelle biologie ovarienne qui pourrait être utilisée pour améliorer la fertilité des femmes infertiles et prolonger la longévité reproductive des femmes.

Bénéfices attendus

L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de procréation assistée. Ce traitement réussit dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de potentiels effets secondaires chez la mère. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le dénosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose et peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'Homme ce qui limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les PNH. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'humain, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Nous avons réalisé une étude pilote au cours de laquelle l'analyse de marqueurs sanguins ont démontré que le babouin était sensible au traitement par le dénosumab. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur les effets du traitement au denosumab sur la fonction reproductive féminine évaluée par les changements hormonaux et de l'ovaire. Lorsque nous traitons des animaux ou des humains in vivo avec un inhibiteur de RANKL tel que le Denosumab, moins de petits follicules meurent et plus de follicules survivent et peuvent être recrutés plus tard dans la vie. Cela implique que les femmes vieillissantes pourraient en bénéficier et que les femmes souffrant d'insuffisance ovarienne pourraient profiter de cette opportunité pour avoir de meilleures chances de réussir le prélèvement d'ovocytes lors d'une FIV.

Procédures

Chaque animal sera capturé et anesthésié SIX fois au cours de l'étude : - 3 courtes anesthésies (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin + ECHOGRAPHIE (16 mL) et injection de denosumab ou placebo (T0-T1-T2) - 1 anesthésie de 1 à 2h pour chirurgie (ovariectomie BIlatérale) avec prélèvement sanguin (16mL) (T3) - DEUX courteS anesthésieS (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) (T4 et T5)+ ECHOGRAPHIE

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture. Anesthésie (dépression cardiorespiratoire, déshydratation, hypotension, hypothermie). Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 8 fois la dose administrée). Complications chirurgicales : saignements, hémorragies, infection de plaie ou déhiscence. Isolement de 2 à 5 jours en post opératoire (ennui, stress).

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine car les prélèvements prévus ne sont pas invalidants.

Remplacement

Récemment, des études ont montré que le système étudié est présent et actif dans les gonades femelles de souris et humains. Cependant, ces études in vitro ont des limites, car l'administration de denosumab a des effets systémiques qui doivent être évalués in vivo. Ce protocole vise à étudier les effets du denosumab qui est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques. Ce projet est donc une étape ultérieure à ces analyse in vitro et qui est nécessaire pour étudier les effets du denosumab sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Pour étudier de tels effets systémiques et hormonaux, une étude in vivo est obligatoire et dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Avant la mise en place de cette étude, une étude pilote a été réalisée pour s'assurer que les babouins sont sensibles au denosumab, et donc que les babouins sont des modèles animaux valables pour le traitement. Le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des données fiables a été choisi afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Le calcul de la puissance est basé sur une étude pilote menée sur un seul babouin, où le taux sanguin d'une hormone a augmenté de 40 %. Avec un niveau de test de 5 % (niveau de signification) et une puissance de 80 %, 5 babouins femelles dans chaque groupe à chaque point dans le temps seront suffisants pour atteindre une signification statistique. L'effet sur la folliculogenèse nécessitera également une comparaison entre le placebo et le traitement au denosumab. 4 à 5 animaux dans chaque groupe sont normalement utilisés pour effectuer une telle analyse, ce qui justifie la taille de l'échantillon. Pour réduire le nombre d'animaux, chaque babouin injecté servira également de contrôle interne. L'effet du denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection.

Raffinement

Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie injectable. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, les femelles seront réveillées dans leurs loges d’origine et réintroduites dans leurs groupes dès qu’elles sont suffisament réveillées, selon la procédure validée par la SBEA. Pour l’ovariectomie (T3), l'intervention a lieu sous anesthésie ) et sous analgésie (anti inflammatoires et morphiniques). L’animal sera isolé la veille de l’intervention de son groupe pour assurer la mise à jeûn, puis restera en infirmerie pendant 2 à 5 jours en post opératoire sous traitement antalgique. Il sera alors suivi avec une grille de score et de douleur spécifique et disposera d’un planning d’enrichissement dédié avec 4 enrichissements manipulatoires ou alimentaires journaliers. Après validation de sa récupération et de son état de santé par l’équipe vétérinaire il sera réintroduit dans son groupe d’origine, en accord avec les procédures validées par la SBEA et sous surveillance de l’équipe BEA.

Choix des espèces

Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'être humain et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'être humain. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Un autre avantage est qu'il est facile de suivre le stade du cycle œstral chez le babouin car il peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale (gonflement et règles). Les animaux inclus seront tous des babouins femelles d'un âge avancé (15-25 ans), mais non ménopausées. En effet, ces animaux seront plus sensibles aux traitements affectant les résultats reproductifs que les jeunes animaux très fertiles, ce qui est important si nous voulons utiliser le médicament pour le traitement de l'ovaire vieillissant chez les femmes.

Quatre macaques à longue queue subissent une chirurgie d'une heure trente à deux heures sous anesthésie générale pour recevoir un vecteur de thérapie génique dans un rein, l'autre rein servant de témoin. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec six prises de sang sous sédation et des injections d'un traitement immunorégulateur. Le porteur qualifie cette administration de "non invasive" et la présente comme un raffinement, alors qu'elle passe par une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et par un abord des voies urinaires exposant à une infection, une inflammation locale et des saignements. Deux à trois semaines plus tard, une seconde chirurgie précède la mise à mort des quatre animaux pour prélèvement d'organes.

Objectifs

La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. L’incidence de la cystinurie est faible (≈1/7000), mais les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Malheureusement, malgré cela, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais ces médicaments entraînent des effets secondaires. Ce projet vise à tester une nouvelle solution de thérapie génique injectée administrée dans les voies urinaires de manière non-invasive. Des études préliminaires chez le primate ont permis de valider l’intégration du gène dans les cellules cibles chez le primate mais en administration invasive. D’autres études ont permis de valider chez le porc, une méthode chirurgicale non invasive d’administration d’un produit de thérapie génique dans le rein par voie rétrograde. Nous souhaitons maintenant appliquer ce même protocole chez le primate (macaques cynomolgus) dont l’anatomie rénale est beaucoup plus proche de celle de l’Homme par rapport au porc afin de confirmer l’efficacité du transfert de gène et conforter à terme cette approche chez l’Homme.

Bénéfices attendus

- Opportunités thérapeutiques : La confirmation que la technique d’administration non invasive permet de reproduire ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie. - Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration non invasive permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. - Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -6 prises de sang sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme de 2 d’injections intramusculaires (2 pour chaque molécules administrées) (durée moins d’une minute). -une chirurgie pour administration de vecteur de thérapie génique sous anesthésie générale (durée entre 1h30 et 2h) -A la fin du projet (au bout de 2-3 semaines) : une chirurgie sous anesthésie générale (max 1h).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont: - pour l’anesthésie : douleur transitoire au site d'injection de l’anesthésique, risque d'hématome au niveau du point d’entrée du cathéter - Injection de la thérapie génique dans les voies urinaires : risque d’infection urinaire, de réaction inflammatoire locale, et de saignement transitoire, - injections intraveineuses : risque d'hématome, risque de réaction allergique. - pour les prises de sang répétées sous anesthésie générale : risque d’hématome.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole (prélèvements d'organes)

Remplacement

Compte tenu du fait que le but du projet est de valider une approche non invasive raffinée pour réaliser de la thérapie génique au niveau rénale, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration de la thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer un animal vivant pour un animal mort.

Réduction

Il s’agit ici d’un travail exploratoire donc purement qualitatif sans statistique. Les 4 primates permettront d’explorer le protocole finalisé utilisé chez le cochon en injectant le même vecteur de thérapie génique sur 1 rein par primate en utilisant le deuxième rein comme control négatif ne recevant que le tampon de formulation. Au total, 4 reins seront exposés au vecteur de thérapie génique et le deuxième rein sera systématiquement utilisé comme témoin négatif. Avec les résultats déjà obtenus précédemment sur 4 primates injectés de manière invasive, les 4 nouveaux primates de ce projet suffiront pour confirmer la reproductibilité des résultats mais après administration non invasive par un protocole directement applicable à l’Homme. Nous pourrons également explorer l’intensité et la distribution dans le rein du transfert de gène en utilisant la même dose utilisée jusqu’à présent chez le porc et ainsi pouvoir comparer.

Raffinement

*****Conditions d’hébergement : Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée avant le début de l’étude. La compatibilité sociale sera vérifiée tout au long de l’étude pour garantir un bien être social. Tous les animaux sont habitués à la présence humaine dès leur arrivée sur site et au préalable à tout protocole expérimental. Les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. ******Conditions expérimentales : l’administration dans le rein par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, ce type de protocole ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cet abord chirugical non-invasif. Les animaux sont anesthésiés pour toutes les procédures et recevront des analgésiques pour les chirurgies et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou autoclavable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant une période de 2-3 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et postopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure si besoin.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocole adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. De plus, nous disposons de données scientifiques montrant que le vecteur de thérapie génique employé permet une intégration remarquable du gène au niveau du rein de souris, rat, macaque et porc. Après avoir optimisé les conditions d’administration du vecteur de thérapie génique chez le porc nous souhaitons maintenant appliquer ce même protocole chez le primate dont l’anatomie rénale est beaucoup plus proche de celle de l’Homme par rapport au porc afin de confirmer l’efficacité du transfert de gène et conforter à terme cette approche chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer un dossier de demande d’essai clinique complet. Les animaux sélectionnés pour ce projet sont de jeunes adultes.

12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Huit reçoivent des traceurs injectés dans le cerveau au cours d'opérations de quatre à six heures, suivies de trois jours de traitement antidouleur, quatre portent un implant crânien et une barre de tête, et quatre vivent sous restriction d'eau pendant sept à seize mois. Le but est fondamental, comprendre comment les voies descendantes du cortex fabriquent des prédictions, question posée en parallèle chez des humains par IRM fonctionnelle. Sur le remplacement, le porteur écarte l'informatique en affirmant qu'il n'existera pas de modèle assez précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.