Hamsters dorés

50 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés puis anesthésiés pour des prises de sang, avant d'être infectés par voie nasale avec un variant du SARS-CoV-2, pour comparer l'efficacité d'un vaccin candidat. Le porteur indique une perte de poids progressive attendue pendant les six jours suivant l'infection, sans autre symptôme ni décès non désiré selon lui. Tous les hamsters sont tués pour autopsie et collecte d'organes.

Objectifs

Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis des protéines situées à la surface du virus. Avec un risque de mutation de ces protéines au cours du temps, l'efficacité des vaccins actuels pourrait s'en trouver diminuée. Par ailleurs la réponse anticorps contre cette protéine de surface, s'estompe dans le temps et pourrait ne plus être suffisante pour une protection à long terme nécessitant des rappels vaccinaux réguliers. Le présent projet se propose de poursuivre l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin candidat produit à partir d’une protéine conservée au sein de la famille des coronavirus (protéine N), qui oriente la réponse immunitaire vers une réponse cellulaire (en plus de la production d'anticorps) en stimulant certaines catégories de cellules (les lymphocytes T) responsables de la destruction des cellules infectées. Ce projet constitue la quatrième phase d'une étude d'efficacité d'un vaccin candidat (3 études menées en 2021). Ici, l'antigène vaccinal a été obtenu par un nouveau procédé de haute purification afin d'être compatible avec des essais cliniques sur l'Homme prévus ultérieurement. Les objectifs de l'étude sont: 1/ Comparer les 2 formes d'antigène résultant de deux procédés de purification différents: DSP1 (ancien procédé ayant abouti au vaccin candidat évalué lors des 3 précédentes études) et DSP3 (nouveau procédé adapté aux Bonnes Pratiques de Fabrication). 2/ Evaluer l'efficacité du nouveau vaccin candidat combiné à un autre vaccin favorisant la réponse anticorps contre la protéine Spike du virus.

Bénéfices attendus

Une confirmation de l'efficacité du vaccin candidat obtenu grâce au nouveau procédé de haute purification de l'antigène permettra d'entrevoir la phase d'essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour prise de sang par voie rétro-orbitale et vaccinés par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (durée totale= quelques minutes). 2/ vaccinés à J28 par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (quelques secondes). 3/ anesthésiés à J42 pour prise de sang par voie rétro-orbitale (durée = quelques minutes). 4/ anesthésiés à J56 pour infection par voie intranasale avec un variant du SARS-CoV2 (quelques minutes) 4/ anesthésiés à J60 (50% de l'effectif) ou J63 (50% de l'effectif) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période de 6 jours post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir du 7ème jour post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.

Remplacement

Les évaluations de la réponse immunitaire post-vaccination et de l'efficacité vaccinale ne peuvent être conduites que sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été défini de sorte à avoir 5 animaux à chaque temps de mise à mort qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

360 animaux non-humains, cobayes, hamsters dorés et gerbilles de Mongolie, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par injection de leptospires pour tester la virulence de souches bactériennes, l'infection provoquant prostration, poils hérissés et perte de poids, les individus moribonds étant mis à mort. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort par CO2. Le porteur affirme que seuls ces animaux développent des signes proches de la maladie humaine et qu'aucun autre modèle n'existe pour étudier la virulence.

Objectifs

Les mécanismes de virulence des leptospires pathogènes restent largement méconnus. Depuis quelques années, le laboratoire a développé des outils génétiques pour l’inactivation de gènes potentiellement impliqués dans la virulence de ces bactéries. Le seul moyen de tester pour la virulence de ces mutants est l’utilisation d’animaux : si un gène code pour un facteur de virulence, l’inactivation de ce gène par l’utilisation d’outils génétiques doit rendre ce mutant non virulent (les animaux survivent à l’infection). Le laboratoire a ainsi publié de nombreux articles sur la caractérisation de mutants non virulents et démontré le rôle de certains mécanismes comme la mobilité et la résistance aux stress, dans la virulence de ces bactéries. Nous envisageons aussi de déterminer les gènes dérégulés lors d’une infection chez la bactérie et l’hôte par des approches de transcriptomique. Le laboratoire peut aussi être amené à tester le caractère virulent de certaines souches cliniques isolées chez des patients présentant des formes plus ou moins graves de leptospirose. Ce projet a donc pour but de tester la virulence de souches de leptospires (mutants obtenus par manipulation génétique ou souches cliniques) et d’identifier les gènes ou voies induites lors d’une infection dans les modèles animaux sensibles (cobayes, hamsters ou gerbilles).

Bénéfices attendus

Les travaux menés jusqu’à maintenant à l’aide de mutants dans les modèles sensibles à la leptospirose ont permis d’identifier de nombreux facteurs de virulence, ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes de la pathogénèse de la leptospirose. L’analyse transcriptomique de la bactérie et de son hôte permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors de l’infection. Enfin, ce projet permettra de mieux évaluer le degré de virulence de différentes espèces pathogènes ou de certaines souches cliniques. Ceci permettra de mettre en place des outils moléculaires pour la détection rapide de souches plus virulentes chez les patients. .

Procédures

L’infection se fera par injection intra-péritoneale d’une solution de bactéries dans l’animal (10 min). Le sang pourra aussi être prélevé par ponction cardiaque immédiatement après la mise à mort de l’animal (

Impact sur les animaux

Les animaux infectés par des souches virulentes présentent habituellement des signes caractéristiques à partir de J5 après l’infection (le délai peut -être plus long en fonction de la dose injectée ou de la nature de la souche de leptospires utilisée), notamment perte d’activité, prostration, poils hérissés et perte de poids.

Devenir

Les animaux utilisés lors des expériences seront mis à mort par inhalation de CO2. Ces animaux qui sont infectés avec des souches de leptospires potentiellement virulentes ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

La virulence des leptospires est très probablement multifactorielle (mobilité flagellaire, adhésion aux cellules, résistance aux stress, production d'hémolysines, reconnaissance de la surface des leptospires par le système immunitaire, etc) et seul l'animal permet d'étudier l'ensemble de ces mécanismes et leurs rôles au cours de l'infection. Cependant, pour l’étude de certains phénotypes comme l’adhésion des bactéries aux cellules de l’hôte, nous avons maintenant mis en place un modèle de cultures de lignées cellulaires afin d'étudier les interactions bactéries-cellules de l'hôte (notamment la capacité des leptospires à adhérer aux cellules et à traverser une couche monocellulaire). Des collaborations sont aussi envisagées pour utiliser ces modèles. Cependant, aucun modèle autre que celui des animaux existe pour l’étude de la virulence.

Réduction

On procèdera tout d'abord à une sélection rigoureuse des souches à tester dans les modèles animaux. Pour l'étude de la virulence d'un mutant (principale activité de l'unité), on ne sélectionnera que les mutants présentant une forte probabilité d'être atténués dans leur virulence (analyse du gène inactivé, étude préalable du phénotype du mutant in vitro, etc). On pourra regrouper le nombre de mutants à tester afin de le comparer à un seul groupe contrôle. Dans le cadre de l’analyse de la charge bactérienne, du transcriptome ou de la réponse immunitaire au cours de l’infection, on limitera les points de prélèvements à la phase précoce (J1 post-infection) et à la phase tardive (J3 et/ ou J6 post-infection).

Raffinement

A réception, les animaux resteront en cage 1 semaine avant toute intervention pour une bonne acclimatation. Les cages seront enrichies avec de l’aliment sous forme de gel, des cylindres en plastique et du coton. On pourra utiliser les chaufferettes et pratiquer la réhydratation sc avec le sérum physiologique. Une infection par les leptospires pathogènes entraîne chez les animaux sensibles (gerbilles, hamsters, cobayes) une prostration et les poils hérissés. Pendant la période de l'infection aigue chez l'animal (pour l'inoculation de 10e4-10e6 bactéries, la mortalité est maximale entre les jours 5 et 9 après l'infection), on procédera à deux visites dans la journée (matin et après-midi), y compris les week-ends et jours fériés, afin d'observer tous signes extérieurs (poils hérissés et prostration). Pour certaines souches virulentes, une perte de poids avant la mort (une perte de 10% de poids chez le hamster indique une leptospirose avancée et irréversible) est aussi observée. Dans ce cas, les animaux sont pesés quotidiennement. Les animaux moribonds seront mis à mort.

Choix des espèces

Cobaye, Gerbille et/ou Hamster : seuls ces animaux sont capables de développer la maladie avec des signes cliniques proches de la pathologie humaine, en particulier avec atteinte des organes tels que le foie, le rein et les poumons. L’inoculation de souches virulentes chez ces animaux par voie intra-peritonéale entraîne la mort des animaux infectés. L’application de points limites permettra de limiter la douleur. Pour les cobayes et hamsters, on privilégiera l'utilisation d'animaux âgés de 4 semaines; des animaux plus âgés peuvent être plus résistants à l'infection (maturité du système immunitaire). Ce n'est pas le cas pour les gerbilles, on pourra donc utiliser des gerbilles jeunes ou adultes.

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.

1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.

Procédures

1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.

Devenir

Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites

Remplacement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.

Réduction

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.

Raffinement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).

Choix des espèces

Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella