Imagerie in vivo du cortex cérébelleux et de la fonction mitochondriale dans les populations neuronales et gliales de l’ataxie de Friedreich

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative rare et héréditaire qui provoque une perte progressive de la coordination motrice. Elle est causée par une perte de fonction de la frataxine, protéine clé du métabolisme du fer mitochondrial. Récemment, un nouveau modèle murin porteur d’une mutation ponctuelle dans le gène FXN (Fxn G127V KI/KI) a été généré (Fil et al., 2020). Cette mutation ayant été identifiée pour la première fois chez des patients atteints d’AF, ce modèle représente un outil préclinique particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous visons à caractériser de manière approfondie les altérations du circuit cérébelleux aux stades pré-symptomatique et symptomatique, en utilisant l’imagerie in vivo. Cette approche constitue le seul moyen d’évaluer dynamiquement l’activité neuronale en tenant compte des interactions synaptiques, mais également d’explorer la fonction mitochondriale et les interactions neurones–glie au sein du cortex cérébelleux. Sur la base de ces données, nous mettrons en place des stratégies de modulation du circuit cérébelleux par des approches chimiogénétiques et de thérapie génique ciblée, afin d’évaluer leur potentiel pour restaurer les déficits comportementaux. Enfin, l’étude des modifications moléculaires associées permettra d’identifier des mécanismes d’intérêt pour le développement de futures thérapies chez les patients atteints d’AF. Ce projet prolonge et complète le projet déjà approuvé consacré à la première caractérisation du modèle G127V KI/KI, en apportant une analyse plus fine des dysfonctionnements mitochondriaux, des interactions cellulaires et des altérations des circuits cérébelleux. ous chercherons à comprendre comment l’activité et le métabolisme des neurones et des cellules gliales fonctionnent à la fois chez les animaux contrôles et G127V. L’accent sera mis sur les interactions neurones–glie et sur le partage de voies métaboliques essentielles, dont la perturbation pourrait contribuer aux dysfonctionnements observés dans l’AF. Les approches de modulation et de protéomique offriront l’opportunité d’identifier les voies clés nécessaires au maintien de l’activité neuronale, de l’homéostasie gliale et d’un état métabolique correct, et permettront de mieux comprendre les altérations propres à l’AF.

Ce projet contribuera à caractériser l’activité neuronale et gliale ainsi que la dynamique mitochondriale au sein du circuit cérébelleux dans un modèle préclinique de l’ataxie de Friedreich. Il fournira de nouvelles connaissances sur le rôle de la frataxine et les conséquences de sa perte de fonction, tout en permettant d’évaluer, d’un point de vue comportemental et moléculaire, la réintroduction de la frataxine dans des populations neuronales spécifiques affectées par la maladie. De plus, les voies ciblées identifiées mettront en évidence de nouvelles voies potentielles pour le développement d’interventions thérapeutiques chez les patients.

Des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin d’évaluer la coordination motrice, la marche et la force musculaire. Chaque test dure entre 30 secondes et 5 minutes, pour un maximum de 15 minutes par session et par animal. Avant le début des tests, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant 7 jours (10 à 20 minutes par jour et par animal) par des manipulations douces et progressives, afin de réduire le stress et d’assurer la fiabilité des observations. Au total, 120 animaux seront concernés par ces tests. Des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’implanter des fenêtres ou des lentilles permettant l’observation directe du cerveau, ou pour injecter des vecteurs rendant certaines cellules visibles. Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur pendant et après l’intervention. La durée des interventions varie de 45 minutes (injections dans le cerveau) à 3 heures (implantation de fenêtre crânienne). Après la chirurgie, une période de récupération avec surveillance rapprochée et soins adaptés est prévue. Lorsque nécessaire pour garantir la sécurité des animaux et une récupération optimale, ceux-ci pourront être hébergés individuellement pendant la phase postopératoire. Après la phase de récupération, certains animaux participeront à des séances d’imagerie afin d’enregistrer l’activité cérébrale à l’état éveillé, au repos ou lors de tâches comportementales. Lors de ces sessions, la tête de l’animal est maintenue stable pendant 30 à 45 minutes. Une habituation progressive de 7 à 10 jours est mise en place, avec une augmentation graduelle de la durée, afin de limiter le stress et l’inconfort. Ces procédures concernent 720 animaux. Des injections ciblées dans le cerveau seront également réalisées pour moduler l’activité des cellules nerveuses ou de soutien, parfois en combinaison avec l’imagerie. Ces interventions concernent 160 animaux. Enfin, des analyses après le décès des animaux seront effectuées pour des études moléculaires et protéomiques, concernant 45 animaux. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, tout en assurant un suivi attentif et continu de leur bien-être.

Les données recueillies par notre laboratoire et par nos collaborateurs montrent que le modèle de souris utilisé pour l’ataxie de Friedreich ne présente pas de troubles moteurs marqués avant l’âge de 9 mois. Des signes légers de manque de coordination peuvent toutefois apparaître dès l’âge de 4 à 5 mois. Les tests de comportement réalisés chez les animaux sont non invasifs et n’entraînent pas de douleur. Ils peuvent cependant provoquer un stress léger et de courte durée, lié à la manipulation des animaux et à leur exposition à un environnement nouveau. Les séances d’imagerie nécessitent une immobilisation temporaire de l’animal, ce qui peut également générer un inconfort ou un stress transitoire, sans effet durable attendu. La chirurgie d’injection dans le cerveau et la pose d’une fenêtre crânienne constituent une intervention importante. Elles peuvent provoquer une douleur au moment de l’intervention ainsi qu’une gêne dans les jours suivants. Comme pour toute chirurgie, des complications post-opératoires telles qu’un saignement, une infection ou un gonflement peuvent survenir, mais elles restent rares et font l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter l’inconfort des animaux.

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.

Le projet utilise exclusivement des souris-modèles génétiquement altérées présentant une diminution de la frataxine, ainsi que des animaux témoins de type naturel. Ce modèle reproduit de manière fidèle les déficits cellulaires et comportementaux observés chez les patients atteints d’ataxie de Friedreich, tout en permettant l’étude in vivo de l’activité cérébrale et de la progression de la maladie. Les stades de développement ont été choisis en fonction des objectifs expérimentaux : 40 à 50 jours post-natal (jeunes adultes pré-symptomatiques) : étude des altérations précoces de l’activité cérébelleuse, avant l’apparition des symptômes moteurs. 70 à 150 jours post-natal (stades précoce à symptomatique) : suivi de la progression de la maladie à travers l’analyse de l’activité cérébrale et des premiers signes d’incoordination. 180 à 270 jours post-natal (adultes symptomatiques) : évaluation de l’effet des approches thérapeutiques et étude des circuits cérébraux à un stade avancé de la maladie. L’utilisation de ces différents stades permet une couverture complète de l’évolution de la pathologie, de la phase présymptomatique à la phase symptomatique, tout en optimisant le nombre d’animaux grâce à la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus.