Rongeurs

Pour étudier le rôle des plaquettes dans les maladies du foie liées à l'obésité, 48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries avec un régime riche en graisses, reçoivent des injections répétées sur animal vigile, puis subissent quatre prélèvements sanguins et un prélèvement terminal sous anesthésie. Le déficit en plaquettes induit peut s'accompagner de petits saignements au point d'injection. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant avoir besoin d'un grand volume de sang et de prélever des organes.

Objectifs

Les maladies du foie sont des conséquences d’un ensemble de troubles souvent associés à l’obésité. Elles évoluent par étapes : accumulation de graisse, inflammation, accumulation de tissu fibreux, et peuvent parfois conduire au cancer du foie, dont le taux de survie à cinq ans est très faible. Ces maladies touchent plus de 30 % de la population mondiale et sont aujourd’hui la principale cause de maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Leurs causes exactes varient d’un patient à l’autre et restent mal comprises, ce qui complique leur prévention et leur traitement. Les plaquettes, connues pour leur rôle dans l’arrêt du saignement, semblent aussi participer au fonctionnement du foie, notamment en cas de troubles métaboliques. Certaines études ont montré que des traitements antiplaquettaires à long terme, peuvent réduire la graisse hépatique, limiter l’inflammation, et diminuer le risque de cancer du foie, tant chez l’homme que dans des modèles animaux. Cependant, on ne comprend pas encore bien comment les plaquettes régulent le métabolisme du foie. Pour y répondre, nous voulons étudier l’effet d’une diminution importante du nombre de plaquettes sur l’apparition des premiers stades de la maladie, en utilisant des souris génétiquement modifiées nourries avec un régime riche en graisses. Ces souris produisent ou ne produisent plus du tout de plaquettes, ce qui aide à comprendre leur rôle précis dans la maladie.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et leurs conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations concernant l’origine de ces maladies hépatiques, et aideront à évaluer l’intérêt de cibler les plaquettes pour le développement de futurs traitements.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime alimentaire riche en lipides pendant 1 semaine. La souris vigile recevra 1 injection de 5 secondes pendant 4 jours consécutifs, puis 1 injection de 5 secondes tous les 2 jours pendant 8 jours. Nous réaliserons 4 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris anesthésiée et 1 prélèvement sanguin terminal de 1 minute sur souris anesthésiée

Impact sur les animaux

La mise en régime riche en lipides chez la souris induit une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe. L’injection répétée réalisée sur animal vigile peut entrainer un stress à la contention et une douleur au point de piqure de l’aiguille de quelques secondes. Le déficit en plaquette des souris peut être associée à un saignement de quelques secondes lors de l’injection répétée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car nous aurons besoin d’un grand volume de sang (700µl), et de prélever des organes.

Remplacement

Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. Aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’habituation des animaux à l’expérimentateur et aux différents gestes, une fois par jour pendant 5 jours, la semaine avant le début de la procédure (contention, manipulation, et pesées) - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages sont munies de particules de bois et enrichie avec des carrés de cellulose + des bâtons de coton + de la frisure afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Par une anesthésie générale de l’animal pendant les prélèvements sanguins - Par l’injection d’antalgique et d’analgésique avant le prélèvement terminal puis sur le plan musculaire avant incision - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante lors des anesthésies. Des points limites permettent de soustraire les animaux à toute souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous disposons de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les plaquettes sanguines de souris ont des caractéristiques très proches de celles de l'Homme. Nous utiliserons des souris de 12 à 20 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

Soumises à une ligature de l'artère fémorale destinée à provoquer une ischémie de la patte, 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi un prélèvement sanguin et des mesures répétées de perfusion sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses histologiques et moléculaires. Le projet vise à évaluer le rôle d'une voie de signalisation, l'AHR, dans la revascularisation et la régénération du muscle après l'ischémie. Le porteur affirme que les modèles in vitro seraient insuffisants et que seule la souris rend compte des interactions au sein d'un tissu entier.

Objectifs

L?isch?mie chronique des membres inf?rieurs (ICMI), forme la plus s?v?re de la maladie art?rielle p?riph?rique, se caract?rise par un arr?t ou une insuffisance de la circulation sanguine dans les muscles squelettiques entrainant une faiblesse et des douleurs musculaires. Dans des conditions physiologiques, le muscle squelettique poss?de une capacit? remarquable de r?g?n?ration gr?ce ? des cellules souches musculaires. Chez l?adulte, les cellules satellites se situent ? proximit? imm?diate des capillaires sanguins compos?s de cellules endoth?liales et interagissent de mani?re bidirectionnelle pour assurer la r?paration du muscle squelettique. Par ailleurs, l?endoth?lium joue un r?le essentiel dans le maintien de l?int?grit? vasculaire, notamment en r?gulant le tonus vasculaire et les ph?nom?nes de formation de caillots sanguins. De nombreuses voies de signalisation peuvent affecter les cellules endoth?liales et moduler leur capacit? ? former de nouveaux vaisseaux sanguins ce qui peut contribuer au d?veloppement de la pathologie. Des ?tudes se sont int?ress?es plus particuli?rement ? la voie de signalisation du r?cepteur aux hydrocarbures aromatiques (AHR) et ont d?montr? que l?activation de la voie AHR pouvait moduler les capacit?s angiog?niques des cellules endoth?liales, ce qui pourrait perturber la revascularisation post-l?sionnelle et ainsi, la r?g?n?ration musculaire. Dans ce contexte, le but de ce projet est d??valuer l?impact de l?activation de la voie AHR dans les cellules endoth?liales sur la revascularisation et la r?g?n?ration des membres isch?mi?s in vivo.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compr?hension des m?canismes responsables des l?sions musculaires post-isch?miques et en particulier l?implication de la voie AHR et des cellules endoth?liales.

Procédures

Les proc?dures invasives sur animal anesth?si? sont au nombre de deux : 1. Mod?le de l?sion musculaire par ligature de l?art?re f?morale (mod?le ICMI) sur animal anesth?si? (1 fois, dur?e : 20 min) 2. Pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? (1 fois, dur?e : 2 min). Les proc?dures non ou peu invasives sur animal anesth?si? ou vigile sont au nombre de un : 1. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesth?si? (2 ? 9 fois / souris en fonction des points de cin?tique d?finis dans la proc?dure, dur?e : 20 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets ind?sirables sont ceux li?s ? la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux li?s ? la r?cup?ration ou post-chirurgie; pouvant conduire ? une perte de poids dans les 24 premi?res heures (10%), une alt?ration de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ?bouriff?, paupi?re ferm?e, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilit? r?duite). Par exp?rience, les signes de souffrance interviennent dans les 24h suivant l?induction des l?sions musculaires, mais ne perdurent g?n?ralement pas au-del?. Dans ce mod?le d?ICMI, il est rarement observ? de n?crose ou de perte du membre inf?rieur (

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure afin de permettre les analyses histologiques et mol?culaires n?cessaires pour r?pondre ? nos questions biologiques.

Remplacement

Afin d??valuer les effets de l?activation de la voie AHR endoth?liale sur la revascularisation et la r?g?n?ration post-isch?mie, le recours ? des mod?les in vitro appara?t insuffisant. En effet, ces approches ne rendent pas compte des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d?un organisme ou d?un tissu entier. De plus, l?utilisation de mod?le in vitro ne pourraient pas rendre compte de la dynamique temporelle des processus de revascularisation et de r?g?n?ration, qui est essentielle dans le contexte d?une isch?mie des membres inf?rieurs. Ainsi, l'utilisation de mod?les animaux reste essentielle pour mieux comprendre les m?canismes physiopathologiques impliqu?s dans l?ICMI. Enfin, la souris est le mod?le de choix en raison des similitudes des syst?mes de r?paration du muscle squelettique humain. Ainsi, le mod?le de ligature de l?art?re f?morale que nous maitrisons au laboratoire permet de reproduire les l?sions isch?miques retrouv?es chez les patients atteints d?ICMI.

Réduction

Nous allons r?duire le nombre d'animaux par l'utilisation des m?thodes non invasives (v?locim?trie laser-doppler) permettant de r?p?ter les analyses sur le m?me animal au cours de la r?g?n?ration, mais aussi gr?ce ? l'utilisation de tests statistiques appropri?s et au fait d?utilisation de la patte controlat?rale comme contr?le sans l?sion. D?apr?s les simulations effectu?es avec l'outil propos? par l'EDA (Experimental Design Assistant) du NC3R, il faut n=10 animaux par groupe exp?rimental pour les analyses histologiques et mol?culaires compte tenu de la variabilit? inter-individuelle dans notre mod?le chirurgical de r?g?n?ration musculaire.

Raffinement

Les animaux import?s resteront une semaine en quarantaine pour acclimatation avant toute manipulation. La souffrance des souris sera r?duite en utilisant des s?datifs et analg?siques. Pour le mod?le d?ICMI, les souris seront anesth?si?es et des injections d?antidouleurs seront faites en pr?- et post-op?ratoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examin?s de fa?on biquotidienne pendant les 3 premiers jours suivant la l?sion musculaire afin de v?rifier leur ?tat g?n?ral de sant?. En cas de signes de souffrance, des mesures gradu?es et adapt?es (analg?sie, mise ? mort compassionnelle, ...) seront prises. La qualit? de l'?levage est am?lior?e en enrichissant les cages exp?rimentales avec des b?tons ? ronger, des ?l?ments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu?un acc?s illimit? ? la nourriture et ? l?eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un mod?le de choix car la physiologie et la r?paration post-l?sionnelle du muscle squelettique est proche de celle de l?Homme. Elle a ?galement l?avantage ind?niable de permettre l?utilisation des souris g?n?tiquement modifi?es. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 7 ? 10 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement form?s.

96 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à trois campagnes de tests à 6, 12 et 18 mois. Les animaux subissent des prises de sang, une suspension à un câble à 45 cm de hauteur, un test de force, un labyrinthe et une course forcée sur tapis avec chocs électriques légers. Le projet évalue un anticorps anti-GDF15 censé freiner le déclin fonctionnel du vieillissement. Les bénéfices annoncés pour la "vitalité" et la "qualité de vie" à un âge avancé restent hypothétiques, les souris étant mises à mort pour nécropsie.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et h?t?rog?ne, se manifestant par diff?rentes trajectoires de d?clin fonctionnel et m?tabolique. GDF15 est l?une des prot?ines les plus corr?l?es ? l??ge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur ? court terme, mais son ?l?vation chronique est associ?e au d?clin li? ? l??ge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'?valuer de mani?re approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'?tude vise ? mettre en ?vidence comment ce traitement influence la pr?servation d'un ensemble de capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) et l'am?lioration des marqueurs cl?s du m?tabolisme comme le taux de cholest?rol et de glucose dans le sang, et la d?pense ?nerg?tique par exemple. En identifiant les effets pr?cis du traitement, ce projet contribuera ? une meilleure compr?hension des m?canismes physiologiques impliqu?s dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?. Le projet pourra se d?rouler dans deux ?tablissements Utilisateurs si n?cessaire.

Bénéfices attendus

Gr?ce ? cette ?tude, nous serons en mesure de mieux comprendre le r?le de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le d?clin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches th?rapeutique pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis ? une s?rie d'?valuations comportementales, motrices, et m?taboliques, r?parties sur 3 semaines, le tout ? 3 reprises, soit ? l??ge de 6, 12 et 18 mois : - Les pr?l?vements de sang : faible volume et sous anesth?sie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'h?matologie. - L?analyse de la composition corporelle : les animaux seront plac?s dans une cellule de contention, type tube, lui-m?me plac? dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface ?paisse et molle pour amortir le choc) sera mesur? ? trois reprises, chaque mesure ?tant espac?e d?une heure. - ?valuation de la m?moire spatiale ? court terme : Les animaux seront soumis ? un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une dur?e d'environ 8 minutes par souris. - ?valuation de la force de pr?hension : La force motrice des membres sera mesur?e par trois prises espac?es d'une heure pour une dur?e totale d'environ 5 minutes par mesure. - ?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? : Les animaux seront observ?s pendant 10 minutes dans une ar?ne lumineuse. - ?valuation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis ? un exercice forc? sur tapis roulant. La dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations ?lectriques de faible intensit? encouragent le mouvement. - La mesure des ?changes gazeux : les animaux sont temporairement individualis?s (48h) pour permettre la mesure des gaz consomm?s et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interf?rence entre les mesures, les tests seront r?partis sur 3 semaines (Pr?l?vements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des ?changes gazeux en semaine 3). L?ensemble du projet jusqu?? ce stade sera r?alis? dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de proc?dure, les animaux seront mis ? je?n durant 2 heures, anesth?si?s pour un pr?l?vement de sang terminal puis mis ? mort pour n?cropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent un faible niveau de stress : - Les pr?l?vements de sang g?n?rent un stress et une douleurs l?gers. Ces pr?l?vements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L?analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exig?e, ce qui g?n?re un stress l?ger et court (moins de 3 minutes au total). - La pr?hension de une ? cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement g?n?re un stress l?ger. - L'?valuation de la coordination motrice g?n?re un stress physique l?ger. Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'?valuation de la m?moire spatiale ? court terme g?n?re un stress l?ger et court (environ 8 minutes) li? ? un environnement nouveau et non familier. - L'?valuation de la force de pr?hension gen?re un stress lors de la pr?hension mais ?galement un stress physique court lors de l?exp?rience (5 minutes par mesure). - L'?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? g?n?re un stress l?ger et court (10 minutes) car l?environnement est nouveau, lumineux et non s?curisant (absence d?enrichissement). - L'?valuation de l'endurance physique g?n?re un stress mod?r? et un inconfort physique dus ? l'exercice forc? (la dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations ?lectriques sur la grille arri?re sont utilis?es uniquement pour inciter l'animal ? courir et sont calibr?es au niveau minimal efficace (choc aversif l?ger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des ?changes gazeux g?n?re un stress mod?r? li? ? l?individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorim?trie sont les m?mes que les fonds de cages d?h?bergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d?une cage ? l?autre durant l?enregistrement. - Le transport ?ventuel en fin de protocole pour la mise ? mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress l?ger li? au mouvement des cages durant quelques minutes (300m ? parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort en fin de proc?dure afin de proc?der ? des n?cropsies (analyses en biochimie et en expression g?nique sur diff?rents organes d'int?r?t).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'?volution des capacit?s intrins?ques et des fonctions m?taboliques d'individus d'?ge avanc?. L'?valuation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou mod?les animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent ?tre reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son esp?rance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires ? ceux de l'Homme, la souris appara?t comme le mod?le de choix le plus pertinent pour cette ?tude.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum en se basant sur les donn?es de la litt?rature et ce nombre a ?t? corrig? par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour ?valuer les masses grasses et maigre constitue ?galement un ?l?ment de r?duction du nombre d'animaux utilis?, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux suppl?mentaires : avant l'utilisation de cet automate, il ?tait n?cessaire de pr?voir un groupe d'animaux d?di? ? la composition corporelle, ?valu?e par pr?l?vement et pes?e des tissus lors d'une n?cropsie.

Raffinement

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent peu de stress (pr?hension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectu?e avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le d?but des tests pour limiter le stress g?n?r? par l?exp?rimentateur. Les animaux seront ?galement acclimat?s ? la salle d?exp?rimentation pendant la phase d?habituation. Les pr?l?vements de sang seront r?alis?s sous anesth?sie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectu? par une personne ayant une longue ex?rience de ce geste technique. Des ?l?ments d?enrichissement seront mis en place dans la cage d?h?bergement afin d?assurer leur bien-?tre et r?duire le stress : animaux plac?s en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l??ge de 12 mois, les souris seront plac?es dans des portoirs connect?s DVC (Cage Digitales Ventil?es) permettant d?identifier pr?coc?ment toute perte d?activit? et de prostration. Enfin, si la mise ? mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transport?s entre les deux ?tablissements suivant une proc?dure de transport d?clar?e lors de l?agr?ment du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport valid?s par signature d?une charte de transport). Les animaux sont transport?s dans leur cage d'origine et les cages seront prot?g?es du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une dur?e de moins de 10 minutes. Le choix de la mise ? mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privil?gi? si l?organisation des laboratoires et des ?quipements au moment de la mise ? mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons ? ?tudier l??volution des capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) d?un individu d??ge avanc? et ses fonctions m?taboliques en fonction d?un traitement anti-GDF15. Cela n?cessite de l??tudier sur des organismes vivants, humains ou mod?les animaux. La souris semble un choix plus appropri? pour cette ?tude gr?ce ? l?esp?rance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires ? l?Homme. Pour ?tudier les diff?rentes trajectoires de vieillissement, une ?valuation des capacit?s et des fonctions m?taboliques sera r?alis?e ? trois ?ges diff?rents : 6, 12 et 18 mois. L?objectif est d?identifier le r?le pr?coce de GDF-15 et de l?action du traitement test? ? long terme.

846 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit une greffe de moelle, une irradiation aux rayons X sur animal vigile, jusqu'à quarante injections de médicaments et des prélèvements de moelle osseuse. Certaines développent une leucémie induite, avec augmentation de la rate et perte de poids, avant le déclenchement de points limites biologiques. Le porteur juge le modèle murin "incontournable" et "indispensable" pour étudier une leucémie liée à la protéine p53, faute de prélèvements de patients en nombre suffisant.

Objectifs

Dans les cancers du sang, les mutations de p53 sont peu fr?quentes except? dans certaines cat?gories comme les leuc?mies aigu?s my?lo?des (LAM) secondaires aux n?oplasmes my?loprolif?ratifs (NMP). Les NMP sont des maladies chroniques caract?ris?es par une augmentation des cellules matures du sang (globules rouges, globules blancs, plaquettes). Ils peuvent se transformer en LAM, de tr?s mauvais pronostic avec, dans plus de la moiti? des cas, une implication de la voie p53. Les mutations de TP53 retrouv?es dans les cancers inactivent les fonctions de p53 (qui emp?che normalement la prolif?ration cellulaire en cas d?anomalie survenant dans la cellule), ce qui entra?ne une prolif?ration et une survie cellulaire non contr?l?es. Il a ?t? montr? que ces mutations pouvaient ?galement conf?rer de nouvelles fonctions ? p53 mut?e. Dans ce projet, nous souhaitons identifier les m?canismes reposant sur des anomalies de p53 responsables du d?veloppement de la leuc?mie. Nous avons d?j? d?velopp? des mod?les murins nous permettant d??tudier la maladie, et montr? que des diff?rences existaient entre les mod?les d?l?t?s ou mut?s pour p53. Objectif (1) : Continuer la caract?risation les mod?les murins. Nous ?tudions la coop?ration des alt?rations de p53 avec celles de g?nes retrouv?s mut?s. Nous ?tudierons quelles populations de cellules prog?nitrices (populations encore peu diff?renci?es qui vont donner naissance apr?s plusieurs divisions aux cellules matures) sont amplifi?es dans la moelle osseuse, lieu de fabrication des cellules sanguines. Nous d?terminerons ?galement si les mutations de p53 conf?rent un avantage s?lectif par rapport ? sa d?l?tion. Objectif (2) : Identification des m?canismes impliqu?s. Nous ?tudierons quels m?canismes sont impliqu?s, en particulier quelles diff?rences sont observ?es sur la prolif?ration cellulaire et la mort cellulaire en pr?sence des alt?rations de p53 dans la moelle osseuse. Nous d?terminerons comment les anomalies de p53 modifient l?expression de g?nes et l?ADN. Nous d?terminerons ?galement le niveau d?instabilit? g?n?tique dans nos mod?les. Objectif (3) : Effet de nouveaux traitements. Nous testerons l?effet de mol?cules pharmacologiques ciblant les voies identifi?es comme importantes dans le d?veloppement de la LAM, dans les mod?les d?velopp?s pour les objectifs 1 et 2 et dans des mod?les de greffes de cellules humaines de patients atteints de LAM post NMP dans des souris immunod?ficientes.

Bénéfices attendus

Notre ?tude permettra de mieux comprendre les ?tapes conduisant au d?veloppement de la maladie chez les patients. Si nous identifions un g?ne ou une voie importante, nous pourrons d?velopper de nouveaux traitements que nous testerons dans les mod?les pr?cliniques d?velopp?s dans le cadre de ce projet. A long terme, nous esp?rons ainsi proposer de nouvelles th?rapies dans ces leuc?mies de mauvais pronostic et am?liorer la survie des patients. Nos r?sultats pourraient aussi ?tre applicables ? d?autres types de cancers avec des mutations de p53, qui repr?sentent plus de la moiti? des cancers solides.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : greffe de cellules murines provenant de souris donneuses portant les g?nes d?int?r?t dans des souris receveuses : une injection, dur?e 1 minute, sous anesth?sie g?n?rale. Irradiation vigile (rayons X), dur?e maximale 15 minutes. Injections de m?dicaments, au maximum 40 sur 3 mois, sous anesth?sie locale, dur?e 30 secondes. Pr?l?vements de sang toutes les 2 semaines sous anesth?sie g?n?rale, n=12 maximum, dur?e 2 minutes. Pour certains animaux, pr?l?vement de moelle osseuse sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie, dur?e 1 minute, nombre maximal: 10.

Impact sur les animaux

Certains des mod?les murins d?veloppent une leuc?mie, ce qui peut conduire ? une spl?nom?galie et une perte de poids. Notre exp?rience pass?e nous a permis de mieux ma?triser le d?veloppement de la maladie chez les souris, en ?tablissant des points limites biologiques pr?coces, avant d?gradation de l??tat g?n?ral des souris, bas?s sur la d?tection de cellules leuc?miques dans le sang. Concernant l?administration de nouveaux traitements, nous ne connaissons pas toujours l??ventuelle toxicit? des mol?cules administr?es. Le traitement peut conduire ? une perte de poids et ? des effets ind?sirables encore inconnus mais nous nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Devenir

Les animaux seront euthanasi?s pour analyses et ?tudes sur organes et tissus post-mortem.

Remplacement

Les leuc?mies aig?es my?lo?des post n?oplasmes my?loprolif?ratifs sont des maladies complexes, et l'?tude de ces cancers repose sur la mise en ?uvre en conditions physiologiques d'interactions complexes entre diff?rentes cellules (dont des cellules immunitaires) et m?diateurs (cytokines, etc..). Etant donn? l?implication de la voie p53 dans les leuc?mie post n?oplasmes my?olprolif?ratifs (retrouv?e dans plus de la moiti? des cas), un mod?le in vivo porteur des alt?rations g?n?tiques retrouv?es dans ces maladies est incontournable. De plus, comme le nombre de pr?l?vements de patients est limit? du fait de la raret? de cette maladie, il est indispensable de d?velopper des mod?les murins. Ils nous permettront de valider et consolider les r?sultats obtenus chez l?Homme. Par ailleurs, le processus de leuc?mogen?se requiert l?environnement m?dullaire impossible ? reproduire in vitro. Enfin, la prolif?ration in vitro de cellules tumorales est limit?e et ne refl?te pas ce qui se passe in vivo chez l?homme. Notre mod?le pourra ?ventuellement par la suite servir ?galement de mod?le pr?clinique si nous identifions de nouvelles cibles th?rapeutiques.

Réduction

Afin de r?duire le nombre d?animaux nous r?alisons au maximum des transplantations primaires (c?est-?-dire que nous r?coltons les cellules de moelle osseuse d?une souris que nous greffons dans plusieurs souris receveuses (5)), pour limiter les couples en ?levage et le nombre de port?es (car les souris donneuses sont des souris en ?levage). Lorsque nous voulons ?tudier plusieurs g?notypes, nous ?tudions le maximum de groupes en m?me temps afin de n?avoir qu?un seul groupe contr?le. Si nous d?terminons que les mutants de TP53 se comportent de la m?me mani?re, nous focaliserons la suite de notre ?tude sur un seul des mutants. Dans le cas de tests de nouvelles drogues, nous r?aliserons au pr?alable des ?tudes pilotes pour identifier d??ventuelles toxicit?s. Le nombre n?cessaire d?animaux a ?t? estim? afin d?avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les ?tudes publi?es.

Raffinement

Les conditions d?h?bergement veilleront ? limiter le stress des animaux (enrichissement : sizzlenests, tunnels, domes). Dans les mod?les leuc?miques ou lors des traitements, la surveillance des animaux sera accrue : observation quotidienne et pes?e minimum 3 fois par semaine, prise de sang toutes les 1-2 semaines, et les points limites pr?coces seront strictement appliqu?s. Des variations de certains param?tres biologiques ? la prise de sang ont ?t? identifi?es comme fortement pr?dictives du d?veloppement d?une leuc?mie, avant que les souris ne pr?sentent de signes de souffrance. Toute intervention sera accompagn? d?anesth?sie locale ou g?n?rale, avec analg?sique en cas d?acte douloureux. En cas de nouveaux traitements, nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Choix des espèces

Les mod?les murins sont ad?quats pour notre ?tude, car ils nous permettent d?explorer les diff?rentes ?tapes de la leuc?mogen?se, dans un mod?le mammif?re qui refl?te en g?n?ral ce qui se passe chez l?homme. Par ailleurs, nous pourrons obtenir dans un temps assez court un nombre satisfaisant d?animaux pr?t ? ?tre exp?riment?. Les exp?rimentations seront men?es sur des dur?es d?un an maximum. Les souris porteuses de mutations de d'int?ret pr?sentent des mutations retrouv?es chez les patients atteints leuc?mie post cancer my?lo?de, et reproduiront donc le plus fid?lement possible les conditions de d?veloppement de la maladie. L?invalidation/expression de ces g?nes d?pendent de l?expression d?une enzyme que nous pouvons induire. Etant donn? que nous souhaitons mod?liser la maladie qui survient chez l?homme ? l??ge adulte, nous induirons les d?l?tions/ expressions de ces g?nes chez les souris autour de 2 mois et ?tudierons les souris ? partir de 5 semaines apr?s induction, soit ? partir de l??ge de 3 mois (?ge adulte).

Greffées avec des cellules leucémiques humaines puis suivies par imagerie, 1 290 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit des injections répétées, jusqu'à sept séances de chimiothérapie, des prises de sang mensuelles et des ponctions de moelle osseuse au genou. Le projet étudie la distribution de cellules d'une leucémie de mauvais pronostic et la résistance aux traitements. Le porteur retient des souris immunodéprimées, qui acceptent la greffe de cellules humaines sans rejet, et écarte le poisson zèbre jugé trop éloigné du système sanguin des mammifères.

Objectifs

Sur la base de donn?es cliniques obtenues au laboratoire ? partir de patients atteints d?un cancer du sang d?un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de d?terminer l?implication, dans le processus de d?veloppement et de la r?sistance aux traitements de cette leuc?mie, de deux prot?ines retrouv?es dans les cellules malades de ces patients. Pour cela, nous d?velopperons un mod?le de greffe chez la souris de cellules de patients, qui expriment une prot?ine qui ?met de la lumi?re, et o? la pr?sence de ces deux prot?ines sera ?ventuellement modifi?e. Nous pourrons ainsi suivre la distribution des cellules leuc?miques dans la souris greff?e gr?ce ? des m?thodes d?imagerie du petit animal. Ce mod?le, s?il mime cette h?mopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les m?canismes responsables de la r?sistance aux traitements de ce type de leuc?mie chez l?Homme. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour d?velopper des th?rapies adapt?es ? ce sous-type particulier de leuc?mie lymphoblastique qui ?chappe aux th?rapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s?int?gre dans un projet de recherche translationnelle, ? partir d?observations cliniques, qui ont permis de mettre en ?vidence l?expression massive de deux prot?ines pour un sous-groupe particulier de patients atteints de cancer du sang de mauvais pronostic. Une meilleure compr?hension des m?canismes de d?veloppement de la maladie et de sa r?sistance aux traitements permettra d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Des mod?les murins nous permettront d?une part, de contr?ler l?expression des deux prot?ines et d??tudier les cons?quences de leur expression sur la distribution des cellules canc?reuse dans la moelle osseuse. Une meilleure connaissance des processus de diss?mination des cellules leuc?miques est n?cessaire pour d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques. Le projet d?crit ici est int?gr? dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autres, le criblage de mol?cules sur des lign?es cellulaires de patients de ce sous-groupe de leuc?mie pour identifier de nouveaux m?dicaments qui permettraient de cibler ces cellules leuc?miques particuli?res, et de gu?rir les patients.

Procédures

MODIFICATION : Les animaux seront soumis ? deux injections sur animal vigile. Pour les animaux trait?s par chimioth?rapie, 7 injections de produits de chimioth?rapies seront r?alis?es sur animal vigile au cours de la proc?dure par semaine (traitement sur 4 semaines). Pour suivre l??volution de l?h?mopathie attendue, 2 ? 12 prises de sang, ? raison d?une prise par mois ou au maximum deux pr?l?vements de moelle osseuse (r?alis?s sur animal anesth?si?, avec au minimum 2 mois entre les deux pr?l?vements), pourront ?tre r?alis?s sur la souris. Les souris seront anesth?si?es pour suivre la distribution des cellules qui ?mettent de la lumi?re dans un appareil d?di? apr?s une injection d'un produit de d?tection (3 injections / semaine). La dur?e des chaque geste ne d?passe pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite ? l?injection de cellules leuc?miques, les souris sont susceptibles de d?velopper une leuc?mie. La majorit? des effets d?l?t?res sera d?e ? l??mergence de cette maladie : l??tat de sant? des souris greff?es peut se d?grader rapidement, n?cessitant un suivi tr?s r?gulier. Les leuc?mies entrainent une forte perturbation de la formule sanguine : en cons?quence, elles perdent du poids et, dans les stades avanc?s, pr?sentent des signes de dyspn?e, d?an?mie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostr?es, avec un pelage non entretenu. L?imagerie de bioluminescence n?cessite l?injection de luciferine sur animal vigile et une anesth?sie des souris ce qui peut constituer une nuisance temporaire g?n?ralement bien support?e. La ponction de moelle osseuse ?tant r?alis?e au niveau du genou, la souris peut avoir des l?sions au niveau du cartilage qui peuvent provoquer des douleurs et perturber temporairement ses d?placements. Enfin, il existe toujours un risque d?infection ou d?inflammation au niveau des points de ponction ou d?injection.

Devenir

Les animaux seront mis ? mort ? la fin des proc?dures pour pr?l?vements et analyses ult?rieures sur les tissus pr?lev?s. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres exp?rimentations.

Remplacement

L?impact des modifications d?expression de CDX2 et/ou UBTF-ATXN7L3 sur la canc?rog?n?se et la distribution dans le corps de la souris des cellules leuc?miques avant et apr?s traitement chimioth?rapeutique sera ?tabli in vivo dans les mod?les murins de greffes. Ce mod?le permet le suivi de cellules leuc?miques dans leur environnement m?dullaire qui est un environnement complexe difficilement mod?lisable in vitro ou ex vivo, et dans un environnement extra-m?dullaire. Cette ?tude de la biodistribution des cellules leuc?miques n?cessite donc l?utilisation d?animaux vivants. Les ?tudes m?canistiques associ?es, non d?crites ici, seront r?alis?es ? partir de mod?les de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lign?es cellulaires en culture mais ne peuvent pas r?pondre aux questions abord?es par un mod?le murin in vivo dans lequel la distribution m?dullaire et extra-m?dullaire peut ?tre suivie et o? l?interaction avec les cellules de la niche est essentielle. L?utilisation d?un autre mod?le animal, par exemple le poisson z?bre, ne permettrait pas non plus de r?capituler la complexit? du syst?me h?matopo??tique des mammif?res.

Réduction

Les chiffres indiqu?s dans le dossier correspondent au nombre estim? maximal d?animaux utilis?s pour les exp?riences envisag?es. Le nombre d?animaux minimum et suffisant a ?t? d?termin? avec un outil math?matique ? 10 animaux par groupe au minimum pour obtenir des r?sultats robustes et fiables statistiquement. La possibilit? d?imager les animaux, d?analyser la num?ration sanguine des animaux par prise de sang et d?immunoph?notyper les cellules de moelle osseuse ponctionn?es au niveau du genou permet une ?tude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilis?s.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en groupes dans des conditions sanitaires contr?l?es et permettant un bien-?tre optimal dans des portoirs ventil?s (igloo, tubes de cellulose pour la fabrication des nids, balan?oires, liti?re d?poussi?r?e). Ils seront acclimat?s au moins deux semaines apr?s leur arriv?e ? l?animalerie et avant le d?but de toute proc?dure. Les proc?dures ont ?t? ?tablies afin de r?duire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux exp?rimentations. Une anesth?sie sera pratiqu?e pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveill?s quotidiennement durant les proc?dures. En cas de signes d?infection, la plaie sera trait?e avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analg?sique. Des points limites pr?coces ont ?t? d?finis afin d?interrompre les proc?dures et limiter la souffrance animale et garantir le bien-?tre animal.

Choix des espèces

L'esp?ce utilis?e est la souris (Mus musculus) qui repr?sente l?esp?ce animal la plus propice pour ce type d??tude pour les raisons suivantes : ?nombreux protocoles bien ?tablis pour cette esp?ce ?possibilit? d'avoir acc?s ? des animaux g?n?tiquement modifi?s, notamment permettant les greffes de cellules humaines sans rejet (animaux immunod?prim?s) ?mod?les mimant tr?s bien les cancers h?matologiques et qui ont d?j? fait l?objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilis?s car les potentielles applications th?rapeutiques s'adresseront ? une population humaine adulte.

688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.

Procédures

Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.

Devenir

Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.

Remplacement

Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.

Réduction

Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.

Raffinement

Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.

Choix des espèces

Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.