Rongeurs

10 050 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 150 réutilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois neurochirurgies, une épilepsie provoquée par injection d'un produit chimique dans le cerveau, puis des enregistrements de plusieurs heures et des injections répétées. Le projet teste les candidats médicaments d'industriels du médicament sur ce modèle d'épilepsie du lobe temporal. La justification de l'effectif de plus de dix mille souris tient en quelques lignes générales sur la réduction.

Objectifs

Les désordres de type épileptique représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes au monde. En effet environ 1% de la population mondiale va dans sa vie avoir une crise d’épilepsie. Au niveau de l’activité cérébrale lors d’une crise de type épileptique, il est observé une modification transitoire du fonctionnement d’un ou plusieurs réseaux de neurones qui vont mal fonctionner. Malgré le développement de plus de 20 antiépileptiques lors des 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par les antiépileptiques. De plus, les principaux antiépileptiques utilisés en clinique montrent certes une efficacité sur les décharges épileptiques mais provoquent de nombreux effets secondaires (fatigabilité, somnolence, tremblement, troubles de l’apprentissage ou de l’humeur, prise ou perte de poids…). Il apparait donc comme critique de développer de nouveaux traitements antiépileptiques afin de traiter les patients épileptiques résistants aux traitements déjà existants et qui provoquent moins d’effets secondaires afin d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous nous proposons de tester, sélectionner et valider de nouveaux candidats médicament développées par les industriels du médicament. Cette approche repose sur l’utilisation d’un modèle de souris reproduisant les principales caractéristiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Une étude pharmacologique extensive de ce modèle de souris du lobe temporal a montré une certaine résistance à certains antiépileptiques. Ce modèle apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouveaux traitements antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de candidats médicament antiépileptiques plus efficaces et présentant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de pallier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.

Procédures

Les animaux de ce projet vont subir jusqu’à 3 neurochirurgies d’environ une heure chacune, et potentiellement une chirurgie (pose de pompe). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Une première chirurgie permettra l’induction du modèle par injection de molécule chimique dans le cerveau (durée 2 minutes). Par la suite, les animaux pourront subir d’autres sessions de chirurgie pendant lesquelles les animaux vont avoir soit une seconde injection de matériel génétique ou de vecteur viral (quelques minutes), et/ou la mise en place d’un dispositif d’enregistrement, et/ou la mise en place de chambre implantable en sous cutané pour la délivrance des médicaments (quelques minutes). Les animaux pourront être soumis à des enregistrements (d’une dizaine d’heures maximum) une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques seront administrés : au maximum 2 injections (quelques minutes) par enregistrement (maximum 10h) avec un maximum de 10 enregistrements par plan d’étude croisé. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du délai possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une à 2 fois par jour, sur une durée maximum de 4 semaines. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits en fonction du plan expérimental établi. Le nombre maximum de prélèvements pouvant être effectués est dépendant de la technique de prélèvement utilisée.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une à trois neurochirurgies d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie, et potentiellement une chirurgie « simple » pour la pose sous cutanée de pompe. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Un état de mal-être pourra persister quelques heures après l’injection qui rend les animaux épileptiques. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir lors des injections des candidats médicament, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due aux mécanismes d'action des molécules testées. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). La répétition des injections peut engendrer un stress léger lors de la manipulation de l’animal et une douleur modérée au point d’injection (piqure d’aiguille). Les enregistrements peuvent engendrer un stress léger du fait de la manipulation des animaux. Des pertes de dispositif permettant l’enregistrement des neurones du cerveau peuvent survenir, entrainant la mise à mort de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien-être de l'animal le permet. Une procédure de ré-utilisation des animaux a été écrite et validée par le vétérinaire référent.

Remplacement

Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal sera testé avant et après les injections pour permettre de comparer les effets du médicament et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées

Raffinement

Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille mesurant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Dès l’apparition d’un signe clinique d’alerte (poids, comportement...) nous nous réfèrerons à une grille de cotation interne spécifique permettant de prendre les mesures nécessaires en fonction des points limites identifiés afin de préserver le bien-être animal. L’évaluation est réalisée jusqu’à disparition du signe d’alerte. Lors des injections, une surveillance particulière est portée sur les animaux. Un arbre décisionnel peut être consulté en cas d’altération de l’état général de l’animal après l’injection afin de le soulager.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Le modèle a été développé chez la souris, car il reproduit les principales caractéristiques observées chez les patients souffrant d’épilepsie du lobe temporal. Ce modèle permet une quantification précise des crises pour évaluer l’effet des candidats médicament. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, ce modèle a été développé chez des animaux adultes afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de l’étude.

Pour tester les candidats médicaments de clients industriels, 1 160 souris rendues obèses par l'alimentation vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une course forcée sur tapis roulant jusqu'à épuisement, avec des chocs électriques de faible intensité, ainsi qu'à des mesures de force et à des prélèvements sanguins. L'étude évalue des molécules anti-obésité seules ou combinées à la sémaglutide. Le projet est présenté comme un protocole standardisé destiné à couvrir dix études sur cinq ans pour ces clients.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, la sémaglutide, un agoniste des récepteurs GLP-1R, a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. La Sémaglutide présente une efficacité impressionnante, du niveau de celle de la chirurgie bariatrique, mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultante de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de sarcopénie obésogène. Le présent projet résulte de la standardisation du protocole expérimental employé et vise à couvrir 10 études indépendants sur les 5 prochaines années. Ces études seront menées à un stade précoce du développement des candidats médicaments de nos clients et vise à tester leur efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Les composés testés ont pour intérêt majeur de cibler des voies de signalisation impliquées à la fois dans la régulation du poids corporel et dans la fonction musculaire. Les composés en développement seront ainsi testés en administration seule ou combinée avec la sémaglutide. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique des candidats médicaments seul sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul, mais également d'étudier la capacité des composés à contrer les effets délétères de la sémaglutide sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont la sémaglutide qui est la plus efficace et la plus prescrite. Néanmoins, la sémaglutide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, les candidats médicaments pourront venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec la sémaglutide, et dans ce dernier cas, en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (25 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament (14 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide (91 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (7 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (2 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de force d'agrippement (2 sessions de mesures de 5 minutes); 7) Mesures de performance sur tapis roulant (2 mesures, durée: 35 minutes); 8) Mesures de la force musculaire in vivo (2 mesures, Durée :20 minutes); 9) Anesthésie générale avant la mise à mort et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations, les mesures de composition corporelle, les administrations des traitements et les tests d'agrippement pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée (Durée maximum des pesées : 2 minutes/ Durée maximum de mesure de la composition corporelle : 2 minutes/ Durée maximum des traitements : 1 minute ; Durée maximum du test d'agrippement : 5 minutes). Les administrations par voie orales ou intrapéritonéale (selon la voie d'administration du candidat médicament) et sous-cutanée occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Les mesure de performance sur tapis roulant pour mesure de la VO2 max occasionne un exercice forcé pour les animaux pouvant être source de stress et de fatigue puisque les animaux sont amenés à courir jusqu'à épuisement ainsi que de douleur légères du fait des chocs électriques de faible intensité. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les deux prélèvements sanguins de 50μl seront source de douleurs légères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses biochimiques et histologiques ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, et les paramètres de performance musculaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé que nous testons ont systématiquement fait l'objet d'études préliminaires réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Les animaux seront sous contrôle direct et permanent des expérimentateurs pendant les tests de course sur tapis roulant et pendant les test de force par agrippement. Les mesure de force musculaire in vivo seront réalisées sur animal anesthésié et une attention particulière sera apportée pendant la phase de réveil. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

60 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, après implantation sous anesthésie d'électrodes cérébrales. Elles sont ensuite isolées deux fois une semaine dans des barils individuels pour les phases d'enregistrement. L'étude cherche à caractériser les troubles du sommeil dans un modèle murin de dystrophie myotonique. Elles sont tuées à la fin pour revérifier leur génotype et prélever le cerveau, les bénéfices espérés restant formulés au conditionnel.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.

Bénéfices attendus

La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 60 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.

Impact sur les animaux

Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.

Réduction

60 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et leurs contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris d'un groupe donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 3 souris supplémentaires de ce même groupe.

Raffinement

Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.

Choix des espèces

Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.

3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 1 728 recevront une injection directement dans le cerveau et 192 une double chirurgie. Elles sont soumises à un régime gras, à un gavage de tamoxifène et à un suivi en cage individuelle, puis tuées pour extraction du cerveau. L'étude porte sur les filets qui entourent certains neurones de la satiété et sur leur rôle dans l'obésité. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'obésité, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’obésité touche aujourd’hui plus de 13 % de la population mondiale et augmente le risque de maladies graves comme le diabète ou les troubles cardiovasculaires. Pour mieux prévenir ou traiter cette maladie, il est essentiel de comprendre comment notre corps régule la faim et la sensation de satiété. Dans le cerveau, une zone appelée l’hypothalamus joue un rôle central. Elle contient des neurones spécifiques, appelés neurones POMC, qui envoient le signal de satiété (on n’a plus faim), et d'autres neurones qui provoquent l’envie de manger. Des recherches récentes montrent que les neurones POMC ne sont pas tous identiques. Certains réagissent moins bien aux signaux hormonaux et seraient plus sensibles à une alimentation trop riche en graisses, ce qui pourrait contribuer à l’installation de l’obésité. Par ailleurs, environ 30 % de ces neurones sont entourés d’une sorte de « filet » protecteur, appelé matrice extracellulaire ou filets périneuronaux (PNN). Ces structures influencent le fonctionnement des neurones et leur capacité à s’adapter. Chez les souris obèses, ces filets semblent profondément modifiés. Nous cherchons à comprendre comment les neurones POMC réagissent aux changements alimentaires (jeûne, réalimentation) et quel rôle joue leur environnement extracellulaire dans cette réponse. Nous allons : Observer ces neurones chez des souris en jeûne, après réalimentation, ou nourries avec un régime gras. Analyser l'activité des neurones et la composition de leur environnement avec des outils d’imagerie et d’électrophysiologie. Modifier directement la matrice autour des neurones pour voir si cela influence leur fonctionnement. Activer ou inhiber artificiellement ces neurones pour étudier l’effet combiné avec les changements de leur environnement. Nous pensons que les modifications de l’environnement des neurones POMC jouent un rôle important dans la dérégulation de la sensation de satiété en cas d’obésité. Mieux comprendre cette interaction entre neurones et matrice extracellulaire pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre l’obésité.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’un milliard le nombre de personnes obèses dans le monde, faisant de l’obésité un enjeu majeur de santé publique. Malgré les efforts thérapeutiques, les traitements disponibles restent globalement peu efficaces à long terme, à l’exception de techniques invasives telles que la chirurgie bariatrique, dont les résultats ne sont pas systématiquement garantis. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l’apparition et à la persistance de cette pathologie, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudions un élément encore peu connu du contrôle de la faim : la matrice extracellulaire, et en particulier les filets périneuronaux (PNN). Ces structures entourent certains neurones du cerveau, notamment les neurones POMC, qui nous aident à ressentir la satiété. Nous pensons que ces filets pourraient réduire la souplesse des neurones, en limitant leur capacité à s’adapter aux changements liés à l’alimentation, surtout en cas d’obésité. Cela pourrait empêcher le cerveau de bien réguler l’appétit lorsque l’environnement nutritionnel change. À court terme, nous voulons comprendre comment ces filets réagissent à une alimentation trop riche ou à des changements rapides de régime, et comment cela influence les neurones qui contrôlent la faim. À plus long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour aider le cerveau à retrouver sa flexibilité, et ainsi améliorer la régulation de l’appétit chez les personnes obèses.

Procédures

4 prélèvements sera effectués au total pour le suivi de la glycémie. Lors de l'habituation au "fasting" : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. Lors de la phase expérimentale : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. A chaque prélèvement, une goutte de sang sera récoltée, soit 50 µL environ. Cela concerne toutes les souris de toutes les procédures, soit 3456 souris. Des procédures chirurgicales sont prévues. 1728 souris auront une injection intra-cérébrale dans le noyau arqué de l'hypothalamus. 192 souris subiront une double chirurgie, soit une injection de virus permettant de contrôler une sous population de neurones, puis une injection d'enzyme permettant de dégrader la matrice extracellulaire.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l’étude recevront une administration orale de tamoxifène, connu pour induire une perte temporaire de tissu adipeux, entraînant une perte de poids transitoire. Le gavage, bien qu’indolore, implique une contention totale, source probable de stress. Des douleurs post-opératoires modérées peuvent survenir à la suite des injections stéréotaxiques bilatérales de vecteurs viraux. Ces douleurs seront prises en charge par un traitement analgésique systématique. Lorsque deux interventions seront nécessaires, un délai suffisant sera respecté entre chaque chirurgie afin de maximiser la récupération. Certaines procédures expérimentales peuvent générer un stress transitoire ou des effets physiologiques réversibles (régime hypercalorique). Ces effets ont été anticipés, et des mesures seront mises en place pour en limiter l’impact (enrichissement augmenté). Le passage en cage individuelle, requis pour un suivi précis de la prise alimentaire, pourra induire un stress lié à l’isolement. Toutefois, les cages resteront proches afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre congénères, réduisant les effets d’isolement social. L’analyse de la composition corporelle par EchoMRI nécessite une brève contention (moins de cinq minutes) dans un tube transparent. Ce stress aigu sera donc de faible intensité et de courte durée. L’administration prolongée d’un régime hypercalorique (HFD) entraînera une prise de poids progressive, ne dépassant pas 200 % du poids initial selon nos données antérieures. Un suivi rigoureux sera mis en place afin de prévenir toute dérive pathologique. Les protocoles de jeûne induiront une perte de poids modérée (inférieure à 10 % du poids initial), totalement réversible à la reprise de l’alimentation. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires aux injections intracérébrales provoqueront une douleur modérée liée à l’incision du scalp et du périoste. Un traitement analgésique sera systématiquement administré, avec une reprise attendue de l’activité normale et du poids en 2 à 3 jours. Enfin, certains tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les effets fonctionnels des manipulations. Ils dureront moins d’une heure et nécessiteront une petite goutte de sang pour mesurer la glycémie avec précision.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, les cerveaux seront alors extraits et des analyses d'imagerie, d'électrophysiologie, ou de "Single Particle Tracking" pourront être effectués ex vivo (le cas échéant).

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous-populations de neurones à POMC et les modifications de leur environnement extracellulaire, en particulier les filets péri-neuronaux (PNN), en réponse à la consommation d’un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones étudiés ne fonctionnent pas de manière isolée : ils interagissent avec d’autres structures cérébrales mais également avec des signaux périphériques d’origine hormonale ou nutritionnelle. La matrice extracellulaire pourrait jouer un rôle clé dans cette interface en modulant la plasticité et la réactivité neuronale. Les effets que nous cherchons à comprendre sont donc le fruit d’interactions complexes entre réseaux neuronaux et signaux métaboliques périphériques. Une telle dynamique ne peut être reproduite in vitro, car elle nécessite un système intégratif capable de refléter fidèlement les adaptations comportementales, telles que la prise alimentaire. De même, aucun modèle informatique ne permettrait aujourd’hui de simuler avec une précision suffisante les interactions entre la matrice extracellulaire, l’activité neuronale, et les réponses métaboliques de l’organisme. Seul un modèle in vivo permet de capturer l’ensemble de ces processus.

Réduction

Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages sera ainsi : carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée de solution saline stérile. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Certains animaux de cette DAP auront un suivi chronique de leur poids, leur prise alimentaire et leur composition corporelle ainsi que le suivi de la prise alimentaire suite à certaines procédures chirurgicales (enzyme dégradant la matrice ou virus permettant le désassemblage de la matrice) nécessitera que les animaux soient placés en cage individuelle. ¬6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris. La souris représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. Afin de permettre le suivi individuel du poids et de la prise alimentaire, uniquement quand cela sera nécessaire, les souris seront placées en cage individuelle. Ces cages vont être rapprocher le plus possible pour permettre au mieux à l’animal d’avoir une interaction visuelle, auditive et olfactive.

Pour mettre au point des microscopes miniaturisés destinés à imager l'activité des neurones chez la souris éveillée, 640 souris vont être utilisées, réparties en 32 lots, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies intracrâniennes et une restriction alimentaire entraînant une perte de 5 à 10 % du poids, puis des séances d'enregistrement de deux à quatre heures. Le projet se présente comme un raffinement réduisant le stress de l'animal, puisqu'il évite de fixer la tête. Cet argument de moindre stress cohabite avec l'ouverture du crâne et l'implantation de dispositifs chez 640 souris.

Objectifs

Un objectif de longue date du domaine des neurosciences est d’élucider comment la perception, la formation de la mémoire et les comportements sont encodés dans le cerveau, à l’échelle des réseaux de neurones. Les méthodes optiques peuvent être très utiles pour atteindre cet objectif, car elles permettent d'enregistrer et de modifier l'activité des neurones dans des régions spécifiques du cerveau, avec une précision cellulaire et de manière répétée au fil des apprentissages. Aujourd’hui, une grande partie de ces expériences sont effectuées en fixant la tête de l’animal sous un microscope. Pourtant, il est fortement intéressant de s’affranchir de la contrainte de la fixation de la tête, de façon à limiter le stress éprouvé par l’animal, à se placer dans des conditions expérimentales les plus physiologiques possible, et à accéder à une palette très diversifiée de comportements. Néanmoins, effectuer des enregistrements optiques de l’activité neuronale chez le rongeur non contraint reste difficile aujourd’hui, en raison des contraintes importantes liées à la miniaturisation des dispositifs embarqués. L’objectif de ce projet est d’améliorer de façon significative les performances des techniques existantes. Deux systèmes seront ainsi développés : 1- Un microscope fibré permettant l’imagerie et la modulation de l’activité neuronale à l’échelle cellulaire avec une très grande précision temporelle, 10 fois supérieure à l’état de l’art. Ce microscope permettra notamment d’imager pour la première fois directement l’activité électrique des neurones individuels chez la souris non-contrainte. La cadence d’acquisition très élevée permettra en outre d’étudier des dynamiques neuronales avec une précision inégalée. 2- Un nouvel endoscope permettant d’accéder à des régions profondes du cerveau de souris non contraintes en réduisant fortement les dommages réalisés par rapport aux microscopes existants (volume de la sonde implantée 6 fois plus faible). Cela permettra un raffinement significatif des méthodes d’endoscopie.

Bénéfices attendus

Les méthodes optiques sont des outils très avantageux pour étudier comment différents mécanismes neuronaux (comportement, perception, mémoire…) sont encodés dans le cerveau, à l’échelle des réseaux de neurones. Néanmoins, la plupart des expériences sont effectuées chez des animaux dont la tête est fixée à un microscope, de façon à tirer partie de méthodes optiques très performantes. Ce projet permettra de développer des méthodes dont les performances sont comparables à celles de ces microscopes, tout en étant adaptées à des souris non-contraintes. Cela aura des bénéfices à la fois pour l’animal, dont le stress sera diminué, et aussi pour la pertinence scientifique des résultats, puisque l’animal sera placé dans de conditions expérimentales les plus physiologiques possible. De plus, cela permettra d’ouvrir l’éventail de comportements étudiés, et donc l’éventail des questions explorées. Enfin, l’une des méthodes développées permettra de diminuer significativement les dommages effectués dans le cerveau lors de l’imagerie de régions profondes. Cela engendrera ainsi un raffinement significatif des méthodes d’endoscopie disponibles pour la communauté des neuroscientifiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies intracrâniennes sous anesthésie générale et analgésie : une injection de vecteur viraux (durée de la chirurgie : environ 45 minutes) et de fixation de dispositif implantable (durée de la chirurgie : environ 1h30). Ensuite une partie des animaux (un quart environ) suivra un protocole d’apprentissage d’une tâche de navigation spatiale simple (durée : 30 min à 1h tous les jours pendant 5 à 10 jours), pour laquelle les animaux seront placés en légère restriction alimentaire permettant d’améliorer l’apprentissage. Ensuite, les animaux suivront des sessions d’enregistrement (au maximum 6 sessions au total, espacées de 1 à 7 jours) de durée environ 2-4h. Enfin, une euthanasie par une méthode règlementaire sous anesthésie et analgésie sera effectuée.

Impact sur les animaux

L’animal pourra ressentir un stress dû aux manipulations par les expérimentateurs, ainsi que durant l’induction de l’anesthésie générale, et lors de la fixation de la tête pour les expériences tête-fixée. Il pourra également ressentir de la douleur et un inconfort induit par la chirurgie (craniectomie et ouverture de la peau peuvent entrainer une douleur et les points de suture peuvent entrainer une démangeaison). Il y a de plus un risque d’hypothermie transitoire lors du réveil post-chirurgical. Il existe également un risque de désunion de cicatrice. L’animal pourra également ressentir de la faim, induite par la restriction alimentaire visant à une perte de masse de 5 à 10 pourcents et permettant une motivation à trouver la récompense alimentaire pendant la tache de comportement. Enfin, il existe un risque d’hémorragie et d’irritation / lésion locale lors des injections de marqueurs fluorescent.

Devenir

Tous les animaux seront donc euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement afin de répondre à une question scientifique.

Remplacement

Des études préalables in vitro (sur des échantillons non issus d’animaux) sont réalisées pour caractériser et optimiser les performances des microscopes en cours de développement et pour limiter grandement le nombre d’expérimentations in vivo. En particulier, pour caractériser l’endoscope qui permettra d’accéder à des régions très profondes du cerveau, nous avons mis au point un échantillon basé sur des billes fluorescentes qui reproduit le mieux possible le cerveau d’une souris in vivo. Chaque bille mime un neurone, et est éclairée avec un faisceau lumineux dont l’évolution de l’intensité au cours du temps est contrôlée de façon indépendante des faisceaux qui éclairent les autres billes. Ainsi, on peut reproduire des neurones actifs avec des motifs d’activités réalistes, tirés d’expériences publiées dans la littérature. De plus, les billes sont disposées sous une couche de milieu diffusant, dont les caractéristiques s’approchent de celles du cerveau. Nous pourrons également ajouter des mouvements de ces billes pour reproduire les mouvements du champ de vue enregistrés pendant une expérience in vivo (ces mouvements sont liés au fait que le cerveau bouge par rapport à la boite crânienne sur laquelle est fixée le microscope). Néanmoins, comme les méthodes optiques développées sont destinées à l’étude de souris in vivo, non contraintes, la validation et la caractérisation finale des microscopes doit obligatoirement se faire dans ces conditions finales d’utilisation.

Réduction

Comme indiqué ci-dessus, un maximum de tests seront réalisés in vitro sur des échantillons non issus d’animaux. Les tests in vivo ne démarreront que lorsque les performances des techniques seront optimales et satisfaisantes. S’il s’avère que certaines difficultés émergent dans les premières expériences in vivo liées à des caractéristiques qui n’avaient pas été mimées dans le modèle in vitro, nous raffinerons l’échantillon in vitro de manière à mimer encore mieux ces caractéristiques, puis nous effectuerons des expériences in vitro supplémentaires sur ces nouveaux échantillons. Dans ce projet, nous souhaitons valider en tout 32 conditions expérimentales différentes, correspondants aux 2 microscopes mis au point et à toutes leurs applications. Pour chacune de ces 32 conditions expérimentales, nous utiliserons un lot de 20 souris : - 10 souris permettant de mettre au point le protocole, en optimisant les paramètres critiques de notre expérience. Nous nous efforcerons de diminuer ce nombre de souris en développant des modèles prédictifs des résultats obtenus dans chaque nouveau protocole en fonction de l’ensemble des résultats obtenus jusque-là; - 5 souris permettant de valider le protocole optimisé, montrer la reproductibilité des résultats, et permettra la publication de la méthode (5 souris est le minimum requis pour une publication dans le domaine de l’instrumentation optique pour les neurosciences); - le taux de succès de ces deux chirurgies successives étant de 75 pourcents, chaque lot contiendra donc 20 souris. Ainsi, le nombre total de souris utilisées sera de 640 souris, réparties en 32 lots (chaque lot correspondant à une condition expérimentale) de 20 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit est automatique. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères. Un isolement temporaire des animaux sera limité au maximum et ne sera mis en œuvre que dans des cas très exceptionnels. Le milieu est enrichi (nidification, rongement). Une période d'acclimatation de 7 jours sera systématiquement pour les animaux provenant du fournisseur agrée défini ou pour les animaux provenant de notre animalerie centrale et transférés dans la pièce de stabulation. Toute chirurgie sera précédée d’une analgésie et anesthésie adéquat. Le maintien de la température est assuré. Un suivi post opératoire est effectué quotidiennement et toutes les mesures sont prises pour veiller au bien-être animal. Des points limites ont été défini et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. La mise en place systématique d’une période de manipulation préalable à l’expérimentation ainsi qu’une habituation progressive du dispositif expérimentale permet de réduire le stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle idéal pour les études auxquelles seront appliqués les microscopes développés, à savoir l’exploration des bases neuronales de la perception, de la formation de la mémoire et des comportements. En effet, il s’agit d’un mammifère, ayant donc des mécanismes cérébraux généralisables dans une grande mesure à l'homme. De plus, l’expression des outils optogénétiques dans ce modèle est bien caractérisée. Par ailleurs, la souris a une appétence certaine pour les tâches de navigation. Des animaux adultes seront utilisés, de façon à ce que la taille du cerveau et de la boite crânienne n’évolue plus ; de plus, c’est chez l’adulte que seront effectuées les études sur les bases neuronales de la perception, de la formation de la mémoire et des comportements. Leur âge sera supérieur ou égal à 7 semaines au moment de l’injection virale. Les animaux sont identifiés par poinçon auriculaire réalisé sous anesthésie générale, pendant l’injection stéréotaxique.