Rongeurs

Une restriction alimentaire maintenant le poids à 90 % de la normale, une immobilisation de la tête et des chirurgies cérébrales de deux à quatre heures avec implant de fibre optique : 288 rats Long Evans vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ces gestes visent à cartographier la "boussole neuronale" qui indique la direction de la tête et à en tester le rôle dans une tâche de navigation. Les retombées médicales évoquées, rééducation ou prothèses vestibulaires pour les personnes âgées, restent hypothétiques et lointaines. Le porteur présente le rat Long Evans comme l'"expert de la navigation" reconnu partout, argument qui tient surtout aux décennies de travaux déjà accumulés sur cette souche.

Objectifs

Pour nous orienter dans l’espace, notre cerveau doit savoir en permanence dans quelle direction notre tête est tournée. De nombreux animaux, et en particulier les mammifères, possèdent ainsi une « boussole neuronale » localisée dans la partie antérieure du cerveau. Cette boussole est tenue informée des changements d’orientation de notre tête grâce aux détecteurs de mouvements de l’oreille interne, appelés organes vestibulaires, et qui sont classiquement associés au contrôle de l’équilibre. Notre objectif est de comprendre comment ces signaux sont utilisés pour synchroniser notre boussole neuronale avec les mouvements de notre tête. Ce projet comporte trois étapes : 1) Cartographier les connexions neuronales au sein du circuit reliant les organes vestibulaires et la boussole neuronale. 2) Observer comment les neurones de ce circuit s'activent en temps réel lorsque l'animal bouge la tête. 3) Tester le rôle de ce circuit en modifiant son activité chez des animaux réalisant une tâche de navigation spatiale.

Bénéfices attendus

En permettant de mieux comprendre comment les informations vestibulaires (relatives aux mouvements de la tête) sont utilisées par le cerveau pour s’orienter dans l’espace, les résultats de ce projet pourraient inspirer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de déficits vestibulaires et de troubles de l’orientation, en particulier chez les personnes âgées. Par exemple, la présbyvestibulopathie, un syndrome vestibulaire lié au vieillissement, affecte 20 à 30 % des plus de 65 ans et plus de 50 % des plus de 80 ans. Elle se caractérise notamment par une altération des capacités cognitives spatiales, entraînant une perte d’autonomie. Une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents pourrait conduire à des protocoles de rééducation plus ciblés ou à l’élaboration de prothèses vestibulaires adaptées. Les mécanismes identifiés pourraient également éclairer d’autres pathologies affectant l’orientation spatiale, comme la maladie d’Alzheimer, où les troubles de la navigation sont précoces et invalidants. D’autre part, Les mécanismes neuronaux identifiés dans le cadre de notre étude pourraient servir de modèle pour concevoir des algorithmes neuro-inspirés d’estimation de l’orientation. Ces algorithmes pourraient potentiellement améliorer la précision et la robustesse des systèmes robotiques autonomes ou des dispositifs d’assistance pour les personnes atteintes de troubles vestibulaires.

Procédures

HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Une partie des animaux (nombre : 228) va être habitué au contact humain pendant une semaine (quelques minutes, 2x/jour), préalablement à toute autre manipulation. CHIRURGIE. L’ensemble des animaux du projet (nombre : 288) va subir une intervention chirurgicale de quelques heures (entre 2 et 4 h) visant à injecter un vecteur viral dans le cerveau et, dans certains animaux (nombre: 228), à y implanter une fibre optique de petite taille (diamètre : 0,2 mm). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale avec couverture analgésique péri-opératoire. Au cours de cette procédure chirurgicale, les animaux recevront les injections sous-cutanées suivantes: 1) buprénorphine (analgésie péri-opératoire), 2) lidocaine (analgésie locale du point d'incision) et 3) sérum physiologique (réhydratation). IMMOBILISATION. Une partie des animaux (nombre : 108) subira une contention du corps et une immobilisation de la tête, au cours d’un protocole d’habituation, puis pendant la phase d’acquisition des données. Habituation : contention du corps uniquement (30 s à 2 min, 2x/jour pendant 4 jours), puis contention du corps et immobilisation de la tête (2 à 5 min, 2x/jour pendant 8 jours). Acquisition des données : une session de contention/immobilisation par jour (5 min) pendant 10 jours. Au cours de cette phase d’acquisition des données, 54 animaux subiront des mouvements imposés (rotations, translations) pendant la phase de contention/immobilisation. TÂCHE DE NAVIGATION SPATIALE. Pendant 4 à 5 semaines, une partie des animaux (nombre : 120) réalisera quotidiennement une tâche de navigation spatiale consistant à rechercher de la nourriture sur une table de 1,80 m de diamètre puis à retourner dans un refuge pour la consommer. Pendant cette période, les animaux seront en restriction alimentaire afin de maintenir leur poids à 90% de sa valeur normale.

Impact sur les animaux

NUISANCES ASSOCIÉES À LA CHIRURGIE (288 animaux au maximum) : 1) au réveil, hypothermie, difficulté à se nourrir et à boire, 2) en post-opératoire, douleur modérée. CONTENTION DU CORPS ET IMMOBILISATION DE LA TÊTE (108 animaux au maximum) : la contention du corps (dans un linge) et l'immobilisation de la tête peuvent induire un stress aigu chez les animaux. RESTRICTION ALIMENTAIRE (120 animaux au maximum) : stress métabolique chronique modéré.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser une analyse approfondie de l'anatomie des circuits neuronaux étudiés, ainsi que pour valider le placement d'une fibre optique de tout petit diamètre (0,2 mm), implantée pendant la chirurgie et utilisée pour les expériences de mesures et de perturbations de l'activité neuronale.

Remplacement

Pour comprendre comment un être vivant s'oriente, il faut pouvoir observer son cerveau pendant qu'il agit. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire cette complexité. IMPORTANCE DU COMPORTEMENT : L'orientation spatiale est un processus qui dépend de ce que l'animal voit et ressent en bougeant. On ne peut pas étudier cette « boussole interne » sur des cellules isolées ou des tissus qui ne sont plus connectés aux sens (comme la vue ou l'équilibre). LIMITES DE L’INFORMATIQUE : Les simulations par ordinateur sont d'excellents outils pour tester des théories ou prédire des résultats. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer la réalité biologique : elles servent à accompagner l'expérience, mais ne peuvent pas s'y substituer. DES MODÈLES DE SUBSTITUTION ENCORE TROP SIMPLES : Les cultures de cellules ou les « mini-cerveaux » (organoïdes) sont très utiles pour d'autres recherches, mais ils n'ont pas la structure complexe d'un cerveau adulte. En effet le cerveau d'un rat adulte a été « sculpté » par ses expériences et ses apprentissages. Cette maturité et cette organisation globale sont indispensables pour comprendre comment les signaux de mouvement sont traités, ce que les modèles de laboratoire ne savent pas encore reproduire. En résumé, pour comprendre une fonction aussi complexe que la navigation dans l'espace, l'observation d'un cerveau complet et actif reste actuellement la seule solution viable.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux possible, nous appliquons plusieurs stratégies de réduction. 1) Pour optimiser le rendement de la chirurgie, c'est à dire maximiser la proportion d'animaux avec un ciblage correct des structures cérébrales étudiées, un appareil stéréotaxique de haute précision sera utilisé. Les animaux dont le ciblage est erroné serviront de contrôles anatomiques, validant par contraste la spécificité fonctionnelle des noyaux visés. 2) Les cerveaux des procédures 2 et 3, exprimant des marqueurs fluorescents, viendront compléter les observations anatomiques réalisées dans la procédure 1, réduisant ainsi la pression sur le nombre d’animaux dans cette procédure. 3) Nos protocoles d’habituation et d’apprentissage sont optimisés pour obtenir un taux de réussite de 100 % pour les objectifs des procédure 2 et 3. 4) Si le rendement chirurgical est au-dessus des attendus expérimentaux et/ou si la significativité statistique des effets mesurés est atteinte plus tôt (analyse au fil de l’eau), les effectifs seront revus à la baisse.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prévues à chaque étape des procédures. HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour s'habituer au contact humain. Cette étape d'apprivoisement réduit considérablement leur stress lors des futures manipulations. UNE VIE SOCIALE PRÉSERVÉE. Les rats sont des animaux sociaux et supportent mal l’isolement. Pour pouvoir héberger les animaux par deux, nous utilisons des implants crânien ultra-résistants, garantissant leur durabilité malgré les tentatives de grignottage du congénère. Les cages sont également enrichies avec des tunnels, du coton et du carton pour stimuler le jeu et l’exploration. GESTION RIGOUREUSE DE LA DOULEUR. Toutes les interventions chirurgicales se font sous anesthésie avec une prise en charge systématique de la douleur (analgésiques). Un suivi très étroit est assuré durant la récupération, et des doses supplémentaires de médicaments sont prévues au moindre signe d'inconfort. APPRENTISSAGE EN DOUCEUR ET PAR LA RÉCOMPENSE. L'habituation à l’immobilisation se fait de manière très progressive. Pour encourager les animaux, nous utilisons un renforcement positif sous forme d'eau sucrée. La réduction alimentaire est légère et progressive. Elle vise à motiver l'animal à rechercher de la nourriture pendant la tâche de navigation spatiale. Les rats conservent un poids proche de la normale (au moins 90 % de leur poids normal) et reçoivent des briquettes de bois à ronger pour prendre soin de leurs incisives malgré une prise alimentaire réduite.

Choix des espèces

Le rat, et particulièrement la souche Long Evans, est considéré par les scientifiques du monde entier comme l'expert de la navigation. C'est un animal naturellement curieux, explorateur et doté d'excellentes capacités d'apprentissage. En travaillant avec ce modèle, nous pouvons comparer nos découvertes avec des décennies de recherches déjà accumulées sur sa « boussole interne ». Le cerveau du rat est suffisamment grand pour permettre le ciblage des petites structures cérébrales (souvent moins de 1 mm) étudiées dans ce projet. Pour observer le cerveau en action pendant que le rat se déplace, l'animal doit porter un petit dispositif de mesure sur sa tête. Le rat est assez robuste pour porter l'équipement de 10 à 12 g prévu dans ce projet, sans aucune gêne pour ses mouvements ou son confort. Les animaux arrivent à l'animalerie à l'âge de 8 ou 9 semaines, ce qui correspond au stade de jeune adulte. Nous attendons qu'ils atteignent 10 semaines pour l'intervention chirurgicale car, à cet âge, leur crâne a quasiment fini sa croissance. Cela assure une stabilité parfaite des implants sur le long terme et une sécurité maximale pour l'animal.

Toutes tuées pour prélever leur tissu nerveux à plusieurs stades de la maladie, 1 095 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris porteuses d'une mutation liée à l'ataxie de Friedreich subissent des chirurgies cérébrales de 45 minutes à 3 heures, pose de fenêtre crânienne ou injections virales, puis des séances d'imagerie tête immobilisée de 30 à 45 minutes et des tests de coordination motrice, de marche et de force. Le projet prolonge un travail antérieur sur le même modèle et vise à explorer les circuits cérébelleux et à tester des thérapies géniques. Le porteur qualifie d'"indispensable" le suivi des protéines d'intérêt à plusieurs temps, ce qui justifie la mise à mort échelonnée des animaux.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative rare et héréditaire qui provoque une perte progressive de la coordination motrice. Elle est causée par une perte de fonction de la frataxine, protéine clé du métabolisme du fer mitochondrial. Récemment, un nouveau modèle murin porteur d’une mutation ponctuelle dans le gène FXN (Fxn G127V KI/KI) a été généré (Fil et al., 2020). Cette mutation ayant été identifiée pour la première fois chez des patients atteints d’AF, ce modèle représente un outil préclinique particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous visons à caractériser de manière approfondie les altérations du circuit cérébelleux aux stades pré-symptomatique et symptomatique, en utilisant l’imagerie in vivo. Cette approche constitue le seul moyen d’évaluer dynamiquement l’activité neuronale en tenant compte des interactions synaptiques, mais également d’explorer la fonction mitochondriale et les interactions neurones–glie au sein du cortex cérébelleux. Sur la base de ces données, nous mettrons en place des stratégies de modulation du circuit cérébelleux par des approches chimiogénétiques et de thérapie génique ciblée, afin d’évaluer leur potentiel pour restaurer les déficits comportementaux. Enfin, l’étude des modifications moléculaires associées permettra d’identifier des mécanismes d’intérêt pour le développement de futures thérapies chez les patients atteints d’AF. Ce projet prolonge et complète le projet déjà approuvé consacré à la première caractérisation du modèle G127V KI/KI, en apportant une analyse plus fine des dysfonctionnements mitochondriaux, des interactions cellulaires et des altérations des circuits cérébelleux. ous chercherons à comprendre comment l’activité et le métabolisme des neurones et des cellules gliales fonctionnent à la fois chez les animaux contrôles et G127V. L’accent sera mis sur les interactions neurones–glie et sur le partage de voies métaboliques essentielles, dont la perturbation pourrait contribuer aux dysfonctionnements observés dans l’AF. Les approches de modulation et de protéomique offriront l’opportunité d’identifier les voies clés nécessaires au maintien de l’activité neuronale, de l’homéostasie gliale et d’un état métabolique correct, et permettront de mieux comprendre les altérations propres à l’AF.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à caractériser l’activité neuronale et gliale ainsi que la dynamique mitochondriale au sein du circuit cérébelleux dans un modèle préclinique de l’ataxie de Friedreich. Il fournira de nouvelles connaissances sur le rôle de la frataxine et les conséquences de sa perte de fonction, tout en permettant d’évaluer, d’un point de vue comportemental et moléculaire, la réintroduction de la frataxine dans des populations neuronales spécifiques affectées par la maladie. De plus, les voies ciblées identifiées mettront en évidence de nouvelles voies potentielles pour le développement d’interventions thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin d’évaluer la coordination motrice, la marche et la force musculaire. Chaque test dure entre 30 secondes et 5 minutes, pour un maximum de 15 minutes par session et par animal. Avant le début des tests, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant 7 jours (10 à 20 minutes par jour et par animal) par des manipulations douces et progressives, afin de réduire le stress et d’assurer la fiabilité des observations. Au total, 120 animaux seront concernés par ces tests. Des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’implanter des fenêtres ou des lentilles permettant l’observation directe du cerveau, ou pour injecter des vecteurs rendant certaines cellules visibles. Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur pendant et après l’intervention. La durée des interventions varie de 45 minutes (injections dans le cerveau) à 3 heures (implantation de fenêtre crânienne). Après la chirurgie, une période de récupération avec surveillance rapprochée et soins adaptés est prévue. Lorsque nécessaire pour garantir la sécurité des animaux et une récupération optimale, ceux-ci pourront être hébergés individuellement pendant la phase postopératoire. Après la phase de récupération, certains animaux participeront à des séances d’imagerie afin d’enregistrer l’activité cérébrale à l’état éveillé, au repos ou lors de tâches comportementales. Lors de ces sessions, la tête de l’animal est maintenue stable pendant 30 à 45 minutes. Une habituation progressive de 7 à 10 jours est mise en place, avec une augmentation graduelle de la durée, afin de limiter le stress et l’inconfort. Ces procédures concernent 720 animaux. Des injections ciblées dans le cerveau seront également réalisées pour moduler l’activité des cellules nerveuses ou de soutien, parfois en combinaison avec l’imagerie. Ces interventions concernent 160 animaux. Enfin, des analyses après le décès des animaux seront effectuées pour des études moléculaires et protéomiques, concernant 45 animaux. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, tout en assurant un suivi attentif et continu de leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les données recueillies par notre laboratoire et par nos collaborateurs montrent que le modèle de souris utilisé pour l’ataxie de Friedreich ne présente pas de troubles moteurs marqués avant l’âge de 9 mois. Des signes légers de manque de coordination peuvent toutefois apparaître dès l’âge de 4 à 5 mois. Les tests de comportement réalisés chez les animaux sont non invasifs et n’entraînent pas de douleur. Ils peuvent cependant provoquer un stress léger et de courte durée, lié à la manipulation des animaux et à leur exposition à un environnement nouveau. Les séances d’imagerie nécessitent une immobilisation temporaire de l’animal, ce qui peut également générer un inconfort ou un stress transitoire, sans effet durable attendu. La chirurgie d’injection dans le cerveau et la pose d’une fenêtre crânienne constituent une intervention importante. Elles peuvent provoquer une douleur au moment de l’intervention ainsi qu’une gêne dans les jours suivants. Comme pour toute chirurgie, des complications post-opératoires telles qu’un saignement, une infection ou un gonflement peuvent survenir, mais elles restent rares et font l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures ont été mises en place. Tout d’abord, les mêmes animaux sont utilisés pour différentes expériences lorsqu’il est possible, en combinant des analyses comportementales, de microscopie in vivo, et des études histologiques ou moléculaires. Cela permet de réduire le nombre total de sujets nécessaires tout en conservant la pertinence scientifique des données. Les effectifs ont été calculés pour garantir une puissance statistique adéquate, en tenant compte de la variabilité attendue entre individus. Pour chaque groupe expérimental, des mâles et des femelles sont utilisés afin de tenir compte des différences sexuelles potentielles dans les phénotypes et les réponses aux interventions, avec un équilibre idéal de 50 % de chaque sexe. De plus, les animaux non utilisés pour certaines analyses sont réservés pour des expériences complémentaires ou des validations ultérieures, évitant ainsi la répétition inutile d’expériences. Les tissus collectés lors des interventions chirurgicales ou des euthanasies sont également exploités de manière optimale pour plusieurs types d’analyses (histologie, biologie moléculaire, protéomique), réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Enfin, des stratégies alternatives, telles que l’utilisation d’animaux transgéniques combinées à des injections virales ciblées, permettent de limiter le recours à des croisements complexes ou à de grandes cohortes d’animaux, tout en obtenant des résultats comparables. Ces approches contribuent à une utilisation plus efficace des animaux et à une réduction significative du nombre total de sujets nécessaires pour ce projet, tout en garantissant la représentativité des deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations afin de réduire leur stress. Des méthodes de manipulation douces et peu stressantes seront utilisées, comme l’utilisation de tunnels ou la prise des souris dans la main, plutôt que par la queue. La prise en charge de la douleur pendant et après l’intervention chirurgicale repose sur un protocole antidouleur complet, mis en place en collaboration avec la vétérinaire référente de la structure. Après la chirurgie, les animaux pourront être hébergés individuellement lorsque cela est nécessaire pour assurer leur sécurité et une surveillance adaptée durant la période de récupération. Pendant cette période, un enrichissement supplémentaire de l’environnement sera fourni (matériel de nidification, éléments à explorer) afin de limiter le stress et de prévenir l’apparition de comportements anormaux. Un suivi vétérinaire quotidien sera réalisé pendant 10 jours à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de douleur. Plusieurs traitements antidouleur sont disponibles et pourront être ajustés si nécessaire. Des critères d’arrêt adaptés à cette chirurgie ont été définis afin de prévenir toute souffrance inutile. Ils incluent notamment l’observation de la prise de nourriture et d’eau, de l’état général, du toilettage et des déplacements de chaque animal. Les traitements seront administrés via l’eau de boisson, légèrement sucrée pour en faciliter la prise, ce qui permet d’éviter toute manipulation supplémentaire et limite le stress des animaux.

Choix des espèces

Le projet utilise exclusivement des souris-modèles génétiquement altérées présentant une diminution de la frataxine, ainsi que des animaux témoins de type naturel. Ce modèle reproduit de manière fidèle les déficits cellulaires et comportementaux observés chez les patients atteints d’ataxie de Friedreich, tout en permettant l’étude in vivo de l’activité cérébrale et de la progression de la maladie. Les stades de développement ont été choisis en fonction des objectifs expérimentaux : 40 à 50 jours post-natal (jeunes adultes pré-symptomatiques) : étude des altérations précoces de l’activité cérébelleuse, avant l’apparition des symptômes moteurs. 70 à 150 jours post-natal (stades précoce à symptomatique) : suivi de la progression de la maladie à travers l’analyse de l’activité cérébrale et des premiers signes d’incoordination. 180 à 270 jours post-natal (adultes symptomatiques) : évaluation de l’effet des approches thérapeutiques et étude des circuits cérébraux à un stade avancé de la maladie. L’utilisation de ces différents stades permet une couverture complète de l’évolution de la pathologie, de la phase présymptomatique à la phase symptomatique, tout en optimisant le nombre d’animaux grâce à la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties sur cinq ans, elles subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins, une mise à jeun de seize heures puis un gavage quotidien de calcium pendant un mois, pour étudier le rôle de plusieurs gènes dans le métabolisme phosphocalcique et l'effet d'un composé. Les retombées annoncées pour les patients restent limitées à la compréhension des mécanismes, sans application clinique décrite. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas la complexité de l'homéostasie calcique dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Pour étudier l'effet de la rigidité des tissus sur des cellules immunitaires liées au cancer, 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une matrice de collagène implantée par chirurgie, refermée par des agrafes, puis un prélèvement de sang terminal. Le porteur minimise l'inconfort, qu'il attribue à l'incision et aux agrafes plutôt qu'au collagène. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement des macrophages dans un organisme entier et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.

Procédures

Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..

Pour valider une nouvelle technique d'IRM mesurant la myéline, 18 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline, ce qui peut provoquer des troubles de la coordination, des troubles de la mémoire et des comportements anxieux ou dépressifs. Le porteur décrit ensuite une "phase de guérison" une fois le produit arrêté, alors que toutes les souris sont tuées en fin de protocole pour vérifier les images sur leur cerveau. La reconstitution de la myéline mise en avant sert à valider un outil d'imagerie, et non à soigner les souris qui l'ont subie.

Objectifs

De nombreuses maladies du cerveau et de la moelle épinière s’accompagnent d’une atteinte de la myéline, une structure agissant comme une couche isolante autour des neurones, permettant aux messages du cerveau de circuler plus vite et efficacement. Parmi ces maladies, nous retrouvons la sclérose en plaques (SEP), dont l'incidence est en augmentation depuis plusieurs années. Ainsi, pour mieux traiter ces patients, il est nécessaire de disposer d'outils en pratique clinique permettant de quantifier cette atteinte, et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet cela de façon non-invasive. Néanmoins, les techniques d’IRM actuellement utilisées en pratique clinique ne permettent pas de voir directement la myéline mais seulement les dégâts infligés au cerveau lors de l’atteinte de cette myéline. Depuis plusieurs années, des techniques d’IRM sont développées pour essayer de mesurer directement l’atteinte de la myéline, et il en existe aujourd’hui une qui est considérée comme la référence. Néanmoins, cette technique est complexe et nécessite une longue durée d’acquisition, rendant son utilisation en pratique clinique impossible en l’état. Nous avons donc développé une nouvelle technique d’IRM ciblant la myéline, plus simple dans sa mise en œuvre. Ce projet vise à tester cette nouvelle méthode d’imagerie, en la comparant à la technique de référence, à l’aide d’un modèle murin imitant la sclérose en plaques humaine : le modèle cuprizone. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir une nouvelle méthode d'IRM fiable, non invasive et applicable en conditions cliniques pour quantifier la myéline in vivo, ce qui fait actuellement défaut pour le suivi des patients atteints de SEP. Cette nouvelle approche sera aussi utile dans le cadre d’autres pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer. Ceci est d'autant plus important que le développement de thérapies innovantes visant à favoriser la remyélinisation (c’est-à-dire visant la réparation de la myéline atteinte, et donc la protection des neurones), devient une priorité depuis quelques années.

Procédures

Le traitement par cuprizone sera administré per os, directement incorporé au sein de la nourriture habituelle des souris, à la concentration de 0,2%. Les animaux bénéficieront de 2 à 4 sessions d’anesthésie générale gazeuse, afin de permettre leur immobilité et de réduire leur stress lors des examens par IRM. Chaque session aura une durée maximale de 2 heures.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par cuprizone peut entraîner chez la souris des troubles moteurs légers, à savoir principalement des troubles de la coordination et locomotion. Elle peut aussi entraîner des troubles comportementaux liés à des problèmes de mémoire et d’apprentissage, pouvant être à l’origine de comportements anxieux ou dépressifs. La cuprizone peut également avoir des effets physiologiques généraux avec une perte de poids et une baisse de l’activité. Toutefois, dès que l'on arrête de donner le produit à la 6ème semaine, le cerveau cesse d'être attaqué. Cela marque le début d'une phase de guérison où l'animal retrouve progressivement sa forme et son comportement normal. Par ailleurs, il peut y avoir un stress lié aux transports des souris entre les animaleries et la plateforme d'imagerie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever et analyser leur cerveau. Cette étape est indispensable pour vérifier que les images obtenues en IRM reflètent bien la réalité biologique observée dans le cerveau.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est obligatoire pour valider la robustesse de nouveaux paramètres IRM dans des conditions biologiques réelles. Ces validations constituent une étape incontournable avant toute transposition en clinique. A ce jour, malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, aucune alternative non animale ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes de démyélinisation et de remyélinisation in vivo.

Réduction

Le nombre de 18 souris est nécessaire et suffisant pour analyser la perte de myéline induite par le traitement à la cuprizone, la reconstitution de la myéline tout en considérant les variabilités inter-individus, aux 3 points temporels de notre étude. Le suivi longitudinal permet de réduire la variabilité inter-individuelle et le nombre total d’animaux utilisés, tout en évaluant la nouvelle technique IRM.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront prises au cours du suivi afin de réduire le stress engendré par les examens IRM répétés,les transports et les contentions multiples et les troubles induits par l'ingestion du médicament pour induire une démyélinisation . Ces mesures seront réalisées sous anesthésie générale, afin que l’animal ne bouge pas et permettra de diminuer le stress induit par le bruit des machines. L’hypothermie, induite par le passage dans la machine IRM sera prévenue par un maintien d’une température stable pendant toute la durée de l’anesthésie. Des points limites seront appliqués, conduisant selon la situation, à l’arrêt de la procédure et/ou à la mise à mort humanitaire conformément aux procédures en vigueur.

Choix des espèces

Le modèle cuprizone est le modèle de choix pour l'étude des changements du contenu en myéline dans le cerveau de souris. Il s’agira de souris femelles adultes ayant un développement cérébral achevé (âgées de 6 à 8 semaines) car la sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, touchant de façon prédominante les femmes.

Nourries six semaines avec un régime gras pour abîmer leur foie, puis injectées au paracétamol pour déclencher une défaillance hépatique aiguë, 340 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'atteinte peut réduire l'activité et la mobilité des animaux dans les heures suivant l'injection, avant le prélèvement de leurs organes. Le protocole teste une molécule censée protéger les cellules du foie. Le bénéfice avancé pour les patients, éviter une greffe, reste renvoyé à un éventuel développement clinique.

Objectifs

L’insuffisance hépatique aiguë sur chronique (IHAC) correspond à une dégradation brutale de la fonction du foie chez des patients atteints d’une maladie chronique du foie. Ce syndrome est associé à un pronostic sévère, avec une mortalité pouvant atteindre 58%. À ce jour, la transplantation hépatique constitue le seul traitement curatif. L’IHAC représente donc un enjeu majeur de santé publique et souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, le paracétamol, bien que largement utilisé et généralement considéré comme sûr aux doses thérapeutiques, peut déclencher une décompensation hépatique. Chez les patients atteints d’une maladie hépatique chronique, cette toxicité pourrait survenir à des doses plus faibles en raison d’une capacité de détoxification hépatique altérée. La mort des cellules du foie joue un rôle important dans cette pathologie. Dans une étude précédente utilisant un modèle murin d’intoxication aiguë au paracétamol, nous avons montré l’effet protecteur d’une molécule ciblant deux voies de mort cellulaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette molécule dans un modèle murin d’hépatite aiguë induite par le paracétamol survenant sur un foie atteint d’une maladie chronique induite par un régime alimentaire riche en lipides, chez des souris mâles.

Bénéfices attendus

L’objectif du présent projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule dans un modèle de pathologie hépatique chronique aggravée par une hépatite aiguë induite par le paracétamol. Cette étape constitue une phase préalable au développement clinique de cette molécule. Si son efficacité est confirmée, cette approche pourrait contribuer à améliorer la survie sans recours à la transplantation hépatique et à en réduire l’indication, répondant ainsi à un besoin médical croissant dans un contexte d’augmentation des maladies métaboliques du foie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures expérimentales incluant un régime alimentaire, des prélèvements sanguins, des injections et une euthanasie sur une durée pouvant aller jusqu’à 7 semaines. Afin d’induire une pathologie hépatique chronique, des groupes de souris seront nourris avec un régime alimentaire spécifique pendant 6 semaines. Durant cette période, les animaux feront l’objet d’un suivi régulier comprenant des pesées et des observations cliniques. Afin de suivre l’évolution de la pathologie, un prélèvement sanguin intermédiaire sera réalisé chez l’ensemble des animaux environ 72 heures avant la fin de cette période. Ce prélèvement sera effectué sous anesthésie générale et la durée de la procédure, incluant l’induction et le réveil, sera inférieure à 5 minutes. Dans certaines procédures, les animaux recevront une injection unique des traitements expérimentaux ou de leur diluant, réalisée sous anesthésie générale en moins de 5 minutes. Une partie des animaux recevra une injection de paracétamol afin d’induire une atteinte hépatique aiguë. Cette injection est réalisée rapidement et ne dure que quelques secondes. Selon les groupes expérimentaux, les animaux seront ensuite suivis pendant des durées variables. Avant l’euthanasie, tous les animaux feront l’objet d’un prélèvement sanguin terminal sur animal vigile, de courte durée, afin de permettre l’analyse des paramètres biologiques. Les animaux seront ensuite euthanasiés pour permettre l’analyse des tissus.

Impact sur les animaux

La MASH est généralement associée à une absence de douleur manifeste aux stades considérés. Au démarrage du protocole expérimental, un léger désagrément transitoire peut être ressenti par l’animal en lien avec le manque d’appétence pour le régime alimentaire hyperlipidique. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture à volonté, à l’exception de la nuit précédant l’injection de paracétamol, durant laquelle la nourriture est retirée, ce qui peut engendrer un léger stress sans conséquences notables. L’induction de l’IHAC par le paracétamol peut provoquer un certain inconfort chez les animaux sans être associé à une douleur intense. Une diminution de l’activité et une réduction de la mobilité des souris peuvent être observées dans les heures suivant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane peut entraîner un stress transitoire à l’induction, une dépression respiratoire légère, une hypothermie, ainsi qu’une récupération parfois ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie et de l’efficacité de nos molécules thérapeutiques.

Remplacement

Dans le contexte du développement des pathologies hépatiques telles que la MASH, les alternatives in vitro ou in silico ne permettent pas, à ce jour, de reproduire la complexité physiopathologique de la maladie. En effet, la MASH résulte d’interactions dynamiques entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, pancréas), d’une grande hétérogénéité cellulaire au sein du microenvironnement hépatique, ainsi que de l’influence du microbiote intrahépatique. Les modèles cellulaires ou organoïdes actuellement disponibles ne permettent pas de reconstituer de manière fiable ces communications inter-organes et intercellulaires, ni de reproduire l’évolution spatiotemporelle des lésions observées in vivo. Le présent projet vise à évaluer l’effet protecteur d’un inhibiteur de nécrose programmée dans un contexte d’insuffisance hépatique aiguë induite par le paracétamol sur un foie déjà atteint de MASH. Ce contexte pathologique implique l’activation coordonnée de multiples cascades cellulaires, inflammatoires et métaboliques, dont l’intégration et la dynamique ne peuvent être intégralement modélisées par les systèmes in vitro disponibles à l’heure actuelle. Enfin, la réalisation de cette étude préclinique in vivo constitue une étape indispensable avant tout développement clinique chez l’humain, conformément aux exigences réglementaires et éthiques en vigueur. Ainsi, malgré l’examen attentif des méthodes alternatives disponibles, aucun remplacement complet de l’expérimentation animale n’est actuellement possible pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux sera strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée à partir de données issues d’études précédentes et d’estimations statistiques, en tenant compte de la variabilité attendue des mesures et de la différence minimale considérée comme biologiquement pertinente pour le critère principal étudié (les enzymes hépatiques ALT). Des méthodes expérimentales et analytiques visant à limiter les biais seront utilisées, notamment la répartition aléatoire des animaux dans les différents groupes expérimentaux. Sur cette base, le nombre minimal d’animaux requis est estimé à 10 par groupe. Les données issues d’expérimentations murines antérieures menées dans un modèle d’hépatite aiguë induite par le paracétamol confirment la pertinence de cette taille d’échantillon, compte tenu de l’importante variabilité interindividuelle associée à ce modèle. Par ailleurs, la conception du projet inclut une phase préalable de mise au point du modèle d’insuffisance hépatique aiguë sur fond chronique (IHAC) et d’ajustement de la dose de paracétamol nécessaire à son induction, réalisée sur un nombre limité d’animaux. Cette étape permettra également d’évaluer l’impact potentiel du diluant des molécules sur le développement de la pathologie, afin de garantir la robustesse et la reproductibilité du modèle avant l’étude des traitements.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes (par fratrie) avec un enrichissement adapté (matériaux de nidification et cachettes) permettant l’expression des comportements naturels. En cas d’isolement d’un individu lié à de l’agressivité de dominance, un enrichissement supplémentaire sera ajouté. Une période d’acclimatation d’au moins une semaine et une habituation progressive aux manipulations (contention douce) permettront de réduire le stress. Les manipulations expérimentales seront limitées au strict nécessaire et, dans la mesure du possible, regroupées afin de réduire la fréquence des contentions. Une surveillance clinique sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation standardisée associée à un suivi du poids de manière hebdomadaire en phase chronique et quotidienne en phase aiguë. Une attention particulière sera portée durant la phase aiguë, notamment dans les heures suivant l’injection de paracétamol, avec une augmentation de la fréquence des observations si nécessaire. L’anesthésie sous l’isoflurane sera utilisée pour les procédures concernées, avec une attention particulière portée au maintien de la température corporelle et à la phase de réveil, afin de limiter les effets indésirables tels que l’hypothermie. Un anesthésique locorégional sera appliqué lors des prélèvements ou de certaines injections réalisées dans des zones sensibles. Des points limites précoces et spécifiques aux modèles utilisés sont définis, incluant notamment une perte de poids excessive, une altération marquée de l’état général, des troubles du comportement ou des signes cliniques sévères. Leur atteinte entraînera l’arrêt de la procédure et la mise en œuvre de mesures appropriées, incluant si nécessaire une euthanasie conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est particulièrement pertinente, car cette lignée constitue un modèle robuste et largement validé pour l’étude de nombreuses pathologies hépatiques et métaboliques. Leur physiologie permet de reproduire, sur des temps expérimentaux raccourcis, des processus pathologiques comparables à ceux observés chez l’Homme. Ce modèle permet d’étudier l’évolution de la maladie et les mécanismes impliqués, comme la mort des cellules, l’inflammation et la réparation du foie. Les souris sont également bien adaptées pour tester de nouvelles molécules et évaluer leur potentiel thérapeutique. Les souris seront incluses dans les protocoles expérimentaux à l’âge adulte, afin de disposer d’une fonction hépatique pleinement mature et fonctionnelle. Ce choix est essentiel pour garantir la validité physiopathologique du modèle, les réponses hépatiques aux agressions toxiques et inflammatoires dépendant étroitement de l’âge. Par ailleurs, l’insuffisance hépatique aiguë sur un foie préalablement altéré par une hépatite chronique de type MASH concerne majoritairement la population adulte, l’âge constituant un facteur de risque majeur dans le développement et la progression de cette pathologie. Seules des souris mâles seront utilisées, conformément aux données scientifiques indiquant une résistance relative des femelles à la MASH et à l’induction d’une hépatite aiguë par le paracétamol. De plus, la prévalence de l’IHAC est plus élevée chez les hommes. Ce choix permet ainsi de maximiser la probabilité de détecter un effet biologique pertinent tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux.