Hamsters dorés

Des dispositifs médicaux dentaires, purs ou sous forme d'extraits, sont appliqués dans les poches des joues de hamsters dorés, un collier maintenu jusqu'à quatre heures les empêchant d'avaler l'élément testé. 570 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour les analyses histopathologiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leurs joues sont examinées pour repérer un érythème, effet qui peut persister jusqu'à la fin de l'étude en cas d'exposition répétée, l'objet du test étant l'autorisation de mise sur le marché exigée par la réglementation européenne. Le porteur indique renoncer aux témoins positifs et à toute analyse statistique, et ne précise ni le nombre de tests prévus chaque année ni le nombre d'animaux par test, tous deux renvoyés à la norme.

Objectifs

Pour de nombreuses pratiques à visées médicales, les professionnels de santé ainsi que les particuliers utilisent au quotidien des dispositifs médicaux (prothèses, pansements dentaire, produit dentaire...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs médicaux. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale. Ce projet est décrit dans une norme règlementaire. Afin de répondre à ces obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du hamster un test de tolérance sur la muqueuse buccale (test d'irritation). Il y a deux manières possibles de traiter les animaux pour ces tests, soit nous utilisons le produit pur, soit sous forme d’extrait. Pour réaliser ces extraits le DM est immergé dans des solvents (liquide définis par la norme) à une température et pendant une durée donnée, ces extraits seront ensuite utilisés pour faire les traitements. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes. Pour les tests de tolérance locale ou d’irritation, le produit à tester ou son extrait est appliqué dans les poches des joues des hamsters. Cela afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation apparaît.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un dispositif médical, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

Les animaux sont pesées deux fois: en début et en fin d'étude (1minute/pesée), un vidage du contenu des poches des joues et rinçage (1 à 2minutes) est effectué avant le début du premier traitement journalier, les animaux sont manipulés avant chaque traitement afin d'observer l'aspect des abajoues (30 secondes), des traitement successifs espacé de minimum 1h sont effectués (de 30 seconde à 1minute) le nombre de traitement dépendra de l'utilisation clinique du disposistif. Lorsque des dispositifs solides ou pâteux sont testés la mise en place d'un collier est nécessaire pour que l'animal n'ingurgite pas l'élément (placement du collier 1min), ce collier reste en place jusqu'à ce que l'élément soit retirés ou que le test soit terminé (maximum 4h).

Impact sur les animaux

Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude lors d’une exposition répétée, la durée du traitement varie en fonction du projet.

Devenir

Les tests de tolérance sur muqueuse buccale conduisent à la mise à mort des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaires à la conclusion de l’étude.

Remplacement

Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH (potentiel hydrogène: acide, neutre ou basique) ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur la muqueuse buccale. Une veille technologique et scientifique est effectuée régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne faisons pas de témoins positifs. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins positifs. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont enrichies avec un tunnel en carton, d'une balençoire et des frisottis. Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau et la litière est change 1 fois par semaine. Des points limites sont définis afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le hamster reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance sur muqueuse buccale comme cité dans la norme règlementaire. Nous utilisons exclusivement des hamsters Golden Syrian. Nous utilisons des jeunes adultes de 7 à 9 semaines, le stade de développement étant également réagi par la norme règlementaire à suivre.

Avant une étude de toxicité, il s'agit de vérifier que des hamsters dorés, des lapins et des furets réagissent à des candidats vaccins contre la grippe et d'autres infections respiratoires. 300 animaux non-humains, 150 hamsters dorés, 75 lapins et 75 furets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie générale à la fin des études. Chacun reçoit une à quatre injections intramusculaires de vaccin, espacées d'une semaine à un mois, et des prises de sang en cours d'étude, puis la mise à mort permet de prélever la rate, des nœuds lymphatiques et "une grande quantité de sang". Le porteur précise que ces études d'immunogénicité sont "exigées par les autorités". Il affirme que les trois espèces retenues sont "les plus appropriées" pour réagir correctement aux vaccins, sans dire ce qui justifie chacune.

Objectifs

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la grippe représente une menace sérieuse pour la santé publique, surtout dans les pays à faible revenu. Les infections respiratoires aiguës, dont l'influenza, sont parmi les principales causes de mortalité, particulièrement chez les enfants de moins de 5 ans et les personnes âgées ou ayant des maladies chroniques. La vaccination est essentielle pour protéger les populations vulnérables contre ces maladies. Plusieurs vaccins saisonniers sont disponibles, mais leur efficacité peut varier d'une année à l'autre en raison des mutations virales. Chaque année, les virus de la grippe subissent des changements, ce qui nécessite souvent l'ajustement des formulations vaccinales. L'objectif de la recherche est de développer des vaccins plus stables qui pourraient offrir une protection durable, réduisant ainsi la nécessité de modifier fréquemment les vaccins. La recherche se concentre également sur le développement de vaccins contre d'autres agents pathogènes respiratoires. Ce processus nécessite la sélection d'antigènes capables de déclencher une réponse immunitaire efficace, souvent renforcée par des adjuvants. Après des phases préliminaires in silico (par ordinateur) et in vitro (tests sur des cellulaires), il est important de tester les candidats vaccins sur des modèles animaux, car la complexité du système immunitaire ne peut être entièrement reproduite en laboratoire. Notre projet a donc pour objectif d'utiliser des animaux pour évaluer l'immunogénicité de candidats vaccins contre l'influenza, afin d'améliorer la protection des populations à risque.

Bénéfices attendus

Le projet vise à évaluer l'immunogénicité et la tolérance de candidats vaccins, ainsi il permet de sélectionner des molécules qui seront ensuite étudieées plus en détail en vue de leur mise sur le marché. En développant des vaccins plus stables et durables, nous espérons réduire la morbidité et la mortalité liées aux infections respiratoires. De plus, les résultats contribueront à la recherche sur d'autres maladies respiratoires, enrichissant notre compréhension des réponses immunitaires et renforçant l'importance de la vaccination dans la prévention des maladies infectieuses. D’autre part, il est encore possible d’améliorer le confort, la tolérance et l’efficacité des vaccins déjà existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à un ensemble d'administration et de prélèvements :(1) Administration du vaccin par voie intramusculaire (2) Prélèvements sanguins en cours et fin d'étude sous anesthésie (3) Prélèvements d'organes après l'euthanasie en fin d'étude. Le nombre d’immunisation (administration du vaccin) et les volumes d’administration respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale, de la voie d’administration et du poids de l’animal. Cependant, il sera compris entre 1 à 4 immunisations selon le plan d’administration avec 1 semaine à 1 mois entre deux immunisations. Le volume et la fréquence des prélèvements sanguins respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale et du poids de l’animal. La durée pour les administrations et les prélèvements seront de quelques secondes. En fonction de l'espèce et de la voie de prélèvement, les animaux seront préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse réversible en quelques minutes ou anesthésie chimiques d'environ 20min).

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est liée aux injections de vaccin ainsi qu’aux prélèvements sanguins, ce qui est susceptible d’apporter un inconfort et/ou de générer du stress chez l’animal. Le nombre d’immunisations et les volumes administrés respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale, de la voie d’administration et du poids de l’animal. Les prélèvements sanguins et les volumes de prélèvement respecteront également les recommandations éthiques : ils varieront en fonction de l’espèce animale et de son poids. Un temps de repos nécessaire sera observé entre deux prélèvements, en fonction du volume prélevé. De plus, comme tout produit de santé, un vaccin peut entraîner des effets indésirables. Ces derniers surviennent généralement dans les deux semaines suivant la vaccination, ou plus rarement deux mois après. Dans l’immense majorité des cas, ces effets sont légers à modérés. Il s’agit principalement de réactions inflammatoires naturelles dues à la mobilisation du système immunitaire après l’injection du vaccin. Cette inflammation peut provoquer des symptômes tels que fièvre, douleur et rougeur au site d’injection. Plus rarement, des réactions allergiques à l’un des composants du vaccin peuvent survenir.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale. Pour les besoins des études, certains organes sont prélevés après l'euthanasié (exemple : rate, noeuds lymphatiques), ainsi qu’une grande quantité de sang.

Remplacement

Les premières phases de sélection des antigènes se déroulent in vitro. Cependant, étant donné que le vaccin à développer a une visée clinique, il est essentiel d’obtenir des données dans des conditions réelles d’utilisation. L’utilisation d’un organisme complet et vivant devient donc indispensable, notamment pour le suivi post-immunisation. Par ailleurs, le fonctionnement du système immunitaire est très complexe et implique des mécanismes qu’il est impossible de reproduire autrement. De plus, des études d’immunogénicité sont exigées par les autorités dans le cadre du développement des vaccins.

Réduction

Le nombre d’animaux doit permettre d’identifier une différence significative entre les produits testés, sur la base de la comparaison quantitative et qualitative des immunisations obtenues (taux d’anticorps, affinité, spécificité, etc.). Les premières études sont réalisées avec des nombres reduits d'animaux, par exemple 3 lapins par groupe. En fonction des résultats obtenus, ce nombre peut être affiné s’il est possible de mettre en évidence des différences significatives avec moins d’animaux. Les effectifs et les tests statistiques seront définis en fonction du nombre de série d’observation, la dépendance ou indépendance de ces séries d’observation, la nature des variables (quantitative ou qualitative), et la nature du test (test paramétrique ou non paramétrique).

Raffinement

Après réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une durée propre à chaque espèce animale. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des évaluations cliniques sont mises en place (observation quotidienne de l’état général, du comportement, etc.). Les actes douloureux ou provoquant un stress élevé, seront réalisés sous anesthésie, avec analgésie adaptée. Tout au long des études les animaux sont manipulés/observés par un personnel formé et habilité à travailler chez les espèces en question. Les voies et volumes de prélèvement et d’administration suivront les recommandations des publications. De plus, des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place pour suivre l'état de l'animal.

Choix des espèces

Le but de cette manipulation, qui précède une étude de toxicité, est de s'assurer que l’espèce est adaptée aux vaccins que nous allons tester. Il est important de choisir un modèle qui réagit correctement au vaccin, et pour cela, trois espèces sont les plus appropriées. Les animaux seront de jeunes adultes (car croissance terminée, paramètres physiologiques stables, réponse immunologique optimale) mais pourront également être des animaux jeunes, dont le système immunitaire ne serait pas mature.

La perte de 20 % du poids maximal accompagne souvent une baisse de mobilité, une prostration et un retrait de l'animal dans sa cage, et le porteur prévoit de tuer les hamsters avant ce seuil. 22 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent dans l'abdomen des parasites responsables de la leishmaniose viscérale, qui colonisent leur foie et leur rate au cours d'une phase silencieuse pouvant durer six mois, puis subissent jusqu'à trente-six séances d'imagerie sous anesthésie, chacune précédée d'une injection dans l'abdomen, et un à quatorze gavages. L'objet déclaré est de faire apparaître chez ces animaux des parasites résistants au principal traitement de la maladie, et leur mise à mort permet de prélever le foie et la rate qui en sont la source.

Objectifs

Le développement de parasites résistants à la molécule testée devient un problème de santé publique d’autant qu’il s’agit actuellement du principal traitement contre la leishmaniose viscérale. Les résultats des recherches conduites in vitro sur le développement de parasites résistants à cette drogue anti-parasitaire ne sont malheureusement pas transposables sur des parasites de terrain (isolés de malades ne répondant pas au traitement) suggérant qu’in vivo les mécanismes et les cibles conduisant à l’apparition du phénotype de résistance sont différents. Le principal objectif de ce projet est donc de nous donner les moyens de comprendre les mécanismes qui conduisent à l’apparition chez les mammifères de parasites résistants à la molécule testée.

Bénéfices attendus

Les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée in situ chez l’homme et l’animal sont encore très mal connus alors que des récidives à l’issu de ce traitement apparaissent. Les recherches réalisées à ce jour par des approches in vitro sont insuffisantes puisqu’elles ne nous permettent pas d’appréhender et de comprendre pourquoi les malades ne répondent pas au traitement. Par ce projet qui consiste à générer in vivo (chez les hamsters) des parasites résistants à la molécule testée et donc à se rapprocher des conditions de terrain, nous espérons être en mesure d’apporter des réponses à cette problématique de santé publique. En effet, les parasites résistants à la molécule testée ainsi générés seront analysés par séquençage de leur génome et de leur transcriptome. Cette approche duelle nous informera sur les signaux génétiques et les signatures transcriptomiques corrélant avec l’adaptation des parasites en réponse à la molécule testée et nous permettra d’identifier les réseaux d’interaction à l’origine de la réponse/résistance à la drogue. Au-delà de l’importance de ces résultats sur notre connaissance générale des mécanismes d’adaptation des Leishmania en réponse à un stress (molécule testée), si ces derniers sont validés avec des prélèvements provenant de patients/chiens en échec de traitement ils représenteront une avancée majeure dans la recherche sur les traitements anti-Leishmania.

Procédures

A compter de l’inoculation des parasites, les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Imagerie intra-vitale non invasive sous anesthésie générale, impliquant une injection intrapéritonéale préalable (15 minutes). Ce suivi sera réalisé au maximum 36 fois, avec un délai entre chaque mesure de 2 semaines minimum. - Pesée une fois par semaine (20 secondes), pendant toute la durée de la procédure soit entre 20 et 50 fois selon les groupes d’individus. - Gavage (20 secondes),1 à 14 fois selon les groupes sur toute la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

L’inoculation des parasites aux hamsters se fera en intrapéritonéale après anesthésie légère des animaux par exposition à l’isoflurane dans une chambre d’induction. En absence de traitement par les drogues anti-parasitaires, les espèces de Leishmania viscérales vont coloniser principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer jusqu’à 6 mois selon les individus. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint la limite de 20% du poids maximal de l’animal s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage. Le traitement est délivré par administration intragastrique (gavage), pendant un maximum de 5 jours ce qui est source de douleur et inconfort de courte durée et de stress. Dans les cas de traitement de l’homme ou du chien pour lesquels l’administration de la drogue anti-parasitaire est répétée sur 28 jours des troubles digestifs ont pu être observés. Compte-tenu de nos connaissances sur le modèle hamster dans un contexte de traitement, la probabilité d’apparition de tels effets chez les hamsters est toutefois minime. Le suivi de la parasitémie par imagerie intra-vitale non invasive est réalisé sur des animaux anesthésiés par exposition continue à l’isoflurane. Toutefois, cette procédure nécessite une injection intrapéritonéale, source de douleur et inconfort légers de courte durée, lorsque les animaux sont endormis. La répétition de la mesure au cours du temps est potentiellement vectrice de stress chronique pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites nécessaire à nos analyses.

Remplacement

Les recherches réalisées à ce jour sur les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée par des approches in vitro sont réalisées majoritairement sur des parasites libres. Or les traitements anti-Leishmania administrés aux mammifères ciblent le stade de développement intra-cellulaire du parasite. Les lignées de cellules de type macrophage qu’elles soient d’origine humaine ou murine sont peu permissives au développement intracellulaire des parasites étudiés ce qui limite fortement leur utilisation. De plus, notamment dans le cas de traitement ou de résistance aux drogues anti-parasitaire il est primordial de pouvoir prendre en compte le tissu (organes cibles = rate et foie) et au-delà l’organisme entier. Le recours à des animaux vivants est de fait indispensable.

Réduction

Ce projet repose sur l’utilisation de 22 hamsters. Ce nombre nous permet d’avoir 4 à 6 individus par groupe pour chacune des analyses que nous avons prévues de réaliser. Le but final n’est pas de faire une étude comparative statistique entre les animaux traités et non traités mais d’observer les trajectoires individuelles sélectionnées après un traitement flash ou une augmentation croissante de la dose de molécule testée comparativement à l’inoculum initial. Pour réaliser ce projet et afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés nous avons choisi d’utiliser le parasite transgénique qui nous permet de mesurer l’évolution de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive sans avoir à mettre à mort les animaux. Ceci nous permet également d’adapter au mieux la mise en œuvre du traitement sur tous les animaux.

Raffinement

L’infection parasitaire étant silencieuse en terme de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, les hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. Afin d’adapter au mieux la mise en place des traitements par la molécule testée, en plus d’un suivi pondéral les animaux font l’objet d’un suivi de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive. L’imagerie sera réalisée toutes les deux semaines entre la deuxième semaine suivant l’inoculation des parasites et la fin des cycles de traitement. L’augmentation de la charge parasitaire dans les organes cibles est corrélée à l’apparition des signes cliniques de la maladie, notamment la perte de poids. En fin de processus, les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite. L’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux et l’imagerie intra-vitale non invasive est réalisée sous exposition continue d’isoflurane. Durant l’expérience, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Un triple enrichissement des conditions d’hébergement est mis en place (frisettes carton, coton, boule).

Choix des espèces

Deux raisons majeures quant au choix du hamster pour ce projet : - Le modèle murin est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales,d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et du foie des animaux infectés. - Le traitement anti-Leishmania par la molécule testée est efficace avec une même posologie que celle de l’homme. C’est donc l’animal de choix pour toute recherche liée aux traitements anti-parasitaire. Les parasites seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 6ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale. D’autre part, compte tenu de la durée de l’expérimentation il est important d’utiliser des animaux jeunes.

Tués à l'issue au motif du risque lié à un agent pathogène de groupe III, 1 000 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis des traitements ou des vaccins administrés sur animal vigile, et jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital. Le porteur décrit l'infection comme une perte de poids transitoire d'environ 10 %, que l'animal contrôle au bout d'une semaine, et présente le hamster doré comme un modèle des formes non sévères de la COVID-19. La mise à mort de la totalité des animaux est acquise dès le départ, quelle que soit leur récupération.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SARS-CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SARS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SARS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire du hamster Syrien modèle de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SARS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SARS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le hamster des infections à SARS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés par différentes voies à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Ces manipulations durent quelques secondes. Le traitement par voie nasale est administré sous anesthésie. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Les prélèvements sanguins nécessaires pour ces analyses seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié avec ajout d’un collyre anesthésique. Ces prélèvements effectués par un manipulateur expérimenté durent quelques secondes. Un maximum de 3 prélèvements sanguins sont prévus sur les animaux sur toute la durée du protocole.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SARS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection et retrouve son poids d’origine vers le 10ème jour.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SARS-CoV-2 ainsi que son innocuité sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SARS-CoV-2 chez le hamster sont maîtrisés depuis 2020 au laboratoire. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de répétabilité et reproductibilité satisfaisantes qui nous permettent de réduire nos études à des groupes de 6 animaux pour atteindre une significativité statistique.

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation une semaine avant les expérimentations. Les hamsters sont hébergés par deux dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Une grille de points limites est établie afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SARS-CoV-2, quel que soit le variant, et représente un modèle de choix pour étudier les formes non sévères de la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires (perte de poids modérée et hyposmie/anosmie), l’animal contrôlant naturellement l’infection au bout d’une semaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles ou femelles. Ils sont sensibles à l’infection SARS-CoV-2 et ne développent pas de symptômes graves.

La mort d'une souris figure parmi les signes de toxicité qui conduiront à réduire la dose lors de l'expérimentation suivante. 2 440 souris et 60 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les souris sont infectées par Leishmania par voie intraveineuse et les hamsters par injection intracardiaque, puis gavées ou injectées cinq jours consécutifs avant que leur foie soit prélevé pour compter les parasites. Le porteur qualifie le hamster d'animal de laboratoire "idéal" pour servir de réservoir, ces animaux étant tués pour récupérer dans leur rate de quoi infecter les lots de souris suivants.

Objectifs

La leishmaniose viscérale est une maladie parasitaire en pleine expansion du fait du réchauffement climatique et des mouvements de populations depuis les zones d’endémie. Cette maladie affecte des populations socialement vulnérables et souvent immunodéprimées. Différentes espèces de Leishmania peuvent mener à la leishmaniose viscérale, dont la Leishmania donovani, qui affecte uniquement l'homme et la Leishmania infantum, qui affecte l'homme et le chien, ce qui fait du chien un réservoir de ce parasite pour l'homme. Sa transmission aux mammifères, y compris aux humains, se fait par des insectes infectés, appelés phlébotomes. Une fois introduites chez l’homme, les leishmanies infectent les cellules du système immunitaire du patient, principalement les macrophages. Malgré le grand impact de cette maladie sur la santé publique, les thérapies actuellement existantes présentent des limites majeures, en termes de toxicité et de chimiorésistance. Dans ce contexte, la recherche et développement de nouveaux médicaments est urgente. Pour ce faire, dans le cadre de programmes de recherche, nous évaluerons l’activité de substances pures soit d’origine naturelle, soit de synthèse et qui sont des inhibiteurs de voies métaboliques spécifiques au parasite, ou bien encore des formulations. Après un premier criblage de cytotoxicité et d’activité in vitro, c’est-à-dire, sur les macrophages et sur les parasites en culture cellulaire, seules les substances les plus actives et les moins toxiques seront évaluées sur des modèles de leishmaniose expérimentale chez l’animal. L’objectif étant de découvrir de nouveaux candidats-médicaments contre les leishmanioses humaines et canines, avant de pouvoir accéder aux essais cliniques de phase 1 chez l'Homme, il est nécessaire de démontrer que les substances sélectionnées in vitro sont capables de réduire la charge parasitaire in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet: - l'identification de candidats – médicaments capables de surmonter les limites des traitements existants, en termes de toxicité et de chimiorésistance.

Procédures

Lors de l’étude de détermination de la dose maximale tolérée certains lots de souris sont soumises à une administration par gavage (voie orale) ou par voie parentérale (intrapéritonéale ou intraveineuse) avec des substances ou des formulations d'intérêt. Les administrations sont effectuées une fois par jour, sur cinq jours consécutifs. En outre, pour la détermination de l'activité antileishmanienne, une seule injection intraveineuse (pour les souris) ou intracardiaque (pour les hamsters) de moins de dix secondes est pratiquée pour l’infection des animaux. Concernant le traitement des souris infectées, les administrations sont effectuées sur cinq jours consécutifs soit par gavage soit par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. Les administrations intraveineuses ou intracardiaques sont réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La leishmaniose n'est pas douloureuse pour les animaux, mais des effets indésirables, comme la perte de poids, l'apathie ou piloérection peuvent survenir lors de la détermination de la dose maximale tolérée, car certaines molécules peuvent s'avérer toxiques. Pendant le traitement, les animaux peuvent ressentir un inconfort lors de l'administration intraveineuse, qui sera minimisée grâce à l'anesthésie à l'isofurane. Quant à l’administration orale, elle est peu douloureuse par gavage.

Devenir

Les souris infectées sont euthanasiées afin de déterminer la charge parasitaire au niveau de leur foie après un traitement sur cinq jours consécutifs qui démarre une semaine après leur infection. Les hamsters infectés sont euthanasiés afin de récupérer les parasites qui serviront à l’infection des lots de souris et d’autres hamsters.

Remplacement

Les substances d'intérêt sont, dans un premier temps, soumises à un test in vitro de cytotoxicité sur les cellules hôtes des parasites, c'est à dire les macrophages. L'absence de cytotoxicité à la concentration de 100 μM justifie de continuer les expérimentations d'évaluation antileishmanienne sur les modèles de Leishmania donovani ou Leishmania infantum chez la souris. Compte tenu des barrières pharmacologiques rencontrées, ainsi que la métabolisation auxquelles sont soumises les substances à évaluer, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’évaluation sur un modèle animal avant de lancer des essais cliniques de phase 1 chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire l'utilisation des animaux, nous allons réaliser une étude de la dose maximale tolérée (DMT). Elle sera réalisée sur des lots de 7 souris par dose. Nos études antérieures ont par ailleurs montré que 7 souris est un nombre suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux substances testées. En l’absence de données sur la toxicité, une première évaluation de la DMT sera faite à 100 mg/kg par voie orale ou par voie intrapéritonéale ou intraveineuse sur 5 jours consécutifs. Si des signes de toxicité apparaissent, tels que la mort d'une souris ou des symptômes majeurs, nous réduirons la dose lors d'une nouvelle expérimentation. A chaque expérimentation, une seule dose sera utilisée afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé. Des groupes de 3 hamsters seront utilisés comme réservoir de parasites pour infecter les souris pour les études d'efficacité. Pour l'évaluation de l'activité antileishmanienne, nous utiliserons 8 animaux par groupe, la variabilité des taux d'infection nécessitant ce nombre pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point pour lequel nous attachons une attention particulière pour toutes les études prévues. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton, et de rouleaux de carton afin de pouvoir constituer de refuges. Un suivi journalier sera également effectué afin de s'assurer de leur état général. En plus, pour minimiser l'inconfort qui peut survenir lors d’une injection intraveineuse, une anesthésie à l’isoflurane sera faite au préalable. Des points limites seront mis en place et strictement appliqués.

Choix des espèces

Pour déterminer la dose maximale tolérée et pour l’étude d’efficacité antileishmanienne les souris seront utilisées, car le modèle souris s'avère un modèle pertinent et reconnu dans la littérature. En autre, le hamster est largement reconnu comme l'animal de laboratoire idéal pour servir de réservoir de parasites. Son utilisation comme réservoir pour infecter les souris est préférable en raison de la grande quantité de parasites obtenue à partir de la rate des hamsters, permettant ainsi d'infecter un nombre important de souris avec une grande efficacité. Les hamsters ont un poids de 80 à 100 grammes et sont âgés de 8 semaines. Les souris ont un poids de 18-20 grammes et sont âgées de 6 à 8 semaines au moment de l’infection.