Rongeurs

Pour tester des molécules censées accélérer l'élimination de l'uranium, du thorium ou du plutonium, 268 rats mâles reçoivent ces actinides par voie intraveineuse, puis un traitement trente minutes plus tard. Ils arrivent avec un cathéter déjà implanté chez le fournisseur, vivent séparés par une plaque de plexiglas et passent 48 heures en cage métabolique pour la collecte des urines et des fèces. Tous seront tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour doser les actinides dans le sang, les reins, le foie et un fémur. Le porteur rattache le projet aux accidents en centrale, à l'usage d'armes nucléaires et aux "bombes sales", et l'inscrit dans le "contexte géopolitique actuel".

Objectifs

Des situations accidentelles, incidentelles ou des actes de malveillance peuvent entraîner une contamination interne par des actinides (uranium, thorium ou plutonium). Ces éléments, utilisés dans les domaines civil, industriel et militaire, présentent à la fois une toxicité chimique et radiologique. À court terme, une contamination peut provoquer des effets graves comme une anémie (diminution de la capacité du sang à transporter l’oxygène), des atteintes des cellules, voire le décès. À plus long terme, elle peut favoriser le développement de cancers. Les actinides ont en outre une affinité pour certains organes, notamment le foie, les os et les reins, où ils peuvent rester stockés pendant des périodes allant de quelques jours à plusieurs dizaines d’années. La prise en charge des contaminations internes repose sur l’utilisation de traitements dits décorporants. Ces traitements consistent à administrer des molécules capables de se lier fortement aux actinides afin de favoriser leur élimination par les voies naturelles (urines et selles). Il s’agit actuellement de la seule stratégie permettant de limiter les dommages aux organes et la rétention prolongée de ces éléments dans l’organisme. À ce jour, les options thérapeutiques restent limitées. Le DTPA (Acide Diéthylène-Triamine-Pentaacétique ou pentétate), seul traitement spécifique disponible, présente une efficacité partielle et peut entraîner des effets indésirables, ce qui justifie le développement de nouvelles molécules plus efficaces et mieux tolérées. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles molécules conçues pour améliorer la prise en charge des contaminations internes par les actinides. Dans les deux premières parties du projet, des essais préliminaires en laboratoire permettront de sélectionner les molécules les plus prometteuses, sur la base de leur capacité à se lier aux actinides et de leur faible toxicité cellulaire (via des études d’efficacité et de toxicité « in vitro »). Dans la dernière partie du projet, les molécules retenues seront ensuite évaluées chez le rat (= in vivo) afin de déterminer leur capacité à réduire la rétention des actinides dans les organes et à en favoriser l’élimination. Le recours à un modèle animal est nécessaire pour étudier ces phénomènes à l’échelle de l’organisme entier, ce qui ne peut être réalisé uniquement par des approches in vitro.

Bénéfices attendus

En contribuant au développement et à l’évaluation de nouvelles molécules capables de favoriser l’élimination d’actinides de l’organisme, ce projet vise à améliorer la prise en charge des personnes exposées à une contamination interne en situation d’urgence nucléaire ou radiologique. A plus long terme, ces travaux s’inscrivent dans une démarche de préparation et de réponse aux situations accidentelles ou intentionnelles, telles que des incidents/accidents en centrale nucléaire, l’utilisation d’armes nucléaires ou des actes de malveillance impliquant des « bombes sales » (= dispositif de dispersion radiologique). Ce projet participe ainsi à la protection de la santé des populations et s’inscrit pleinement dans le contexte géopolitique actuel.

Procédures

Les interventions suivies par tous les animaux sont les suivantes : - Chirurgie d’implantation d’un cathéter (réalisée chez le fournisseur) - Pesée des animaux vigiles sur balance (1 min, trois fois) - Administration des actinides par voie intraveineuse sur animal vigile puis 30 minutes après, le traitement, également par voie intraveineuse (deux contentions de 1-2 min, espacées de 30 minutes) - Placement en cage à métabolisme afin de collecter les excreta et permettre la mesure des actinides dans les urines et les fèces (durée 48 heures). Les cages à métabolisme sont conçues de manière à permettre la séparation et la collecte des urines et des fèces, grâce à un système de support adapté, tout en permettant à l’animal de se déplacer librement.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues au cours du projet sont principalement liées aux manipulations nécessaires pour les injections et le suivi biologique des animaux. Les animaux porteront un cathéter pour faciliter l’administration des actinides et des traitements, qui pourrait entrainer un inconfort local, une gêne modérée ou un risque d’inflammation. Les injections pourront induire un stress ponctuel, lors de la contention notamment. Ces nuisances resteront modérées et de courte durée. Il n’est pas attendu d’effet toxique majeur des actinides et des molécules. La collecte des urines et de fèces pour la mesure de l’excrétion des actinides nécessite le placement en cage à métabolisme pendant une durée maximale de 48h. Cela peut générer un stress lié à l’isolement temporaire et à la réduction de l’enrichissement.

Devenir

Pour évaluer l’efficacité des molécules, il sera nécessaire d’euthanasier les animaux à la fin de la procédure. En effet, en administrant les molécules après contamination par les actinides, l’objectif sera d’observer une diminution de la présence des actinides dans l’organisme et une augmentation de l’excrétion des actinides par rapport à l’absence de traitement. Pour cela, il sera nécessaire de mesurer les actinides dans les urines, les fèces, le sang, les reins, le foie et un fémur. La collecte des fèces et des urines lors du passage en cage à métabolisme se fera de manière non invasive et permettra de récolter une partie des échantillons biologiques. Cependant, la collecte du sang, des reins, du foie et d’un fémur, requerra l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Le projet intègre pleinement le principe de remplacement. Plus particulièrement, les deux premières étapes du projet constituent des méthodes alternatives à l’expérimentation animale : - L’évaluation de l’affinité d’une dizaine de molécules est réalisée in vitro, dans des milieux synthétiques mimant des compartiments biologiques pertinents en cas de contamination interne (sérum de rat, cellules osseuses). Cette approche permet d’étudier les interactions molécule-actinide sans recours à l’animal et de sélectionner les molécules les plus prometteuses. - Les études réalisées sur les cellules permettent une évaluation précoce de la toxicité des molécules afin d’exclure les molécules présentant un profil de sécurité défavorable, évitant ainsi leur évaluation chez l’animal. A l’issue de ces étapes, les molécules les plus prometteuses (plus efficaces et peu toxiques) seront retenus pour les études de décorporation in vivo. Ainsi, le recours à l’expérimentation animale intervient en dernier ressort et constitue la dernière étape du projet. L’approche in vivo vient combler les limites des approches in vitro qui ne permettent pas d’appréhender des paramètres complexes tels que la biodistribution, la pharmacocinétique (= devenir d’une molécule dans l’organisme), la pharmacodynamie (= effet d’une molécule sur l’organisme) et l’excrétion des actinides et des molécules, qui nécessitent un modèle intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’ensemble de la stratégie expérimentale permet de limiter le recours à l’expérimentation animale tout en garantissant la pertinence et la qualité des données scientifiques qui seront obtenues.

Réduction

La stratégie du projet, articulée en étapes successives, participe également au principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. En effet, les études d’affinité et de toxicité in vitro, permettent une sélection initiale des molécules, en écartant les molécules présentant une affinité insuffisante et un profil de sécurité défavorable, évitant leur évaluation in vivo, et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ensuite, le nombre d’animaux par condition/groupe a été déterminé à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir une puissance suffisante pour exploiter correctement les données qui seront obtenues. Les résultats de l’analyse indiquent que 10 animaux par condition sont nécessaires pour pouvoir mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. En prévoyant une marge supplémentaire pour prendre en compte une éventuelle mortalité ou des échantillons non exploitables/analysables, le nombre d’animaux nécessaire par groupe est fixé à 14 et à 20 pour les animaux témoins. Par ailleurs, le choix d’injecter une partie des actinides en mélange permet d’évaluer plusieurs situations de contamination au sein d’un même protocole expérimental, contribuant également à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, les animaux font l’objet de plusieurs prélèvements au terme de la procédure expérimentale, permettant l’analyse de plusieurs paramètres chez un même individu : excrétion urinaire et fécale, rétention tissulaire, marqueurs biologiques sanguins d’atteinte du foie et des reins … Les tissus et échantillons collectés seront conservés et pourront être partagés ou réutilisés pour des analyses complémentaires, évitant le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Le projet a été conçu en intégrant le principe de raffinement afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux seront reçus à l’animalerie avec un cathéter déjà en place. Ce geste sera réalisé chez le fournisseur par des personnes formées et habituées à cette technique. Lorsque les animaux seront réceptionnés, ils feront l’objet d’une attention spécifique de la part des soigneurs, et les cathéters feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de limiter toute complication ou douleur. En cas de besoin, un produit désinfectant ou anti-inflammatoire sera appliqué. Par ailleurs, l’utilisation de cathéters permet une contention et une manipulation efficace (plus facile et plus rapide) pour l’injection des actinides et ensuite du traitement dans le délai de 30 minutes. Cette technique, moins invasive que deux injections proches avec seringue et aiguille, permettra ainsi de réduire le stress des animaux. Par ailleurs, le port du cathéter impose un hébergement individuel afin de limiter le risque d’arrachage du cathéter par les animaux entre eux (toilette, bagarre). Pour limiter l’isolement et l’impact sur le bien-être, ils seront hébergés par groupe de 2 par cage, avec un plexiglas transparent séparant la cage pour maintenir un contact visuel et olfactif. Chacun des deux rats possédera son enrichissement (petite maison rouge + morceau de bois à ronger). Un suivi clinique quotidien sera mis en place, incluant la surveillance de l’état général, du comportement et du site d’implantation du cathéter.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrivant dans le cadre de premières études d’efficacité pharmacologique, les animaux utilisés seront des rats adultes dont la physiologie, les fonctions rénales, hépatiques et osseuses sont matures. Par ailleurs, cela assure une cohérence les conditions expérimentales choisies pour les études in vitro. Pour ce projet, seuls des rats mâles seront utilisés. Cela permet notamment de limiter la variabilité biologique liée aux fluctuations hormonales associées au cycle de la femelle, susceptibles d’influencer la pharmacocinétique, la biodistribution et l’excrétion des actinides. L’inclusion d’un seul sexe permet de réduire la variabilité entre les animaux et de limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Par ailleurs, l’utilisation de rat mâles est cohérente avec une grande partie des données disponibles dans la littérature sur la décorporation des radionucléides (= famille d’éléments dont font partie les actinides). Dans un second temps et en fonction des résultats obtenus, il pourra être envisagé de poursuivre l’étude des ligands en incluant des animaux femelles. Ce projet s’inscrivant dans le cadre de premières études d’affinité et d’efficacité pharmacologique, les animaux utilisés seront des rats adultes dont la physiologie, les fonctions rénales, hépatiques et osseuses sont matures. Par ailleurs, cela assure une cohérence avec le sérum de rat utilisé dans les études d’affinité in vitro, provenant d’animaux âgés de 8 à 12 semaines.

Le système immunitaire des souris utilisées est rendu déficient pour favoriser la prise de tumeurs mammaires humaines. 114 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les poumons et les ganglions. Après injection des cellules tumorales, elles subissent une chirurgie de résection et l'implantation d'une puce sous la peau, puis six semaines de mesures au pied à coulisse et de pesées trois fois par semaine, la peau au niveau de la tumeur pouvant s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur reconnaît n'avoir pas pu justifier statistiquement l'effectif de la première procédure, 24 souris, et s'appuie sur la littérature et son expérience.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est un sous-type particulièrement agressif du cancer du sein. Représentant environ 10 à 15 % de l’ensemble des cancers du sein, le cancer du sein triple négatif touche plus fréquemment des patientes jeunes et présente une forte propension à métastaser précocement, en particulier vers les poumons, le cerveau et les os. Malgré les avancées réalisées en oncologie, ce cancer demeure l’un des sous-types les plus difficiles à traiter en raison de sa grande hétérogénéité, du nombre limité d’options thérapeutiques ciblées et de l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies conventionnelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer le pronostic des patientes. Parallèlement, les progrès réalisés dans les modèles précliniques, notamment grâce a de nouveaux modèles et à l’imagerie en temps réel, ont permis d’évaluer l’efficacité de traitements expérimentaux dans des contextes biologiquement pertinents. Dans ce contexte, le présent projet vise à explorer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ce type de cancer. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau dispositif médical implantable sous-cutané (puce microfluidique) dans un modèle xénogreffe de cancer du sein métastatique triple négatif. Le modèle sera suivi à l’aide d’un système d’imagerie afin d’évaluer la réponse globale au dispositif.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif, étant peu ou non réceptives aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de cellules tumorales par injection (1min). Chirurgie de résection et implantation de la puce microfluidique (10min) Mesures tumorales au pied à coulisse 3x/sem et pesées 3x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 6 semaines après implantation. Imagerie par fluorescence (10min, 1x/semaine) Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois. Prélèvements sanguins une fois toutes les deux semaines (3min).

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une détresse respiratoire et une altération de la mobilité peuvent être envisagés suite au développement des métastases, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin de réséquer la tumeur et d’implanter la puce microfluidique en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever en post-mortem les poumons et les ganglions lymphatiques pour les analyser.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas totalement le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur métastatique ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Pour la première procédure, il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de 24 souris. Dans la 2e procédure, pour la comparaison des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique approprié et nous avons donc besoin de 90 animaux, ce qui fait un total de 114 animaux pour les deux procédures.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire en induisant une déficience pour une meilleure prise de nos tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois une injection dans la veine située derrière le globe oculaire, et jusqu'à cinq prélèvements de sang à la veine de la mandibule. Le porteur indique que les injections derrière l'œil peuvent produire des effets indésirables sur cet organe, que les prélèvements exposent à la déshydratation et aux hématomes, et que le déclenchement de la réaction immunitaire altère l'état général des animaux. Elles sont tuées pour prélever la rate et en extraire les cellules productrices d'anticorps, une étape que le porteur juge "indispensable" faute de modèle informatique reproduisant une réponse immunitaire.

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (5 au maximum) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen (maximum 4 +1 avec une stimulation forte selon le protocole) ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Gavées chaque jour pendant cinq semaines, soit 35 administrations, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles vivent seules en cage, sont pesées onze fois, puis subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour doser l'ocytocine dans leurs tissus. Le porteur affirme que la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier". Les trois composés testés appartiennent à un client du laboratoire, à un stade que le RNT qualifie de très précoce, et l'éventuelle mise sur le marché d'un médicament reste au conditionnel.

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries, et notamment L. reuteri, réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (11 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par gavage orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Prélèvement sanguin sous anesthésie (prélèvement; durée : 3 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures régulières du poids corporel peuvent provoquer un stress léger, notamment en raison de la manipulation et de la restriction temporaire des mouvements. Les traitements par gavage oral, réalisés pendant 5 semaines, peuvent entraîner une gêne légère et un stress modéré. Bien que des études préliminaires aient été conduites préalablement à notre étude, des effets indésirables pourraient être induits par les composés testés. Enfin, au dernier jour de l’étude, les animaux seront anesthésiés ce qui pourra engendrer un stress de courte durée pour permettre la réalisation d'un prélèvement sanguin.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs expérimentés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude, avec accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels, et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin réalisé au jour 28 (D28) sera précédé d’une anesthésie afin de limiter le stress des animaux. Enfin, un suivi quotidien des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une intervention rapide en cas d’atteinte des seuils établis. Ces interventions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l’emploi d’analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.

Choix des espèces

LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.

Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

2 200 souris subissent une électrostimulation sous anesthésie destinée à léser leur muscle, puis une mesure de force musculaire également sous anesthésie. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ce dispositif de "totalement non-invasif" alors qu'il sert à endommager le muscle, et affirme que l'interaction entre cellules ne peut être étudiée qu'in vivo. Les souris sont tuées pour prélever le tissu musculaire et analyser le métabolisme des cellules souches qu'il contient.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Cette régénération est notamment médiée par une population cellulaire spécifique, les cellules souches musculaires. De précédentes études ont démontré l’importance du métabolisme dans la fonction de ces cellules. Le projet vise à i) caractériser le comportement et le destin de cette population cellulaire au cours de la régénération, ii) identifier les régulations métaboliques sous-jacentes, iii) identifier des cibles biologiques qui permettraient d’influer sur la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser les régulations métaboliques qui surviennent au cours de la régénération musculaire et d’identifier des cibles potentielles qui permettraient d’influer sur cette régénération. De plus, les analyses réalisées au cours de ce projet conduiront à la création d’une base de données importante sur le métabolisme des cellules souches lors de la régénération musculaire qui pourra alimenter des projets ultérieurs et être mise à disposition de la communauté scientifique. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques.

Procédures

Les souris sont soumises à un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum) et à une une mesure de force musculaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation, anesthésies). Le stress des animaux inclut : 1) l'anesthésie gazeuse lors de l'induction de la blessure musculaire (environ 15 minutes), 2) l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort (environ 1 minute).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8-12 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes.