Rongeurs

Pour présélectionner des candidats médicaments contre la maladie de Parkinson, 720 rats reçoivent une substance qui réduit transitoirement des messagers chimiques du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le modèle reproduit des symptômes moteurs réversibles, ralentissement et rigidité, avant injections, gavages et prélèvements de liquide céphalorachidien. Le porteur le présente comme un "filtre précoce" épargnant des animaux à des études plus invasives. Il en fait un argument de réduction, tout en prévoyant de tester jusqu'à quarante candidats médicaments de ses clients sur cinq ans.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par un dysfonctionnement progressif du cerveau. Les traitements actuellement disponibles permettent d’améliorer les symptômes moteurs, mais leur efficacité reste incomplète et s’accompagne d’effets secondaires importants, notamment l’apparition de mouvements involontaires chez une grande majorité de patients. Le besoin de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc majeur. L’objectif du projet est d’identifier de nouveaux candidats médicaments capables d’améliorer les symptômes moteurs de type parkinsonien. Pour cela, nous proposons d’utiliser un modèle chez le rat. Une substance sera administrée afin de réduire transitoirement certaines substances chimiques du cerveau. Ce modèle reproduit de manière réversible certains symptômes moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson, tels que les mouvements ralentis, la réduction de l’activité locomotrice ou la rigidité. Contrairement aux modèles classiques qui provoquent des lésions irréversibles du cerveau, cette approche n’entraîne pas de destruction des cellules nerveuses. Elle permet ainsi de limiter le recours à des procédures lourdes et de réduire le nombre d’animaux soumis à des interventions invasives. L’intérêt principal de ce modèle réside dans son rôle de filtre précoce dans le développement préclinique. Il permet d’obtenir rapidement une première indication de l’efficacité d’un traitement sur les symptômes moteurs liés à une diminution de certaines substances chimiques du cerveau. Seules les molécules démontrant un effet bénéfique dans ce modèle seront ensuite évaluées dans des modèles plus invasifs reproduisant la perte progressive de certains neurones. Ainsi, l’utilisation de ce modèle contribue directement à la réduction du nombre d’animaux exposés à des approches lésionnelles sévères. En résumé, le projet vise à présélectionner des molécules actives sur les symptômes moteurs de type parkinsonien dans un modèle à sévérité limitée, avant d’engager des études approfondies dans d’autres modèles. Cette démarche s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en limitant le recours aux modèles invasifs aux seuls candidats présentant un intérêt thérapeutique démontré. 40 candidats médicaments pourront être testés dans ce projet (4 groupes x 10 études, sur 5 ans).

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques. Ce modèle permettra à nos clients de sélectionner les molécules qui feront l’objet d’études nécessitant une approche plus invasive. Ce modèle permet de réduire le nombre d’animaux qui subiront une approche plus invasive grâce à la pré-sélection de molécules d’intérêt. Les molécules qui ne montrent aucun effet sur l’amélioration des troubles moteurs induits dans ce modèle ne seront pas retenues pour des études plus approfondies. Cette démarche bénéficie à la fois au respect des principes de raffinement et de réduction, et à nos clients, en permettant d’orienter les efforts de financement vers les candidats thérapeutiques les plus pertinents. Les résultats de ce projet seront accessibles à court terme, les tests comportementaux étant réalisés peu de temps après l’injection de réserpine et s’effectuant dans la journée.

Procédures

Les animaux vont subir des injections (1 fois 1 min), des administrations de traitement dans le corps sur animal vigile ou anesthésié pour certaines injections (1 fois par jour pendant 1 jour à 2 mois maximum/1 min), des prélèvements de sang sur animaux anesthésiés, avec réveil (1 à 4 fois/1 min) et des mesures du comportement moteur (1 à 2 fois/5 min à 3 heures) et des prélèvements du liquide qui protège le cerveau sur animaux anesthésiés, sans réveil (1 fois/10 min).

Impact sur les animaux

La substance administrée est diluée dans une solution qui peut provoquer une irritation locale, une inflammation ou une douleur transitoire au point d’injection (nuisances légères). L’injection peut entrainer une hypothermie, une perte de poids et une difficulté à faire des mouvements, les animaux récupérant au bout d’environ 24 à 48h (nuisances modérées car transitoires). Les substances administrées peuvent avoir des effets indésirables, tels qu’un effet irritant du composé, un changement de comportement, une perte d'appétit ou bien de l'agressivité (nuisances légères). Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : voie orale : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. Si le traitement est administré par injection, il peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. L’inhalation du traitement peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress léger. Toutes les nuisances relatives aux méthodes d’administration ou aux tests comportementaux sont d’intensité légère.

Devenir

A l’issu de cette procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Ce modèle est généré dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Il permet de valider l’efficacité d’une molécule sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Une fois une molécule d’intérêt identifiée, son efficacité pourra être testée dans des modèles reproduisant la perte progressive des neurones impliqués dans la maladie de Parkinson. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui devront subir des expériences plus lourdes ou des chirurgies pour tester des molécules peu avancées dans le processus de développement. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes.

Raffinement

Avant toute manipulation, nous respecterons une période d'acclimatation des animaux d’au minimum 7 jours. Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Les animaux seront pesés toutes les semaines et tous les jours pendant 3 jours après l'injection sous-cutanée. Lors de ces injections, des éléments de raffinement sont prévus. Les animaux sont observés plusieurs fois par jour (2 fois par jour minimum). Les administrations de traitements peuvent être réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Certaines injections e feront sous anesthésie gazeuse. Si le traitement provoque des effets indésirables, il peut être interrompu et l’animal surveillé. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les animaux sont observés selon plusieurs critères et dans le cas où les points limites sont dépassés, une décision de mise à mort est prise par les expérimentateurs pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est utilisé dans ce modèle car le fonctionnement de son cerveau est proche de celui de l’humain, ce qui permet de reproduire fidèlement les symptômes moteurs parkinsoniens. Il dispose également de nombreux tests comportementaux validés, offrant une évaluation sensible des altérations induites et des effets des traitements. Enfin, sa taille, son comportement stable et la facilité de réalisation d’études longitudinales en font un modèle expérimental pratique et reproductible. Les rats Sprague Dawley ou Long Evans sont utilisés car nous avons une expertise sur ces souches et les tests comportementaux ont été validés sur celles-ci. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.

4 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une induction du cholangiocarcinome, un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie, trente-deux passages en résonance magnétique et plusieurs injections de vaccin ou de chimiothérapie. Le porteur reconnaît des risques de péritonite après injections répétées et applique des points limites déclenchant la mise à mort. Le cancer visé a une survie à cinq ans inférieure à vingt pour cent, mais l'efficacité du vaccin peptidique reste à démontrer.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins peptidiques comme nouvelle stratégie à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer affectant les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire pour non seulement prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi limiter sa progression et, enfin, améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente un des pronostics les plus sombres avec une survie à 5 ans inférieure à vingt pour cent, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de trois vecteurs pour l’induction tumorale (une minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par échographie sous anesthésie générale (dix minutes par animal, une fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, deux fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront pesées au moins une fois par semaine (animaux vigiles, moins d’une minute par animal). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination peptidique sous anesthésie gazeuse (pour un maximum de trois au total, une minute par souris par jour). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris).

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimio- et immuno-thérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et les sites d’injections peuvent s’infecter. La répétition des injections peut induire une distension abdominale et des signes cliniques de péritonite (cas rare). La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert une induction tumorale, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins peptidiques dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins ont été développés, in vitro, via l’identification de 13 antigènes par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4114 souris, pouvant être réduit à 2500-3000 grâce à l’approche séquentielle, où les procédures s’enchaînent à condition que l’hypothèse de la procédure précédente soit validée. Des groupes de seize souris (huit femelles et huit mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à une semaine d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et distinctes du personnel en charge de la gestion des élevages. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, etc...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de six semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

Pour créer un modèle de glaucome, 1 635 souris reçoivent dans l'œil des microbilles aimantées qui bloquent l'évacuation du liquide oculaire et font monter durablement la pression, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à deux chirurgies d'induction, une injection de thérapie candidate et huit séances de tests visuels et d'imagerie, certaines sous anesthésie. Le porteur décrit une irritation possible de l'œil après l'injection des particules. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour analyser la rétine et le cerveau, les techniques sur animal vivant étant jugées insuffisantes.

Objectifs

Le glaucome est une pathologie chronique et irréversible du nerf optique, caractérisée par une atteinte des cellules de la rétine et une altération progressive du champ visuel. Elle touche plus de 60 millions de personnes dans le monde, dont 1,6 million en France. Son principal facteur de risque est l’augmentation de la pression dans l’œil. Les traitements actuels visent à abaisser cette pression par des collyres, laser ou chirurgie. Une nouvelle piste, la neuroprotection, cherche à préserver les cellules de la rétine indépendamment de la pression de l’œil, mais la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu freine le développement de thérapies efficaces. Dans ce projet, notre équipe vise à étudier le glaucome en utilisant un modèle chez la souris qui imite de façon très fidèle ce qui se passe dans le glaucome humain. Pour créer ce modèle, on injecte dans l’œil de la souris de petites billes aimantées. Celles-ci bloquent l’évacuation normale du liquide présent dans l’œil (l’humeur aqueuse). Cela provoque une augmentation durable de la pression à l’intérieur de l’œil et entraine la mort progressive des cellules nerveuses de la rétine, l’activation de cellules immunitaires dans l’œil, comme on le voit chez les personnes atteintes de glaucome. Ce modèle permet d’étudier la maladie dans un environnement contrôlé et sans inflammation inutile, ce qui est important pour des résultats fiables. Une étude chez l’animal est indispensable ici, car les interactions complexes entre la pression dans l’œil, l’inflammation et la mort des neurones ne peuvent pas être reproduites en laboratoire dans une simple boîte de culture. Nous suivrons l’évolution du glaucome chez différentes lignées de souris, nous analyserons finement les tissus pour comprendre ce qui se passe tout au long des voies visuelles. Les objectifs sont donc de comprendre le rôle des cellules inflammatoires dans le développement du glaucome et tester de nouvelles approches de protection des neurones dans le glaucome, administrées directement dans l’œil.

Bénéfices attendus

L’objectif final est de comprendre pourquoi et comment les cellules de la rétine meurent dans le glaucome, et trouver de nouveaux traitements capables de protéger la vue. Pour cela, nous utiliserons un modèle de glaucome chez la souris qui reproduit très bien ce qui se passe chez l’humain : la pression dans l’œil augmente lentement et durablement, comme dans la vraie maladie. Cela permet d’observer étape par étape comment l’inflammation et les dérèglements locaux abîment les neurones de la vision. En analysant finement le fonctionnement de la rétine et en observant les tissus au microscope, l’équipe pourra comprendre la chaîne d’événements qui mène à la perte de vision, ce qui est essentiel pour savoir où et quand intervenir pour sauver les cellules visuelles. Dans ce projet nous testerons de nouveaux traitements afin de voir s’ils peuvent empêcher la mort des cellules de la rétine. Le développement ultérieur de ces traitements chez l’Humain permettrait de retarder ou empêcher la perte de vision, là où les traitements actuels ne font que réduire la pression oculaire.

Procédures

La chirurgie d'induction du glaucome est réalisée deux fois par animal (initiale et à la quatrième semaine de la première injection) chez une partie des animaux sur cinq ans, sous anesthésie locale et générale, pour une durée de quinze minutes par animal. L'injection de thérapies candidates est effectuée une fois par animal, une semaine après la première injection de microbilles, chez une partie des animaux sur cinq ans, sous anesthésie locale et générale, pour une durée d'environ cinq minutes par animal. Les examens fonctionnels et d'imagerie sont réalisés chez tous les animaux avant la première injection, puis à une, trois, quatre, six, huit, dix et douze semaines. Le test d'acuité visuelle est mesuré sur animal vigile et dure environ dix minutes. La mesure de la pression intraoculaire est réalisée sur animal vigile, avec trois mesures successives par œil, indolores, pour une durée d'environ cinq minutes par animal. L'imagerie rétinienne est réalisée sous anesthésie générale et dure environ trente minutes. En résumé, chaque souris subit au maximum deux chirurgies d'induction, une injection et huit séances de tests visuels et d'imagerie, dont certaines sous anesthésie. Toutes ces procédures sont réalisées avec analgésie adaptée et surveillance systématique. Les animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien selon deux méthodes réglementaires différentes en fonction des analyses à effectuer.

Impact sur les animaux

Toutes les interventions prevues dans ce projet sont realisees sous anesthesie generale. Les produits anesthésiants peuvent provoquer une legere gene au point d’injection, ainsi qu’un faible stress passager. Comme pour toute anesthesie, il existe de rares risques de complications, tels qu’un ralentissement du cœur ou de la respiration, ou une baisse de la temperature corporelle. L’injection des particules etudiees dans ce projet à l’interieur de l’œil peut entrainer une irritation de l’oeil. Les examens d’imagerie necessitent egalement une anesthesie et peuvent, dans certains cas, entrainer une legere irritation de la surface de l’œil.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés de manière reglementaire en fin de procédure, car des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires. En effet, les techniques fonctionnelles et d’imagerie utilisées sur l’animal vivant ne permettent actuellement qu’une analyse incomplète et superficielle des phenomènes impliques dans la physiopathologie du glaucome.

Remplacement

L’étude des phénomenes inflammatoires lies au glaucome nécessite de travailler sur un organisme vivant complet. En effet, il n’existe pas aujourd’hui de modele en laboratoire capable de reproduire avec précision les interactions complexes entre les cellules nerveuses, les cellules immunitaires et la circulation sanguine dans l’œil. Ce projet vise egalement à tester des traitements susceptibles de proteger les cellules nerveuses et de moduler la reponse inflammatoire. Pour cela, certaines analyses doivent être réalisees sur des tissus oculaires et cérébraux, préleves apres que les animaux aient été endormis puis euthanasiés sans souffrance. L’utilisation du modele animal, en particulier chez la souris, est donc indispensable pour répondre à ces questions scientifiques. Ces recherches sont une étape nécessaire pour mieux comprendre la maladie et, à terme, pour developper des approches therapeutiques efficaces chez l’être humain.

Réduction

Ce projet, prévu sur une durée de cinq ans, utilisera au maximum 1 640 souris. Ce nombre a ete soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en respectant la règle de réduction. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à partir des résultats d’études précédentes et de calculs de puissance statistique précis. Pour chaque souris, plusieurs structures de la voie visuelle seront analysées afin d’optimiser au maximum les prélèvements et limiter le recours à d’autres animaux. Comme seule une partie des souris développe une élévation stable de la pression oculaire, il faut environ 20 animaux par groupe pour garantir des résultats scientifiquement solides tout en limitant leur utilisation. Les données seront ensuite analysées à l’aide de tests statistiques adaptés pour vérifier la fiabilité des résultats. Ce travail permettra de tirer des conclusions robustes tout en maintenant le plus haut niveau d’exigence éthique et scientifique.

Raffinement

Avant toute experience, les animaux disposent d’une periode d’adaptation d’au moins cinq jours pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ils sont hebergés dans des cages ventilées, enrichies avec du materiel favorisant leur confort (comme des abris en carton et baton à ronger), avec de la nourriture et de l’eau disponibles en permanence. Le nombre d’animaux par cage est limite à cinq, afin de garantir leur bien-etre. Les conditions d’élevage respectent la réglementation en vigueur : la temperature et le taux d’humidité sont controlés et conforme à la législation en vigueur. Les animaux sont observés chaque jour par du personnel qualifie. En cas d’anomalie ou de signe de souffrance, des mesures adaptées sont prises selon un protocole validé par le comité du bien-être animal : cela peut aller d’un simple traitement à l’arrêt de l’expérimentation, voire à l’euthanasie si necessaire pour éviter toute douleur. Les expérimentations sont effectuées sous anesthesie genérale chaque fois que nécéssaire, avec des traitements antidouleur administres avant, pendant et après l’intervention le cas échéant. Un système de suivi individuel par des étiquettes accollées aux cages permet de garantir un suivi adapte constant de l’animal afin de s’assurer du bien-etre animal tout au long du projet.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris se justifie parce qu’elle permet de créer et d’étudier des lignées d’animaux modifies genetiquement. Dans ce projet, nous utiliserons des souris entre 8 et 12 semaines d’âge, afin d’eviter les effets liés au vieillissement, qui pourrait fausser les analyses sur les cellules nerveuses et immunitaires. Les souris utilisées seront soit des souris commerciales, soit des souris porteuses de modifications specifiques du système immunitaire permettant de reproduire la pathologie humaine étudiées dans ce projet. Ces modeles permettront d’observer très precisement et au fil du temps comment differentes cellules inflammatoires apparaissent et se deplacent dans l’oeil.

Administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou nasale jusqu'à 120 fois pour certains, 14 080 souris et rats vont être utilisés dans des études de toxicité, tous tués à l'issue pour analyser leurs organes. Ces procédures d'un niveau de souffrance modéré visent à évaluer l'innocuité de nouveaux candidats médicaments avant tout passage chez l'humain. Le porteur mentionne des points limites qui déclenchent la mise à mort anticipée des animaux dont l'état se dégrade. L'effectif, le plus élevé du lot, est présenté comme "adapté des recommandations de l'OCDE", sans que le total soit autrement justifié.

Objectifs

L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.

Procédures

1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Les animaux seront sous anestésie chimique lors des administration intratrachéales. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).

Choix des espèces

L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.

Jusqu'à huit anesthésies, une électroporation par micro-choc électrique et huit injections par animal: 395 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Le porteur reconnaît les douleurs liées aux injections et aux électroporations ainsi que le stress des anesthésies répétées. L'objectif est de comparer des formulations d'ARNm afin d'en retenir les plus efficaces avant un éventuel essai chez l'humain. La régénération plus rapide de la peau promise aux patients reste une perspective, alors que les atteintes aux souris sont immédiates.

Objectifs

Dans ce projet, plusieurs candidats médicaments ont déjà été sélectionnés à l’issue de nos travaux précédents, et le modèle murin d’administration par électroporation (micro-choc électrique permettant au candidat de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) est désormais développé et validé. L’objectif est maintenant de tester et de comparer différentes formulations de ces candidats, notamment selon une approche dose-réponse, afin d’identifier les formulations les plus efficaces et les mieux tolérées. Cette étape est indispensable pour affiner la sélection des meilleurs produits avant leur caractérisation finale et la conception d’un futur essai clinique chez l’homme..

Bénéfices attendus

Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection de nos composés pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d’injection seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le remplacement des animaux n’est pas possible dans ce projet car les objectifs nécessitent l’étude d’un organisme vivant intégrant l’ensemble des paramètres physiologiques. L’évaluation de l’administration intradermique par électroporation, de la tolérance locale et systémique, de la bio distribution, de l’expression spatio-temporelle de l’ARNm et de l’efficacité biologique des candidats implique des interactions complexes entre la peau, le système immunitaire, la vascularisation et les processus de réparation tissulaire. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Les modèles alternatifs (ou ces constructions/formulations ont été évaluées) permettent uniquement d’étudier des mécanismes isolés (cytotoxicité, pénétration, expression locale), mais pas la réponse globale de l’organisme ni l’efficacité fonctionnelle des composés. De plus, le suivi par bioluminescence de l’expression de la luciférase nécessite un organisme vivant. Ainsi, l’expérimentation animale constitue une étape indispensable de validation préclinique.

Réduction

Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs . Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non-toxicité (sur peau reconstruite notamment) des vecteurs d’intérêt dans les différentes formulations testées, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « la plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des constructions/formulations (élimination plus ou moins rapide par l’organisme). Souris swiss femelles âgées de 7 semaines en début d’expérimentation et 9-14 semaines maximum en fin d’expérimentation. La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.