Rongeurs

Un gavage quotidien pendant jusqu'à quarante jours chez les mâles, et des prélèvements sanguins pouvant atteindre 15 % du volume sanguin total: 1 760 rats juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'étude mesure l'ouverture vaginale et la séparation préputiale pour repérer les produits chimiques qui perturbent la puberté, selon des lignes directrices reconnues en Europe et aux États-Unis. Le porteur annonce des effets toxiques modérés, dont des pertes de poids, une salivation augmentée, des tremblements ou des variations de mobilité et de température corporelle. 1 610 rats seront tués pour prélever leurs organes, 100 réutilisés dans un projet de formation ou de prélèvement d'échantillons, et 50 gardés en vie pour être adoptés, à condition de ne présenter aucun signe de mal-être.

Objectifs

Le premier objectif de ce projet est de vérifier si un produit chimique peut agir comme certaines hormones naturelles, en particulier les œstrogènes (que ce soit de manière agoniste/en activant des récepteurs ou antagoniste en les bloquant). Certains produits peuvent en effet imiter ou bloquer l’action de ces hormones, ce qui peut perturber le fonctionnement normal de l’organisme. Cela peut avoir des conséquences négatives sur la santé, notamment sur la croissance et la reproduction. Le deuxième objectif du projet est d’identifier les produits chimiques qui pourraient perturber le système hormonal. Pour cela, on observe leur impact sur le développement de la puberté chez de jeunes rats, mâles et femelles. Ces tests précoces permettent de repérer rapidement les substances potentiellement problématiques et d’éviter des études plus longues impliquant davantage d’animaux. Ils fournissent de nombreuses informations et reposent sur des méthodes reconnues au niveau international, comme les tests utérotrophiques et pubertaires (lignes directrices en Europe et aux états unis).

Bénéfices attendus

Cette étude conduite précocement avec un nombre restreint d’animaux permet d’identifier très tôt dans le développement d’une molécule des effets sur l’équilibre hormonal ou la croissance d’un animal juvénile et d’arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes de perturbation endocrinienne importantes et ainsi éviter des études plus importantes avec plus d'animaux.

Procédures

Les animaux juvéniles seront gavés journalièrement à l’aide d’une sonde souple et flexible en plastique adaptée à leur taille et âge pendant 3 à 23 jours chez la femelle et maximum 40 jours chez le mâle. Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins d’une durée inférieure à 2 minutes, pourront être réalisés sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique ainsi que le volume maximal prélevable correspondant à 15 % du volume sanguin total. Pour les prélèvements d’organes, les animaux sont mis à mort à la fin de l'experimentation.

Impact sur les animaux

Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des animaux. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Des micro-prélèvements peuvent être effectués par ponction à la veine saphène ou pour un volume plus important à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Les effets toxiques attendus sur ce projet sont modérés car une étude de tolérance et de choix de doses a déjà été réalisée. Certains signes de toxicité modérée peuvent néanmoins apparaître en cours d'études incluant des pertes de poids ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, augmentation ou diminution de la mobilité, tremblements ou impact sur la température corporelle.

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la maturité sexuelle, les animaux sont généralement mis à mort pour prélèvements d’organes. Si aucun prélèvement n’est réalisé (exemple : femelles de la partie pubertaire), les animaux témoins ne présentant aucun signe de mal être en fin de procédure pourront être gardés pour être réutilisés dans le projet formation ou sample par exemple ou gardés en vie pour être adoptés.

Remplacement

Avant de réaliser cette étude sur le modèle animal, de nombreux essais in vitro (exemple : Aromatase, steroidogenesis, androgen/oestrogen receptor binding affinity) ou in silico - réalisé par ordinateur à partir de données déjà acquises - sont utilisés pour prédire le potentiel effet de perturbation endocrinienne (sur les hormones) d’une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, conduisant - ou pas - à l’induction d’effets de perturbation endocrinienne, ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. De plus, certains paramètres comme le développement de la puberté par évaluation du début de l’ouverture vaginale ou de la séparation préputiale ne peuvent pas être mesurés in vitro.

Réduction

Ce projet se fait dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux basé sur l’expérience du laboratoire et permettant une évaluation biologique et statistique suffisantes : 8 animaux/groupe (6 femelles/groupe seulement pour la partie utérotrophique). Deux molécules peuvent être testées dans une seule étude afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (1 seul groupe témoin). Après plus de 5 années d'expérience, le nombre d’animaux par groupe a été redéfini et est le minimum d’animaux nécessaires compte tenu de la sensibilité et de la variabilité du test, afin de faire une évaluation correcte des paramètres enregistrés. L’objectif reste également de ne tester chez l’animal que des molécules sélectionnées comme non toxiques par des méthodes alternatives et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le processus de recherche et développement.

Raffinement

Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux animaux juvéniles (exemple : gel de nutrition ajouté pour le sevrage des femelles à l'age de 18 jours), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière pendant la première phase de traitement (au moins 2 observations dans la journée). Ils sont pesés quotidiennement pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptées aux animaux juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort, les animaux juvéniles sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Pour la partie utérotrophique le test aurait pu être réalisé sur des femelles adultes ovariectomisées par (retrait chirurgical des ovaires) (OECD 440). Cette méthode n’a pas été retenue au laboratoire afin d’éviter le prétraitement chirurgical des animaux.

Choix des espèces

Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de la souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat est recommandé par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisie (Rat Wistar). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Ces études visent à étudier les effets d’un composé d’essai sur différents paramètres de la puberté. Ainsi, de jeunes rats immatures agés de 18 et 23 jours au début de l’étude sont utilisés dans ce projet conformément aux recommandations des lignes directrices internationales. Cela nécessite donc l’utilisation d’animaux sexuellement immatures. Des mesures seront prises pour garantir que seuls les animaux sevrés à un âge bien précis soient utilisés dans l'étude, car la sensibilité du test varie en fonction de l'âge de l'animal. L’utilisation de jeunes femelles dont dont le systeme hormonal n'est pas encore actif (axe hypothalamo-pituito-ovarien non fonctionnel) est nécessaire afin d’avoir de faibles niveaux d’œstrogènes endogènes/naturels en circulation. La partie uterotrophique devant s’arrêter au jour 21 après la naissance et le traitement étant de 3 jours consécutifs (lignes directrices internationales), des femelles immatures au jour 18 après la naissance seront utilisées.

Opérées pendant une heure et demie pour recevoir dans le cerveau un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement, les souris de ce projet reçoivent aussi jusqu'à deux injections de molécules agissant sur le système du stress avant des tests de mémoire. 2 856 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Les tests sont nommés, reconnaissance d'objets nouveaux et mémoire de localisation, trois essais de neuf à dix minutes sur trois jours, pour comprendre comment la corticostérone altère la mémoire et si le mécanisme décrit chez les mâles vaut aussi chez les femelles. Le porteur décrit le génotypage comme la coupe de 0,2 cm du bout de la queue entre cinq et douze jours de vie, suivie d'un tatouage des orteils, et reconnaît que cela provoque "un état de stress et de douleur", tout en classant 864 de ces souris en souffrance légère.

Objectifs

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.

Bénéfices attendus

Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.

Impact sur les animaux

Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.

Remplacement

Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.

Réduction

Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.

Raffinement

Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).

Choix des espèces

Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.

216 rats génétiquement modifiés, obèses et hypertendus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Ils subissent des jeûnes de seize heures, des injections de glucose ou d'insuline avec mesure de la glycémie tous les quinze minutes, des échographies cardiaques sous anesthésie à dix et vingt semaines, puis une mesure de pression intracardiaque par sonde avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif déclaré est d'établir la carte d'identité de cellules sanguines qui pourraient devenir un marqueur de la cardiomyopathie diabétique, testable ensuite chez les patients par une simple prise de sang. Le texte situe cette mesure de pression intracardiaque chez des souris, alors que le projet ne porte que sur des rats.

Objectifs

La cardiomyopathie diabétique est une maladie du muscle du coeur qui touche particulièrement les patients diabétiques de type 2, ayant souvent un syndrome métabolique. Elle est associée à un mauvais fonctionnement du coeur qui peut engendrer le développement d’autres maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque. L’insuffisance cardiaque se définit par une mauvaise distribution du sang dans le corps par le coeur et cliniquement aboutit à une fatigue et un essoufflement dans les gestes de la vie courante. Actuellement, les techniques d’analyses/identifications de cette maladie ne sont pas spécifiques du diabète de type 2 et sont souvent tardives, impliquant que la maladie est déjà bien installée. Récemment, des cellules circulantes du sang (PBMC) ont été identifiées comme des indicateurs biologiques potentiels de plusieurs maladies dont certaines en lien avec le diabète de type 2 et des maladies cardiaques. Ces biomarqueurs peuvent être isolés et étudiés à partir d’une simple prise de sang. Notre objectif est d’établir la carte d’identité des PBMC que nous pourrions associer à l’insuffisance cardiaque dans un modèle de rat diabétique, obèse et hypertendu, pour identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait permettre d’identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients par simple prise de sang.

Procédures

Sur un groupe d’animaux, un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline sera effectué pour le suivi de la glycémie afin de déterminer le statut du diabète. Après une période de repos (minimum une semaine), un jeun de 16h sera réalisé avant la mise à mort pour avoir un état nourri similaire pour les analyses ultérieures. Le lendemain matin, sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera réalisé, entrainant la mort de l’animal. Les organes seront ensuite prélevés post-mortem pour les analyses. Sur un autre groupe, le suivi sera de 5 ou 10 semaines chez des rats génétiquement modifiés obèses ou minces, avec suivi de la glycémie toutes les deux semaines. Le développement du diabète chez les rats sera mesuré par un test à 8 ou 18 semaines. Pour cela, les rats seront mis à jeun pendant 16 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Une échographie sera effectuée à 10 et 20 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. La pression du sang dans le cœur sera mesurée à l’aide d’une sonde sur des souris sous anesthésie et sous analgésie avant la mise à mort pour prélèvements des organes à analyser.

Impact sur les animaux

Ce type de rats obèses et hypertendus développe une insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée, c’est-à-dire un remplissage en sang diminué du cœur, mais une éjection normale du sang par le cœur. Comme chez les patients, face à un effort, ces rats sont plus fatigués. L’obésité peut entrainer un inconfort avec une diminution des mouvements. Les tests de tolérance au glucose ou à l’insuline peuvent entrainer une légère douleur de courte durée due à l’injection et au prélèvement de sang. La mise à jeun peut entrainer un risque d’hypoglycémie. Les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer une légère douleur et un court stress.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse des différents organes.

Remplacement

Cette maladie comporte un dérèglement métabolique qui altère plusieurs organes, avec une communication par le sang entre eux : notre objectif étant d’identifier un marqueur circulant de cette maladie, le recours à l’animal est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les prélèvements (sang et tissus) seront utilisés sur d’autres projets (analyses des molécules circulantes du sang, fonction des cellules du cœur et du foie).

Raffinement

Notre projet comporte un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline (sc versus iv) au cours d’un test de tolérance. Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous médication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis

Choix des espèces

Ce type de rats obèses et hypertendus est à ce jour considéré comme l’un des meilleurs modèles précliniques de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée d’origine métabolique. Des rats ZSF1 obèses et minces seront utilisés à 10 et 20 semaines pour étudier la progression de la maladie.

Conçu comme une expérience pilote destinée à constituer une plateforme d'évaluation d'autres substances, ce projet utilise 35 souris modifiées génétiquement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Trente d'entre elles reçoivent une inoculation de fibres protéiques dans le cerveau, sous anesthésie, au cours d'une intervention de trente à quarante-cinq minutes, puis un dérivé d'un composé du thé vert leur est injecté sous la peau deux fois par jour, cinq jours par semaine, pendant six semaines. Quatre tests d'agrippement mesurent leur force musculaire, et la confirmation des premiers signes moteurs, démarche saccadée et posture voûtée, déclenche la mise à mort avant la paralysie du train postérieur. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale, sans dire ce qui a été cherché de ce côté.

Objectifs

Le projet vise à évaluer l’intérêt d’un traitement par une substance chimique dérivée d’un composé du thé vert, ayant montré une capacité à désagréger la protéine (alpha-synucléine) présente dans les lésions du cerveau des patients atteints d’atrophie multisystématisée (AMS), une maladie apparentée à la maladie de Parkinson, mais rendant les patients rapidement dépendants et avec une survie inférieure à 10 ans. Nous souhaitons évaluer la possibilité d’utiliser un traitement par injections répétées sous la peau de cette substance chimique pour freiner le processus d’agrégation de cette protéine et la perte de force musculaire et les déficits de locomotion qui en résultent chez des souris modifiées génétiquement atteintes de cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à évaluer dans un modèle expérimental une possibilité de traitement de l’atrophie multisystématisée, alors qu'aucun traitement neuroprotecteur n'est actuellement disponible. Nous pouvons disposer d’une substance prototype susceptible d’interagir avec la région de la protéine qui serait déterminante dans cette sévérité. La mise en place de ce protocole représente plus largement une expérience pilote qui permettra de constituer une plateforme expérimentale disponible pour évaluer d’autres substances ciblant l’agrégation protéique. Il n’existe en effet pas à ce jour de thérapie spécifique de la progression de ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les souris, modifiées génétiquement, font l’objet d’une inoculation dans le cerveau de fibres protéiques (à l’âge de 6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez 30 des 35 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet d’une inoculation intra-cérébrale de fibres protéiques sous anesthésie générale et locale, puis d’un traitement par la substance chimique par injections sous la peau deux fois par jour et 5 jours par semaine, pendant 6 semaines. Les injections dans le cerveau sont réalisées régulièrement au laboratoire et peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Cette inoculation est réalisée afin de reproduire la maladie humaine (atrophie multisystématisée) et mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs et son évolution à l’issue du traitement. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal, qui peuvent présenter une posture voûtée. La confirmation de ces premiers signes cliniques, tels qu’évalués selon une grille de scoring, détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire ad libitum. Afin d’évaluer plus précisément l’influence du traitement sur le statut clinique des animaux un suivi de la force musculaire par la réalisation d’un test d’agrippement est prévue, à 4 reprises au cours de la vie de chaque animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les modifications génétiques présentes chez les souris utilisées dans ce projet conduisent à une paralysie, survenant plus précocement suite à l’inoculation de fibres protéiques. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures. Celle-ci n’apparaît lors du vieillissement de ces souris qu’à partir de l’âge de 22 mois et les souris éventuellement survivantes à l’âge de 1 an seront mises à mort.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé que chez la souris, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et les lésions du cerveau suite à un traitement médicamenteux, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les effectifs sont définis sur la base d'outils statistiques afin de pouvoir mettre en évidence un bénéfice éventuel du traitement sur la force musculaire et sur la durée de survie. Les échantillons cérébraux collectés permettront de réaliser des comparaisons des marqueurs des lésions du cerveau.

Raffinement

Pour les inoculations dans le cerveau réalisées sous anesthésies générale et locale, associées à l’administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.

Choix des espèces

Les souris sont des souris modifiées génétiquement et développent rapidement la maladie suite à l’inoculation d’extraits cérébraux provenant de patients atteints d‘atrophie multisystématisée ainsi que de certaines fibres protéiques, telles que celle choisie pour le projet. Le projet prévoit des inoculations de fibres protéiques dans le cerveau chez la souris adulte (2 mois). Le choix de cet âge à l’inoculation permet de réaliser l’inoculation chez un animal adulte et son observation jusqu’au développement des signes cliniques annonciateurs d’une paralysie.