Rongeurs

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre applications sur la peau, une instillation dans le nez et une injection dans l'abdomen, pour tester un inhibiteur protéique dans un modèle d'inflammation pulmonaire. Le porteur décrit un inconfort de l'ordre de la minute lors de l'instillation nasale et une douleur passagère au point d'injection. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'inflammation pulmonaire dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle stratégie thérapeutique dans un modèle d'inflammation pulmonaire chez la souris Balb/c. Cette nouvelle stratégie est basée sur l’injection d'un inhibiteur de nature protéique d'une protéine impliquée dans la sécrétion de mucus et dans la contraction musculaire au niveau pulmonaire.

Bénéfices attendus

Nous travaillons sur la fonction respiratoire et il n’existe pas d’alternative pour étudier les phénomènes mis en jeu dans l'inflammation pulmonaire au niveau d’un organisme entier mis à part les modèles animaux.

Procédures

4 applications percutanées (1 fois par semaine, durée 1 min) 1 application intra nasale (durée 1 min) 1 injection intra péritonéale (durée 30s)

Impact sur les animaux

La phase de challenge par voie intra nasale peut contribuer à un inconfort temporaire (ordre de la minute maximum). Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de la procédure pour les besoins expérimentaux

Remplacement

Les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de l'inflammation pulmonaire, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les paramètres immunologiques (fréquences des cellules inflammatoire) (T-test, bilatéral, risque α à 0.05 et une puissance de test de 0.9) conduit à utiliser un minimum 8 souris/groupe. Le même calcul concernant la résistance des voies aériennes mesurée par FlexiVent nous conduit a un minimum de 8 souris/groupe.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études de l'inflammation du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus, nos modèles ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les protocoles d’induction d'inflammation seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. L’âge de la souris pouvant modifier la réponse de type inflammation, nous utilisons des sujets sevrés. Ceux-ci sont néanmoins jeunes afin que le phénomène de sénescence ne puisse pas interférer avec les mécanismes étudiés dans le cadre de protocole de longue durée.

Greffées d'une tumeur sous la peau puis traitées par cinq injections, 1 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, peut occasionner gêne et douleur. L'objectif est de tester des anti-inflammatoires censés relancer les défenses immunitaires contre le cancer. Le porteur situe les retombées à l'identification possible de nouvelles cibles, sans engagement de résultat.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’un épuisement des globules blancs lors du cancer. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer l’impact d’un traitement bloquant l’action de ces protéines sur l’épuisement des réponses immunitaires et la croissance tumorale

Bénéfices attendus

A terme, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (1 minute/souris). Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation. 5 injections de traitements (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections de traitement et l'injection de cellules tumorales peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

La complexité de l’étude du cancer nécessite d’avoir recours à un organisme vivant pour étudier l’ensemble des acteurs impliqués dans ce phénomène. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes plus simples ne nécessitant pas d’animaux, et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés afin d’avoir un nombre minimal d’animaux pour pouvoir obtenir des résultats exploitables. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi très régulièrement par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies biologiques sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus pour envisager ensuite d’éventuels traitements chez l’Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la biologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 10 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.

3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever une lignée reproduisant la sclérose en plaques sur deux établissements. Les animaux porteurs de la mutation peuvent développer une paralysie de la queue ou des membres et un lymphome qui comprime les poumons vers 7 à 8 mois. Une biopsie de moins de trente secondes sert à génotyper chaque animal vigile. Selon leur génotype, les souris sont expédiées vers l'autre établissement, gardées pour d'autres projets, ou mises à mort quand elles n'ont pas le génotype recherché ou atteignent les points limites.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune (le corps attaque ses propres constituants) chronique du système nerveux central (cerveau, moëlle épinière et nerfs optiques). Elle se manifeste par des troubles moteurs, sensitifs, de l’équilibre, visuels… responsables à long terme d'un handicap. Elle touche 120000 personnes en France dont 3000 nouveaux cas par an. Dans la majorité des cas, les premiers symptômes apparaissent entre 25 et 35 ans. Des facteurs génétiques mais également des facteurs environnementaux prédisposent à la maladie. Les causes exactes de la sclérose en plaques restent inconnues à ce jour. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de cette pathologie. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition et le développement de la sclérose en plaques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition et du développement de la sclérose en plaques mais également le développement de traitements pharmacologiques.

Procédures

Les animaux présentent un phénotype dommageable (modèle de sclérose en plaque). Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Cette procédure ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une biopsie suffit pour établir le génotype de l’animal.

Impact sur les animaux

Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. 3,5 à 4% des animaux de la lignée peuvent développer à tout âge de façon spontanée une maladie neurodégénérative dont les signes cliniques vont d’une paralysie partielle ou légère de la queue (principalement à l'extrémité) ou des membres à une paralysie complète de la queue ou des membres. Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt développent un lymphome dont l’apparition se fait à environ 7-8 mois. Ces lymphomes touchent environ 13,5% des animaux et sont caractérisés par un gonflement du thymus induisant une constriction des poumons à l’intérieur du thorax.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de maladies neurodégénératives, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux par nos collaborateurs. Le nombre d’animaux est déterminé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt sont susceptibles de développer une maladie neurodégénérative de façon spontanée. L’apparition des symptômes signe du développement sous-jacent d’une maladie neurodégénérative entrainera la mise à mort de l’animal concerné. De plus, à partir de l’âge de 7-8 mois, ces animaux peuvent également développer un lymphome. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, les animaux porteurs de la mutation d’intérêt seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 6-7 mois. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d’observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

Pour entraîner des opérateurs aux gestes techniques, 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections, des prélèvements et des gavages répétés, gestes qui peuvent provoquer hématomes, hémorragies, perforation d'un organe ou fausse route pendant l'apprentissage. À la fin de chaque session, les souris sont mises à mort pour que les opérateurs s'exercent aux nécropsies. L'effectif repose sur le nombre de personnes à former, à raison de quatre souris par personne, sans aucun calcul statistique.

Objectifs

Les objectifs de ce projet de formation sont multiples : uniformiser les pratiques afin d'être le plus reproductible possible et raffiner les techniques pour fournir une qualité optimale dans les résultats expérimentaux sur souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont multiples : première approche des gestes techniques classiques, sensibilisation sur les bonnes pratiques, raffiner les techniques réduisant l'impact sur le bien-être animal et le stress, le matériel utilisé, les manipulations et l'harmonisation des savoir-faire afin d'être reproductible.

Procédures

Les souris auront des injections (3, 3min), des prélèvements (2; 3min) et des gavages (3 ; 3min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux seront : 1) contention : stress de l'animal, augmentation fréquence cardiaque et respiratoire 2) prélèvements : stress de l'animal, hématome, hémorragie 3) injections : stress de l'animal, hématome, perforation d'un organe, hémorragie, gonflement de la cavité occulaire 4) gavage : stress de l'animal, fausse route, saignements de la cavité buccale. Ces nuisances ou effets indésirables ne sont pas possible à éviter du fait de la phase d'apprentissage de ceux-ci.

Devenir

A la fin de chaque session de formation, les animaux seront mis à mort en systématique pour permettre aux opérateurs de réaliser des nécropsies en vue de prélèvements d'organes.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de permettre aux personnes ayant déjà la formation niveau applicateur, de mettre en pratique les connaissances acquises. Des alternatives à l’utilisation d’animaux vivants ont été envisagées : travaux pratiques intéractifs, utilisation de poupées pour imiter la taille de l'animal, etc. Dans le cadre de la première approche des gestes techniques, il est nécessaire d'assurer une formation complémentaire technique et de suivi sur animal vivant. En effet, certains gestes techniques tels que les gavages ou les injections nécessitent l'utilisation d'animaux vivants afin d'avoir la dextérité et la sensibilité du geste (contention, fausse route, injection non maitrisée, etc.).

Réduction

Dans le cadre de la mise en place de ce projet, le nombre d'animaux aura été réduit au maximum. Le nombre d’animaux utilisés est estimé en fonction du besoin d’un nombre de personnes à former. Il est pris en compte d’éviter l'effet cumulatif des gestes techniques, en limitant le nombre de geste par animal. Il est calculé l'utilisation de 4 souris pour 1 personne formée. Il est prévu 5 sessions de formation sur 20 personnes par an, soit 200 personnes au total sur les 2 ans. Au total, 800 souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 3 semaines minimum sans limite d'âge. Il est à noter que pour les animaux destinés à ce projet, il sera envisagé de récupérer les animaux destinés à la mise à mort de n'importe quel fond génétique. Aucune approche statistique n’a été réalisée, le nombre ayant été évalué par retour d'expérience et besoins terrain.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux destinés à la mise à mort. Ces animaux n'auront subit aucun geste mise à part le prélèvement pour génotypage (prélèvement à l'oreille). L'utilisation d'anesthésie gazeuse (anesthésie gazeuse par isoflurane en induction entre 3 et 4%) sera effectuée pour la réalisation d'un prélèvement submandibulaire avec des lancettes de taille adaptée. L'utilisation de canules souples de gavages permettra de limiter l'invasivité du geste, l'utilisation d'aiguilles de taille appropriées et enfin la mise à mort des animaux à la fin des sessions de formation permettant de former le personnel sur ce geste également. Pour chaque geste technique réalisé, les points limites spécifiques seront observés : - gavage : fausse route, étouffement - injection intra-péritonéale : convulsion, hématome - injection veine caudale : convulsion, hématome - injection sous-cutanée : hématome

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée sur le site. Il est nécessaire que la formation effectuée se fasse sur cette espèce. Aucune souche ne sera privilégiée afin de permettre aux personnes formées d'être opérationnelles sur l'intégralité des demandes et contraintes techniques et ainsi limiter le nombre d'animaux. Ils pourront être utilisés à partir de 3 semaines et sans limite d'âge cependant l'âge des animaux ne dépassera pas 8 mois.