Rongeurs

300 souris subissent une chirurgie unique sous anesthésie provoquant un accident vasculaire cérébral, ischémique ou hémorragique selon le groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite observées six ou vingt-quatre heures, avec deux prélèvements de sang et deux évaluations neurologiques, puis tuées pour doser des biomarqueurs et mesurer le volume de la lésion cérébrale. Le porteur reconnaît que certaines présentent après l'opération une fatigue, une perte de mobilité ou des difficultés à se nourrir pouvant durer jusqu'à la fin de la période d'observation. Il écrit que, malgré plus de vingt ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible n'explique l'évolution de ces marqueurs, et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une urgence médicale majeure et constitue l’une des principales causes de décès et de handicap dans le monde. Parmi les AVC, ceux causés par un caillot qui bloque une grosse artère dans le cerveau (appelés AVC ischémiques) peuvent bénéficier de traitements efficaces. Cependant, même avec une prise en charge rapide, plus d’un patient sur deux reste dépendant trois mois après l’AVC. Le facteur le plus important pour améliorer les chances de récupération est le temps : chaque demi-heure de retard augmente considérablement le risque de décès ou de séquelles. Or, avant d’initier un traitement, les médecins doivent réaliser une imagerie (scanner ou IRM) pour vérifier s’il s’agit d’un AVC ischémique (avec occlusion d’une artère) ou hémorragique (avec saignement d’une artère), car les traitements sont opposés selon le type. Ce délai d’attente est donc un obstacle majeur. Des travaux récents ont identifié des molécules présentes dans le sang (biomarqueurs) qui pourraient permettre de reconnaître rapidement le type d’AVC. Mais ces biomarqueurs n’ont pas encore été testés dans des conditions permettant leur utilisation fiable en pratique. En particulier, on ne connaît pas leur évolution dans le temps ni leur réponse spécifique selon le type d’AVC. Ce projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, l’évolution de ces biomarqueurs dans des modèles expérimentaux d’AVC ischémique et hémorragique. Grâce à un environnement contrôlé, il sera possible de mieux comprendre leur comportement dans le temps et d’identifier ceux qui permettent de différencier rapidement les types d’AVC. À terme, ces résultats pourraient contribuer au développement d’un test sanguin rapide chez l’humain, utilisable dès les premiers instants, pour orienter plus vite les patients vers le bon traitement, et ainsi diminuer la mortalité et le risque de séquelles neurologiques sévères après un AVC.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet cherche à repérer des marqueurs biologiques dans le sang qui réagissent très tôt après un accident vasculaire cérébral (AVC). L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans le corps dès les premières heures, et de voir si certains marqueurs sanguins permettent de faire rapidement la différence entre les deux grands types d’AVC : l’AVC ischémique (lié à un caillot) et l’AVC hémorragique (lié à une rupture de vaisseau). Cette phase permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes de l’AVC et d’identifier des éléments utiles pour améliorer le diagnostic dans les services d’urgence. À long terme, ces découvertes permettront de créer un outil de diagnostic simple et rapide, basé sur un test biologique réalisable dès la première prise en charge du patient. Cet outil pourra : •Accélérer la mise en route du bon traitement, ce qui est essentiel car chaque minute compte. Un gain d’une heure pourrait réduire d’environ 20 % les risques de décès ou de handicap. •Orienter le patient directement vers le service le plus adapté à sa situation (urgences classiques, service spécialisé, salle d’imagerie interventionnelle), en évitant les pertes de temps liées à des transferts inutiles. À plus long terme, ce système pourrait aussi être intégré dans les études cliniques testant de nouveaux traitements, pour pouvoir les administrer plus tôt et de façon plus ciblée. En résumé, ce projet a pour but d’améliorer la rapidité et la précision du diagnostic des AVC, ce qui bénéficiera directement aux patients en augmentant leurs chances de survie et de récupération. Il contribuera aussi à une meilleure organisation des soins d’urgence et à une avancée importante dans le domaine des maladies neurologiques.

Procédures

Le projet sera mené sur 300 souris, réparties en quatre groupes correspondant à différents modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). Chaque souris sera observée et suivie selon une organisation identique comprenant une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours, un examen de base avant l’intervention durant 5 minutes et une prise de sang de très faible volume. Chaque souris sera utilisée pour une unique intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie durant moins de 20 minutes. Ensuite elle sera observée pour une durée de 6h ou de 24h où elle subira deux prélèvements veineux durant moins de 10 secondes et deux évaluations cliniques durant moins de 5 minutes sans aucune contention prolongée.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines interventions peuvent entraîner un inconfort ou des effets secondaires chez les souris, mais toutes les procédures sont encadrées et réalisées dans le respect du bien-être animal. Les tests neurologiques réalisés après l’intervention peuvent provoquer un léger stress, mais celui-ci est de très courte durée. Les prélèvements de sang effectués sur des animaux éveillés peuvent entraîner un bref inconfort, comparable à une piqûre, mais ils sont très courts et les volumes prélevés sont minimes. De même, les injections (sous la peau ou dans l’abdomen) peuvent provoquer un léger inconfort au moment de l’acte, mais la douleur est passagère. Concernant les chirurgies pratiquées dans ce projet, une douleur modérée et transitoire est possible au niveau de la zone opérée. Après la chirurgie, certains animaux peuvent présenter une gêne neurologique : fatigue, perte de mobilité ou difficultés à se nourrir. Ces effets sont surveillés et pris en charge, mais peuvent durer jusqu’à la fin de la période d’observation. Dans tous les cas, des traitements antidouleur adaptés sont administrés, et des critères précis sont mis en place pour limiter toute souffrance inutile. Les animaux sont étroitement surveillés tout au long de l’étude, et toute détresse conduit à une intervention immédiate.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort à un temps défini dans le cadre d’un recueil d’organes et de tissus (sang, cerveau) nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. La mise à mort est indispensable pour l’analyse biologique (dosage de biomarqueurs), histologique (analyse du volume lésionnel) et immuno-histochimique (étude de l’expression et de la localisation tissulaire des protéines d’intérêt).

Remplacement

À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant de répondre à la question scientifique posée sans recourir à l’expérimentation animale. Malgré plus de 20 ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible ne permet d’expliquer de manière précise et fiable comment évoluent certains marqueurs biologiques après un accident vasculaire cérébral (AVC). Les modèles développés en laboratoire (sur cellules, dits "in vitro") ne permettent pas non plus de reproduire l’ensemble des mécanismes complexes qui se déclenchent lors d’un AVC, comme les réactions inflammatoires, la coagulation, les atteintes des vaisseaux sanguins ou encore la souffrance neuronale. Les modèles animaux, en particulier chez la souris, sont aujourd’hui les seuls à permettre une reproduction fidèle de ce qui se passe dans le corps humain lors d’un AVC, que ce soit par obstruction d’un vaisseau ou hémorragique (saignement cérébral). Ces modèles sont déjà largement utilisés pour comprendre la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques. En l’absence d’alternative fiable chez l’humain ou en laboratoire, l’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour répondre à la question posée dans ce projet de recherche, dans le but de mieux comprendre la maladie et d’améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs stratégies ont été mises en place. Les marqueurs étudiés ont été directement sélectionnés à partir de données humaines déjà disponibles, issues de grandes bases cliniques, d’analyses de la littérature scientifique et de tests réalisés sur du sang de patients. Ensuite, chaque souris incluse dans le protocole permettra d’obtenir plusieurs prélèvements de sang à différents moments, ce qui évite d’utiliser un animal par point de mesure. Grâce aux progrès des techniques de laboratoire, de très faibles volumes de sang (quelques microlitres) suffisent désormais pour analyser les marqueurs recherchés. Ces prélèvements sont réalisés selon les recommandations internationales, sans dépasser les seuils autorisés. Enfin, un calcul précis du nombre de souris nécessaires a été réalisé avant le début du projet grâce à une évaluation statistique, pour s’assurer que chaque animal utilisé est indispensable. Grâce à l’organisation choisie, ce protocole permet de réduire d’environ deux à trois fois le nombre de souris qui aurait été nécessaire avec une approche classique. L’ensemble de ces mesures permet de respecter les principes éthiques de la recherche animale et de limiter son impact tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Avant toute procédure susceptible d’induire une douleur modérée, une analgésie préventive sera administrée. Une crème ou un spray anesthésique local sera également appliqué afin d’engourdir la zone traitée et de limiter l’inconfort au réveil. Les souris seront ensuite installées dans une chambre chauffée pour favoriser un réveil confortable. Les animaux auront un accès permanent à l’eau et à une alimentation adaptée, notamment sous forme gélifiée après l’intervention pour favoriser leur récupération. L’état de santé sera surveillé de manière rigoureuse grâce à des grilles d’évaluation précises, permettant de détecter toute douleur ou signe de détresse. Ces évaluations porteront à la fois sur le comportement de l’animal et sur ses capacités motrices. En cas de douleur mal soulagée ou de signes de souffrance importants, l’application de points limites stricts et spécifiques au projet sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.

Exposées in utero aux polluants, puis allaitées par des mères elles-mêmes exposées, certaines souris respirent ensuite la fumée de cigarette deux heures par jour pendant trois mois avant d'être tuées à six mois. 1 464 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi un prélèvement de queue dans les dix jours suivant la naissance pour le génotypage, et pour une partie une chirurgie suivie de plusieurs heures d'imagerie pulmonaire sous anesthésie, sans réveil. Le porteur écrit que les souris peuvent apparaître prostrées pendant l'exposition quotidienne à la fumée mais retrouvent leur activité dès la sortie de l'enceinte, et qu'au-delà de cette prostration transitoire aucun signe de souffrance n'est attendu.

Objectifs

La présente demande d'autorisation de projet repose sur l'étude des conséquences respiratoires de l’exposition aux polluants aériens sur la maturation du système immunitaire pulmonaire précoce et les risques d’incidence de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) à plus long terme. L'une des premières prises de conscience des effets majeurs de la pollution atmosphérique sur la santé a eu lieu lors d'un épisode survenu à Londres pendant l'hiver 1952 : durant 4 jours, un épais brouillard s'est abattu sur la ville, et 4000 décès supplémentaires (par rapport à la même période les années précédentes) ont été enregistrés, plus de la moitié étant pour causes respiratoires. La pollution atmosphérique est maintenant reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. L'hypothèse est ici que l’exposition aux polluants au cours de différentes phases de la vie (périnatale / adolescence / adulte) impacte durablement le système immunitaire pulmonaire générant une sensibilité accrue aux risques de développer une pathologie respiratoire à long terme comme la BPCO dont la cause principale est le tabagisme. Ainsi l'étude a pour objectif d'évaluer les effets de la pollution dans l’induction des maladies respiratoires chez l’animal au-delà de la BPCO. Le projet vise à répondre aux questions suivantes : 1/ Quel est l’impact de l’exposition aux polluants atmosphériques sur le compartiment immunitaire dans les poumons à court et long terme ; 2/ Quelles sont les populations immunitaires qui ont un rôle dans le développement des troubles respiratoires à plus long terme.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons à étudier le lien entre l’impact de l’exposition aux polluants sur la maturation et l’activation du système immunitaire pulmonaire et le risque d’incidence de pathologies chroniques respiratoires en particulier la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Cette pathologie correspond à une atteinte progressive et irréversible de la fonction respiratoire, présentent une variabilité très importante chez les patients atteints, et dont les déterminants notamment précoces restent largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients atteints. Bien que l'exposition tabagique soit le principal facteur de risque, il apparait que l’historique de l’exposition aux polluants représente aussi un facteur déterminant du risque de développer des maladies à plus long terme. Ce projet a pour objectif principal d'identifier les effets des polluants atmosphériques sur le système immunitaire, garant de l'intégrité tissulaire et du bon fonctionnement du système respiratoire. Ce domaine fait partie d'une problématique de santé publique très actuelle au-delà des effets du tabagisme et pour laquelle encore trop peu d'études sont mises en place. Ces études ont pour vocation de permettre une meilleure prise en charge thérapeutique des patients en ciblant la régulation du système immunitaire, et ainsi une amélioration certaine de leur qualité de vie.

Procédures

Prélèvement tissulaire (extremité de la queue) dans les 10 jours suivant leur naissance ou de sang en sous mandibulaire au sevrage après 1 mois d'âge, pour le génotypage procédure de 1 minute.- Exposition aux polluants atmosphériques pendant 7 jours directement dans leur cage d'origine.-Exposition quotidienne aux fumées de cigarette à raison de (2h/jour) pendant 3 mois à la fumée de cigarettes à l'aide d'une machine permettant là encore d'exposer les animaux sans les sortir de leur cage.-Injection retroorbitale sous anésthésie 1 minute par animal sans réveil-Procédure chirurgicale pour imagerie intravitale: 4h par animal : chirurgie 30 min et imagerie entre 2h et 3h30 (anesthésie générale max 4h).

Impact sur les animaux

Les prélèvements tissulaires pour génotypage engendrent des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les expositions aux polluants peuvent engendrer un stress chez l’animal de par le changement d'environnement, cependant aucun signe particulier n’a été observé lors des différentes campagnes d'exposition déjà réalisées au laboratoire. Pour l’exposition à la fumée de cigarettes, certaines souris peuvent apparaitre prostrées pendant la durée de l'exposition quotidienne, mais récupèrent leurs activités normales dès la sortie de l'enceinte d'exposition. Au-delà de la possible prostration transitoire, aucun signe de souffrance n’est attendu par ces approches. L’imagerie pulmonaire se fait sous anesthésie complète sans réveil de l’animal. D’expérience, le moindre signe de souffrance de l’animal sous anesthésie sera immédiatement détecté lors de la chirurgie (trouble respiratoire, sursaut musculaire, mobilité moustache) et pendant l'imagerie grâce au suivi continu de l'acquisition des images extrêmement sensible au moindre mouvement de l’animal (témoin de la moindre sensation de douleur). Au moindre cas, une adaptation du dosage en anesthésie sera réalisée en première intention, et sans amélioration dans les 5 minutes, une mise à mort anticipée sera pratiquée. Ainsi pour toutes ces procédures tous les gestes invasifs sont pratiqués sous anesthésie.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin des procédures. L'ensemble de l'étude repose sur le prélèvement d'organe ne permettant pas le maintien en vie des animaux ou des approches d'imagerie trop invasives pour permettre un rétablissement sans souffrance de l'animal.

Remplacement

La question de l'impact des expositions aux polluants atmosphériques sur les risques de développer des pathologies pulmonaires a plus long terme rend les modèles animaux incontournables. La réponse in vivo du système immunitaire est au coeur de nos questions. Néanmoins nous utilisons des approches in vitro d'exposition aux polluants sur lignées de cellule qui permettent de cibler les facteurs polluants les plus importants et ainsi réduire les combinaisons à tester in vivo. La modélisation des atmosphères polluants repose aussi sur des analyses épidémiologiques. Nous développons aussi des approches par organoïdes pour ces questions.

Réduction

Le modèle animal généré nous permet d’utiliser les mêmes animaux pour plusieurs approches analytiques. Le regroupement dans le même animal de plusieurs transgènes est un outil majeur pour identifier les différentes populations de cellules en même temps et ainsi réduire le nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le projet aux seules expériences indispensables, tout en tenant compte des contraintes liées à l'utilisation de l'enceinte d'exposition. En effet, un seul type d'atmosphère ne peut être généré en même temps, ce qui implique la répétition des groupes "Air non pollué-référence" pour chaque lot expérimental. Au-delà de l’analyse des poumons nous étendrons notre analyse sur plusieurs autres organes pour anticiper les questions futures. Nous basons notre échantillonnage par groupe sur la variabilité possible des réponses et les besoins rigoureux de reproductibilité afin d’atteindre les différences statistiques minimales. En études longitudinales les tests statitistiques seront réalisés pour comparer dans le temps et entre les groupes et pour des comparaisons deux à deux. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés et en particulier dans le cas des expositions in utero. Le projet prévoit le recours à un nombre d'animaux aussi limité que possible : 1464 souris au total seront réalisées sur 5 ans

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient plusieurs types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. L’exposition aux polluants est une procédure légère sans aucun geste technique réalisé, au-delà du stress possible causé par les changements transitoires des conditions d’hébergement Néanmoins la surveillance des animaux dans ces différents contextes est maintenue et tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera mis à mort si aucun traitement n’est envisageable. Pour l’imagerie intravitale, les animaux bénéficient d'une anesthésie gazeuse et sont mis à mort avant le réveil ne nécessitant pas de soin post opératoire. Dans tous les cas la mise à mort se fera faite sous anésthésie.

Choix des espèces

La physiologie pulmonaire de la souris est suffissement proche de celle de l'homme et nous disposons de modèles transgéniques uniques pour cette étude. Les modèles d'exposition aux polluants sont validés pour ce modèle avec des données utiles déjà générées. L'exposition adulte aux polluants sera en partie réalisée sur des souris de 3 à 6 mois d’âge L'exposition in utero sera faite sur souris gestante L'exposition juvénile sera faite sur souris allaitantes et souriceaux entre 0 et 7 jours- Dans certains cas, les souriceaux seront utilisés à J14, J21 et J60 pour étudier les différents stades du développement pulmonaire. Dans d'autres cas, les souriceaux seront exposés à partir de 3 mois d’âge aux fumées de cigarette pendant 3 mois et mis à mort à 6 mois pour étudier les prémisses de la BPCO.

Deux chirurgies du crâne d'une heure chacune, une lésion du cortex moteur puis la pose d'un implant, attendent 90 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite trois IRM sous anesthésie et des épreuves motrices, avant d'être tués pour analyser leur tissu cérébral. Le porteur décrit une douleur aiguë liée à l'incision du cuir chevelu et à la trépanation, des risques de saignements intracrâniens, d'œdème cérébral et de crises d'épilepsie soudaines, ainsi qu'un inconfort prolongé pendant la cicatrisation. Il annonce des tests évaluant l'amplitude des mouvements, la force et la sensibilité des membres antérieurs sans préciser lesquels, et compte parmi les bénéfices du projet la réduction du nombre d'animaux que permet le suivi d'un même individu dans le temps.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU). L’AJOUT D’UNE PROCÉDURE VISANT À PERMETTRE UNE POSSIBLE RÉDUCTION DU NOMBRE TOTAL D’ANIMAUX UTILISÉS AINSI QU’UNE OPTIMISATION DES CONDITIONS EXPÉRIMENTALES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ AVEC AJOUT DE 6 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.

Devenir

La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.

Remplacement

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.

Réduction

L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.

Jusqu'à vingt et une injections par animal, une pompe osmotique posée sous la peau par incision et une séance d'imagerie intravitale : 2 058 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Ces souris sont modifiées pour accueillir des cellules souches humaines, ce qui les rend sévèrement immunodéficientes et vulnérables aux infections, et elles reçoivent un traitement chimiothérapeutique avant la greffe. Le porteur signale une douleur pouvant durer plusieurs jours après la pose de la pompe, et des abcès possibles aux points d'injection répétée. Le projet vise des vecteurs injectables directement dans le sang, pour épargner aux patients la manipulation de leurs cellules hors du corps et une chimiothérapie dont le porteur écrit que les conséquences sont "lourdes pour l'organisme".

Objectifs

La β-thalassémie et la drépanocytose sont les maladies héréditaires génétiques les plus fréquentes au monde. Elles sont dues à des mutations génétiques causant de nombreux symptômes ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie (40 ans). Des thérapies géniques sont développées depuis des années afin de guérir ces maladies. Cependant, ces traitements nécessitent la manipulation des cellules souches hors du corps de chaque patient avant leur transplantation. Ce genre de manipulation est complexe et présente plusieurs limitations techniques. De plus, les traitements actuels nécessitent que les patients subissent une chimiothérapie dont les conséquences sont lourdes pour l’organisme. Nous proposons dans ce projet de contourner toutes ces limitations et d’améliorer l'efficacité de ces thérapies en testant une nouvelle génération de vecteurs thérapeutiques ciblant directement les cellules souches à l’intérieur du corps du patient.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront une preuve de concept de l’application de nos stratégies de modification du génome par administration directe dans la circulation sanguine. Ces nouveaux traitements permettront d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles et de réduire à la fois leur coût et la souffrance des patients.

Procédures

Anesthésie gazeuse (2X), 30s à 15min. Anesthésie profonde (1X), 1min. MODIFICATION Injections (21X maximum), 30s par intervention. Injection en intraveineuse (1X), 1 min par intervention. Prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2X) et sous anesthésie profonde (1X), 2 min par intervention. Injection en sous-cutanée (7X), 10s par intervention. Imagerie intravitale (1X), 10min par intervention. Pose de pompe osmotique (X1) : incision, 15min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux utilisés dans ce projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement myéloablatif léger appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. La pose de pompe osmotique par chirurgie sous-cutanée peut provoquer une douleur légère durant plusieurs jours après l’opération. L’injection de cellules souches en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. Les prélèvements de sangs réalisés sous anesthésie gazeuse peuvent provoquer une douleur. MODIFICATION : Les injection répétées de médicament sur 21 jours peuvent provoquer une irritation légère ou un abcès au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Le développement des vecteurs de ce projet a été réalisé en laboratoire, sans l’usage d’animaux, dans les conditions qui se rapprochent des celles observées dans le corps humain. La nature de ce projet, qui se focalise sur la capacité de ces nouveaux vecteurs à fonctionner dans la circulation sanguine, nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l’homme.

Réduction

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Pour le traitement statistique de nos données, nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de raffiner nos protocoles en diminuant la souffrance engendrée par le conditionnement chimiothérapeutique. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés au cours du conditionnement afin de surveiller toute perte de poids anormale. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Les animaux seront hébergés sur portoir ventilé, avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Enfin, la souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score spécifique.

Choix des espèces

Les seuls modèles animaux aujourd'hui disponibles pour l'étude des cellules souches humaines ont été développés chez la souris. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une homogénéité génotypique importante. Les membres de notre laboratoire disposent d'une expertise sur cette espèce, ce qui facilite la réalisation d'un tel projet. Les animaux subiront une greffe de cellules souches à l'âge de 5 à 7 semaines car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe de cellules souches humaines.

Pour un travail pratique destiné à des étudiants de master, 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de streptozotocine trois semaines avant la séance pour être rendue diabétique, d'autres sont des rats génétiquement diabétiques, et tous subissent le jour du travail pratique une injection de glucose, six prélèvements de sang par incision de la queue et deux à deux heures trente de manipulations, avant d'être tués. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet d'atteindre les "objectifs pédagogiques fixés" et que l'utilisation de rats est "indispensable" pour observer la régulation glycémique. Sur le choix de l'espèce, il s'en tient à une phrase sur les similitudes de physiologie entre le rat et l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser un diabète expérimental chez le rat, en comparaison avec un animal sain, dans le cadre d’un TP pour des étudiants en Master 1. Il permet aux étudiants de comprendre les principes diagnostiques du diabète et d’analyser des données physiologiques in vivo. Les mesures ponctuelles (glycémie à jeun, tests dynamiques) donnent une valeur instantanée, tandis que les indicateurs intégratifs (hémoglobine glyquée) reflètent la glycémie sur plusieurs semaines. Leur combinaison offre une évaluation complète de la pathologie métabolique.

Bénéfices attendus

Ce projet pédagogique permet aux étudiants de mettre en pratique des compétences expérimentales en physiologie animale dans un cadre éthique et réglementé. Il favorise la compréhension des mécanismes physiopathologiques du diabète et l’interprétation de paramètres glycémiques et insulinémiques. La comparaison de deux modèles de diabète différents (STZ et GK) illustre l’hétérogénéité de la pathologie et développe l’esprit critique des étudiants. Enfin, il sensibilise les étudiants au bien-être animal, en mettant en œuvre une analgésie préventive, une anesthésie adaptée et une mise à mort contrôlée.

Procédures

Certains animaux subiront une injection intrapéritonéale de streptozotocine (STZ, 40 mg/kg) pour l’induction du diabète (réalisée 3 semaines avant le TP). Tous les animaux (témoins, rats rendus diabétiques par STZ et rats GK spontanément diabétiques) seront soumis à plusieurs interventions expérimentales : - Injection intrapéritonéale de glucose (1 g/kg) lors du test de tolérance au glucose ; - Prélèvements sanguins sous anesthésie : 6 échantillons de 100 µL par animal (plus une goutte pour glycémie à jeun) prélevés par incision caudale ; - Mise à mort contrôlée à la fin du TP. Toutes ces interventions sont réalisées sous analgésie et anesthésie, avec un suivi attentif de l’état physiologique des animaux. La durée totale des manipulations le jour du TP est d’environ 2 à 2,5 heures par animal, tandis que l’injection de STZ est ponctuelle et réalisée une seule fois, trois semaines avant le TP.

Impact sur les animaux

Les rats diabétiques, qu’ils soient issus du modèle chimique (STZ) ou du modèle spontané (GK), présentent une hyperglycémie chronique, qui peut entraîner des manifestations physiologiques telles que polyurie et légère perte de poids. Ces effets font partie de la pathologie étudiée et nécessitent une surveillance accrue et un entretien adapté des cages (changement deux fois par semaine pour maintenir l’hygiène). Chez les rats STZ, la procédure de suivi de la glycémie implique des prélèvements sanguins hebdomadaires et limités (10 µL) réalisés sur la queue, effectués de manière ponctuelle et rapide. Cette manipulation est considérée comme minimale et ne nécessite pas de prise en charge analgésique supplémentaire. L’ensemble des manipulations prévues durant le TP (analgésie, anesthésie, prélèvements sanguins, mis à mort contrôlée) est conçu pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux et garantir leur bien-être pendant toute la durée de l’expérience.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les rats sont maintenus en vie 3 semaines pour aller en procédure 2. A l'issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une approche expérimentale physiologique, et à ce stade, aucune alternative non animale ne permet d’atteindre les objectifs pédagogiques fixés. L’utilisation de rats est indispensable pour étudier l’impact du diabète sur la régulation glycémique et la réponse insulinique in vivo, ainsi que pour observer de manière intégrée les paramètres physiopathologiques associés à l’hyperglycémie. Les modèles diabétiques choisis, rats STZ pour le diabète induit par STZ et rats Goto-Kakizaki (GK) pour le diabète spontané, constituent des modèles bien établis et largement validés dans la littérature scientifique. Ils présentent des caractéristiques physiologiques et métaboliques proches de celles observées chez l’homme, ce qui permet aux étudiants de comprendre et d’analyser de manière réaliste les mécanismes du diabète.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce TP est limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs pédagogiques. Chaque binôme de deux étudiants travaille sur deux rats, comprenant un rat sain et un rat diabétique. Pour le modèle diabétique, la moitié des binômes utilise un rat STZ et l’autre moitié un rat Goto-Kakizaki (GK). Le modèle STZ présente une variabilité individuelle dans l’intensité et l’installation de l’hyperglycémie, liée à la sensibilité variable des cellules β pancréatiques à la streptozotocine. Pour garantir que tous les binômes disposent d’un rat diabétique stable, un surplus de 10 % de rats STZ est prévu, soit 1 rat supplémentaire, portant le nombre total de rats STZ à 9 au lieu de 8. De plus, le nombre de rats STZ injectés pourra être légèrement augmenté si le nombre de rats GK disponibles pour la date du TP est insuffisant. En effet, en raison de l’état diabétique, le rat GK se reproduit moins efficacement que le rat Wistar sain, ce qui peut limiter la disponibilité des animaux diabétiques pour le TP. Cet ajustement permet de maintenir un nombre suffisant d’animaux diabétiques, tout en restant conforme à la règle de réduction. Le TP s’adresse à 32 étudiants, soit 16 binômes, nécessitant 32 rats au total. Les résultats obtenus par chaque binôme sont mutualisés et discutés au sein de la salle, optimisant l’exploitation des données et évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Tous les rats seront surveillés quotidiennement (aspect global, signes de stress ou de douleur). De même pour les paramètres environnementaux des pièces d'hébergement : la température, les horaires des cycles jours/nuits, les taux d'hydrométrie. Pour les rats Wistar le change de litière est fait une fois par semaine avec un enrichissement sous forme de cubes de papier pour qu'ils puissent faire un nid et un bout de bois à ronger. Le changement de l'eau des biberons est fait 2 fois par semaine. Pour les rats STZ et les rats GK diabétiques qui ont une augmentation du volume et de la fréquence des urines, le change des biberons sera fait 3 fois par semaine. Pour ces rats, le change des cages est fait 2 fois par semaine dans une litière ultra absorbante pour leur apporter un maximum de confort ; nous éviterons le nid qui une fois souillé par l'urine entraine des mauvaises odeurs et de l'humidité ; sera disposé dans la cage un bout de bois à ronger pour favoriser le bien-être et et l’expression de comportements naturels, propres aux rongeurs. Les prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sur la queue de l’animal, d’un volume de 10 µL, ne provoquent pas de douleur notable et ne nécessitent donc aucune prise en charge analgésique. Une fois par semaine nous évaluerons par grille de score adapté, l'apparence, le comportement, et l'hydratation des animaux. Seront mis à mort les rats ayant un score caractéristique de souffrances sévères (moins de 10% attendus).

Choix des espèces

Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celles de l’humain.